Quantitative Proteinbestimmung Ziele: − Prinzip einer ...

BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche Proteinbestimmung Biuret
Stand 29.11.08 ©HL Seite 4 von 6
Biuret-Reaktion (Nachweis der Peptidbindung)
Prinzip:
Die Biuret-Reaktion ist spezifisch für alle Substanzen mit zwei oder mehr Peptidbindungen. Die
Reaktion ist nach der Verbindung Biuret (H2N-CO-NH-CO-NH2) benannt, die sich leicht beim
trockenen Erhitzen von Harnstoff bildet.
In Proteinen wird mit dieser Reaktion somit die Konzentration an Peptidbindungen (geknüpft
zwischen der -Carboxylgruppe und der -Aminogruppe zweier Aminosäuren) gemessen.
Biuret-positive Substanzen ergeben mit Cu 2+ -Salzen (in alkalischer Lösung unter Zusatz von
Tartrat- und Jodidionen zur Stabilisierung) einen rot- bis blauvioletten Farbkomplex, dessen
Farbintensität bei 540 nm fotometrisch bestimmt werden kann.
Aus der Struktur des Komplexes ergibt sich, dass bei Einsatz
verschiedener Proteine gleicher Konzentration nur eine sehr
geringe Variation in der Farbintensität auftreten kann.
Allerdings ist die Empfindlichkeit der Reaktion gering.
Für eine Bestimmung werden ca. 1 - 10 mg Protein benötigt.
Günstig dagegen ist die hohe Spezifität der Reaktion. Neben
Proteinen werden lediglich Peptide erfasst. Die Biuret-Methode
ist in Anwesenheit von Ammonium-Ionen, die tiefblau gefärbte
Cu-Tetramin-Komplexe bilden, nicht einsetzbar. Proteinbestimmungen
in ammoniumsulfathaltigen Proteinfraktionen, die
im Rahmen von Anreicherungsexperimenten anfallen, dürfen
somit nicht direkt mit dieser Methode durchgeführt werden. Tris- und Good’s Puffersubstanzen
stören den Test ebenfalls.
In solchen Fällen ist zunächst eine Proteinfällung (s.u.) vorzunehmen. Im alkalischen Milieu des
Biuret-Tests lösen sich Proteinniederschläge rasch auf, so dass nach einer Fällung und anschließendem
Waschen des Präzipitats der Test direkt mit dem Pellet durchgeführt werden kann.
Die Reproduzierbarkeit der Methode ist bei Einhaltung der Rahmenbedingungen sehr gut.
Biuret-Reagenz:
Das Biuret-Reagenz ist eine Mischung von Kaliumnatriumtartrat, Kupfersulfat und Kaliumjodid,
die in der angegebene Reihenfolge in Natronlauge gelöst werden.
Die molaren Konzentrationen der fertigen Lösung sind:
32mM K-Na-Tartrat, 12mM CuSO4, 30mM KJ, 200mM NaOH.
100ml herstellen und dunkel aufbewahren.
Test-Durchführung: (i.d.R. in 2ml Reaktionsgefäßen)
Zu 0,4ml einer Probe (0,5 - 5mg Protein enthaltend) 1,5ml Biuret-Reagens geben. Mischen.
Proben und ein Leerwert/Blindprobe (statt Proteinlösung, 0,4ml Lösungsmittel einsetzen)
in Halbmikroküvetten(d = 1cm) umfüllen und 30min bei Raumtemperatur stehen lassen.
Extinktion (Absorption) gegen den Leerwert bei 540nm messen.
Proteinfällung vor dem Biuret-Test: (i.d.R. in 2ml Reaktionsgefäßen)
Benötigt wird 3M TCA-Lösung (24,5g Trichloressigsäure auf 50ml mit A.dest.).
0,4ml Proteinlösung (0,5 - 5mg enthaltend) mit 0,1ml 3M TCA-Lösung versetzen, gut mischen,
10min auf Eis stehen lassen, kurz vortexen, 5 min bei max. speed abzentrifugieren, den Zentrifugationsüberstand
mit einer ausgezogenen Pasteurpipette möglichst vollständig abnehmen und
verwerfen.
Das Präzipitat in 0,4ml A.dest. resuspendieren und das Farbreagenz zugeben. Nach der vollständigen
Auflösung des Präzipitats noch einmal gut mischen!
Die Kalibrierkurve ist entsprechend zu erstellen!