Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 32<br />
nung nach zwei Parametern erreicht, wodurch unterschiedliche <strong>Protein</strong>e mit gleichem<br />
Molekulargewicht unterschieden werden können. Bei <strong>der</strong> isoelektrischen Fokussierung<br />
(IEF) bildet eine in einer Acrylamidgelmatrix enthaltene Mischung nie<strong>der</strong>molekularer<br />
Trägerampholyte nach Anlegen einer Spannung einen stabilen pH- Gradienten aus, in<br />
dem sich die amphoteren <strong>Protein</strong>e nach Erreichen ihres isoelektrischen Punktes in en-<br />
gen stationären Banden konzentrieren. Als Trennprinzip wird die Tatsache ausgenutzt,<br />
dass die Mobilität <strong>der</strong> <strong>Protein</strong>e an ihrem isoelektrischen Punkt annähernd null ist.<br />
2.3.3.1 Materialien und Lösungen<br />
• IEF Elektrophoresekammer Typ 155 (Bio Rad, München)<br />
• Glasröhrchen 150 mm lang, 1,5 mm Innendurchmesser (Bio Rad, München)<br />
• Ampholines pH 3,5-10 (40% -ige Lösung; Fluka)<br />
• Kanüle 180 mm lang, 22 Gauche (Fluka)<br />
• Einwegspritze 5 ml (Bekton - Dickesson)<br />
• IEF - Standard 2 mg/ml Cytochrom C in IEF Probenpuffer<br />
• IEF - Probenpuffer 9,5 M Harnstoff<br />
2% w/v Triton X 100<br />
2% v/v Ampholines pH 3,5-10<br />
Aqua bidest.<br />
• IEF-Acrylamidlsg. 28,38% w/vAcrylamid<br />
1,62% w/v N,N-Methylenbisacrylamid<br />
Aqua bidest. ad 100%<br />
• Triton X 100 Lsg. 10% w/v Triton X 100<br />
• Gelüberschichtungslsg. 8 M Harnstoff<br />
• Probenüberschichtungslsg. 1,75 M Harnstoff<br />
1,25% Triton X 100<br />
Aqua bidest. ad 100%<br />
• Anodenpuffer 25 mM (3,33 g/l) Asparaginsäure<br />
25 mM (3,68 g/l) Glutaminsäure<br />
• Kathodenpuffer 570 mM (120 ml/l) Ethylendiamin<br />
25 mM (4,35 g/l) Arginin<br />
25 mM (3,65 g/l) Lysin<br />
• IEF-Gelmischung 2,76g Harnstoff<br />
1 ml Triton X 100 Lsg<br />
0,66 ml IEF-Acrylamidlsg.<br />
0,25 ml Ampholines<br />
7 µl Temed<br />
Aqua bidest. ad 5 ml<br />
10 µl APS - Lösung (kurz vor dem Gießen hinzugeben)<br />
2.3.3.2 Vorbereitungen<br />
Alle Lösungen wurden vor Versuchsbeginn gründlich entgast. Die gründlich gesäuberten<br />
Glasröhrchen wurden an einem Ende mit Parafilm verschlossen und vertikal in einer