Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 37<br />
Ende wurde mit einem Metallgewicht beschwert. Anschließend erfolgte Dialyse gegen<br />
den benötigten Puffer bei 4°C für 24 Stunden unter ständigem Umrühren. Der Dialy-<br />
sierpuffer wurde dre<strong>im</strong>al gewechselt. Mit Hilfe <strong>der</strong> Dialyse wurde nicht reagiertes Mar-<br />
kierungsreagens aus <strong>der</strong> <strong>Protein</strong>lösung entfernt.<br />
2.3.6 <strong>Protein</strong>transfer auf PVDF-Membran<br />
Um die <strong>Protein</strong>e, die in <strong>der</strong> SDS-PAGE aufgetrennt wurden, spezifisch nachzuweisen o-<br />
<strong>der</strong> automatisch N - Terminal sequenzieren zu lassen, mussten diese auf einem Medium<br />
<strong>im</strong>mobilisiert werden. Dies geschieht durch Elektro - Blotting auf eine PVDF - Membran<br />
[98]. Die für spezifische Nachweise eingesetzte PVDF - Membran Immobilin P besitzt eine<br />
Porengröße von 0,45µm und eine von <strong>der</strong> Molekülgröße abhängige, typische Absorpti-<br />
onsfähigkeit von 85µg/cm 2 (Insulin) bis 295µg/cm 2 (Ziegen - IgG). Für Sequenzierreakti-<br />
onen wurde eine spezielle Membran, Immobilin P SQ, mit einer Porengröße von 0,2 µm<br />
eingesetzt. Die <strong>Protein</strong>e werden durch starke unspezifische elektrostatische und hydro-<br />
phobe Wechselwirkungen fixiert. Im Gegensatz zu Nitrocellulose - Membranen bietet die<br />
PVDF - Membran den Vorteil von sehr gleichmäßiger Oberflächen- und Strukturbeschaf-<br />
fenheit und hoher Materialfestigkeit.<br />
2.3.6.1 Materialien und Lösungen<br />
Ovalbumin<br />
Molekurgewicht 45 000 D<br />
Anzahl Lysine 20<br />
eingesetzte Menge <strong>Protein</strong> 10 mg<br />
Molzahl 2,40 x 10 -7<br />
MolzahlxAnzahl Lysine +1 5,04 x 10 -6<br />
Molzahl Fluoresceinlösung x 1,4 7,01 x 10 -6<br />
Fluoresceinlösung 35 µl<br />
eingesetzte Menge <strong>Protein</strong> 2,5 mg<br />
Molzahl 6,00 x 10 -8<br />
MolzahlxAnzahl Lysine +1 1,26 x 10 -6<br />
Molzahl Digoxigeninlösung x 1,4 1,7x10 -6<br />
Digoxigeninlösung 55 µl<br />
Tab. 4 Berechnungsschema für Markierungsreagens<br />
• Naßblotkammer TRANS- BLOT (Bio Rad, München)<br />
• PVDF - Membran Immobilon P bzw. Immobilin P SQ (Milipore, Eschborn)<br />
• Filterpapier 0,3 mm, Typ 4369, 460 * 570 mm (Schleicher + Schüll, Deutschland)<br />
• Flachspatel, 24 cm (Roth, Karlsruhe)<br />
• Pinzette, fein (Aesculap- Werke, Waiblingen), Griff - Flächen mit Silikonschlauch geschützt
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