Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 68<br />
OVA Grade VII [121]. Somit wurde gewährleistet, dass es sich um dasselbe <strong>Protein</strong> han-<br />
delt. In einem nächsten Lauf wurde die präparative Reinigung an <strong>der</strong> POROS HQ/F-<br />
Säule untersucht. Für die verwendete Säule ist ein max<strong>im</strong>ales Bindevermögen von ca.<br />
40 mg <strong>Protein</strong> angegeben. Da ein Großteil <strong>der</strong> Verunreinigungen von OVA Grade II nicht<br />
an die Matrix bindet, wurden 50 mg Ausgangsmaterial eingesetzt. Der präparative An-<br />
satz zeigte einige Unterschiede zum analytischen Lauf. Zum einen eluiert das Material<br />
früher als be<strong>im</strong> analytischen Lauf, zum an<strong>der</strong>en wird ein breiter Elutionspeak erhalten.<br />
Eine Konzentrationsbest<strong>im</strong>mung ergab, dass ca. 12 mg <strong>Protein</strong> von <strong>der</strong> Säule eluiert<br />
werden konnten. Dies entspricht ungefähr 25% des Ausgangsmaterials.<br />
Um das Material näher zu charakterisieren, wurde von dem Säuleneluat eine Gelfiltrati-<br />
on an Superose 12 durchgeführt (Abb. 10-C). Hierfür wurden 12,5 µg eingesetzt, um ei-<br />
nen Vergleich mit den in <strong>der</strong> Diplomarbeit [121] gewonnen Daten zu ermöglichen. Im<br />
Gegensatz zu OVA Grade VII zeigt das gereinigte <strong>Protein</strong> neben dem bekannten Haupt-<br />
peak bei 26,6 Min. Retentionszeit einen weiteren Peak, <strong>der</strong> früher eluiert. SDS-Page<br />
Analysen konnten jedoch keinen Unterschied <strong>der</strong> beiden Peaks aufzeigen, so dass es<br />
sich be<strong>im</strong> ersten Peak vermutlich um eine stärker manosylierte Form des Ovalbumins<br />
handelt. Ausgehend von diesen Daten wurde eine präparative Reinigung von einem<br />
Gramm OVA Grade II an einer Mono Q- Matrix durchgeführt. Das erhaltene Chroma-<br />
togramm ähnelt dem an <strong>der</strong> POROS HQ/F erhaltenen Ergebnis. Der frühere Elutions-<br />
zeitpunkt ist mit <strong>der</strong> unterschiedlichen Matrix zu erklären.<br />
SDS-PAGE Analysen zeigen die hohe Reinheit des eluierten Materials. Unterschiede <strong>im</strong><br />
Aufreinigungsvermögen <strong>der</strong> POROS HQ/F und <strong>der</strong> Mono Q- Matrix konnten nicht fest-<br />
gestellt werden. Die Abb. 11-A zeigt die silbergefärbten Eluate <strong>der</strong> Anionenaustauschch-<br />
romatographie. Obwohl in den Spuren 2-5 eine hohe Probenkonzentration eingesetzt<br />
wurde, zeigt sich dennoch die hohe Reinheit des OVA - <strong>Protein</strong>s gegenüber dem Aus-<br />
gangsmaterials in Spur 1. Die Bandenunschärfe ist auf die hohen Salzkonzentration <strong>der</strong><br />
Proben nach <strong>der</strong> Anionenaustausch – Chromatographie sowie <strong>der</strong> Manosylierung von<br />
OVA zurückzuführen. Zudem kommt es unter diesen Bedingungen zu Artefakten be<strong>im</strong><br />
Nachweis <strong>der</strong> <strong>Protein</strong>e durch Silberfärbung [156]. Verdünnt man die Proben, so zeigt<br />
sich eine nahezu 100%ige Reinheit des OVA – <strong>Protein</strong>s (Spur 6 und 7). Gegenüber dem<br />
käuflich erworbenen Material (Spur 8) zeigen sich keine Abbauprodukte. In <strong>der</strong> Abb. 11-<br />
B wurden die beiden Peak - Eluate <strong>der</strong> Gelfiltration weiter untersucht. Hierbei zeigte<br />
sich, dass beide Peak - Eluate ein identisches Molekulargewicht aufwiesen, obwohl sie