Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 52<br />
2.7 Molekulargenetische Arbeiten<br />
2.7.1 Isolierung von Gesamt- RNA aus eukaryontischen Zellen<br />
Bei allen Arbeiten mit RNA muß beson<strong>der</strong>s die Kontamination mit RNA- degradierenden<br />
Enzymen, den Ribonukleasen, vermieden werden. Diese ubiquitären und äußerst robus-<br />
ten Enzyme zeichnen sich durch extreme Thermostabilität und Unempfindlichkeit gegen<br />
chemische Agenzien <strong>der</strong> verschiedensten Stoffklassen aus. Da diese Enzyme bereits in<br />
geringen Mengen wirksam sind, wurden folgende Vorsichtsmaßnahmen getroffen:<br />
• Bei allen Arbeiten wurden Handschuhe getragen<br />
• Glas- und Plastikwaren wurden vor Gebrauch autoklaviert<br />
• Wenn möglich wurden die Lösungen zur Inaktivierung von RNasen mit DEPC behandelt und autoklaviert<br />
• Es wurde nur DEPC- behandeltes Aqua bidest. (DEPC-H2O) verwendet<br />
• RNA- Präparationen wurden stets bei –70°C gelagert<br />
• Alle Lösungen wurden sterilfiltriert<br />
2.7.1.1 Einfrieren von Zellen für RNA- Präparationen<br />
Die für die RNA- Isolierung vorgesehenen Zellen wurden geerntet und einmal mit PBS<br />
gewaschen. Von dem erhaltenen Zellsed<strong>im</strong>ent wurde verbleibende Waschflüßigkeit mög-<br />
lichst weitgehend entfernt. Die Zellen wurden anschließend in flüssigem Stickstoff bei –<br />
196°C schockgefroren und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –70°C gelagert.<br />
2.7.1.2 Präparation <strong>der</strong> RNA<br />
• GSCN-Stammlösung 59,1 g GSCN<br />
950 mg Na-Citrat<br />
625 mg Sarcosyl<br />
ad 100 ml DEPC-H2O<br />
• GSCN/ME 976 µl GSCN- Stammlösung<br />
24 µl 2-Mercaptoethanol<br />
• NaAc-Lsg. 3M Natriumacetat, pH 8,0<br />
• Phenol/Chloroform Lsg. 25 ml Phenol<br />
24 ml Chloroform<br />
1 ml Isoamylalkohol<br />
• DEPC/EtOH 5 µl DEPC<br />
45 µl 99,9% Ethanol<br />
• NP40-Lyse- Stammlsg. 0,5 ml 2 M Tris<br />
2,8 ml 5 M NaCl<br />
1,5 ml 1 M MgCl2<br />
0,5 ml NP40