Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 48<br />
2.4.4.3 Regeneration <strong>der</strong> Säule<br />
Um die Trenneigenschaften <strong>der</strong> Säule zu erhalten, ist ein regelmäßiges Waschen <strong>der</strong><br />
Säule notwendig; nach ca. 30-40 Chromatographieläufen ist zusätzlich ein Filterwechsel<br />
notwendig.<br />
Zur Reinigung wurde die Säule zuerst mit 50 ml 70% Essigsäure gewaschen, dabei wur-<br />
de eine Flußrate von 0,2 ml / min eingestellt. Die Essigsäure wurde durch 50 ml 20%<br />
Ethanol ersetzt. Im nachfolgenden Schritt wurde <strong>der</strong> pH mit 0,1 M NaOH neutralisiert<br />
und <strong>im</strong> abschließenden Schritt die Säule mit Aqua bidest. gewaschen. Die Säule konnte<br />
nun mit dem benötigten Puffer equilibriert werden.<br />
Wurde die Trenneffizienz <strong>der</strong> Säule durch den Waschvorgang nicht wie<strong>der</strong> hergestellt,<br />
wurde zusätzlich <strong>der</strong> obere Filter <strong>der</strong> Säule nach Herstellerangaben gewechselt.<br />
2.4.5 Anionenausch- Chromatographie mit POROS HQ/F und MonoQ HR10/10<br />
Die analytische Säule POROS HQ/F ist ein Polystyren / Divinylbenzen Medium, das für<br />
die Perfusionschromatographie opt<strong>im</strong>iert ist. Bei <strong>der</strong> Perfusionschromatographie enthal-<br />
ten die Matrixpartikel zusätzliche Kanäle, die es <strong>der</strong> Flüssigkeit erlauben, auch durch<br />
die Beads zu fließen. Dadurch wird die erfor<strong>der</strong>liche Distanz für die Diffusion <strong>der</strong> Bio-<br />
moleküle zu und von internen Bindungsseiten gegenüber <strong>der</strong> konventionellen Chroma-<br />
tographie verkürzt. Hierdurch werden hohe Flußraten ohne Verlust <strong>der</strong> Bindungskapazi-<br />
tät und Auflösung ermöglicht. Damit kann die benötigte Zeit für einen Lauf drastisch<br />
verkürzt werden, was vor allem für analytische Trennungen von Vorteil ist [104] . Die<br />
präparative Säule MonoQ HR 10/10 ist ein quervernetztes, hydrophiles Polyetherresin,<br />
an das quatäre Ammoniumgruppen gekoppelt sind. Die MonoQ ist gegenüber <strong>der</strong> PO-<br />
ROS HQ/F Säule ein klassisches Medium. Beide sind starke Anionenaustauscher und<br />
zeigen eine ähnliche Trennleistung. Die mit <strong>der</strong> POROS HQ/F Säule ermittelten Gradien-<br />
ten konnten leicht auf die präparative Säule übertragen werden, wenn man den Gra-<br />
dienteninSäulenvolummen(CV)berechnete.<br />
2.4.5.1 Proben und Puffervorbereitung<br />
Um opt<strong>im</strong>ale Ergebnisse zu erhalten, wurden die Probe und die Puffer sorgfältig vorbe-<br />
reitet. Alle verwendeten Puffer wurden sterilfiltriert und vollständig entgast. Die Proben