Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 29<br />
2.3.2 Eind<strong>im</strong>ensionale SDS - Polyacrylamid Gelelektrophorese<br />
Bei <strong>der</strong> 1D-SDS-Page werden <strong>Protein</strong>e unter denaturierenden Bedingen nach ihrem Mo-<br />
lekulargewicht aufgetrennt. Durch die Bindung von Natriumdodecylsulfat (SDS ,H3C-<br />
(CH2)10-CH2OSO3 - Na +) werden die <strong>Protein</strong>e denaturiert, da SDS alle nicht kovalenten<br />
Wechselwirkungen in nativen <strong>Protein</strong>en zerstört. Die SDS - Anionen binden sich an die<br />
Hauptketten, etwa ein SDS - Molekül pro zwei Aminosäurereste, so dass ein Komplex<br />
aus denaturiertem <strong>Protein</strong> und SDS entsteht. Die stark negative Ladung des <strong>Protein</strong>s ist<br />
dank seiner Masse proportional. Die erworbene negative Ladung ist zumeist wesentlich<br />
größer als die ursprüngliche Ladung des <strong>Protein</strong>s, so dass seine Ladung vernachlässigt<br />
werden kann. Somit hängt die Wan<strong>der</strong>ungsgeschwindigkeit nur noch von <strong>der</strong> Moleku-<br />
largröße bzw. <strong>der</strong> Anzahl SDS - vermittelter Ladungen und <strong>der</strong> Porengröße des Gels ab.<br />
Des weiteren ist die elektrophoretische Beweglichkeit vieler <strong>Protein</strong>e in SDS - Polyacry-<br />
lamidgelen dem Logarithmus ihrer Masse proportional [92 a - f].<br />
Um <strong>im</strong> nie<strong>der</strong>molekularen Bereich zwischen 1-100 kD eine bessere Auftrennung zu er-<br />
halten, wurde zusätzlich zum Glycin – System nach Lämmli das Tricin – System einge-<br />
setzt. Dieses wird durch den Einsatz des Leitions Tricin und ein diskontinuierliches Puf-<br />
fersystem erreicht [93].<br />
2.3.2.1 Materialien und Lösungen<br />
• Flachgelkammern, Anfertigung nach Institutserfor<strong>der</strong>nissen (Keuz, Reiskirchen)<br />
• 2 Glasplatten 165 * 150 mm, eine mit einem Ausschnitt von 120*20 mm an <strong>der</strong> schmalen Seite<br />
• Abstandshalter (Spacer) aus Kunststoff (170 * 12 mm; 1,5 mm o<strong>der</strong> 1,0 mm dick)<br />
• Probenkamm, Teflon, 120 mm breit, 12 Probentaschen à 100µl<br />
• Metallklammern (Roth, Karlsruhe)<br />
• Vaseline (Roth, Karlsruhe)<br />
• Elektrodenpuffer Glycin 4x 60 g Tris<br />
288 g Glycin<br />
100 ml SDS 20% (20 g)<br />
ad 5 l, eingestellt auf pH 8,5<br />
• Anodenpuffer Tricin 0,2 M Tris (24,23 g/l)<br />
ad 1 l, mit konz. HCl auf pH 8,9 eingestellt<br />
• Kathodenpuffer Tricin 0,1 M Tris (12,11 g/l)<br />
0,1 M Tricin (17,92 g/l)<br />
0,1 M SDS (5 ml 20 % SDS-Lsg. / 1000 ml)<br />
ad 1 l, pH beträgt 8,25<br />
• Lösung A 3 M (366 g/l) Tris<br />
48 % (v/v) 1 N HCl (480 ml/l)<br />
eingestellt auf pH 8,5<br />
• Lösung B 3,0 M Tris (36,34 g/ 100 ml)