Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 97<br />
Die Dendritischen Zellen zeigen ein ähnliches Aufnahmeverhalten wie die γ -Interferon<br />
Abb. 23 <strong>Prozessierung</strong> von FITC – OVA durch DC´s und GM-CSF - M∅<br />
KM-Zellen wurden für 8 Tage in <strong>der</strong> Gegenwart von 2ng rmGM-CSF kultiviert. Nach <strong>der</strong> Zellernte<br />
erfolgte eine Zellseparation mittels Magnetbeadselektion. Es wurden 5x10 5 DC und 1x10 6 Zellen<br />
<strong>der</strong> Restpopulation eingesetzt und in 24 Well Platten umgesetzt. Die Antigenzugabe von 25µg<br />
FITC-OVA erfolgte für die angegebene Zeitdauer. Nach Ablauf <strong>der</strong> Inkubationszeiten wurde die<br />
Zellsolubilisierung in den Platten durchgeführt. Die Solubilisate wurden in <strong>der</strong> SDS-PAGE<br />
aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Nachweis <strong>der</strong> Fragmente<br />
erfolgte durch Fluoreszenzaktivierung, die Signale wurden mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet.<br />
Die Blots wurden densitometrisch ausgewertet. Es wurden für jede Bande 4080 Pixel (0,1 inch 2 )<br />
vermessen und <strong>der</strong> durchschnittliche Grauwert gegenüber <strong>der</strong> Zeit aufgetragen. Auf <strong>der</strong> Abzisse<br />
ist die Inkubationsdauer, auf <strong>der</strong> Ordinate <strong>der</strong> mittlere Grauwert <strong>der</strong> Banden mit einem<br />
Molekulargewicht von 50 kD (blau), 40 kD (pink) und 30 kD (grün) aufgetragen.<br />
A: Dendritische Zellen; B: GM – CSF M∅<br />
st<strong>im</strong>ulierten Makrophagen. Erste Abbauprodukte mit einem Molekulargewicht von 40<br />
kD sind jedoch bereits bei einer Inkubationszeit <strong>der</strong> Zellen mit dem FITC-OVA von 15<br />
min nachweisbar. Das 40 kD Fragment wird mit zunehmen<strong>der</strong> Inkubationszeit stärker<br />
und erreicht ein Max<strong>im</strong>um an Intensität nach einer einstündigen Inkubation. Danach