Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 31<br />
2.3.2.3 Vorbereitungen<br />
An den nicht ausgeschnitten Seiten zwischen zwei Glasplatten wurden je drei Abstands-<br />
halter positioniert, <strong>der</strong> Kontaktbereich zwischen Glasplatte und Abstandshalter durch<br />
dünnes Auftragen von Vaseline abgedichtet und mit Hilfe von Metallklammern fixiert. In<br />
den Hohlraum zwischen die Glasplatten konnten nun die Polyacrylamid - Gellösungen<br />
gegossen werden. Nach Ansetzen <strong>der</strong> benötigten Menge an Gellösung wurde kurz vor<br />
dem Gießen APS 10% als Starter <strong>der</strong> Polymerisierungsreaktion zugesetzt und die Lösung<br />
gut durchmischt.<br />
Nach Zugabe von APS - Lösung zur angesetzten Sammelgellösung wurde die Geltasche<br />
gefüllt und <strong>der</strong> Probenkamm sorgfältig positioniert. Nach einer Polymerisationsdauer<br />
von mindestens einer Stunde wurde <strong>der</strong> Probenkamm vorsichtig entfernt und die Ta-<br />
schen mit Aqua bidest. gespült.<br />
Vor dem Einsetzen des vorbereiteten Flachgels in die Elektrophoresekammer wurde <strong>der</strong><br />
untere Spacer entfernt und verbleibende Vaseline <strong>im</strong> entstandenen Spalt entfernt. Nun<br />
wurden die Kammern mit Elektrophoresepuffer gefüllt und verbleibende Luft <strong>im</strong> Spalt<br />
o<strong>der</strong> den Probentaschen mit Hilfe einer abgewinkelten Kanüle und einer Einwegspritze<br />
entfernt, um eine gleichmäßige Ausbreitung des elektrischen Feldes zu ermöglichen.<br />
2.3.2.4 Durchführung <strong>der</strong> Gelelektrophorese<br />
Der Probenpuffer wurden mit 1ml Bromphenol - Blau versetzt, um zum einen eine visu-<br />
elle Kontrolle be<strong>im</strong> Auftragen <strong>der</strong> Proben zu gewährleisten als auch den Fortgang <strong>der</strong> E-<br />
lektrophorese beobachten zu können. Die Proben wurden mit Hilfe einer Hamiltonkanü-<br />
le aufgetragen, dass max<strong>im</strong>ale Endvolumen <strong>der</strong> Proben betrug 100 ml. Die Elektropho-<br />
rese wurde bis zum Erreichen <strong>der</strong> Proben in das Trenngel bei 40 mA durchgeführt, an-<br />
schließend wurde die Stromstärke auf 6 bis 8 mA bei Glycin -, bzw. auf 10-15 mA bei<br />
Tricin- Gelen reduziert und das Gel über Nacht laufen gelassen. Die Elektrophorese<br />
wurde beendet, wenn <strong>der</strong> Farbstoff den unteren Rand des Gels erreicht hatte.<br />
2.3.3 Zweid<strong>im</strong>ensionale Gelelektrophorese<br />
Die zweid<strong>im</strong>ensionale Gelelektrophorese nach O´Farrell [94] ist eine hochauflösende<br />
Trennmethode für <strong>Protein</strong>e. Zusätzlich zur Trennung nach dem Molekulargewicht wird<br />
eine Trennung nach dem isoelektrischen Punkt vorgeschaltet. Hierdurch wird eine Tren-