Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 83<br />
<strong>Protein</strong>asen inhibiert. Durch den Einsatz von EDTA werden zudem die Metalloproteasen<br />
inhibiert. Für die weiteren Versuche wurde bei <strong>der</strong> Solubilisierung <strong>der</strong> Zellen stets <strong>der</strong><br />
<strong>Protein</strong>ase – Inhibitor Cocktail Complete eingesetzt. Zusammenfassend ergibt sich durch<br />
den Einsatz des nichtionischen Detergens Triton X 100 mit dem Inhibitor- Cocktail<br />
Complete <strong>der</strong> opt<strong>im</strong>ale Solubilisierungspuffer für die weiteren Versuche. Die opt<strong>im</strong>ale<br />
Zellzahl liegt bei 1x10 6 Zellen.<br />
Für die Trennung <strong>der</strong> Zellsolubilisate in <strong>der</strong> SDS – PAGE wurden Tricin – Gele eingesetzt<br />
[93]. Diese boten gegenüber den herkömmlichen Glycin – Gelen nach Laemmli [92] den<br />
Vorteil <strong>der</strong> höheren Auflösung <strong>im</strong> Molekulargewichtsbereich von 1-100 kD. Nachteilig ist<br />
jedoch die geringere Schärfe <strong>der</strong> Banden. Zudem sind die Gele sehr empfindlich gegen-<br />
über hohen Salzkonzentrationen <strong>im</strong> Probenpuffer. Für die Kinetikanalysen wurde <strong>der</strong><br />
direkte Fluoreszenz – Nachweis gewählt, da so densiometrische Auswertungen möglich<br />
waren. Die verwendete CCD – Kamera verfügt über eine lineare Kennlinie, während<br />
Röntgenfilme eine exponentielle Kennlinie haben. Da das vorhandene Imagingsystem je-<br />
doch nur eine begrenzte Auflösung hat, wurde aus drucktechnischen Gründen bei den<br />
Kinetikexper<strong>im</strong>enten auf eine Darstellung <strong>der</strong> SDS – Gele weitgehend verzichtet.<br />
Diese ersten Exper<strong>im</strong>ente zeigten, dass mit dem gewählten Exper<strong>im</strong>entalansatz in<br />
KMM∅ generierte Abbaufragmente von FITC-OVA in <strong>der</strong> SDS – PAGE getrennt werden<br />
können und durch Fluoreszenzaktivierung nachgewiesen werden können. Dabei zeigte<br />
sich nach einem vierstündigen FITC-OVA Pulse bereits ein Abbaufragment mit einem<br />
Molekulargewicht von 40 kD.<br />
3.1.8 Kinetik <strong>der</strong> Antigenprozessierung durch Knochenmarksmakrophagen<br />
Um ein grundlegendes Verständnis über die dynamischen Prozesse <strong>der</strong> Antigenprozes-<br />
sierung zu erhalten, wurden Kinetikexper<strong>im</strong>ente durchgeführt. Mit Hilfe dieser Experi-<br />
mente sollte geklärt werden, in welchem Zeitraum das Modellantigen FITC - Ovalbumin<br />
durch intrazelluläre <strong>Protein</strong>asen degradiert wird. Durch diese Information könnte <strong>der</strong><br />
Ort <strong>der</strong> <strong>Prozessierung</strong> innerhalb des Endo-/lysosomalen Apparates angenähert werden.<br />
Grundlegende Arbeiten über die Endozytose zeigten eine klare Korrelation zwischen dem<br />
Aufenthalt in best<strong>im</strong>mten intrazellulären Kompart<strong>im</strong>enten und <strong>der</strong> Zeit seit Aufnahme<br />
des Antigens[125]. Zusätzlich wurde <strong>der</strong> Einfluss <strong>der</strong> Makrophagenaktivierung auf die<br />
<strong>Prozessierung</strong> untersucht. Hierzu wurden die Knochenmarksmakrophagen einerseits mit<br />
γ- Interferon, an<strong>der</strong>erseits mit dem bakteriellen Oberflächenantigen LPS st<strong>im</strong>uliert.