Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 38<br />
• Transferpuffer 48 mM (5,82 g/l) TRIS<br />
39 mM (2,94 g/l) Glycin [99]<br />
2.3.6.2 Durchführung<br />
Zur Vorbereitung des Western Blots wurde die Blotkammer mit Transferpuffer gefüllt<br />
und bei 4°C vorgekühlt. Das Polyacrylamid - Gel wurde nach vorsichtigem Abheben <strong>der</strong><br />
Glasplatten für 15- 25 min in Transferpuffer equilibriert; während dieses Schrittes wur-<br />
de das Gel mit Hilfe eines Skalpells auf die benötigte Größe geschnitten. Die PVDF -<br />
Membran wurde auf Gelgröße zurechtgeschnitten, wobei darauf geachtet wurde, die<br />
Membran nicht mit ungeschützten Fingern zu berühren. Vier Filterpapiere wurden für<br />
Abb. 6 Schematischer Aufbau <strong>der</strong> Transfer-Apperatur<br />
1 = Gelhalter, 2 = Gel, 3 = Membran, 4 Filterpapier, 5 Puffertank<br />
das Blotten auf Gelgröße zusammengeschnitten und vor dem Blotten in Transferpuffer<br />
inkubiert. Die PVDF - Membran wurde kurz in p.a. Methanol angefeuchtet und für min-<br />
destens 5 min. in Transferpuffer equilibriert. Die Schaumstoffunterlagen <strong>der</strong> Blothalte-<br />
rung wurden nach gründlicher Reinigung mit Aqua bidest. in Transferpuffer befeuchtet<br />
und die einzelnen Komponenten wie in Abb. 6 übereinan<strong>der</strong> geschichtet, wobei genau