Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten ...

3 OPTIMIERUNG DER HPLC- UND GC-METHODEN 43
Ein wichtiger Vorteil der Vorsäulenderivatisierung mit OPA ist, daß das überschüssi-
ge Reagenz nicht aus der Reaktionsmischung entfernt werden muß, da es selbst
nicht fluoresziert [76]. Der Einführung der Derivatisierung von AS mit OPA standen
in den letzten Jahren Probleme der unterschiedlichen Bildungsgeschwindigkeit und
der Stabilität der OPA-Derivate entgegen. Es konnte in der Folgezeit durch eine voll-
automatisierte, dadurch gut reproduzierbare Derivatisierungsprozedur beseitigt wer-
den.
Als Thiolverbindung zur achiralen Bestimmung von AS werden häufig 2-Mer-
captoethanol (ME) oder 3-Mercaptopropionsäure (MPA) eingesetzt [71,149,150]. Zur
Lösung des Problems der Nichterfassung von sekundären AS haben PALMERINI et
al. [151] vorgeschlagen, alle primären AS mit OPA ohne Zusatz von Thiolverbindun-
gen umzusetzen. Dabei entstehen nicht fluoreszierende Derivate. Anschließend
werden sekundären AS mit 4-Chlor-7-nitrobenzo-furazan (NBD-Cl) zu Fluoreszenz-
derivaten umgesetzt, die getrennt von allen anderen AS bestimmt werden können.
Diese Methode ist jedoch wegen geringerer Effektivität gegenüber der OPA-Derivate
nicht empfehlenswert [146].
Die Vorsäulenderivatisierung mit OPA in Kombination von 9-Fluorenylmeth-
oxycarbonylchlorid (FMOC-Cl) bietet eine schnelle und empfindliche Methode zur
simultanen Analyse von primären und sekundären AS [76,152,154]. FMOC-Cl, ein
Ester der Chlorameisensäure, reagiert schnell und quantitativ mit einem Amin zu
einer Urethanverbindung und somit sind sowohl primäre als auch sekundäre Amine
durch FMOC-Cl derivatisierbar [73] (Abb. 3-2), was den bedeutendsten Vorteil ge-
genüber der OPA-Derivatisierung darstellt. Ein Nachteil der FMOC-Methode ist je-
doch, daß das Reagenz selbst fluoresziert und als relativ großer Reagenzpeak im
Elutionsbereich der AS-Derivate erscheint. Eine Kombination beider Methoden durch
automatisierte, aufeinanderfolgende Vorsäulenderivatisierung vereinigt die Vorteile
beider Methode.
OPA reagiert zuerst in Gegenwart einer achiralen Thiolverbindung, z.B. MPA mit
primären AS. Nach der nachfolgenden Umsetzung mit FMOC-Cl für sekundäre AS
werden OPA/MPA-FMOC-AS-Derivate an Umkehrphasen mittels HPLC getrennt. Als
bisher beste Gesamttrennung demonstrierte SCHUSTER [152] eine kombinierte
HPLC-Methode nach der Vorsäulenderivatisierung mit OPA/MPA-FMOC-Cl, indem