Quantitative Proteinbestimmung Ziele: − Prinzip einer ...
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BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche <strong>Proteinbestimmung</strong> Biuret<br />
Stand 29.11.08 ©HL Seite 2 von 6<br />
Da in dieser Lehrerfortbildung nur die Biuret-Methode durchgeführt werden soll, hier zu den<br />
anderen o.g. Methoden noch einige Anmerkungen:<br />
Lowry-Test<br />
Cu + -Ionen aus der Biuret-Reaktion (siehe dort) bilden mit dem Folin-Ciocalteau Reagenz einen<br />
instabilen blauen Komplex, der als Maß der Proteinkonzentration dient.<br />
Vorteile: ein altehrwürdiges Verfahren.<br />
Nachteile: Der «Lowry» macht viel Pipettierarbeit und wird durch viele Pufferbestandteile gestört,<br />
so durch Mercaptoethanol, Hepes, Triton-X-100 und andere Seifen (fallen aus). Es empfiehlt<br />
sich daher, das Protein der Proben auszufällen und den Lowry mit dem Proteinpellet<br />
durchzuführen. Die Reagenzien müssen, außer dem Folin-Ciocalteau Reagenz (Merck), selbst<br />
hergestellt werden. Die Vergleichbarkeit zwischen den Lowry-Proteinwerten verschiedener Labors<br />
ist schlecht, denn jedes Labor führt den Test mit kleinen Änderungen durch.<br />
Bradford-Test<br />
Bei der Bindung des Farbstoffs Coomassie brilliant blue G-250 an Proteine verschiebt sich das<br />
Absorptionsmaximum von 465nm ohne Protein auf 595nm bis 620nm mit Protein in Abhängigkeit<br />
vom Farbstoffanteil der stabilen blauen Protein-Farbstoffkomplexe. I.d.R. wird bei 595nm<br />
gemessen, die Zunahme der Absorption ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Probe.<br />
Vorteile: geringe Pipettierarbeit, rasch (die Farbentwicklung ist nach 2 min beendet.) und sensitiv<br />
(Empfindlichkeit ähnlich der Lowry-Methode, linearer Bereich 5 bis 50 µg Protein).<br />
Viele Substanzen, welche die Folin-Reaktion stören (vor allem Reduktionsmittel), zeigen k<strong>einer</strong>lei<br />
Einfluss.<br />
Nachteile: Die Reaktion läuft in saurem Milieu ab, in dem viele Proteine ausfallen. Spätestens<br />
nach 20min sollten alle Proben gemessen sein.<br />
Es stören Detergenzien, z. B. SDS oder Triton, aber auch Neutralsalze wie (NH4)2S04.<br />
Der größte Nachteil ist in den beträchtlichen Extinktionsdifferenzen zu sehen, die man erhält,<br />
wenn gleiche Mengen verschiedener Proteine eingesetzt werden.<br />
BCA-Test<br />
Protein bildet mit Cu 2+ -Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu 2+ -<br />
Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu + -Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure<br />
(BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.<br />
Vorteile: Der Test ist schnell (dauert 10 min bei 65°C), empfindlich (Nachweisgrenze 0,5 g<br />
Protein) und resistent gegen Seifen wie Triton-X-100. Die Reaktion läuft im alkalischen Milieu<br />
ab, bei dem fast alle Proteine in Lösung bleiben. Die Reagenzien sind im Handel erhältlich und<br />
geben wunderschöne Farben.<br />
Nachteile: Es stören hohe Konzentrationen von komplexbildenden Reagenzien (z.B. EDTA);<br />
des weiteren Ammoniumsulfat, N-Acetylglucosamin, Glycin, reduzierende Stoffe wie Glucose,<br />
DTT oder Sorbitol und eine Reihe von Pharmaka wie Chlorpromazin, Penicillin und Vitamin C.<br />
Extinktionsmessungen bei 280nm<br />
Verbindungen, die aromatische Ringsysteme enthalten, absorbieren auf Grund der leichten Anregbarkeit<br />
von -Elektronensystemen Licht im Wellenlängenbereich zwischen 260 und 280nm<br />
Dies gilt somit auch für Proteine, bei denen die Absorption vornehmlich durch den Gehalt an<br />
Tyrosin und Tryptophan bestimmt wird.<br />
Vorteile: Schnell, ohne nennenswerten Arbeitsaufwand. Protein verbleibt nativ.<br />
Weit verbreitet sind Messungen bei 280nm zur kontinuierlichen Registrierung des Proteingehaltes<br />
(Durchflussfotometer) in den Eluaten nach säulenchromatographischen Trennungen.<br />
Nachteile: Da verschiedene Proteine sehr unterschiedlichen Gehalt an aromatischen Aminosäuren<br />
haben können, ist die Methode nur zur groben Abschätzung des Proteingehaltes geeignet.<br />
Alle niedermolekularen aromatischen Verbindungen verursachen Störungen. Bei Nutzung der