Quantitative Proteinbestimmung Ziele: − Prinzip einer ...

BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche Proteinbestimmung Biuret
Stand 29.11.08 ©HL Seite 2 von 6
Da in dieser Lehrerfortbildung nur die Biuret-Methode durchgeführt werden soll, hier zu den
anderen o.g. Methoden noch einige Anmerkungen:
Lowry-Test
Cu + -Ionen aus der Biuret-Reaktion (siehe dort) bilden mit dem Folin-Ciocalteau Reagenz einen
instabilen blauen Komplex, der als Maß der Proteinkonzentration dient.
Vorteile: ein altehrwürdiges Verfahren.
Nachteile: Der «Lowry» macht viel Pipettierarbeit und wird durch viele Pufferbestandteile gestört,
so durch Mercaptoethanol, Hepes, Triton-X-100 und andere Seifen (fallen aus). Es empfiehlt
sich daher, das Protein der Proben auszufällen und den Lowry mit dem Proteinpellet
durchzuführen. Die Reagenzien müssen, außer dem Folin-Ciocalteau Reagenz (Merck), selbst
hergestellt werden. Die Vergleichbarkeit zwischen den Lowry-Proteinwerten verschiedener Labors
ist schlecht, denn jedes Labor führt den Test mit kleinen Änderungen durch.
Bradford-Test
Bei der Bindung des Farbstoffs Coomassie brilliant blue G-250 an Proteine verschiebt sich das
Absorptionsmaximum von 465nm ohne Protein auf 595nm bis 620nm mit Protein in Abhängigkeit
vom Farbstoffanteil der stabilen blauen Protein-Farbstoffkomplexe. I.d.R. wird bei 595nm
gemessen, die Zunahme der Absorption ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Probe.
Vorteile: geringe Pipettierarbeit, rasch (die Farbentwicklung ist nach 2 min beendet.) und sensitiv
(Empfindlichkeit ähnlich der Lowry-Methode, linearer Bereich 5 bis 50 µg Protein).
Viele Substanzen, welche die Folin-Reaktion stören (vor allem Reduktionsmittel), zeigen keinerlei
Einfluss.
Nachteile: Die Reaktion läuft in saurem Milieu ab, in dem viele Proteine ausfallen. Spätestens
nach 20min sollten alle Proben gemessen sein.
Es stören Detergenzien, z. B. SDS oder Triton, aber auch Neutralsalze wie (NH4)2S04.
Der größte Nachteil ist in den beträchtlichen Extinktionsdifferenzen zu sehen, die man erhält,
wenn gleiche Mengen verschiedener Proteine eingesetzt werden.
BCA-Test
Protein bildet mit Cu 2+ -Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu 2+ -
Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu + -Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure
(BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.
Vorteile: Der Test ist schnell (dauert 10 min bei 65°C), empfindlich (Nachweisgrenze 0,5 g
Protein) und resistent gegen Seifen wie Triton-X-100. Die Reaktion läuft im alkalischen Milieu
ab, bei dem fast alle Proteine in Lösung bleiben. Die Reagenzien sind im Handel erhältlich und
geben wunderschöne Farben.
Nachteile: Es stören hohe Konzentrationen von komplexbildenden Reagenzien (z.B. EDTA);
des weiteren Ammoniumsulfat, N-Acetylglucosamin, Glycin, reduzierende Stoffe wie Glucose,
DTT oder Sorbitol und eine Reihe von Pharmaka wie Chlorpromazin, Penicillin und Vitamin C.
Extinktionsmessungen bei 280nm
Verbindungen, die aromatische Ringsysteme enthalten, absorbieren auf Grund der leichten Anregbarkeit
von -Elektronensystemen Licht im Wellenlängenbereich zwischen 260 und 280nm
Dies gilt somit auch für Proteine, bei denen die Absorption vornehmlich durch den Gehalt an
Tyrosin und Tryptophan bestimmt wird.
Vorteile: Schnell, ohne nennenswerten Arbeitsaufwand. Protein verbleibt nativ.
Weit verbreitet sind Messungen bei 280nm zur kontinuierlichen Registrierung des Proteingehaltes
(Durchflussfotometer) in den Eluaten nach säulenchromatographischen Trennungen.
Nachteile: Da verschiedene Proteine sehr unterschiedlichen Gehalt an aromatischen Aminosäuren
haben können, ist die Methode nur zur groben Abschätzung des Proteingehaltes geeignet.
Alle niedermolekularen aromatischen Verbindungen verursachen Störungen. Bei Nutzung der