Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 88<br />
Um Hinweise auf die an <strong>der</strong> Antigenprozessierung beteiligten Enzyme zu erhalten, wurde<br />
die Kinetikanalyse unter dem Einfluss des Aspartat- <strong>Protein</strong>aseinhibitors Pepstatin A<br />
durchgeführt. Pepstatin A inhibiert die lysosomalen <strong>Protein</strong>asen Kathepsin D und E. Die<br />
Wirksamkeit des <strong>Protein</strong>aseinhibitors unter den gewählten Bedingungen ist in [126] be-<br />
schrieben worden. Bei <strong>der</strong> eingesetzten Konzentration sind keine toxischen Nebenwir-<br />
kungen festzustellen. Ein Einfluss auf die generierten FITC-OVA Peptide durch den Pro-<br />
teinaseinhibitor Pepstatin A konnte jedoch bei keinem Aktivierungszustand <strong>der</strong> Kno-<br />
chenmarksmakrophagen festgestellt werden. Die Fragmente st<strong>im</strong>men vom Molekularge-<br />
wicht her mit den ohne Einfluss des Inhibitors entstandenen überein. Es konnten nur<br />
Abbau - Fragmente von FITC-OVA mit einem Molekulargewicht von 40 kD und 30 kD<br />
nachgewiesen werden.<br />
Wie die Kinetikanalyse in Abb. 20 A für unst<strong>im</strong>ulierte Knochenmarksmakrophagen zeigt,<br />
ist keinerlei Einfluss des <strong>Protein</strong>aseinhibitors Pepstatin A feststellbar. Auch hier sind<br />
Abbaufragmente mit einem Molekulargewicht von 40 kD bereits nach einer halben<br />
Stunde messbar. Mit Zunahme <strong>der</strong> Antigen- Inkubationsdauer n<strong>im</strong>mt die Signalstärke<br />
dieses Fragments leicht ab. Das Max<strong>im</strong>um des Signals liegt bei einem Antigenpulse von<br />
fünfzig Minuten, danach n<strong>im</strong>mt die Stärke wie<strong>der</strong> ab. Nach einer sechzigminütigem In-<br />
kubationsdauer kann das 30 kD Fragment nachgewiesen werden. Die Signalstärke die-<br />
ses Fragments n<strong>im</strong>mt mit zunehmen<strong>der</strong> Inkubationsdauer leicht ab. Fragmente mit<br />
niedrigerem Molekulargewicht sind nicht nachweisbar.<br />
Gegenüber den ohne Inhibitor behandelten LPS- st<strong>im</strong>ulierten Makrophagen ist das 40<br />
kD Fragment bereits nach einer Inkubationsdauer von zwanzig Minuten nachweisbar<br />
(Abb.20 B). Die Signalstärke dieses Fragments n<strong>im</strong>mt mit zunehmen<strong>der</strong> Antigenpulse-<br />
Dauer kontinuierlich zu. Ein Max<strong>im</strong>um wird nach vierstündigem Pulse erreicht, eine<br />
weitere Zunahme nach längerer <strong>Protein</strong>gabe ist nicht messbar. Das 30 kD Fragment ist<br />
nach sechzig Minuten nachweisbar, mit zunehmen<strong>der</strong> Dauer <strong>der</strong> Antigengabe n<strong>im</strong>mt<br />
das Signal leicht zu.<br />
Ein Effekt des <strong>Protein</strong>aseinhibitors Pepstatin A auf die Kinetik <strong>der</strong> Antigenprozessierung<br />
ist auch bei den mit γ- Interferon st<strong>im</strong>ulierten Knochenmarksmakrophagen messbar<br />
(Abb. 20 C). Das 40 kD Abbaufragment ist nach fünfzig Minuten nachweisbar, die Sig-<br />
nalstärke n<strong>im</strong>mt bis zum Max<strong>im</strong>um bei 240 Minuten zu. Das 30 kD Fragment ist erst<br />
nach vier Stunden nachweisbar.