Enzymatische Analytik Ethanol
Enzymatische Analytik Ethanol
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BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche <strong>Enzymatische</strong> <strong>Analytik</strong> <strong>Ethanol</strong><br />
Stand 30.11.08 ©HL Seite 1 von 9<br />
<strong>Enzymatische</strong> <strong>Analytik</strong> – <strong>Ethanol</strong>bestimmung - Der optische Test<br />
Ziele:<br />
Prinzip der enzymatischen <strong>Analytik</strong>: Bestimmung der Konzentration von Metaboliten durch direkte<br />
Messungen.<br />
Bestimmung der <strong>Ethanol</strong>konzentration in einem Medium,<br />
z.B.: Alkoholgehalt von Bier oder Wein<br />
Basisinformationen:<br />
Die hohe Spezifität und Effektivität, mit denen Enzyme ihre Substrate umsetzen, lässt sich ausnutzen,<br />
um Substanzen zu erfassen, die als Substrate für einfach verfügbare Enzyme dienen. Für<br />
einen enzymatischen Test sind insbesondere solche Substrate geeignet, deren Umsetzung sich<br />
fotometrisch, fluorimetrisch oder über Lumineszenz detektieren lassen. Klassisches Beispiel dafür<br />
ist der optische Test, bei dem die veränderte Lichtabsorption beim Übergang von NAD + (keine<br />
Lichtabsorption bei 340 nm) zu NADH + H + gemessen wird (s.VA Absorptionsspektren von<br />
NAD und NADH+H + ), die auf der Oxidation eines Substrats durch eine Dehydrogenase beruht<br />
(s.u. Reaktionsmechanismus). Dabei ergibt sich die Änderung des Messparameters direkt aufgrund<br />
der ablaufenden Reaktion.<br />
Bestimmung der Konzentration von Metaboliten durch direkte Messungen<br />
Beispiele für direkte Messungen, die mit Hilfe von spezifischen Dehydrogenasen durchgeführt<br />
werden:<br />
<strong>Ethanol</strong> + NAD + ↔ Acetaldehyd + NADH + H + (Alkoholdehydrogenase, ADH)<br />
Glutamat + NAD + ↔ α-Ketoglutarat + NADH + H + (Glutamatdehydrogenase)<br />
Malat + NAD + ↔ Oxalacetat + NADH + H + (Malatdehydrogenase)<br />
Lactat + NAD + ↔ Pyruvat + NADH + H + (Lactatdehydrogenase)<br />
Da es sich um Gleichgewichtsreaktionen handelt, kann man diese Reaktionen für die Konzentrationsbestimmung<br />
sowohl der Substrate wie auch der Produkte benutzen.<br />
Durch Ankopplung einer solchen Reaktion an eine enzymatische Umsetzung, die selbst nicht zu<br />
einer Veränderung von photometrisch oder fluorimetrisch erfassbaren Parametern führt, lassen<br />
sich sehr viele Metaboliten spezifisch und empfindlich nachweisen.<br />
Bestimmung der Konzentration von Metaboliten durch gekoppelte Messungen,<br />
(s. VA <strong>Enzymatische</strong> <strong>Analytik</strong>, Glucosebestimmung mit Hexokinase)<br />
<strong>Enzymatische</strong> Analysen als direkte oder gekoppelte optische Tests sind in der Klinischen Chemie<br />
und der Lebensmittelanalytik weit verbreitet. Die Spezifität der Enzymreaktionen ermöglicht<br />
eine gezielte <strong>Analytik</strong>, die fotometrische Detektion eine Automation der Analysen.<br />
Grundsätzlich unterscheidet man bei enzymatischen Konzentrationsbestimmungen zwei Verfahren,<br />
die Endwertmethode (Endpunktbestimmung) und die kinetische Methode, von denen aber<br />
nur die Endwertmethode hier beschrieben werden soll.<br />
Das Grundprinzip ist:<br />
• Der zu bestimmende Stoff wird mit Hilfe des spezifischen Enzyms und Coenzyms umgesetzt.<br />
• Die Stoffmenge der Substanz und die Stoffmenge reduziertes Coenzym sind proportional<br />
zueinander.<br />
• Das reduzierte Coenzym wird fotometrisch bestimmt.<br />
• Die Daten werden auf den zu bestimmenden Stoff (Analyt) umgerechnet.<br />
Um Endpunktbestimmungen durchführen zu können, d.h. um "vollständige" Umsetzung in eine<br />
Richtung zu erreichen, obwohl Enzymreaktionen bekanntermaßen Gleichgewichtsreaktionen<br />
sind und um den vollständigen Umsatz in angemessener Zeit zu erzielen, sind folgende Kriterien<br />
zu beachten:
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• Es muss mit hohem Coenzymüberschuss bzw. mit sogenannten Fängern für die Reaktionsprodukte<br />
gearbeitet werden. Für die Bestimmung von z.B. <strong>Ethanol</strong> mit Hilfe von ADH wird<br />
man einen Überschuss an NAD + verwenden, die Reaktion bei leicht alkalischem pH durchführen,<br />
um die entstehenden Protonen zu neutralisieren und Semicarbazid zusetzen, um das<br />
entstandene Aldehyd zu binden.<br />
• Die Substratkonzentration sollte immer weit unter KM liegen.<br />
(KM(Alkoholdehydrogenase aus Hefe ≈ 10 -2 mol/l)<br />
• Es ist eine relativ hohe Enzymmenge einzusetzen (s.u.).<br />
• Die Reaktionsbedingungen (Temperatur, pH, usw.) sollten für das Enzym optimal sein.<br />
Hinweise zur Probenvorbereitung:<br />
• Lösen der Substanzen im Testpuffer(Coenzym), stabilisierenden Puffersystemen (Enzym)<br />
und i.d.R. A.dest.(Probe).<br />
• bei biologischen Proben ggf. schonende Enteiweißung mit Perchlorsäure oder Trichloressigsäure.<br />
Neutralisierung mit KOH oder KHCO3 (Vorsicht, schäumt!). Abzentrifugieren des<br />
Niederschlags.<br />
• eventuell Zugabe einer Standardmenge der zu analysierenden Substanz.<br />
• Vorwärmen des kompletten Testgemischs (einschließlich Enzym).<br />
Hinweise zur Durchführung:<br />
• Vorlegen des kompletten Testgemisches außer dem Enzym<br />
• Messung des Nullwerts (konstantes Signal erforderlich)<br />
• starten mit Enzym<br />
• Inkubation bis zum Stillstand der Reaktion<br />
• Messung des Probenwerts (oder Standards).<br />
Auswertung:<br />
Berechnung der Differenz von Proben- und Nullwert. Ablesen der Konzentration aus einer<br />
Eichkurve oder Berechnung an Hand von Eichfaktoren (molarer Extinktionskoeffizient).<br />
Überprüfung der Testmethode:<br />
Folgende Kriterien sind Hinweise auf eine richtige Versuchsdurchführung:<br />
• Proportionalität von Einwaage und Analysenergebnis bei verschiedenen Einwaagen<br />
• Proportionalität zwischen eingesetztem Probevolumen (bei flüssigen Proben) und Analysenergebnis<br />
(bei konstantem Gesamtvolumen!)<br />
• quantitative Wiederfindung einer vor Probenvorbereitung zugemischten bekannten Menge<br />
der zu bestimmenden Substanz (Standard-Additionsverfahren).<br />
Fehlerquellen:<br />
• Überschreiten des optimalen Konzentrationsbereichs<br />
• "Schleichreaktion" - Beseitigung: Extrapolation oder Messung gegen Leerwert<br />
• störende Nebenreaktion - Beseitigung: Vorlauf ohne Enzymzusatz<br />
• ungenügende Spezifität des Enzyms.
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<strong>Enzymatische</strong> Konzentrationsbestimmung von <strong>Ethanol</strong> (Kit)<br />
Vorbemerkungen:<br />
<strong>Ethanol</strong> wird durch Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD + ) in Gegenwart des Enzyms Alkoholdehydrogenase<br />
(ADH) zu Acetaldehyd oxidiert:<br />
<strong>Ethanol</strong> + NAD + Alkoholdehydrogenase (ADH) Acetaldehyd + NADH + H +<br />
Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite von <strong>Ethanol</strong> und NAD + . Durch alkalisches<br />
Milieu und durch Abfangen des gebildeten Acetaldehyds kann das Gleichgewicht auf die rechte<br />
Seite verschoben werden.<br />
In dem kommerziell erhältlichen Kit wird das entstandene Acetaldehyd in Gegenwart von Aldehyddehydrogenase<br />
(Al-DH) quantitativ zu Essigsäure oxidiert:<br />
Acetaldehyd + NAD + + H20 Aldehyddehydrogenase (Al-DH) Essigsäure + NADH + H +<br />
NADH ist Messgröße und aufgrund seiner Absorption bei 340nm zu bestimmen.<br />
Da pro <strong>Ethanol</strong>molekül zwei NADH H + -Moleküle entstehen, ist die <strong>Ethanol</strong>menge der doppelten<br />
NADH +H + -Menge äquivalent.<br />
Reagenzien des Kits:<br />
1. Flasche 1 mit ca. 100ml Lösung, zusammengesetzt aus: Kaliumdiphosphat-Puffer, pH ca. 9,0; Stabilisatoren.<br />
Lösung 1 ist stabil bei +4°C<br />
2. Flasche 2 mit ca. 30 Tabletten; jede Tablette enthält: NAD, ca. 4mg; Aldehyddehydrogenase, ca. 0,8U;<br />
Stabilisatoren. Der Inhalt der Flasche 2 ist stabil bei +4°C<br />
3. Flasche 3 mit ca. 1,6ml Suspension, ADH, ca. 7000U. Der Inhalt der Flasche 3 ist stabil bei +4°C<br />
4. <strong>Ethanol</strong>-Standardlösung zur Testkontrolle (Die Messung der Standardlösung ist nicht erforderlich zur<br />
Berechnung von Ergebnissen.) Standardlösung unverdünnt verwenden.<br />
Herstellung der Lösungen:<br />
1. Inhalt der Flasche 1 unverdünnt verwenden.<br />
2. In einem Becherglas oder Zentrifugenglas je nach Anzahl der Bestimmungen für jeden Test (Leerwert<br />
und Proben) eine Tablette aus Flasche 2 mit drei ml Lösung aus Flasche 1 lösen (zur Entnahme der<br />
Tabletten aus Flasche 2 Pinzette benutzen), ergibt Reaktionsgemisch 2, das bei +4°C 1 Tag haltbar ist.<br />
3. Inhalt der Flasche 3 unverdünnt verwenden.<br />
Bestimmungsansatz:<br />
Wellenlänge 340nm<br />
Küvette: Glas oder Kunststoff,<br />
1cm Schichtdicke<br />
Temperatur: 20-25°C<br />
Testvolumen: 3,150ml<br />
Messung: gegen Luft oder Wasser<br />
oder Leerwert bei Verwendung<br />
eines Zweistrahlfotometers<br />
Probelösung: 0,3-6µg <strong>Ethanol</strong> in<br />
0,1ml Probevolumen<br />
In Küvetten 1) pipettieren Leerwert Probe<br />
Reaktionsgemisch 2 3,000ml 3,000ml<br />
A.dest. 0,100ml ---------<br />
Probelösung 2) --------- 0,100ml<br />
Mischen 3) , nach ca. 3min Extinktionen der Lösungen messen<br />
(E1). Reaktion starten durch Zugabe von:<br />
Suspension 3 0,050ml 0,050ml<br />
Mischen, Stillstand der Reaktion abwarten (5–10min) und<br />
Extinktionen der Lösungen messen (E2). Falls die Reaktion<br />
nach 10min nicht zum Stillstand gekommen ist, Extinktionen<br />
weiter in 2min-Abständen messen, bis keine Extinktionszunahme<br />
mehr erfolgt.<br />
Für Leerwert und Probe Extinktionsdifferenzen (E2-E1)<br />
Originalvorschrift des Kits! berechnen: 4) E = (E2 – E1)Probe - (E2 – E1)Leerwert<br />
für Zweistrahlfotometer: E = E2 Probe – E2 Leerwert<br />
1)<br />
normale Küvetten - keine Halbmikro – verwenden.<br />
2)<br />
Vor der Dosierung der Probelösung Pipettenspitze der Kolbenhubpipette mit der Probelösung vorspülen.<br />
Probelösung stets direkt in das Reaktionsgemisch 2 pipettieren.<br />
3)<br />
Küvetten vor dem Mischen mit Parafilm verschließen.<br />
Es ist unbedingt notwendig, während der gesamten Messung die Küvetten mit Parafilm verschlossen zu<br />
halten! (s. Hinweise zur Testdurchführung)<br />
4)<br />
Die gemessene Extinktionsdifferenz sollte zur Erzielung eines ausreichend präzisen Ergebnisses in der Regel<br />
mindestens 0,100 Extinktionseinheiten betragen.
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Berechnung:<br />
Nach der allgemeinen Berechnungsformel für die Bestimmung der Konzentration gilt:<br />
VT<br />
⋅ M ⋅ FV<br />
3,<br />
150 ⋅ 46,<br />
07 ⋅ Fv<br />
ß = ⋅ ∆E<br />
[g/l] für <strong>Ethanol</strong> ß = ⋅ ∆E<br />
= 0,<br />
115 ⋅ ∆E<br />
⋅ Fv [g/l]<br />
ε ⋅ d ⋅VP<br />
⋅ Ä<br />
6,<br />
3⋅1000<br />
⋅1,<br />
00 ⋅ 0,<br />
100 ⋅ 2<br />
ß = Massenkonzentration der Substanz in der Analysenprobe [g/l bzw. mg/ml],<br />
VT = Gesamtvolumen des Testansatzes [ml], M = molare Masse der Substanz [g/mol],<br />
FV = Verdünnungsfaktor zwischen Probe im Testansatz und Analysenprobe,<br />
ε = mol. Extinktionskoeffizient, von NADH bei 340nm = 6,3x10 3 [l x mol -1 x cm -1 ],<br />
d = Schichtdicke der Küvette [cm], VP = Probevolumen im Testansatz [ml], Ä = stöchiometrischer Äquivalenzfaktor<br />
zwischen Reagenz und Substanz, ∆E = Extinktionsänderung.<br />
Hinweise zur Testdurchführung:<br />
In der Küvette muss die <strong>Ethanol</strong>menge zwischen 0,3µg und 6µg betragen. Zur Erzielung einer ausreichend<br />
hohen Extinktionsdifferenz ist die Probelösung soweit zu verdünnen, dass die <strong>Ethanol</strong>-<br />
Konzentration zwischen 0,01 und 0,06g/1 liegt.<br />
Bedingt durch die hohe Empfindlichkeit der Methode ist darauf zu achten, dass ethanolfreies Wasser<br />
verwendet wird und in ethanolfreier Atmosphäre gearbeitet wird.<br />
Verdünnungstabelle:<br />
Geschätzte Menge Verdünnung Verdünnungs-<br />
<strong>Ethanol</strong> [g/l] mit A.dest. faktor F<br />
< 0,06g ---- 1<br />
0,06-0,6g 1 + 9 10<br />
0,6-6,0g 1 + 99 100<br />
6,0-60g 1 + 999 1000<br />
> 60g 1 +9999 10000<br />
Ist die gemessene Extinktionsdifferenz (∆E) zu<br />
klein (z.B. < 0,100), so ist die Probelösung erneut<br />
herzustellen (höhere Einwaage oder weniger<br />
starke Verdünnung), oder das in die Küvette<br />
zu pipettierende Probevolumen (VP) ist bis auf<br />
0,500 ml zu erhöhen. Das Volumen an Lösung 1<br />
bzw. Reaktionsgemisch 2 bleibt dabei unverändert<br />
(3,000ml). In gleichem Maße ist das in die<br />
Leerwert-Küvette zu pipettierende Volumen an A.dest zu erhöhen. Geändertes Probevolumen VP und<br />
Testvolumen VT sind in die Berechnungsformel entsprechend einzusetzen.<br />
Wegen der Flüchtigkeit von <strong>Ethanol</strong> wird beim Verdünnen A.dest vorgelegt und die Probe unter die Wasseroberfläche<br />
pipettiert.<br />
Spezifität der Bestimmung:<br />
Der Einfluss von Aldehyden und Ketonen wird durch die Reihenfolge der Reagenzienzugabe beim Test<br />
ausgeschaltet. Methanol wird wegen ungünstiger KM-Werte der verwendeten Enzyme nicht umgesetzt.<br />
n-Propanol und n-Butanol werden unter Testbedingungen quantitativ umgesetzt, höhere primäre Alkohole<br />
führen zu probenabhängigen Schleichreaktionen. Sekundäre, tertiäre und aromatische Alkohole reagieren<br />
nicht. Glycerin stört den Test auch bei höheren Konzentrationen nicht.<br />
Bei der Analyse von Reinsubstanz <strong>Ethanol</strong> ist mit Ergebnissen von ca. 100% zu rechnen. (Eine Wiederfindung<br />
von weniger als 100% bedeutet nicht unbedingt eine unvollständige Umsetzung bei der enzymatischen<br />
Bestimmung, sondern ist eher ein Hinweis für den Verlust an Analyt während der Handhabung,<br />
dem Verlust an Analyten bei der Herstellung der <strong>Ethanol</strong>lösung und beim Pipettieren der verdünnten<br />
<strong>Ethanol</strong>lösung in den Testansatz.)<br />
Empfindlichkeit und Nachweisgrenze:<br />
Die geringste Extinktionsdifferenz, die das Verfahren unterscheiden kann, beträgt 0,005 Extinktionseinheiten.<br />
Das entspricht bei einem maximal einzusetzenden Probevolumen VP = 0,500ml bei einem Testvolumen<br />
VT = 3,550ml und Messung bei 340nm einer Konzentration an <strong>Ethanol</strong> von ca. 0,1mg/1 (bei VP =<br />
0,100ml und VT = 3,150ml entsprechend 0,6mg/1 Probelösung).<br />
Die Nachweisgrenze von 0,5mg/1 ergibt sich aus der Extinktionsdifferenz von 0,020 (gemessen bei<br />
340nm), dem maximalen Probevolumen VP = 0,500ml und dem Testvolumen VT = 3,550ml.<br />
Linearität:<br />
Linearität der Bestimmung ist gegeben von ca. 0,3µg <strong>Ethanol</strong>/Ansatz (0,5mg <strong>Ethanol</strong>/1 Probelösung;<br />
Probevolumen VP = 0,500ml; Testvolumen VT = 3,550ml) bis 12µg <strong>Ethanol</strong>/Ansatz (0,12g <strong>Ethanol</strong>/1<br />
Probelösung; Probevolumen VP = 0,100ml; Testvolumen VT =3,150ml).<br />
Präzision:<br />
Bei einer Doppelbestimmung, ausgehend von einer Probelösung, ist mit Unterschieden bei den Extinktionsdifferenzen<br />
von 0,005 bis 0,010 Extinktionseinheiten zu rechnen. Das entspricht bei einem Probevo-
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lumen VP = 0,100ml und einem Testvolumen VT = 3,150 ml einer <strong>Ethanol</strong>-Konzentration von ca.<br />
0,5-1mg/l. (Ist bei der Probenvorbereitung eine Verdünnung vorgenommen worden, ist mit dem Verdünnungsfaktor<br />
F zu multiplizieren. Bei einer Einwaage von 1g Probe/100ml = 10g/1 sind die zu erwartenden<br />
Unterschiede ca. 0,005-0,01g/100g.)<br />
Störungen:<br />
<strong>Ethanol</strong> im verwendeten A.dest. oder in der Laborluft führt zu erhöhten Leerwerten bzw. zu Schleichreaktionen.<br />
Deshalb ist das Verschließen der Küvetten beim Testansatz erforderlich.<br />
Erkennen von Störungen:<br />
1. Ist die Umsetzung von <strong>Ethanol</strong> nach der unter 'Bestimmungsansatz' angegebenen Zeit beendet, so kann<br />
im allgemeinen auf einen störungsfreien Ablauf geschlossen werden.<br />
2. Nach Ablauf der Reaktion kann durch Zugabe von <strong>Ethanol</strong> (qualitativ oder quantitativ) die Reaktion<br />
wieder gestartet werden: Die erneute Änderung der Extinktion nach Zugabe des Standardmaterials ist ein<br />
Beweis für den störungsfreien Ablauf der Bestimmung.<br />
3. Grobe Fehler beim Testansatz und Störungen der Bestimmung durch Inhaltsstoffe der Probe können<br />
auch erkannt werden, wenn aus einer Probelösung eine Doppelbestimmung mit verschiedenen Probevolumina<br />
(z.B. 0,100ml und 0,200ml) ausgeführt wird: Die gemessenen Extinktionsdifferenzen müssen den<br />
eingesetzten Probevolumina proportional sein.<br />
Bei der <strong>Analytik</strong> fester Proben wird die Einwägung verschiedener Mengen (z.B. 1g und 2g) in 100ml<br />
Messkolben empfohlen. Bei gleichen Probenvolumina für die Testansätze muss Proportionalität zwischen<br />
Extinktionsdifferenz und Einwaage gegeben sein.<br />
4. Störungen der Bestimmung durch Inhaltsstoffe der Probe können weiterhin durch Mitführen eines internen<br />
Standards erkannt werden: Neben Proben-, Leerwert- und Standardansatz wird ein weiterer Ansatz<br />
mit Probe- und Standardlösung analysiert. Aus den ermittelten Extinktionsdifferenzen wird die Wiederfindung<br />
berechnet.<br />
5. Verluste während der Probenvorbereitung können durch Wiederfindungsversuche erkannt werden: Die<br />
Probe wird mit und ohne zugesetztem Standardmaterial vorbereitet und anschließend gemessen. Der Zusatz<br />
muss (innerhalb des Analysenfehlers) quantitativ wiedergefunden werden.<br />
Gefährlichkeit der Reagenzien:<br />
Die Reagenzien zur Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> sind keine gefährlichen Stoffe oder Zubereitungen im Sinne<br />
der Gefahrstoffverordnung. Die beim Umgang mit Chemikalien üblichen Vorsichtsmaßnahmen sollten<br />
jedoch beachtet werden. Nach Gebrauch können die Reagenzien zum Abwasser gegeben werden.<br />
Allgemeine Hinweise zur Probenvorbereitung:<br />
Flüssige, klare, farblose und annähernd neutrale Proben direkt, nach Verdünnen gemäß Verdünnungstabelle<br />
(zur Vermeidung von <strong>Ethanol</strong>-Verlusten ist die zu verdünnende Lösung immer unter die<br />
Oberfläche des Verdünnungsmittels zu pipettieren) oder mit einem Probevolumen bis 0,500ml zum Test<br />
einsetzen;<br />
trübe Lösungen filtrieren (es können hierbei geringe Verluste an <strong>Ethanol</strong> auftreten);<br />
Kohlensäure-haltige Proben (z. B. durch Filtration) entgasen (es können hierbei geringe Verluste an<br />
<strong>Ethanol</strong> auftreten) oder mit Ätzkali (KOH) oder Ätznatron (NaOH) alkalisieren, um CO2 in Form von<br />
Bikarbonat zu binden;<br />
saure Proben durch Zugabe von Natronlauge oder Kalilauge auf pH 8-9 einstellen;<br />
saure und schwach gefärbte Proben durch Zugabe von Natronlauge oder Kalilauge auf pH 8-9 einstellen<br />
und ca. 15min stehen lassen;<br />
'stärker gefärbte' Proben (falls erforderlich auf pH 8-9 eingestellt) gegen Probenleerwert (= Puffer bzw.<br />
A.dest. + Probe) messen (Fotometer mit Probenleerwert im Strahlengang auf 0,000 einstellen);<br />
stark gefärbte Proben, mit Polyamid oder Polyvinylpolypyrrolidon, PVPP (z.B. 2g/100ml Probe) behandeln<br />
(es können hierbei geringe Verluste an <strong>Ethanol</strong> auftreten);<br />
feste und halbfeste Proben zerkleinern oder homogenisieren, mit Wasser extrahieren bzw. lösen, wenn<br />
nötig filtrieren; ggf. Trübstoffe und Farbstoffe mit Carrez-Reagenzien (s. u.) entfernen;<br />
Protein-haltige Proben mit Carrez-Reagenzien (s. u.) klären oder mit Perchlorsäure enteiweißen;<br />
Fett-haltige Proben mit warmem Wasser in einem Kölbchen mit Steigrohr extrahieren, zur Abscheidung<br />
des Fettes abkühlen lassen, Steigrohr mit Wasser nachspülen, filtrieren; alternativ nach Extraktion mit<br />
warmem Wasser mit Carrez-Reagenzien klären.<br />
Carrez-Klärung:<br />
Carrez-I-Lösung: Kalium-hexacyanoferrat(II), 85mmol/l = 3,6g K4[Fe(CN)6] x 3H20/100ml<br />
Carrez-II-Lösung: Zinksulfat, 250mmol/l = 7,2g ZnS04 x 7H20/100ml
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Geeignete Probenmenge in einen 100ml Messkolben genau einwägen bzw. pipettieren, ca. 60ml A.dest.<br />
hinzufügen. Anschließend 5ml Carrez-I-Lösung und 5 ml Carrez-II-Lösung sorgfältig dosieren. Mit Natronlauge,<br />
0,1mol/l, pH 7,5-8,5 einstellen. Nach jeder Zugabe kräftig mischen, Messkolben mit Wasser bis<br />
zur Marke auffüllen, mischen und filtrieren.<br />
Anwendungsbeispiele:<br />
Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> in Alkohol-armem und Alkohol-freiem Bier:<br />
Ca. 100ml Probe im Becherglas unter vorsichtigem Rühren mit festem Ätzkali (KOH) oder Ätznatron<br />
(NaOH) versetzen bis ein pH-Wert von ca. 8-9 erreicht ist. Lösung, ggf. nach Verdünnen gemäß Verdünnungstabelle,<br />
zum Test einsetzen.<br />
Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> in Essig:<br />
Essig ggf. filtrieren und neutralisieren. Wenn stärker verdünnt wird, ist Neutralisieren nicht erforderlich.<br />
Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> in Protein-haltigen Proben:<br />
Protein-haltige Proben oder Probelösungen mit Perchlorsäure (1mol/l) im Verhältnis 1 : 3 (1 + 2) enteiweißen,<br />
dann zentrifugieren und Überstand mit Kalilauge (2mol/l) neutralisieren.<br />
Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> in Fruchtsäften:<br />
a) Klare, helle Säfte nach Neutralisation und je nach Alkoholgehalt verdünnt (s. Verdünnungstabelle)<br />
zum Test einsetzen.<br />
b) Dunkle Säfte zur Entfärbung am günstigsten mit 2% Polyamid oder Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)<br />
(z.B. 5ml Saft + 100mg Polyamid oder PVPP) 2min lang (Gefäß verschlossen halten) rühren und filtrieren;<br />
die meist klare Lösung nach Neutralisation zum Test einsetzen. Bei Verdünnen der Probe erübrigt<br />
sich oft eine Entfärbung.<br />
c) Trübe Säfte filtrieren, ggf. mit Carrez-Lösungen klären: 10ml Saft in einen 25ml Messkolben pipettieren,<br />
1,25ml Carrez-1-Lösung, 1,25ml Carrez-II-Lösung und 2,50ml NaOH (0,1mol/l) zufügen, nach<br />
jeder Zugabe kräftig schütteln, mit A.dest. auf 25ml auffüllen, filtrieren (Verdünnungsfaktor F = 2,5).<br />
Klare, höchstens schwach opaleszierende Probelösung zum Test, ggf. nach weiterem Verdünnen, einsetzen.<br />
Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> in alkoholhaltigen Getränken:<br />
a) Wein: Weine werden mit A.dest. auf die geeignete Konzentration (s. Verdünnungstabelle) verdünnt.<br />
Entfärben und Neutralisieren ist nicht erforderlich.<br />
b) Bier: Etwa 5-10ml Bier filtrieren oder im Becherglas ca. 30s lang mit einem Glasstab zur Entfernung<br />
der Kohlensäure rühren. Probe mit Wasser 1 : 1000 (1 + 999) verdünnen und zum Test einsetzen.<br />
c) Likör: Dünnflüssige Liköre zum Verdünnen in entsprechenden Messkolben pipettieren und mit Wasser<br />
bis zur Marke auffüllen.<br />
Dickflüssige Liköre (z.B. Eierlikör): ca. 1g Likör in einen 100ml Messkolben genau einwägen, mit<br />
A.dest. bis zur Marke auffüllen, zur Fettabscheidung in den Kühlschrank stellen, filtrieren. Klare Lösung<br />
mit Wasser 1 : 100 (1 + 99) verdünnen und zum Test einsetzen. Ergebnis in g/100g berechnen.<br />
d) Branntwein: Bei Verdünnung auf geeignete Konzentration (z.B. 1 + 9999) die üblichen Maßnahmen<br />
bei der Probeentnahme von alkoholischen Getränken beachten. Messwerte (g <strong>Ethanol</strong>/l Lösung) anhand<br />
von Tabellen in Volumenprozente (v/v) umrechnen.<br />
Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> in Pralinen, Bonbons und anderen alkoholhaltigen Schokoladen-<br />
Erzeugnissen:<br />
Pralinen mit dünnflüssigen Füllungen (Weinbrandbohnen, -kirschen):<br />
Eine Praline vorsichtig öffnen; 0,50ml der Füllung in einen mit ca. 25ml Wasser gefüllten 50ml Messkolben<br />
pipettieren, Pipettenspitze dabei in das Wasser eintauchen. Messkolben mit Wasser bis zur Marke<br />
auffüllen, verschließen, mischen. Lösung im Verhältnis 1 : 20 (1 + 19) mit Wasser verdünnen. 0,100ml<br />
der verdünnten Lösung zum Test einsetzen (Verdünnungsfaktor F = 2000).<br />
Schokoladenerzeugnisse mit dickflüssigen Füllungen:<br />
Die Füllung von 1 oder mehreren Bonbons oder Pralinen in einen mit ca. 5ml Wasser gefüllten 50ml<br />
Messkolben genau einwägen (wenn mit Hilfe einer Pipette eingewogen wird, soll die Pipettenspitze den<br />
Wasserspiegel nicht berühren); mit Wasser bis zur Marke des Messkolbens auffüllen; mischen, gegebenenfalls<br />
filtrieren und soweit verdünnen, dass der Alkoholgehalt der Probe unter 0,12g/l liegt.<br />
Bestimmung von <strong>Ethanol</strong> in Konfitüren:<br />
Probe gut homogenisieren (Mixer etc.) und ca. 10-20g in ein Becherglas genau einwägen. Mit etwas<br />
Wasser verrühren und Mischung ggf. mit Kalilauge neutralisieren, quantitativ in einen 100ml Messkolben<br />
überspülen, mit A.dest. bis zur Marke auffüllen.Lösung ggf. mit 2% Polyamid oder PVPP entfärben (s.<br />
oben), filtrieren, Filtrat unverdünnt zum Test einsetzen.
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Konzentrationsbestimmung von <strong>Ethanol</strong> mit selbst hergestellten Reagenzien:<br />
Vorbemerkungen:<br />
<strong>Enzymatische</strong> Konzentrationsbestimmungen lassen sich auch ohne den jeweiligen Testkit durchführen.<br />
In diesem Fall müssen die Reagenzien selbst hergestellt werden. Dabei orientiert man<br />
sich an den Angaben des Testkits bzw. den allgemeinen Richtlinien zur Durchführung enzymatischer<br />
Analysen (s.o. Basisinformationen). In gewissem Maße kann man auch Änderungen in der<br />
Testdurchführung vornehmen, wenn o.g. Kriterien beachtet werden.<br />
So soll die enzymatische <strong>Ethanol</strong>bestimmung nur mit einem Enzym, der Alkoholdehydrogenase<br />
= ADH und Abfangen des entstehenden Acetaldehyds mit Semicarbazid erfolgen. Da in diesem<br />
Fall pro <strong>Ethanol</strong>molekül nur ein NADH + H + -Molekül entsteht, ist die während der Reaktion<br />
gebildete NADH + H + -Menge der eingesetzten <strong>Ethanol</strong>menge direkt äquivalent.<br />
Außerdem soll das Testvolumen auf etwa 2ml (1,8ml NAD-Lösung, 0,1ml Probe, 0,05ml ADH)<br />
verringert und 2ml Reaktionsgefäße verwendet werden. So ergibt sich eine bequemere Durchführung<br />
des Tests (mischen, verschlossen halten der Reaktionsansätze).<br />
Die Reagenzien müssen natürlich an die veränderte Testdurchführung angepasst werden.<br />
Durchführung:<br />
Es sollen für etwa 16 Tests (5-6 Konzentrationen für eine Eichkurve, 2 verschiedene Proben in 2<br />
Verdünnungsstufen, jeweils Doppelbestimmungen, 2 Leerwerte) die benötigten Puffer, NAD-<br />
Lösung und Enzymlösung hergestellt werden. Außerdem sind eine <strong>Ethanol</strong>-Stammlösung und<br />
daraus die benötigten Verdünnungen für eine Eichkurve herzustellen.<br />
• Stellen Sie 100ml Testpuffer her:<br />
0,1M Natriumpyrophosphat- = tetra-Natriumdiphosphat-Puffer,<br />
0,5% Semicarbazid-hydrochlorid enthaltend<br />
mit 1M NaOH auf pH 8,8 eingestellt<br />
M[Na4P2O7 x 10H2O] = 446g/mol<br />
• Berechnen Sie den Messbereich in µg <strong>Ethanol</strong>/Test, der sich durch die veränderten Rahmenbedingungen<br />
(s.o.) ergibt, wenn Emin nicht kleiner als 0,1, Emax nicht größer als 1,1 sein<br />
soll.<br />
• Kalkulieren Sie die Konzentration der herzustellenden NAD-Lösung. Der erforderliche<br />
Überschuss an NAD im Test soll in etwa dem im Testkit entsprechen.<br />
Vergleichen Sie dazu den maximalen NAD-Verbrauch = NADH-Bildung bei vorschriftsmäßiger<br />
Anwendung des Testkits (Messbereich: 0,3-6µg <strong>Ethanol</strong>/Testansatz,<br />
M[<strong>Ethanol</strong>] = 46g/mol, 1 <strong>Ethanol</strong> → 2 NADH) mit der pro Ansatz eingesetzten NAD-Menge<br />
(4mg Tablette/Ansatz, M[NAD] = 663,4g/mol).<br />
Berechnen Sie die erforderliche Konzentration der herzustellenden NAD-Lösung unter Berücksichtigung<br />
des ermittelten Messbereichs (s.o.), des gewünschten Überschusses und dem<br />
eingesetzten Volumen (1,8ml) pro Test.<br />
Lassen Sie die Praktikumsleitung Ihre Kalkulation überprüfen.<br />
Stellen Sie 30ml NAD-Lösung in Testpuffer der berechneten Konzentration her.<br />
• Stellen Sie 25ml Lösung zur Suspension der ADH her:<br />
2,4M (NH4)2SO4 in Testpuffer,<br />
0,2% Rinderserumalbumin (BSA) enthaltend<br />
M[(NH4)2SO4] = 132g/mol<br />
• Berechnen Sie die einzuwiegende Masse des zur Verfügung stehenden ADH-Lyophilisats für<br />
10ml ADH-Suspension, wenn die eingesetzten Enzymeinheiten (in 0,05ml) dem Testkit in<br />
etwa entsprechen sollen (0,05ml, 7000U/1,6ml).<br />
Es werden i.d.R. 10ml ADH-Suspension für die gesamte Praktikumsgruppe hergestellt!<br />
• Planen Sie die Herstellung einer <strong>Ethanol</strong>-Stammlösung aus vergälltem <strong>Ethanol</strong> (99%,<br />
= 0,79g/ml, M = 46g/mol) und die notwendigen Verdünnungen zur Herstellung der Eichlösungen<br />
innerhalb des oben berechneten Messbereichs. Besprechen Sie Ihren Plan mit der
BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche <strong>Enzymatische</strong> <strong>Analytik</strong> <strong>Ethanol</strong><br />
Stand 30.11.08 ©HL Seite 8 von 9<br />
Praktikumsleitung. Stellen Sie die Stammlösung und die Verdünnungsreihen in verschließbaren<br />
10ml Einweg-Röhrchen bzw. 2ml Reaktionsgefäßen her.<br />
• Wählen Sie zwei alkoholhaltige Proben zur Bestimmung ihres <strong>Ethanol</strong>-Gehaltes.<br />
Verdünnen sie die Proben nach ihrem geschätzten Alkoholgehalt in den Messbereich.<br />
Stellen Sie für die Messung sicherheitshalber zwei Verdünnungsstufen her.<br />
• Entwickeln Sie einen Bestimmungsansatz in Anlehnung an den des Testkits.<br />
• Pipettieren Sie die verschiedenen Reagenzien gemäß Ihres Bestimmungsansatzes in Halmikroküvetten<br />
und verschließen Sie die Küvetten mit Parafilm. Stellen Sie den Leerwert 2x<br />
her.<br />
• Richten Sie das Fotometer für die Bestimmung ein.<br />
• Bestimmen Sie zunächst die Absorption aller Proben gegen den Leerwert vor einer ADH-<br />
Zugabe (E1). Wozu dienen diese Messungen?<br />
Hinweis: Soll direkt von der Fotometer-Software aus den Standard-Messungen eine Eichkurve<br />
erstellt werden, so darf das Fotometer keinen Messauftrag für die Absorptionen E1 erhalten.<br />
Die Absorptionen vor der ADH-Zugabe sind in diesem Falle nur im Statusfenster abzulesen,<br />
zu notieren und zu prüfen, ob sie vernachlässigbar sind (Abs. E1 < 0,005). Sollten die<br />
Absorptionen E1 größer sein, sind die Differenzen gemäß Anleitung zu bilden und die Standards<br />
nachträglich zu editieren (siehe Bedienungsanleitung der Fotometer).<br />
• Geben Sie zu einem der beiden Leerwerte und allen Proben 0,05ml ADH und mischen Sie<br />
die Proben in den mit Parafilm verschlossenen Küvetten gründlich.<br />
• Vergleichen Sie die Absorptionen der Leerwerte ohne und mit ADH.<br />
Auch hier sollte die im Statusfenster angezeigte Absorption vernachlässigbar gering sein.<br />
(Es gibt jedoch ADH im Handel, die geringe Mengen NADH gebunden hat.)<br />
• Stellen Sie in den hinteren Zellenhalter den Leerwert mit ADH und in den vorderen die Eichlösung<br />
mit der höchsten <strong>Ethanol</strong>konzentration. Im Statusfenster können Sie die Absorptionsänderung<br />
während der Reaktion verfolgen.<br />
Wenn die Absorption nicht mehr steigt, können die verschiedenen Eichlösungen und die entsprechend<br />
verdünnten Proben gegen den Leerwert mit ADH gemessen werden.<br />
• Erstellen Sie eine Eichkurve.<br />
Berechnen Sie mit Hilfe des Programms Excel die Geradengleichung für die Ausgleichsgerade<br />
sowie das Bestimmtheitsmaß (= Korrelationskoeffizient).<br />
Bestimmen Sie aus der Eichkurve den molaren Extinktionskoeffizienten ε für NADH.<br />
Vergleichen Sie den so ermittelten Wert für ε mit dem Literaturwert (s.u. Berechnung).<br />
• Ermitteln Sie die <strong>Ethanol</strong>konzentration der beiden ausgewählten Proben<br />
1. aus der Eichkurve<br />
2. durch Berechnung (s.u. Berechnung).<br />
Berechnung:<br />
Nach der allgemeinen Berechnungsformel für die Bestimmung der Konzentration gilt:<br />
VT<br />
⋅ M ⋅ FV<br />
ß = ⋅ ∆E<br />
[g/l]<br />
ε ⋅ d ⋅VP<br />
⋅ Ä<br />
ß = Massenkonzentration der Substanz in der Analysenprobe [g/l bzw. mg/ml],<br />
VT = Gesamtvolumen des Testansatzes [ml],<br />
M = molare Masse der Substanz [g/mol], M(<strong>Ethanol</strong>) = 46g/mol,<br />
FV = Verdünnungsfaktor zwischen Probe im Testansatz und Analysenprobe,<br />
ε = mol. Extinktionskoeffizient, von NADH bei 340nm = 6,3x10 3 [l x mol -1 x cm -1 ],<br />
d = Schichtdicke der Küvette [cm],<br />
VP = Probevolumen im Testansatz [ml],<br />
Ä = stöchiometrischer Äquivalenzfaktor zwischen Reagenz und Substanz,<br />
∆E = Extinktionsänderung.
BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche <strong>Enzymatische</strong> <strong>Analytik</strong> <strong>Ethanol</strong><br />
Stand 30.11.08 ©HL Seite 9 von 9<br />
Literatur:<br />
Boehringer (r-biopharm) Methoden der biochemischen <strong>Analytik</strong><br />
Follmann, Grundlagen der Biochemie, Uni Kassel Praktikum Biochemie<br />
Geckeler/Eckstein, Bioanalytische und biochemische Labormethoden, vieweg<br />
Kleber u.a., Biochemisches Praktikum, Gustav Fischer<br />
Lottspeich / Zorbas, Bioanalytik, Spektrum<br />
Matissek u.a., Lebensmittelanalytik, Springer<br />
Pingoud/Urbanke, Arbeitsmethoden der Biochemie, deGruyter<br />
Schwedt, Taschenatlas der <strong>Analytik</strong>, Thieme<br />
Suelter, Experimentelle Enzymologie, Gustav Fischer<br />
Urbach u.a., Praktikum zur Stoffwechselphysiologie der Pflanzen, Thieme<br />
Wilson/Goulding, Methoden der Biochemie, Thieme<br />
Bestimmungsansatz:<br />
In Reaktionsgefäße (2ml) Leerwert<br />
pipettieren<br />
1)<br />
Probe 2)<br />
NAD-Lösung 1,800ml 1,800ml<br />
A.dest. 0,100ml ---------<br />
Probelösung 3)<br />
Wellenlänge 340nm<br />
Küvette: Halbmikro, Kunststoff,<br />
1cm Schichtdicke<br />
Temperatur: 20-25°C<br />
Testvolumen: 1,95ml<br />
--------- 0,100ml<br />
Messung: gegen Leerwert,<br />
Zweistrahlfotometer<br />
Probelösung: 1,5-15µg <strong>Ethanol</strong> in<br />
0,1ml Probevolumen<br />
Reaktionsgefäße verschließen, mischen, nach ca. 3min<br />
1x Leerwert (Vergleichsküvette) und 1x Probenleerwert<br />
(Messküvette) umfüllen in Küvetten, Extinktion messen<br />
(E1). Reaktion in den Reaktionsgefäßen starten durch<br />
Zugabe von:<br />
ADH-Suspension 0,050ml 0,050ml<br />
Mischen, Stillstand der Reaktion abwarten (10min)<br />
und Extinktionen der Lösungen w.o.a. messen (E2).<br />
Falls die Reaktion nach 10min nicht zum Stillstand<br />
gekommen ist 4) , Extinktionen weiter in 2min-<br />
Abständen messen, bis keine Extinktionszunahme<br />
mehr erfolgt.<br />
Extinktionsdifferenzen 5) berechnen:<br />
Zweistrahlfotometer: E = (E2 – E1)Probe<br />
1)<br />
Leerwert 2x herstellen (1x für Vergleichsküvette vor der Inkubation und 1x mit Enzym für Vergleichsküvette<br />
nach der Inkubationszeit).<br />
2) 2x Probenleerwert herstellen (NAD-Lösung und Probenlösung höchster Konzentration, ohne Enzym)<br />
Extinktionen von Leerwert und Probenleerwert vor und nach der Inkubationszeit miteinander vergleichen:<br />
Extinktionen müssten konstant und sehr gering sein!<br />
3) Vor der Dosierung der Probelösung Pipettenspitze der Kolbenhubpipette mit der Probelösung vorspülen.<br />
Probelösung stets direkt in die NAD-Lösung pipettieren.<br />
4) Küvetten mit Parafilm verschließen.<br />
Es ist unbedingt notwendig, während der gesamten Messung die Küvetten mit Parafilm verschlossen zu<br />
halten!<br />
5) Die gemessene Extinktionsdifferenz sollte zur Erzielung eines ausreichend präzisen Ergebnisses in der Regel<br />
mindestens 0,100 Extinktionseinheiten betragen.