Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 93<br />
Abb. 22 Einfluß verschiedener <strong>Protein</strong>aseinhibitoren auf die<br />
Antigenprozessierung durch KMM∅<br />
KM-Zellen wurden für 11 Tage in <strong>der</strong> Gegenwart von M-CSF kultiviert. An Tag 10 wurden die<br />
Zellen in einer Dichte von 1x10 6 Zellen/ml in 24 Well-Platten umgesetzt. Die St<strong>im</strong>ulation mit LPS<br />
bzw. γ-INF erfolgte von Tag 8 an und wurde bis zur Zellsolubilisierung durchgeführt. Zusätzlich<br />
wurden die Zellen vor Versuchsablauf für 20h mit den angegeben Inhibitoren vorinkubiert. Die<br />
Antigenzugabe von 25µg FITC-OVA erfolgte für 4h. Nach Ablauf <strong>der</strong> Inkubationszeit wurde die<br />
Zellsolubilisierung in den Platten durchgeführt. Die Solubilisate wurden in <strong>der</strong> SDS-PAGE<br />
aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Nachweis <strong>der</strong> Fragmente<br />
erfolgte durch Fluoreszenzaktivierung, die Signale wurden mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet.<br />
A=unst<strong>im</strong>ulierte M∅; B= LPS – St<strong>im</strong>ulation für 72h,1µg/ml; C= St<strong>im</strong>ulation mit 20U rrγ-IFN für<br />
72h<br />
1=200µg/ml E-64, 2=100µg/ml E-64, 3=30µg/ml E-64, 4=100µg/ml Pepstatin A, 5= 20 µg/ml<br />
Pepstatin A,6=400µg/ml Leupeptin,7=20µg/ml Leupeptin,8=5µg/ml CAT3,9=1µg/ml CAT3,<br />
10=0 7µg/ml CAT3