Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten ...

5.2.6 Diskussion der Methoden
5 DISKUSSION 143
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwie verschiedene HPLC-Systeme für die chirale
AS-Analyse nach Derivatisierung mit OPA und N-Isobutyryl-L/D-cystein (IBL/DC).
System I: HP 1090 (Hewlett Packard) und System II: LaChrom (Merck Hitachi). Die
OPA/IBL(D)C-Methode wurde zuerst mit dem HP 1090 System optimiert und durch
Modifizierung einzelner chromatographischer Parameter auf das LaChrom System
übertragen. Dabei wurden die verwendeten Reagenzien und Puffer (siehe Kap.
2.3.2) in Mengen und Konzentrationen möglichst geringfügig verändert, so daß die
Gesamttrennung und die Elutionsfolge nahezu identisch waren (siehe Kap. 3.3.1 und
3.3.2).
Im Folgenden werden Unterschiede der beiden Systeme im Bezug auf Gesamttren-
nung, Problematik einzelner AS-Trennungen, Derivatisierungsvorgang und Bestim-
mungsgrenzen dargestellt.
5.2.6.1 Gesamttrennung
Die von BRÜCKNER et al. [165,166] entwickelte OPA/IBL(D)C-Methode ermöglicht
die Trennung aller proteinogenen L-Aminosäuren und der entsprechenden
D-Enantiomere (17 DL-AS Paare), Glycin, Gaba, DL-Cit, DL-Orn sowie des internen
Standards L-Abu mit Ausnahme von Prolin und Cyst(e)in mittels System HP 1090 an
einer konventioneller RP-18-Phase (Hypersil ODS2) unter Verwendung eines ein-
fachen linearen Gradienten innerhalb von 75 min in einem chromatographischen
Lauf. Der Wechsel von IBLC auf IBDC führt dabei zu einer Elutionsumkehr innerhalb
der Enantiomerenpaare, bei Derivatisierung mit IBLC eluieren zuerst die L-AS, bei
IBDC die D-AS. Die Reihenfolge der AS untereinander bleibt jedoch unverändert,
was vorteilhaft für die Identifizierung und Absicherung der Zuordnung der detektier-
ten Signale ist.
Die Gesamttrennung und die Elutionsfolge der AS waren beim LaChrom System
und beim HP 1090 System nahezu identisch, wobei einige Überschneidungen bzw.
Koelutionen einzelner AS beobachtet wurden (siehe Kap. 5.2.6.2). Eine Trennsäule
von Waters (Nova-Pak C18, 300 mm x 3,9 mm I.D., Korngröße: 5 μm ) wurde zur