Enzymatische Analytik Ethanol

BT-Lehrer-Fortbildung „2. Kasseler Labortage“ 01./02.12.08 Versuche Enzymatische Analytik Ethanol 

Stand 30.11.08 ©HL Seite 1 von 9 

Enzymatische Analytik – Ethanolbestimmung - Der optische Test 

Ziele: 

Prinzip der enzymatischen Analytik: Bestimmung der Konzentration von Metaboliten durch direkte 

Messungen. 

Bestimmung der Ethanolkonzentration in einem Medium, 

z.B.: Alkoholgehalt von Bier oder Wein 

Basisinformationen: 

Die hohe Spezifität und Effektivität, mit denen Enzyme ihre Substrate umsetzen, lässt sich ausnutzen, 

um Substanzen zu erfassen, die als Substrate für einfach verfügbare Enzyme dienen. Für 

einen enzymatischen Test sind insbesondere solche Substrate geeignet, deren Umsetzung sich 

fotometrisch, fluorimetrisch oder über Lumineszenz detektieren lassen. Klassisches Beispiel dafür 

ist der optische Test, bei dem die veränderte Lichtabsorption beim Übergang von NAD + (keine 

Lichtabsorption bei 340 nm) zu NADH + H + gemessen wird (s.VA Absorptionsspektren von 

NAD und NADH+H + ), die auf der Oxidation eines Substrats durch eine Dehydrogenase beruht 

(s.u. Reaktionsmechanismus). Dabei ergibt sich die Änderung des Messparameters direkt aufgrund 

der ablaufenden Reaktion. 

Bestimmung der Konzentration von Metaboliten durch direkte Messungen 

Beispiele für direkte Messungen, die mit Hilfe von spezifischen Dehydrogenasen durchgeführt 

werden: 

Ethanol + NAD + ↔ Acetaldehyd + NADH + H + (Alkoholdehydrogenase, ADH) 

Glutamat + NAD + ↔ α-Ketoglutarat + NADH + H + (Glutamatdehydrogenase) 

Malat + NAD + ↔ Oxalacetat + NADH + H + (Malatdehydrogenase) 

Lactat + NAD + ↔ Pyruvat + NADH + H + (Lactatdehydrogenase) 

Da es sich um Gleichgewichtsreaktionen handelt, kann man diese Reaktionen für die Konzentrationsbestimmung 

sowohl der Substrate wie auch der Produkte benutzen. 

Durch Ankopplung einer solchen Reaktion an eine enzymatische Umsetzung, die selbst nicht zu 

einer Veränderung von photometrisch oder fluorimetrisch erfassbaren Parametern führt, lassen 

sich sehr viele Metaboliten spezifisch und empfindlich nachweisen. 

Bestimmung der Konzentration von Metaboliten durch gekoppelte Messungen, 

(s. VA Enzymatische Analytik, Glucosebestimmung mit Hexokinase) 

Enzymatische Analysen als direkte oder gekoppelte optische Tests sind in der Klinischen Chemie 

und der Lebensmittelanalytik weit verbreitet. Die Spezifität der Enzymreaktionen ermöglicht 

eine gezielte Analytik, die fotometrische Detektion eine Automation der Analysen. 

Grundsätzlich unterscheidet man bei enzymatischen Konzentrationsbestimmungen zwei Verfahren, 

die Endwertmethode (Endpunktbestimmung) und die kinetische Methode, von denen aber 

nur die Endwertmethode hier beschrieben werden soll. 

Das Grundprinzip ist: 

• Der zu bestimmende Stoff wird mit Hilfe des spezifischen Enzyms und Coenzyms umgesetzt. 

• Die Stoffmenge der Substanz und die Stoffmenge reduziertes Coenzym sind proportional 

zueinander. 

• Das reduzierte Coenzym wird fotometrisch bestimmt. 

• Die Daten werden auf den zu bestimmenden Stoff (Analyt) umgerechnet. 

Um Endpunktbestimmungen durchführen zu können, d.h. um "vollständige" Umsetzung in eine 

Richtung zu erreichen, obwohl Enzymreaktionen bekanntermaßen Gleichgewichtsreaktionen 

sind und um den vollständigen Umsatz in angemessener Zeit zu erzielen, sind folgende Kriterien 

zu beachten:



• Es muss mit hohem Coenzymüberschuss bzw. mit sogenannten Fängern für die Reaktionsprodukte 

gearbeitet werden. Für die Bestimmung von z.B. Ethanol mit Hilfe von ADH wird 

man einen Überschuss an NAD + verwenden, die Reaktion bei leicht alkalischem pH durchführen, 

um die entstehenden Protonen zu neutralisieren und Semicarbazid zusetzen, um das 

entstandene Aldehyd zu binden. 

• Die Substratkonzentration sollte immer weit unter KM liegen. 

(KM(Alkoholdehydrogenase aus Hefe ≈ 10 -2 mol/l) 

• Es ist eine relativ hohe Enzymmenge einzusetzen (s.u.). 

• Die Reaktionsbedingungen (Temperatur, pH, usw.) sollten für das Enzym optimal sein. 

Hinweise zur Probenvorbereitung: 

• Lösen der Substanzen im Testpuffer(Coenzym), stabilisierenden Puffersystemen (Enzym) 

und i.d.R. A.dest.(Probe). 

• bei biologischen Proben ggf. schonende Enteiweißung mit Perchlorsäure oder Trichloressigsäure. 

Neutralisierung mit KOH oder KHCO3 (Vorsicht, schäumt!). Abzentrifugieren des 

Niederschlags. 

• eventuell Zugabe einer Standardmenge der zu analysierenden Substanz. 

• Vorwärmen des kompletten Testgemischs (einschließlich Enzym). 

Hinweise zur Durchführung: 

• Vorlegen des kompletten Testgemisches außer dem Enzym 

• Messung des Nullwerts (konstantes Signal erforderlich) 

• starten mit Enzym 

• Inkubation bis zum Stillstand der Reaktion 

• Messung des Probenwerts (oder Standards). 

Auswertung: 

Berechnung der Differenz von Proben- und Nullwert. Ablesen der Konzentration aus einer 

Eichkurve oder Berechnung an Hand von Eichfaktoren (molarer Extinktionskoeffizient). 

Überprüfung der Testmethode: 

Folgende Kriterien sind Hinweise auf eine richtige Versuchsdurchführung: 

• Proportionalität von Einwaage und Analysenergebnis bei verschiedenen Einwaagen 

• Proportionalität zwischen eingesetztem Probevolumen (bei flüssigen Proben) und Analysenergebnis 

(bei konstantem Gesamtvolumen!) 

• quantitative Wiederfindung einer vor Probenvorbereitung zugemischten bekannten Menge 

der zu bestimmenden Substanz (Standard-Additionsverfahren). 

Fehlerquellen: 

• Überschreiten des optimalen Konzentrationsbereichs 

• "Schleichreaktion" - Beseitigung: Extrapolation oder Messung gegen Leerwert 

• störende Nebenreaktion - Beseitigung: Vorlauf ohne Enzymzusatz 

• ungenügende Spezifität des Enzyms.



Enzymatische Konzentrationsbestimmung von Ethanol (Kit) 

Vorbemerkungen: 

Ethanol wird durch Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD + ) in Gegenwart des Enzyms Alkoholdehydrogenase 

(ADH) zu Acetaldehyd oxidiert: 

Ethanol + NAD + Alkoholdehydrogenase (ADH) Acetaldehyd + NADH + H + 

Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite von Ethanol und NAD + . Durch alkalisches 

Milieu und durch Abfangen des gebildeten Acetaldehyds kann das Gleichgewicht auf die rechte 

Seite verschoben werden. 

In dem kommerziell erhältlichen Kit wird das entstandene Acetaldehyd in Gegenwart von Aldehyddehydrogenase 

(Al-DH) quantitativ zu Essigsäure oxidiert: 

Acetaldehyd + NAD + + H20 Aldehyddehydrogenase (Al-DH) Essigsäure + NADH + H + 

NADH ist Messgröße und aufgrund seiner Absorption bei 340nm zu bestimmen. 

Da pro Ethanolmolekül zwei NADH H + -Moleküle entstehen, ist die Ethanolmenge der doppelten 

NADH +H + -Menge äquivalent. 

Reagenzien des Kits: 

1. Flasche 1 mit ca. 100ml Lösung, zusammengesetzt aus: Kaliumdiphosphat-Puffer, pH ca. 9,0; Stabilisatoren. 

Lösung 1 ist stabil bei +4°C 

2. Flasche 2 mit ca. 30 Tabletten; jede Tablette enthält: NAD, ca. 4mg; Aldehyddehydrogenase, ca. 0,8U; 

Stabilisatoren. Der Inhalt der Flasche 2 ist stabil bei +4°C 

3. Flasche 3 mit ca. 1,6ml Suspension, ADH, ca. 7000U. Der Inhalt der Flasche 3 ist stabil bei +4°C 

4. Ethanol-Standardlösung zur Testkontrolle (Die Messung der Standardlösung ist nicht erforderlich zur 

Berechnung von Ergebnissen.) Standardlösung unverdünnt verwenden. 

Herstellung der Lösungen: 

1. Inhalt der Flasche 1 unverdünnt verwenden. 

2. In einem Becherglas oder Zentrifugenglas je nach Anzahl der Bestimmungen für jeden Test (Leerwert 

und Proben) eine Tablette aus Flasche 2 mit drei ml Lösung aus Flasche 1 lösen (zur Entnahme der 

Tabletten aus Flasche 2 Pinzette benutzen), ergibt Reaktionsgemisch 2, das bei +4°C 1 Tag haltbar ist. 

3. Inhalt der Flasche 3 unverdünnt verwenden. 

Bestimmungsansatz: 

Wellenlänge 340nm 

Küvette: Glas oder Kunststoff, 

1cm Schichtdicke 

Temperatur: 20-25°C 

Testvolumen: 3,150ml 

Messung: gegen Luft oder Wasser 

oder Leerwert bei Verwendung 

eines Zweistrahlfotometers 

Probelösung: 0,3-6µg Ethanol in 

0,1ml Probevolumen 

In Küvetten 1) pipettieren Leerwert Probe 

Reaktionsgemisch 2 3,000ml 3,000ml 

A.dest. 0,100ml --------- 

Probelösung 2) --------- 0,100ml 

Mischen 3) , nach ca. 3min Extinktionen der Lösungen messen 

(E1). Reaktion starten durch Zugabe von: 

Suspension 3 0,050ml 0,050ml 

Mischen, Stillstand der Reaktion abwarten (5–10min) und 

Extinktionen der Lösungen messen (E2). Falls die Reaktion 

nach 10min nicht zum Stillstand gekommen ist, Extinktionen 

weiter in 2min-Abständen messen, bis keine Extinktionszunahme 

mehr erfolgt. 

Für Leerwert und Probe Extinktionsdifferenzen (E2-E1) 

Originalvorschrift des Kits! berechnen: 4) E = (E2 – E1)Probe - (E2 – E1)Leerwert 

für Zweistrahlfotometer: E = E2 Probe – E2 Leerwert 

1) 

normale Küvetten - keine Halbmikro – verwenden. 

2) 

Vor der Dosierung der Probelösung Pipettenspitze der Kolbenhubpipette mit der Probelösung vorspülen. 

Probelösung stets direkt in das Reaktionsgemisch 2 pipettieren. 

3) 

Küvetten vor dem Mischen mit Parafilm verschließen. 

Es ist unbedingt notwendig, während der gesamten Messung die Küvetten mit Parafilm verschlossen zu 

halten! (s. Hinweise zur Testdurchführung) 

4) 

Die gemessene Extinktionsdifferenz sollte zur Erzielung eines ausreichend präzisen Ergebnisses in der Regel 

mindestens 0,100 Extinktionseinheiten betragen.



Berechnung: 

Nach der allgemeinen Berechnungsformel für die Bestimmung der Konzentration gilt: 

VT 

⋅ M ⋅ FV 

3, 

150 ⋅ 46, 

07 ⋅ Fv 

ß = ⋅ ∆E 

[g/l] für Ethanol ß = ⋅ ∆E 

= 0, 

115 ⋅ ∆E 

⋅ Fv [g/l] 

ε ⋅ d ⋅VP 

⋅ Ä 

6, 

3⋅1000 

⋅1, 

00 ⋅ 0, 

100 ⋅ 2 

ß = Massenkonzentration der Substanz in der Analysenprobe [g/l bzw. mg/ml], 

VT = Gesamtvolumen des Testansatzes [ml], M = molare Masse der Substanz [g/mol], 

FV = Verdünnungsfaktor zwischen Probe im Testansatz und Analysenprobe, 

ε = mol. Extinktionskoeffizient, von NADH bei 340nm = 6,3x10 3 [l x mol -1 x cm -1 ], 

d = Schichtdicke der Küvette [cm], VP = Probevolumen im Testansatz [ml], Ä = stöchiometrischer Äquivalenzfaktor 

zwischen Reagenz und Substanz, ∆E = Extinktionsänderung. 

Hinweise zur Testdurchführung: 

In der Küvette muss die Ethanolmenge zwischen 0,3µg und 6µg betragen. Zur Erzielung einer ausreichend 

hohen Extinktionsdifferenz ist die Probelösung soweit zu verdünnen, dass die Ethanol- 

Konzentration zwischen 0,01 und 0,06g/1 liegt. 

Bedingt durch die hohe Empfindlichkeit der Methode ist darauf zu achten, dass ethanolfreies Wasser 

verwendet wird und in ethanolfreier Atmosphäre gearbeitet wird. 

Verdünnungstabelle: 

Geschätzte Menge Verdünnung Verdünnungs- 

Ethanol [g/l] mit A.dest. faktor F 

< 0,06g ---- 1 

0,06-0,6g 1 + 9 10 

0,6-6,0g 1 + 99 100 

6,0-60g 1 + 999 1000 

> 60g 1 +9999 10000 

Ist die gemessene Extinktionsdifferenz (∆E) zu 

klein (z.B. < 0,100), so ist die Probelösung erneut 

herzustellen (höhere Einwaage oder weniger 

starke Verdünnung), oder das in die Küvette 

zu pipettierende Probevolumen (VP) ist bis auf 

0,500 ml zu erhöhen. Das Volumen an Lösung 1 

bzw. Reaktionsgemisch 2 bleibt dabei unverändert 

(3,000ml). In gleichem Maße ist das in die 

Leerwert-Küvette zu pipettierende Volumen an A.dest zu erhöhen. Geändertes Probevolumen VP und 

Testvolumen VT sind in die Berechnungsformel entsprechend einzusetzen. 

Wegen der Flüchtigkeit von Ethanol wird beim Verdünnen A.dest vorgelegt und die Probe unter die Wasseroberfläche 

pipettiert. 

Spezifität der Bestimmung: 

Der Einfluss von Aldehyden und Ketonen wird durch die Reihenfolge der Reagenzienzugabe beim Test 

ausgeschaltet. Methanol wird wegen ungünstiger KM-Werte der verwendeten Enzyme nicht umgesetzt. 

n-Propanol und n-Butanol werden unter Testbedingungen quantitativ umgesetzt, höhere primäre Alkohole 

führen zu probenabhängigen Schleichreaktionen. Sekundäre, tertiäre und aromatische Alkohole reagieren 

nicht. Glycerin stört den Test auch bei höheren Konzentrationen nicht. 

Bei der Analyse von Reinsubstanz Ethanol ist mit Ergebnissen von ca. 100% zu rechnen. (Eine Wiederfindung 

von weniger als 100% bedeutet nicht unbedingt eine unvollständige Umsetzung bei der enzymatischen 

Bestimmung, sondern ist eher ein Hinweis für den Verlust an Analyt während der Handhabung, 

dem Verlust an Analyten bei der Herstellung der Ethanollösung und beim Pipettieren der verdünnten 

Ethanollösung in den Testansatz.) 

Empfindlichkeit und Nachweisgrenze: 

Die geringste Extinktionsdifferenz, die das Verfahren unterscheiden kann, beträgt 0,005 Extinktionseinheiten. 

Das entspricht bei einem maximal einzusetzenden Probevolumen VP = 0,500ml bei einem Testvolumen 

VT = 3,550ml und Messung bei 340nm einer Konzentration an Ethanol von ca. 0,1mg/1 (bei VP = 

0,100ml und VT = 3,150ml entsprechend 0,6mg/1 Probelösung). 

Die Nachweisgrenze von 0,5mg/1 ergibt sich aus der Extinktionsdifferenz von 0,020 (gemessen bei 

340nm), dem maximalen Probevolumen VP = 0,500ml und dem Testvolumen VT = 3,550ml. 

Linearität: 

Linearität der Bestimmung ist gegeben von ca. 0,3µg Ethanol/Ansatz (0,5mg Ethanol/1 Probelösung; 

Probevolumen VP = 0,500ml; Testvolumen VT = 3,550ml) bis 12µg Ethanol/Ansatz (0,12g Ethanol/1 

Probelösung; Probevolumen VP = 0,100ml; Testvolumen VT =3,150ml). 

Präzision: 

Bei einer Doppelbestimmung, ausgehend von einer Probelösung, ist mit Unterschieden bei den Extinktionsdifferenzen 

von 0,005 bis 0,010 Extinktionseinheiten zu rechnen. Das entspricht bei einem Probevo-



lumen VP = 0,100ml und einem Testvolumen VT = 3,150 ml einer Ethanol-Konzentration von ca. 

0,5-1mg/l. (Ist bei der Probenvorbereitung eine Verdünnung vorgenommen worden, ist mit dem Verdünnungsfaktor 

F zu multiplizieren. Bei einer Einwaage von 1g Probe/100ml = 10g/1 sind die zu erwartenden 

Unterschiede ca. 0,005-0,01g/100g.) 

Störungen: 

Ethanol im verwendeten A.dest. oder in der Laborluft führt zu erhöhten Leerwerten bzw. zu Schleichreaktionen. 

Deshalb ist das Verschließen der Küvetten beim Testansatz erforderlich. 

Erkennen von Störungen: 

1. Ist die Umsetzung von Ethanol nach der unter 'Bestimmungsansatz' angegebenen Zeit beendet, so kann 

im allgemeinen auf einen störungsfreien Ablauf geschlossen werden. 

2. Nach Ablauf der Reaktion kann durch Zugabe von Ethanol (qualitativ oder quantitativ) die Reaktion 

wieder gestartet werden: Die erneute Änderung der Extinktion nach Zugabe des Standardmaterials ist ein 

Beweis für den störungsfreien Ablauf der Bestimmung. 

3. Grobe Fehler beim Testansatz und Störungen der Bestimmung durch Inhaltsstoffe der Probe können 

auch erkannt werden, wenn aus einer Probelösung eine Doppelbestimmung mit verschiedenen Probevolumina 

(z.B. 0,100ml und 0,200ml) ausgeführt wird: Die gemessenen Extinktionsdifferenzen müssen den 

eingesetzten Probevolumina proportional sein. 

Bei der Analytik fester Proben wird die Einwägung verschiedener Mengen (z.B. 1g und 2g) in 100ml 

Messkolben empfohlen. Bei gleichen Probenvolumina für die Testansätze muss Proportionalität zwischen 

Extinktionsdifferenz und Einwaage gegeben sein. 

4. Störungen der Bestimmung durch Inhaltsstoffe der Probe können weiterhin durch Mitführen eines internen 

Standards erkannt werden: Neben Proben-, Leerwert- und Standardansatz wird ein weiterer Ansatz 

mit Probe- und Standardlösung analysiert. Aus den ermittelten Extinktionsdifferenzen wird die Wiederfindung 

berechnet. 

5. Verluste während der Probenvorbereitung können durch Wiederfindungsversuche erkannt werden: Die 

Probe wird mit und ohne zugesetztem Standardmaterial vorbereitet und anschließend gemessen. Der Zusatz 

muss (innerhalb des Analysenfehlers) quantitativ wiedergefunden werden. 

Gefährlichkeit der Reagenzien: 

Die Reagenzien zur Bestimmung von Ethanol sind keine gefährlichen Stoffe oder Zubereitungen im Sinne 

der Gefahrstoffverordnung. Die beim Umgang mit Chemikalien üblichen Vorsichtsmaßnahmen sollten 

jedoch beachtet werden. Nach Gebrauch können die Reagenzien zum Abwasser gegeben werden. 

Allgemeine Hinweise zur Probenvorbereitung: 

Flüssige, klare, farblose und annähernd neutrale Proben direkt, nach Verdünnen gemäß Verdünnungstabelle 

(zur Vermeidung von Ethanol-Verlusten ist die zu verdünnende Lösung immer unter die 

Oberfläche des Verdünnungsmittels zu pipettieren) oder mit einem Probevolumen bis 0,500ml zum Test 

einsetzen; 

trübe Lösungen filtrieren (es können hierbei geringe Verluste an Ethanol auftreten); 

Kohlensäure-haltige Proben (z. B. durch Filtration) entgasen (es können hierbei geringe Verluste an 

Ethanol auftreten) oder mit Ätzkali (KOH) oder Ätznatron (NaOH) alkalisieren, um CO2 in Form von 

Bikarbonat zu binden; 

saure Proben durch Zugabe von Natronlauge oder Kalilauge auf pH 8-9 einstellen; 

saure und schwach gefärbte Proben durch Zugabe von Natronlauge oder Kalilauge auf pH 8-9 einstellen 

und ca. 15min stehen lassen; 

'stärker gefärbte' Proben (falls erforderlich auf pH 8-9 eingestellt) gegen Probenleerwert (= Puffer bzw. 

A.dest. + Probe) messen (Fotometer mit Probenleerwert im Strahlengang auf 0,000 einstellen); 

stark gefärbte Proben, mit Polyamid oder Polyvinylpolypyrrolidon, PVPP (z.B. 2g/100ml Probe) behandeln 

(es können hierbei geringe Verluste an Ethanol auftreten); 

feste und halbfeste Proben zerkleinern oder homogenisieren, mit Wasser extrahieren bzw. lösen, wenn 

nötig filtrieren; ggf. Trübstoffe und Farbstoffe mit Carrez-Reagenzien (s. u.) entfernen; 

Protein-haltige Proben mit Carrez-Reagenzien (s. u.) klären oder mit Perchlorsäure enteiweißen; 

Fett-haltige Proben mit warmem Wasser in einem Kölbchen mit Steigrohr extrahieren, zur Abscheidung 

des Fettes abkühlen lassen, Steigrohr mit Wasser nachspülen, filtrieren; alternativ nach Extraktion mit 

warmem Wasser mit Carrez-Reagenzien klären. 

Carrez-Klärung: 

Carrez-I-Lösung: Kalium-hexacyanoferrat(II), 85mmol/l = 3,6g K4[Fe(CN)6] x 3H20/100ml 

Carrez-II-Lösung: Zinksulfat, 250mmol/l = 7,2g ZnS04 x 7H20/100ml



Geeignete Probenmenge in einen 100ml Messkolben genau einwägen bzw. pipettieren, ca. 60ml A.dest. 

hinzufügen. Anschließend 5ml Carrez-I-Lösung und 5 ml Carrez-II-Lösung sorgfältig dosieren. Mit Natronlauge, 

0,1mol/l, pH 7,5-8,5 einstellen. Nach jeder Zugabe kräftig mischen, Messkolben mit Wasser bis 

zur Marke auffüllen, mischen und filtrieren. 

Anwendungsbeispiele: 

Bestimmung von Ethanol in Alkohol-armem und Alkohol-freiem Bier: 

Ca. 100ml Probe im Becherglas unter vorsichtigem Rühren mit festem Ätzkali (KOH) oder Ätznatron 

(NaOH) versetzen bis ein pH-Wert von ca. 8-9 erreicht ist. Lösung, ggf. nach Verdünnen gemäß Verdünnungstabelle, 

zum Test einsetzen. 

Bestimmung von Ethanol in Essig: 

Essig ggf. filtrieren und neutralisieren. Wenn stärker verdünnt wird, ist Neutralisieren nicht erforderlich. 

Bestimmung von Ethanol in Protein-haltigen Proben: 

Protein-haltige Proben oder Probelösungen mit Perchlorsäure (1mol/l) im Verhältnis 1 : 3 (1 + 2) enteiweißen, 

dann zentrifugieren und Überstand mit Kalilauge (2mol/l) neutralisieren. 

Bestimmung von Ethanol in Fruchtsäften: 

a) Klare, helle Säfte nach Neutralisation und je nach Alkoholgehalt verdünnt (s. Verdünnungstabelle) 

zum Test einsetzen. 

b) Dunkle Säfte zur Entfärbung am günstigsten mit 2% Polyamid oder Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) 

(z.B. 5ml Saft + 100mg Polyamid oder PVPP) 2min lang (Gefäß verschlossen halten) rühren und filtrieren; 

die meist klare Lösung nach Neutralisation zum Test einsetzen. Bei Verdünnen der Probe erübrigt 

sich oft eine Entfärbung. 

c) Trübe Säfte filtrieren, ggf. mit Carrez-Lösungen klären: 10ml Saft in einen 25ml Messkolben pipettieren, 

1,25ml Carrez-1-Lösung, 1,25ml Carrez-II-Lösung und 2,50ml NaOH (0,1mol/l) zufügen, nach 

jeder Zugabe kräftig schütteln, mit A.dest. auf 25ml auffüllen, filtrieren (Verdünnungsfaktor F = 2,5). 

Klare, höchstens schwach opaleszierende Probelösung zum Test, ggf. nach weiterem Verdünnen, einsetzen. 

Bestimmung von Ethanol in alkoholhaltigen Getränken: 

a) Wein: Weine werden mit A.dest. auf die geeignete Konzentration (s. Verdünnungstabelle) verdünnt. 

Entfärben und Neutralisieren ist nicht erforderlich. 

b) Bier: Etwa 5-10ml Bier filtrieren oder im Becherglas ca. 30s lang mit einem Glasstab zur Entfernung 

der Kohlensäure rühren. Probe mit Wasser 1 : 1000 (1 + 999) verdünnen und zum Test einsetzen. 

c) Likör: Dünnflüssige Liköre zum Verdünnen in entsprechenden Messkolben pipettieren und mit Wasser 

bis zur Marke auffüllen. 

Dickflüssige Liköre (z.B. Eierlikör): ca. 1g Likör in einen 100ml Messkolben genau einwägen, mit 

A.dest. bis zur Marke auffüllen, zur Fettabscheidung in den Kühlschrank stellen, filtrieren. Klare Lösung 

mit Wasser 1 : 100 (1 + 99) verdünnen und zum Test einsetzen. Ergebnis in g/100g berechnen. 

d) Branntwein: Bei Verdünnung auf geeignete Konzentration (z.B. 1 + 9999) die üblichen Maßnahmen 

bei der Probeentnahme von alkoholischen Getränken beachten. Messwerte (g Ethanol/l Lösung) anhand 

von Tabellen in Volumenprozente (v/v) umrechnen. 

Bestimmung von Ethanol in Pralinen, Bonbons und anderen alkoholhaltigen Schokoladen- 

Erzeugnissen: 

Pralinen mit dünnflüssigen Füllungen (Weinbrandbohnen, -kirschen): 

Eine Praline vorsichtig öffnen; 0,50ml der Füllung in einen mit ca. 25ml Wasser gefüllten 50ml Messkolben 

pipettieren, Pipettenspitze dabei in das Wasser eintauchen. Messkolben mit Wasser bis zur Marke 

auffüllen, verschließen, mischen. Lösung im Verhältnis 1 : 20 (1 + 19) mit Wasser verdünnen. 0,100ml 

der verdünnten Lösung zum Test einsetzen (Verdünnungsfaktor F = 2000). 

Schokoladenerzeugnisse mit dickflüssigen Füllungen: 

Die Füllung von 1 oder mehreren Bonbons oder Pralinen in einen mit ca. 5ml Wasser gefüllten 50ml 

Messkolben genau einwägen (wenn mit Hilfe einer Pipette eingewogen wird, soll die Pipettenspitze den 

Wasserspiegel nicht berühren); mit Wasser bis zur Marke des Messkolbens auffüllen; mischen, gegebenenfalls 

filtrieren und soweit verdünnen, dass der Alkoholgehalt der Probe unter 0,12g/l liegt. 

Bestimmung von Ethanol in Konfitüren: 

Probe gut homogenisieren (Mixer etc.) und ca. 10-20g in ein Becherglas genau einwägen. Mit etwas 

Wasser verrühren und Mischung ggf. mit Kalilauge neutralisieren, quantitativ in einen 100ml Messkolben 

überspülen, mit A.dest. bis zur Marke auffüllen.Lösung ggf. mit 2% Polyamid oder PVPP entfärben (s. 

oben), filtrieren, Filtrat unverdünnt zum Test einsetzen.



Konzentrationsbestimmung von Ethanol mit selbst hergestellten Reagenzien: 

Vorbemerkungen: 

Enzymatische Konzentrationsbestimmungen lassen sich auch ohne den jeweiligen Testkit durchführen. 

In diesem Fall müssen die Reagenzien selbst hergestellt werden. Dabei orientiert man 

sich an den Angaben des Testkits bzw. den allgemeinen Richtlinien zur Durchführung enzymatischer 

Analysen (s.o. Basisinformationen). In gewissem Maße kann man auch Änderungen in der 

Testdurchführung vornehmen, wenn o.g. Kriterien beachtet werden. 

So soll die enzymatische Ethanolbestimmung nur mit einem Enzym, der Alkoholdehydrogenase 

= ADH und Abfangen des entstehenden Acetaldehyds mit Semicarbazid erfolgen. Da in diesem 

Fall pro Ethanolmolekül nur ein NADH + H + -Molekül entsteht, ist die während der Reaktion 

gebildete NADH + H + -Menge der eingesetzten Ethanolmenge direkt äquivalent. 

Außerdem soll das Testvolumen auf etwa 2ml (1,8ml NAD-Lösung, 0,1ml Probe, 0,05ml ADH) 

verringert und 2ml Reaktionsgefäße verwendet werden. So ergibt sich eine bequemere Durchführung 

des Tests (mischen, verschlossen halten der Reaktionsansätze). 

Die Reagenzien müssen natürlich an die veränderte Testdurchführung angepasst werden. 

Durchführung: 

Es sollen für etwa 16 Tests (5-6 Konzentrationen für eine Eichkurve, 2 verschiedene Proben in 2 

Verdünnungsstufen, jeweils Doppelbestimmungen, 2 Leerwerte) die benötigten Puffer, NAD- 

Lösung und Enzymlösung hergestellt werden. Außerdem sind eine Ethanol-Stammlösung und 

daraus die benötigten Verdünnungen für eine Eichkurve herzustellen. 

• Stellen Sie 100ml Testpuffer her: 

0,1M Natriumpyrophosphat- = tetra-Natriumdiphosphat-Puffer, 

0,5% Semicarbazid-hydrochlorid enthaltend 

mit 1M NaOH auf pH 8,8 eingestellt 

M[Na4P2O7 x 10H2O] = 446g/mol 

• Berechnen Sie den Messbereich in µg Ethanol/Test, der sich durch die veränderten Rahmenbedingungen 

(s.o.) ergibt, wenn Emin nicht kleiner als 0,1, Emax nicht größer als 1,1 sein 

soll. 

• Kalkulieren Sie die Konzentration der herzustellenden NAD-Lösung. Der erforderliche 

Überschuss an NAD im Test soll in etwa dem im Testkit entsprechen. 

Vergleichen Sie dazu den maximalen NAD-Verbrauch = NADH-Bildung bei vorschriftsmäßiger 

Anwendung des Testkits (Messbereich: 0,3-6µg Ethanol/Testansatz, 

M[Ethanol] = 46g/mol, 1 Ethanol → 2 NADH) mit der pro Ansatz eingesetzten NAD-Menge 

(4mg Tablette/Ansatz, M[NAD] = 663,4g/mol). 

Berechnen Sie die erforderliche Konzentration der herzustellenden NAD-Lösung unter Berücksichtigung 

des ermittelten Messbereichs (s.o.), des gewünschten Überschusses und dem 

eingesetzten Volumen (1,8ml) pro Test. 

Lassen Sie die Praktikumsleitung Ihre Kalkulation überprüfen. 

Stellen Sie 30ml NAD-Lösung in Testpuffer der berechneten Konzentration her. 

• Stellen Sie 25ml Lösung zur Suspension der ADH her: 

2,4M (NH4)2SO4 in Testpuffer, 

0,2% Rinderserumalbumin (BSA) enthaltend 

M[(NH4)2SO4] = 132g/mol 

• Berechnen Sie die einzuwiegende Masse des zur Verfügung stehenden ADH-Lyophilisats für 

10ml ADH-Suspension, wenn die eingesetzten Enzymeinheiten (in 0,05ml) dem Testkit in 

etwa entsprechen sollen (0,05ml, 7000U/1,6ml). 

Es werden i.d.R. 10ml ADH-Suspension für die gesamte Praktikumsgruppe hergestellt! 

• Planen Sie die Herstellung einer Ethanol-Stammlösung aus vergälltem Ethanol (99%, 

= 0,79g/ml, M = 46g/mol) und die notwendigen Verdünnungen zur Herstellung der Eichlösungen 

innerhalb des oben berechneten Messbereichs. Besprechen Sie Ihren Plan mit der



Praktikumsleitung. Stellen Sie die Stammlösung und die Verdünnungsreihen in verschließbaren 

10ml Einweg-Röhrchen bzw. 2ml Reaktionsgefäßen her. 

• Wählen Sie zwei alkoholhaltige Proben zur Bestimmung ihres Ethanol-Gehaltes. 

Verdünnen sie die Proben nach ihrem geschätzten Alkoholgehalt in den Messbereich. 

Stellen Sie für die Messung sicherheitshalber zwei Verdünnungsstufen her. 

• Entwickeln Sie einen Bestimmungsansatz in Anlehnung an den des Testkits. 

• Pipettieren Sie die verschiedenen Reagenzien gemäß Ihres Bestimmungsansatzes in Halmikroküvetten 

und verschließen Sie die Küvetten mit Parafilm. Stellen Sie den Leerwert 2x 

her. 

• Richten Sie das Fotometer für die Bestimmung ein. 

• Bestimmen Sie zunächst die Absorption aller Proben gegen den Leerwert vor einer ADH- 

Zugabe (E1). Wozu dienen diese Messungen? 

Hinweis: Soll direkt von der Fotometer-Software aus den Standard-Messungen eine Eichkurve 

erstellt werden, so darf das Fotometer keinen Messauftrag für die Absorptionen E1 erhalten. 

Die Absorptionen vor der ADH-Zugabe sind in diesem Falle nur im Statusfenster abzulesen, 

zu notieren und zu prüfen, ob sie vernachlässigbar sind (Abs. E1 < 0,005). Sollten die 

Absorptionen E1 größer sein, sind die Differenzen gemäß Anleitung zu bilden und die Standards 

nachträglich zu editieren (siehe Bedienungsanleitung der Fotometer). 

• Geben Sie zu einem der beiden Leerwerte und allen Proben 0,05ml ADH und mischen Sie 

die Proben in den mit Parafilm verschlossenen Küvetten gründlich. 

• Vergleichen Sie die Absorptionen der Leerwerte ohne und mit ADH. 

Auch hier sollte die im Statusfenster angezeigte Absorption vernachlässigbar gering sein. 

(Es gibt jedoch ADH im Handel, die geringe Mengen NADH gebunden hat.) 

• Stellen Sie in den hinteren Zellenhalter den Leerwert mit ADH und in den vorderen die Eichlösung 

mit der höchsten Ethanolkonzentration. Im Statusfenster können Sie die Absorptionsänderung 

während der Reaktion verfolgen. 

Wenn die Absorption nicht mehr steigt, können die verschiedenen Eichlösungen und die entsprechend 

verdünnten Proben gegen den Leerwert mit ADH gemessen werden. 

• Erstellen Sie eine Eichkurve. 

Berechnen Sie mit Hilfe des Programms Excel die Geradengleichung für die Ausgleichsgerade 

sowie das Bestimmtheitsmaß (= Korrelationskoeffizient). 

Bestimmen Sie aus der Eichkurve den molaren Extinktionskoeffizienten ε für NADH. 

Vergleichen Sie den so ermittelten Wert für ε mit dem Literaturwert (s.u. Berechnung). 

• Ermitteln Sie die Ethanolkonzentration der beiden ausgewählten Proben 

1. aus der Eichkurve 

2. durch Berechnung (s.u. Berechnung). 

Berechnung: 

Nach der allgemeinen Berechnungsformel für die Bestimmung der Konzentration gilt: 

VT 

⋅ M ⋅ FV 

ß = ⋅ ∆E 

[g/l] 

ε ⋅ d ⋅VP 

⋅ Ä 

ß = Massenkonzentration der Substanz in der Analysenprobe [g/l bzw. mg/ml], 

VT = Gesamtvolumen des Testansatzes [ml], 

M = molare Masse der Substanz [g/mol], M(Ethanol) = 46g/mol, 

FV = Verdünnungsfaktor zwischen Probe im Testansatz und Analysenprobe, 

ε = mol. Extinktionskoeffizient, von NADH bei 340nm = 6,3x10 3 [l x mol -1 x cm -1 ], 

d = Schichtdicke der Küvette [cm], 

VP = Probevolumen im Testansatz [ml], 

Ä = stöchiometrischer Äquivalenzfaktor zwischen Reagenz und Substanz, 

∆E = Extinktionsänderung.



Literatur: 

Boehringer (r-biopharm) Methoden der biochemischen Analytik 

Follmann, Grundlagen der Biochemie, Uni Kassel Praktikum Biochemie 

Geckeler/Eckstein, Bioanalytische und biochemische Labormethoden, vieweg 

Kleber u.a., Biochemisches Praktikum, Gustav Fischer 

Lottspeich / Zorbas, Bioanalytik, Spektrum 

Matissek u.a., Lebensmittelanalytik, Springer 

Pingoud/Urbanke, Arbeitsmethoden der Biochemie, deGruyter 

Schwedt, Taschenatlas der Analytik, Thieme 

Suelter, Experimentelle Enzymologie, Gustav Fischer 

Urbach u.a., Praktikum zur Stoffwechselphysiologie der Pflanzen, Thieme 

Wilson/Goulding, Methoden der Biochemie, Thieme 

Bestimmungsansatz: 

In Reaktionsgefäße (2ml) Leerwert 

pipettieren 

1) 

Probe 2) 

NAD-Lösung 1,800ml 1,800ml 

A.dest. 0,100ml --------- 

Probelösung 3) 

Wellenlänge 340nm 

Küvette: Halbmikro, Kunststoff, 

1cm Schichtdicke 

Temperatur: 20-25°C 

Testvolumen: 1,95ml 

--------- 0,100ml 

Messung: gegen Leerwert, 

Zweistrahlfotometer 

Probelösung: 1,5-15µg Ethanol in 

0,1ml Probevolumen 

Reaktionsgefäße verschließen, mischen, nach ca. 3min 

1x Leerwert (Vergleichsküvette) und 1x Probenleerwert 

(Messküvette) umfüllen in Küvetten, Extinktion messen 

(E1). Reaktion in den Reaktionsgefäßen starten durch 

Zugabe von: 

ADH-Suspension 0,050ml 0,050ml 

Mischen, Stillstand der Reaktion abwarten (10min) 

und Extinktionen der Lösungen w.o.a. messen (E2). 

Falls die Reaktion nach 10min nicht zum Stillstand 

gekommen ist 4) , Extinktionen weiter in 2min- 

Abständen messen, bis keine Extinktionszunahme 

mehr erfolgt. 

Extinktionsdifferenzen 5) berechnen: 

Zweistrahlfotometer: E = (E2 – E1)Probe 

1) 

Leerwert 2x herstellen (1x für Vergleichsküvette vor der Inkubation und 1x mit Enzym für Vergleichsküvette 

nach der Inkubationszeit). 

2) 2x Probenleerwert herstellen (NAD-Lösung und Probenlösung höchster Konzentration, ohne Enzym) 

Extinktionen von Leerwert und Probenleerwert vor und nach der Inkubationszeit miteinander vergleichen: 

Extinktionen müssten konstant und sehr gering sein! 

3) Vor der Dosierung der Probelösung Pipettenspitze der Kolbenhubpipette mit der Probelösung vorspülen. 

Probelösung stets direkt in die NAD-Lösung pipettieren. 

4) Küvetten mit Parafilm verschließen. 

Es ist unbedingt notwendig, während der gesamten Messung die Küvetten mit Parafilm verschlossen zu 

halten! 

5) Die gemessene Extinktionsdifferenz sollte zur Erzielung eines ausreichend präzisen Ergebnisses in der Regel 

mindestens 0,100 Extinktionseinheiten betragen.

Enzymatische Analytik Ethanol

Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.

Template löschen?

Als Template speichern?