Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten ...

3 OPTIMIERUNG DER HPLC- UND GC-METHODEN 45
3.2 Achirale OPA/MPA-FMOC-Cl-Methode mittels HPLC
SCHUSTER [152] demonstrierte eine kombinierte Methode mit einem HPLC-System
von Hewlett-Packard HP 1090 Series M, in der überwiegend Proteinhydrolysate und
physiologische Flüssigkeiten nach Vorsäulenderivatisierung mit OPA/MPA-FMOC-Cl
analysiert wurden.
Für die achirale Aminosäurenanalytik wurde im Rahmen dieser Arbeit eine standar-
disierte und vollautomatisierbare Derivatisierung mit OPA/MPA-FMOC-Cl auf der
Basis der Methode von SCHUSTER [152] und durch eigene systematische Messun-
gen bei HPLC-System LaChrom von Merck Hitachi optimiert. Während der Optimie-
rung der eingesetzten Methode wurden einzelne chromatographische Daten modifi-
ziert und dadurch gelang eine zusätzliche Trennung einiger Aminosäuren. Die Un-
terschiede werden im Abschnitt 5.2.6 ausführlich dargestellt.
3.2.1 Optimierung der chromatographischen Trennung
3.2.1.1 Vorsäulenderivatisierung der Aminosäuren
Die Derivatisierung der AS erfolgte unter Verwendung eines programmierbaren Au-
tosamplers (Abb. 3-3). Im ersten Schritt der Derivatisierung wurde Probe bzw. Stan-
dard, Kaliumboratpuffer und OPA-MPA-Reagenz aufeinanderfolgend aufgezogen
und in “Reakti-Vials“ überführt. Nach dem mehrmaligen Mischen und einer Reakti-
onszeit von 200 Sek. wurde das zweite Derivatisierungsreagenz FMOC-Cl zuge-
setzt. Nach weiteren 90 Sek. wurde die Reaktion durch Zugabe einer genau abge-
messenen Menge von Essigsäure gestoppt. Die Erniedrigung des pH-Wertes dient
dem stabilen, optimalen Ablauf der Reaktion und zur Schonung der Säule, da auf
Silika basierende Trennsäulen für alkalische pH-Wert meist nicht geeignet sind.
Nach der Derivatisierung wurden 20 μl des Aliquotes der Lösung in die HPLC-
Apparatur injiziert [168].