Quantitative Proteinbestimmung Ziele: − Prinzip einer ...

BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche Proteinbestimmung Biuret
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Quantitative Proteinbestimmung
Ziele:
− Prinzip einer fotometrischen Konzentrationsbestimmung am Bsp. Proteinbestimmung Biuret:
Stammlösung, Eichlösungen, Verdünnungsreihe, denaturierende Proteinfällung, Messbereich,
Kalibriergerade, Proteinbestimmung einer unbekannten Probe
− Sicherer Umgang mit einem Spektralfotometer
Vorbemerkungen:
Die quantitative Bestimmung von Proteinen ist eine der wichtigsten und am häufigsten durchgeführten
Arbeitsoperationen in einem biochemischen Labor:
• Die Wirksamkeit eines Zellaufschlusses ist nach Abtrennung der Zelltrümmer ausschließlich
auf der Basis des Proteingehaltes im zellfreien Extrakt zu bewerten.
• Die Beurteilung der Anreicherung von einzelnen Proteinen aus solchen Rohextrakten durch
Fällung, Dialyse und Chromatographie ist ohne eine quantitative Proteinbestimmung nach
jeder Operation nicht vorstellbar.
• Die Proteinkonzentration ist die wichtigste Bezugsgröße für die enzymatische Aktivität. Bei
Bezug der Reaktionsgeschwindigkeit (Enzymaktivität) auf den Proteingehalt in mg erhält
man die spezifische Aktivität, bei Bezug auf die molare Protein(Enzym)-Konzentration, was
saubere Präparate und die Kenntnis der Molmasse voraussetzt, die Wechselzahl des Enzyms.
Quantitative Proteinbestimmungen werden seit mehr als 70 Jahren durchgeführt. Die hierfür
entwickelten Methoden sind zahlreich. Sie wurden, dem biochemischen Erkenntnisstand und der
aktuellen Gerätetechnik angepasst, im Laufe der Zeit empfindlicher und spezifischer. Die Methoden
sind heute fast so vielgestaltig wie die Proteine selbst. Trotzdem ist keine Technik in der
Lage, alle Aufgabenstellungen zu lösen. Welche Methode genutzt werden kann, hängt von der
Spezifik des Einsatzgebietes, von der verfügbaren Proteinmenge und von der vorhandenen Gerätetechnik
ab. Alle bisher bekannten Bestimmungsmethoden können auf die Nutzung von vier
grundsätzlich verschiedenen Proteineigenschaften zurückgeführt werden:
- Vorhandensein von Peptidbindungen
- Reaktivität von Gruppen in Aminosäureseitenketten
- Kolloidcharakter
- Ligandbindungsvermögen.
Viele Verfahren eignen sich gleichzeitig zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von
Aminosäuren und Peptiden. Grundsätzlich lassen sich alle Methoden, die zur Bestimmung von
Aminosäuren entwickelt wurden, auch zu Proteinbestimmungen einsetzen. In der Praxis am häufigsten
für die quantitative Proteinbestimmung genutzt wurden bisher die Biuret- und die Lowry-
Methode sowie die direkte spektrale Erfassung im Wellenlängenbereich um 280 nm. In den letzten
Jahren werden die Bradford- und die BCA-Methode zunehmend häufiger angewandt.
Quantitative Proteinbestimmungen ergeben, auch wenn sie ohne jeglichen subjektiven Fehler
durchgeführt werden könnten, Resultate, die nie ganz exakt die wahre Proteinmenge repräsentieren.
Dies liegt am Erfassungsprinzip selbst und wird besonders deutlich, wenn man Proteinlösungen
gleicher Konzentration durch Einwaage verschiedener sauberer Proteine herstellt und
dann den Proteingehalt mit verschiedenen Methoden ermittelt. Es ist daher gute Sitte, zum ermittelten
Konzentrationswert auch den verwendeten Test und das Vergleichsprotein anzugeben.
Vergleich verschiedener quantitativer Proteinbestimmungsmethoden
bei Einsatz gleicher Mengen verschiedener Proteine
(Stammlösungen jeweils 10 mg/m1). Bei den Bestimmungen
nach der Biuret-(weiß) und Lowry-(gestrichelt) Methode diente
Rinderserumalbumin, bei der Messung bei 280 nm(schwarz)
Hefe-ADH als Standard.

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Da in dieser Lehrerfortbildung nur die Biuret-Methode durchgeführt werden soll, hier zu den
anderen o.g. Methoden noch einige Anmerkungen:
Lowry-Test
Cu + -Ionen aus der Biuret-Reaktion (siehe dort) bilden mit dem Folin-Ciocalteau Reagenz einen
instabilen blauen Komplex, der als Maß der Proteinkonzentration dient.
Vorteile: ein altehrwürdiges Verfahren.
Nachteile: Der «Lowry» macht viel Pipettierarbeit und wird durch viele Pufferbestandteile gestört,
so durch Mercaptoethanol, Hepes, Triton-X-100 und andere Seifen (fallen aus). Es empfiehlt
sich daher, das Protein der Proben auszufällen und den Lowry mit dem Proteinpellet
durchzuführen. Die Reagenzien müssen, außer dem Folin-Ciocalteau Reagenz (Merck), selbst
hergestellt werden. Die Vergleichbarkeit zwischen den Lowry-Proteinwerten verschiedener Labors
ist schlecht, denn jedes Labor führt den Test mit kleinen Änderungen durch.
Bradford-Test
Bei der Bindung des Farbstoffs Coomassie brilliant blue G-250 an Proteine verschiebt sich das
Absorptionsmaximum von 465nm ohne Protein auf 595nm bis 620nm mit Protein in Abhängigkeit
vom Farbstoffanteil der stabilen blauen Protein-Farbstoffkomplexe. I.d.R. wird bei 595nm
gemessen, die Zunahme der Absorption ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Probe.
Vorteile: geringe Pipettierarbeit, rasch (die Farbentwicklung ist nach 2 min beendet.) und sensitiv
(Empfindlichkeit ähnlich der Lowry-Methode, linearer Bereich 5 bis 50 µg Protein).
Viele Substanzen, welche die Folin-Reaktion stören (vor allem Reduktionsmittel), zeigen keinerlei
Einfluss.
Nachteile: Die Reaktion läuft in saurem Milieu ab, in dem viele Proteine ausfallen. Spätestens
nach 20min sollten alle Proben gemessen sein.
Es stören Detergenzien, z. B. SDS oder Triton, aber auch Neutralsalze wie (NH4)2S04.
Der größte Nachteil ist in den beträchtlichen Extinktionsdifferenzen zu sehen, die man erhält,
wenn gleiche Mengen verschiedener Proteine eingesetzt werden.
BCA-Test
Protein bildet mit Cu 2+ -Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu 2+ -
Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu + -Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure
(BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.
Vorteile: Der Test ist schnell (dauert 10 min bei 65°C), empfindlich (Nachweisgrenze 0,5 g
Protein) und resistent gegen Seifen wie Triton-X-100. Die Reaktion läuft im alkalischen Milieu
ab, bei dem fast alle Proteine in Lösung bleiben. Die Reagenzien sind im Handel erhältlich und
geben wunderschöne Farben.
Nachteile: Es stören hohe Konzentrationen von komplexbildenden Reagenzien (z.B. EDTA);
des weiteren Ammoniumsulfat, N-Acetylglucosamin, Glycin, reduzierende Stoffe wie Glucose,
DTT oder Sorbitol und eine Reihe von Pharmaka wie Chlorpromazin, Penicillin und Vitamin C.
Extinktionsmessungen bei 280nm
Verbindungen, die aromatische Ringsysteme enthalten, absorbieren auf Grund der leichten Anregbarkeit
von -Elektronensystemen Licht im Wellenlängenbereich zwischen 260 und 280nm
Dies gilt somit auch für Proteine, bei denen die Absorption vornehmlich durch den Gehalt an
Tyrosin und Tryptophan bestimmt wird.
Vorteile: Schnell, ohne nennenswerten Arbeitsaufwand. Protein verbleibt nativ.
Weit verbreitet sind Messungen bei 280nm zur kontinuierlichen Registrierung des Proteingehaltes
(Durchflussfotometer) in den Eluaten nach säulenchromatographischen Trennungen.
Nachteile: Da verschiedene Proteine sehr unterschiedlichen Gehalt an aromatischen Aminosäuren
haben können, ist die Methode nur zur groben Abschätzung des Proteingehaltes geeignet.
Alle niedermolekularen aromatischen Verbindungen verursachen Störungen. Bei Nutzung der

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Methode zur Proteinbestimmung in Rohextrakten muss berücksichtigt werden, dass diese in der
Regel beträchtliche Mengen an Nucleinsäuren enthalten, die ebenfalls in diesem Spektralbereich
absorbieren. (OD-Messung bei 260nm zur Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren) .
Annähernd gilt: Protein (mg/ml) =1,55 x E280 –0,76 x E260.
Hinweis: Für fotometrische Messungen im UV-Bereich sind Quarzküvetten bzw. spezielle UV-
Kunststoffküvetten zu verwenden!

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Biuret-Reaktion (Nachweis der Peptidbindung)
Prinzip:
Die Biuret-Reaktion ist spezifisch für alle Substanzen mit zwei oder mehr Peptidbindungen. Die
Reaktion ist nach der Verbindung Biuret (H2N-CO-NH-CO-NH2) benannt, die sich leicht beim
trockenen Erhitzen von Harnstoff bildet.
In Proteinen wird mit dieser Reaktion somit die Konzentration an Peptidbindungen (geknüpft
zwischen der -Carboxylgruppe und der -Aminogruppe zweier Aminosäuren) gemessen.
Biuret-positive Substanzen ergeben mit Cu 2+ -Salzen (in alkalischer Lösung unter Zusatz von
Tartrat- und Jodidionen zur Stabilisierung) einen rot- bis blauvioletten Farbkomplex, dessen
Farbintensität bei 540 nm fotometrisch bestimmt werden kann.
Aus der Struktur des Komplexes ergibt sich, dass bei Einsatz
verschiedener Proteine gleicher Konzentration nur eine sehr
geringe Variation in der Farbintensität auftreten kann.
Allerdings ist die Empfindlichkeit der Reaktion gering.
Für eine Bestimmung werden ca. 1 - 10 mg Protein benötigt.
Günstig dagegen ist die hohe Spezifität der Reaktion. Neben
Proteinen werden lediglich Peptide erfasst. Die Biuret-Methode
ist in Anwesenheit von Ammonium-Ionen, die tiefblau gefärbte
Cu-Tetramin-Komplexe bilden, nicht einsetzbar. Proteinbestimmungen
in ammoniumsulfathaltigen Proteinfraktionen, die
im Rahmen von Anreicherungsexperimenten anfallen, dürfen
somit nicht direkt mit dieser Methode durchgeführt werden. Tris- und Good’s Puffersubstanzen
stören den Test ebenfalls.
In solchen Fällen ist zunächst eine Proteinfällung (s.u.) vorzunehmen. Im alkalischen Milieu des
Biuret-Tests lösen sich Proteinniederschläge rasch auf, so dass nach einer Fällung und anschließendem
Waschen des Präzipitats der Test direkt mit dem Pellet durchgeführt werden kann.
Die Reproduzierbarkeit der Methode ist bei Einhaltung der Rahmenbedingungen sehr gut.
Biuret-Reagenz:
Das Biuret-Reagenz ist eine Mischung von Kaliumnatriumtartrat, Kupfersulfat und Kaliumjodid,
die in der angegebene Reihenfolge in Natronlauge gelöst werden.
Die molaren Konzentrationen der fertigen Lösung sind:
32mM K-Na-Tartrat, 12mM CuSO4, 30mM KJ, 200mM NaOH.
100ml herstellen und dunkel aufbewahren.
Test-Durchführung: (i.d.R. in 2ml Reaktionsgefäßen)
Zu 0,4ml einer Probe (0,5 - 5mg Protein enthaltend) 1,5ml Biuret-Reagens geben. Mischen.
Proben und ein Leerwert/Blindprobe (statt Proteinlösung, 0,4ml Lösungsmittel einsetzen)
in Halbmikroküvetten(d = 1cm) umfüllen und 30min bei Raumtemperatur stehen lassen.
Extinktion (Absorption) gegen den Leerwert bei 540nm messen.
Proteinfällung vor dem Biuret-Test: (i.d.R. in 2ml Reaktionsgefäßen)
Benötigt wird 3M TCA-Lösung (24,5g Trichloressigsäure auf 50ml mit A.dest.).
0,4ml Proteinlösung (0,5 - 5mg enthaltend) mit 0,1ml 3M TCA-Lösung versetzen, gut mischen,
10min auf Eis stehen lassen, kurz vortexen, 5 min bei max. speed abzentrifugieren, den Zentrifugationsüberstand
mit einer ausgezogenen Pasteurpipette möglichst vollständig abnehmen und
verwerfen.
Das Präzipitat in 0,4ml A.dest. resuspendieren und das Farbreagenz zugeben. Nach der vollständigen
Auflösung des Präzipitats noch einmal gut mischen!
Die Kalibrierkurve ist entsprechend zu erstellen!

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Durchführung:
Es soll die Konzentration einer Rinderserumalbumin (BSA, Albumin-Fraktion V) –Lösung
bestimmt werden, deren Konzentration im Messbereich des Biuret-Tests liegt.
Hinweis: Eine „Unbekannte“ wird immer mindestens in Doppelbestimmung gemessen.
Es sollen zwei Messreihen durchgeführt werden:
Messreihe 1, ohne Fällung: 10 Standards, gleichmäßig über den Messbereich verteilt.
Die erforderlichen Teilvolumina aus der Stammlösung entnehmen und auf 0,4ml mit A.dest.
ergänzen.
Messreihe 2, mit Fällung: 5 von den in Messreihe 1 festgelegten Verdünnungen auswählen,
je zweimal (Doppelbestimmung) herstellen und vor dem Biuret-Test die oben beschriebene
Fällung durchführen.
• Biuret-Reagenz herstellen (Angaben s.o.).
• Pipettiertabelle für die Herstellung der Standards erstellen:
Aus der Testdurchführung Messbereich in mg/ml definieren.
ß (Stammlösung) entspricht oberer Messbereichsgrenze
RG-Nr. ß (mg/0,4ml) ß (mg/ml) VStamml. (µl) VA.dest (µl) Reihe 2
1 5
2
3
4
5
6
7
8
9
10
----------------
-
----------------
-
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-
----------------
-
----------------
-
• Für die o.a. zwei Messreihen den Bedarf an Protein (BSA V) kalkulieren und
ausreichendes Volumen Stammlösung herstellen.
Hinweis: generelle Mindesteinwaage 50mg, ß-Konz. sind normalerweise in Messkolben herzustellen,
hier ohne große Fehler Zugabe des Endvolumens mit Pipette möglich.
Benötigtes Protein direkt in Falcon-Tubes, 15ml, einwiegen.
Schaumbildung beim Lösen kann durch Zentrifugieren entfernt werden.
• Standards herstellen (s.o. Pipettiertabelle)
d.h. z.B. für Messreihe 2: fällen usw..
• Proben („Unbekannte“) in Doppelbestimmung für Messreihe 1 und 2 herstellen,
d.h. z.B. für Messreihe 2: fällen usw..
• Blindprobe nicht vergessen

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Fotometer anstellen
An jedem der drei Spektralfotometer liegt eine Kurz-Bedienungsanleitung.
Machen Sie sich mit dem Fotometer vertraut und gehen Sie nach der Bedienungsanleitung(Konfigurationseinstellungen,
Bestimmungsmethode) vor.
• Jeweils eine Kalibrierkurve aus den zwei Messreihen erstellen und den Proteingehalt der
Proben („Unbekannten“) ermitteln.
• Die Ergebnisse mit der tatsächlich hergestellten Konzentration und die beiden Messreihen
untereinander vergleichen.
weitere Hinweise:
Es gibt verschiedene Möglichkeiten Standards herzustellen, so z.B.
− Arbeiten mit größeren Volumina, aus denen das Probenvolumen entnommen wird
− die einzelnen Stufen durch Unterverdünnung herstellen, usw..
Mit Schülergruppen empfiehlt sich, das Arbeiten mit Fotometern, die Herstellung von Verdünnungsreihen
usw. mit einem Farbstoff zu üben, bevor eine Proteinbestimmung durchgeführt
wird. (vgl. VA Einführung in die Fotometrie)
Da meist mehr als ein Praktikum für obige VA zu veranschlagen ist:
− Stammlösung und Standards aus BSA können zur Verhinderung eines mikrobiellen
Abbaus eingefroren werden. Beim Auftauen gründliches Mischen nicht vergessen.
− Im Kühlschrank und in verschlossenen Reaktionsgefäßen halten sich mit Biuret versetzte
Proben mindestens eine Woche.
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Anwendungsbeispiele:
soll nur die Analytik an sich geübt werden, empfehlen sich Lebensmittelproben, z.B.
Proteinextraktion aus eiweißreichen Pflanzensamen mit geeigneten Puffern, Vergleich mit
Literaturwerten, Diskussion der Unterschiede (z.B. lösliche/nicht lösliche Speicherproteine)
Proteinextraktion aus Fleisch
Werden verschiedene Fischsorten als Ausgangsmaterial verwendet, kann die Proteinbestimmung
genutzt werden, um die Proben auf sinnvolle Konzentration in einer PAGE verdünnen
zu können.
soll eine Proteinbestimmung im Rahmen von Stoffwechseluntersuchungen oder/ und Biomasseproduktion
eingesetzt werden, bietet sich folgendes an:
im Sinne von Projekt- bzw. Lernsituation-orientiertem Unterricht bzw. selbstorganisiertem
Lernen kein fertiges Versuchsprotokoll ausgeben, sondern
Formulierung einer Aufgabenstellung, z.B.
1. Es soll ein (oder mehrere) Aufschlussverfahren für Hefezellen optimiert/verglichen werden
(Ziel könnte eine ADH-Isolierung sein)
2. Die Biomasseproduktion von Hefe unter verschiedenen Bedingungen soll verfolgt werden
(hier könnten aerobe und anaerobe Bedingungen verglichen und untersucht werden, ob die
Trockenmassebestimmung mit der Proteinbestimmung korreliert)
Informationsbeschaffung, z.B. Internet
Entwicklung einer Versuchsanleitung z.B. zu 1.:
Variation und Vergleich verschiedener Parameter
verschiedene Aufschlusspuffer (ohne und mit Detergenz, wegen cytosolischen / membrangebundenen
Proteinen, ohne/mit verschiedenen Osmolytika, ohne/mit EDTA)
verschiedene Materialien (Sand – Aluminiumoxid – Glasperlen),
Glassbeads unterschiedlicher Größe, Vortex-Dauer, Anteile Hefe-Puffer-Beads usw. usw.
Durchführung, Messwertaufnahme
Auswertung und Präsentation der Ergebnisse (Berechnungen, Schaubilder, Grafiken)