Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten ...

3 OPTIMIERUNG DER HPLC- UND GC-METHODEN 42
3 OPTIMIERUNG DER HPLC- UND GC-METHODEN
3.1 Vorsäulenderivatisierung mit OPA zur achiralen und chiralen
Bestimmung von Aminosäuren mittels HPLC
Das selbst nicht fluoreszierende ortho-Phthaldialdehyd (OPA) bildet mit primären
Aminoverbindungen in Gegenwart einer Thiolverbindung im alkalischen Milieu ein
fluoreszierendes Isoindolringsystem (Abb. 3-1). Bei der Reaktion wird der Amino-
stickstoff in einen Pyrrolring umgewandelt und daher können sekundäre Amine wie
z.B. Pro und Hyp nicht mit OPA reagieren [71,144-146]. Zur quantitativen Aminosäu-
renanalytik kann das OPA-Reagenz durch eine geeignete Variation der achiralen
und chiralen Thiolverbindungen vielseitig verwendet werden. Die Verwendung von
OPA zur AS-Analyse mittels HPLC erfolgt meist in Verbindung mit einer Vorsäulen-
derivatisierung an RP-18-Umkehrphasen [147]. Es wurde auch die Trennung der AS
an Ionenaustauschern mittels HPLC mit einer Fluoreszenzderivatisierung im Nach-
säulen-Verfahren empfohlen. Dieses Verfahren ist jedoch aufwendiger [148].
CHO
CHO
SR 1,2
+ H2N-CHR-COOH +
N-R
OPA prim. AS
HS-R 1 ; 3-Mercaptopropionsäure (MPA)
HS-R 2 ; N -Isobutyryl-L bzw. -D-cystein (IBL/DC)
HS-R 1,2
achiral / chiral
Isoindolderivat
Abb. 3.1: Reaktionsschema der primären AS mit OPA in Gegenwart von achiralen
und chiralen Thiolverbingungen