Facharbeit Restriktionsverdau am Plasmid pUC 18 ... - German Weber

Bernhard–Strigel–Gymnasium Kollegstufe/ Jahrgang: 2007/ 2009
Memmingen
Bewertung:
Facharbeit
Restriktionsverdau am
Plasmid pUC 18
Leistungskurs: Biologie
mit verschiedenen Enzymen
Abgegeben am: 30. 01. 2009
Kollegiat: Stefanie Funk
Facharbeit: Note:_________ Punkte:_________
Mündliche Prüfung: Note:_________ Punkte:_________
Gesamtergebnis: Note:_________ Punkte:_________
Datum und Unterschrift des Kursleiters:______________________________

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Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................... 2
1. Einleitung ........................................................................................................................ 3
2. Material ........................................................................................................................... 3
2.2 Verwendete Chemikalien ...................................................................................... 3 - 4
2.3 Verwendete Laborgeräte ............................................................................................ 4
3. Plasmidisolation.............................................................................................................. 4
3.1 Allgemeines zu Plasmiden .....................................................................................4 - 5
3.2 Isolation der Plasmide mit Hilfe eines QIAprep–Miniprep .................................. 5 - 7
3.3 Nachweis der isolierten Plasmide durch die Agarosegelelektrophorese............... 7 - 9
4. Restriktionsendonuklease–Verdau ................................................................................ 9
4.1 Allgemeines zum Restriktionsverdau ..................................................................9 - 11
4.2 Ergebnisse der jeweiligen Enzyme ........................................................................... 11
4.2.1 EcoRI ............................................................................................................... 12
4.2.2 Hind ................................................................................................................. 12
4.2.3 SalI................................................................................................................... 12
4.2.4 PvuI.................................................................................................................. 13
4.2.5 Cfr9I oder XmaI............................................................................................... 13
4.2.6 TaqI.................................................................................................................. 13
4.2.7 ApaLI ............................................................................................................... 14
4.2.8 ScrFI................................................................................................................. 14
4.2.9 SpeI .................................................................................................................. 15
5. Fehleranalyse ..........................................................................................................15 - 16
6. Literaturverzeichnis ...............................................................................................17 - 18
7. Selbstständigkeitserklärung ........................................................................................ 19
8. Anhang.................................................................................................................... 20 - 22

1. Einleitung
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Auf der Suche nach dem Thema für meine Facharbeit kamen wir auf die Idee, eine Testreihe
mit den im Biotechnologie-Labor vorhandenen Restriktionsenzymen (EcoR, Hind3, SalI,
PvuI, Cfr9I oder XmaI, TaqI, ApaLI, ScrFI und SpeI) zu machen. Dazu wird das Plasmid
pUC 18 (2686 bp) aus E. coli Bakterien isoliert und danach jeweils mit einem der
Restriktionsenzyme zusammengegeben. Meine Aufgabe ist es, die Schnittstellen der
Restriktionsenzyme zu überprüfen, d. h. zu kontrollieren ob sie an den richtigen Stellen
schneiden und ob sie bei pUC 18 überhaupt schneiden, also noch funktionsfähig sind. Der
Vergleich, ob die Schnittstellen richtig sind ist möglich, durch Vorgaben aus dem Internet
(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php).
Obwohl ich nicht an dem von Herrn Schmitt geleiteten Praktikum in unserem Biotechnologie-
Labor teilgenommen habe, hat mich die Mikrobiologie als Facharbeitsthema interessiert. Mir
war klar, dass es schwierig werden würde, da es in der Mikrobiologie wichtig ist, sehr genau
zu sein. Jedoch überwog die Neugier darauf einfach mal genauer zu sehen, wie die
Laborarbeit funktioniert.
Die nachfolgenden Seiten lassen tiefer in meine Laborarbeit blicken. Beginnend mit der
Präparation der Plasmide bis zu dem Versuchsaufbau und den Ergebnissen des
Restriktionsendonuklease-Verdaus.
2. Material
2.1 Verwendete Chemikalien
► QIAprep- Miniprep
► Restriktionsenzyme (EcoR, Hind3, SalI, PvuI, Cfr9I oder XmaI, TaqI, ApaLI, ScrFI
und SpeI)

► Gelladungspuffer
► Elektrophoresepuffer (TAE- Puffer)
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► DNA Größenstandard “Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM 03131”
► Ethidiumbromidlösung
2.2 Verwendete Laborgeräte
► sterile Eppendorfgefäße
► Pipetten mit passenden, sterilen Spitzen
► Heizblock
► Schüttler
► Vortexer
► Zentrifuge
► Autoklav
► Gelkammer
► Laborwaage
► Spannungsquelle
► UV-Leuchttisch
► sterile Reagenzgläser
► Kühlschrank
► Gefrierschrank
► Reinigungssäule
3. Plasmidisolation
3.1 Allgemeines zu Plasmiden
Informationen zu den Plasmiden fand ich unter www.nugi-zentrum.de, 2006 a.
Plasmide sind wichtige Werkzeuge der Biochemie, Molekularbiologie und der Genetik. Es
sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die mehrere Gene enthalten können. Aufgrund ihrer
Größe (zwischen 1 und 25 kBp) ist es, beispielsweise für Versuche im Labor, einfacher die

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Plasmide aus Bakterien zu isolieren, anstatt deren chromosomale DNA, weil diese im
Vergleich zu den Plasmiden ziemlich groß ist. Außerdem sind die Informationen in der
chromosomalen DNA nicht so kompakt verpackt wie in den Plasmiden, was für einen
weiteren Vorteil der Plasmide, speziell bei der Isolation spricht.
Abbildung 1: pUC 18 Abbildung 2: chromosomale DNA & Plasmid
3.2 Isolation der Plasmide mit Hilfe eines QIAprep–Miniprep
Die Plasmidisolation wird auch alkalische Lyse genannt.
Im Wesentlichen besteht sie aus der alkalischen Lyse und der Reinigung der Plasmid-DNA.
Hierbei werden die Zellwände der Bakterien mit einer alkalischen Lösung
(Natriumdodecylsulfat) aufgeschlossen und denaturiert. Die brauchbare Plasmidlösung erhält
man dann, indem man die Bakterien vom Medium abzentrifugiert und somit die
chromosomale DNA und die restlichen Zellbestandteile auf den Boden des Reagenzglases
gelangen und nicht mehr mit der Plasmidlösung vermengt sind.
∗ Zu Beginn wird ein LB-Flüssigmedium aus 6 ml demineralisiertem Wasser und 0,12 g LB-
Zubereitung hergestellt.
∗ Dann wird das Flüssigmedium mit Bakterien angeimpft. Es wird eine Übernacht-Kultur
hergestellt. Dazu werden 3 ml von dem LB-Flüssigmedium und 5 µl Ampicilin in ein
steriles Reagenzglas gegeben. Das Ampicilin wird dazu gegeben, weil das Plasmid pUC18
eine Ampicilinresistenz vorweist und somit gewährleistet ist, dass in dem Medium nur
pUC18 wächst und keine anderen Kulturen. Zu dem Flüssigmedium und dem Ampicilin
werden dann noch E. coli Bakterien (kommen im menschlichen und tierischen Darm vor)

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gegeben. Dazu wird eine sterile Pipettenspitze kurz in die Stammkultur eingetaucht und
danach wird sie mit Hilfe des Abwerfers in das Reagenzglas geworfen. Das Reagenzglas
wird anschließend für 37°C über Nacht in den Schüttler gestellt, dass die Bakterien
wachsen können.
∗ Mit der Übernacht-Kultur und einem QIAprep Kit (www1.qiagen.com) wird nun die
Plasmidisolation durchgeführt. Es werden 1,5 ml von der Bakterienlösung in ein
Eppendorfgefäß gegeben und danach 5 Minuten lang zentrifugiert. Anschließend pipettiert
man den Überstand heraus, so dass nur der weiße, feste Rest am Boden des
Eppendorfgefäßes übrig bleibt.
∗ Das übriggebliebene Pellet wird mit 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Man muss das
Eppendorfgefäß auf den Rüttler halten, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar sind.
∗ Danach werden noch 250 µl Puffer P2 dazugegeben. Man muss das Eppendorfgegäß jetzt
vier- bis sechsmal vorsichtig drehen. Vorsichtig drehen deshalb, weil ansonsten die
chromosomale DNA zerrissen werden kann und dies eventuell zu Problemen bei der
Identifizierung der Plasmide führt.
∗ Jetzt werden 350 µl vom Puffer N3 hinzugegeben. Das Eppendorfgefäß muss nun erneut
vier- bis sechsmal vorsichtig gedreht werden, um die Flüssigkeiten zu vermischen, ohne
die chromosomale DNA zu beschädigen. Die Lösung sollte jetzt trüb werden.
∗ Diese Lösung wird dann für zehn Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert, so dass ein weißes,
festes Pellet am Boden des Eppendorgefäßes entsteht.
∗Der flüssige Überstand (ca.850 µl), der nach dem Zentrifugieren in dem Eppendorfgefäß ist,
wird in eine Reinigungssäule (vorher in ein Eppendorfgefäß stecken) des QIAprep Kits
pipettiert.
∗ Danach wird die Lösung nochmals 30 - 60 s zentrifugiert und der Rückstand der sich nach
dem Zentrifugieren im Eppendorfgefäß befindet wird verworfen.
∗ In die Reinigungssäule werden nun 0,5 ml des Puffers PB pipettiert. Diese Lösung muss
wieder für 30 - 60 s in die Zentrifuge gegeben werden.
∗ Um die Reinigungssäule zu reinigen, muss man 0,75 ml Puffer PE dazugeben und erneut
für 30 - 60 s zentrifugieren.
∗ Der Rückstand der sich nach diesen Schritten im Eppendorfgefäß befindet wird verworfen
und die Reinigungssäule wird danach für eine Minute zentrifugiert, um den restlichen

Reinigungspuffer zu entfernen.
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∗ Jetzt muss die Reinigungssäule in ein neues, steriles Eppendorfgefäß gesteckt werden. Um
die DNA schließlich aus der Säule zu lösen, werden 50 µl demineralisiertes Wasser
dazugegeben. Hier benutzen wir Wasser anstatt dem vorgegebenen Puffer EB, weil der
Puffer bei den späteren Schritten mit den Enzymen stören könnte. Die Reinigungssäule mit
dem demineralisiertem Wasser wird nun für eine Minute stehen gelassen und anschließend
muss sie für eine Minute zentrifugiert werden.
∗ Der enstandene Rest, der sich nach dem Zentrifugieren im Eppendorfgefäß befindet, ist die
Plasmidlösung
∗ Im Anhang befindet sich eine bildliche Darstellung der Plasmidisolation.
3.3 Nachweis der isolierten Plasmide durch die Agarose-Gelelektrophorese
„Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine molekularbiologische Methode, um Nukleinsäure-
Stränge (RNA oder DNA) nach ihrer Größe zu trennen.” (www.wikipedia.de) Hierbei wird
ein Gel als Trägermedium verwendet. Das Gel wirkt bei der Elektrophorese wie ein Sieb. Das
heißt, dass die kurzen DNA-Stücke schneller zur Anode wandern, als die langen und
ringförmigen DNA-Stücke. Auch kann man die Porengröße des Gels durch die Konzentration
von Agarose festlegen. Die Agarose-Gelelektrophorese wird in einer Gelkammer
durchgeführt, die man nach dem Beladen mit der zu identifizierenden DNA an eine
Stromquelle anschließt. Da die DNA-Fragmente negativ geladen sind wandern sie immer von
der Kathode zur Anode. Zur Identifizierung der DNA-Bruchstücke lässt man in dem Gel
einen Marker (z. B. von Fermentas) mitlaufen.

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Abbildung 3: Legende zum verwendeten Größenstandard
Zur Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese habe ich mich an das
Durchführungsprotokoll von Herrn Schmitt gehalten. Weitere Informationen zur
Gelelktrophorese fand ich im Internet unter www.nugi-zentrum.de, 2006 d.
Man beginnt mit der Herstellung eines 1%-igen Agarosegels. Hierzu werden 0,2 g Agarose in
eine Schraubdeckelflasche gegeben und mit 20 ml TAE-Puffer aufgegossen. Der TAE-Puffer
hat einen leicht alkalischen pH-Wert und soll eine Denaturierung der DNA verhindern.
Danach gibt man einen Rührfisch in die Flasche und kocht das Gel unter Beobachtung in der
Mikrowelle auf. Man muss aufpassen, dass kein Siedeverzug entsteht und beim Rausnehmen
der Flasche aus der Mikrowelle unbedingt Lederhandschuhe tragen, weil das Gel sehr heiß
wird. Jetzt wird das heiße Gel vorsichtig in die Gelkammer gegossen und man muss den
Kamm einsetzen, solange das Gel noch flüssig ist. Nach dem Abkühlen des Gels (es wird
milchig-trübe) wird der Kamm entnommen.
Anschließend beginnt die Vorbereitung der Plasmide für die Gelelektrophorese. Dazu werden
5 µl der Plasmidlösung mit 2 µl Gelladungspuffer gemischt. Der Gelladungspuffer besteht aus
Glycerin und zwei Farbstoffen und sorgt durch das Glycerin dafür, dass die Proben, die in die
Geltaschen pipettiert werden nicht wieder heraus diffundieren. Die Farbstoffe wandern
parallel zu der Mischung aus Plasmidlösung und Gelladungspuffer und dienen zur Kontrolle
während der Elektrophorese. Vor dem Beladen der Taschen wird TAE-Puffer in die
Gelkammer gegossen bis das Gel leicht bedeckt ist. Nun beginnt das Befüllen der Geltaschen.

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Man pipettiert zuerst 5 µl des Markers “Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM 03131” in die
rechte äußere Tasche. Dann kommen die zu identifizierenden Plasmidstämme in das Gel und
schließlich in die linke äußere Tasche nochmals 5 µl des oben genannten Markers. Hierbei
darauf achten, dass man die Reihenfolge der Proben vor dem Lauf des Gels schriftlich
festhält. Schließlich wird der Gelelelktrophoreseapparat an eine Spannungsquelle
angeschlossen (Polung beachten). Dann wird die Spannungsquelle eingeschaltet. In unserem
Fall waren es ca. 100 Volt. Danach lässt man das Gel für ungefähr 1, 5 Stunden laufen, bis die
blaue Bande fast das Ende des Gels erreicht hat.
Um das Gel auszuwerten wird es von einer Lehrkraft in einer Ethidiumbromidlösung gefärbt
und anschließend auf einen UV-Leuchttisch gelegt. Diese Arbeit übernimmt ein Lehrer, weil
Ethidiumbromid krebserregend ist. Das UV-Licht macht die Banden der gewanderten
Plasmidstämme und des Markers sichtbar.
Abbildung 4: Gelelektrophorese
4. Restriktionsendonuklease–Verdau
4.1 Allgemeines zu Restriktionsendonuklease-Verdau
Restriktionsenzyme werden auch als Restriktionsendonukleasen bezeichnet. Sie sind DNA-
spaltende Enzyme und werden aus Bakterien gewonnen. Dort schützen sie den
Mikroorganismus vor zum Beispiel Bakteriophagen, indem sie die Phagen-DNA

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zerschneiden, bevor sie repliziert wird. Heute sind sie aber auch ein wichtiges Werkzeug der
Molekularbiologie.
Zur Durchführung des Versuches hielt ich mich an das Durchführungsprotokoll von Herrn
Schmitt und zusätzliche Informationen fand ich auf der Internetseite:www.nugi-zentrum.de,
2006 c. In diesemVersuch soll das isolierte Plasmid pUC 18 mit den Restriktionsenzymen
EcoR, HindIII, SalI, PvuI, Cfr9I oder XmaI, TaqI, ApaLI, ScrFI und SpeI verdaut werden.
Anschließend wird durch eine Gelelektrophorese festgestellt, ob der Verdau erfolgreich war.
Die Abläufe, die nun folgen, müssen insgesamt mit jedem Enzym einzeln gemacht werden.
In ein steriles Eppendorfgefäß werden 16 µl steriles, demineralisiertes Wasser, 1 µl
Plasmidlösung, 2 µl 10-fach Puffer und 1 µl von der jeweiligen Restriktionsenzymlösung
gegeben. Man muss darauf achten, dass man bei jedem Enzym den richtigen Puffer benutzt.
Diese Informationen findet man unter www.fermentas.com.
♦ für EcoRI den Puffer EcoRI
♦ für Hind III den Puffer R
♦ für SalI den Puffer O
♦ für PvuI den Puffer R
♦ für Cfr9I oder XmaI den Puffer Cfr9I
♦ für TaqI den Puffer TaqI
♦ für ApaLI den Puffer Tango
♦ für ScrFI den Puffer O
Das Enzym SpeI konnte nicht getestet werden, da dieses Restriktionsenzym pUC 18 nicht
schneidet.
Nach dem Zusammengeben der verschiedenen Flüssigkeiten werden alle befüllten
Eppendorfgefäße bis auf das mit dem Restriktionsenzym TaqI für 50 Minuten bei 37°C in den
Inkubator gegeben. Auf die Mischung mit TaqI wird vor dem Inkubieren eine Paraffin-Öl-
Schicht gegeben, weil sie zwar auch für 50 Minuten in den Inkubator muss, jedoch stellt sich
bei dieser Restriktionsendonuklease die Enzymaktivität erst bei 65°C ein und somit würde die
Flüssigkeit ohne diese Öl-Schicht verdampfen.
Zur Überprüfung, ob der Restriktionsverdau funktioniert hat, macht man wie bei der
Plasmidisolation eine Gelelektrophorese. Für diese Gelelektrophorese muss man ein 0,8%iges

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Agarosegel herstellen. Dazu benötigt 0,16 g Agarose, die man dann mit TAE-Puffer auf 20 ml
aufgießt. Diese Mischung kocht man wieder unter Beobachtung in der Mikrowelle. Beim
Rausnehmen darauf achten, Lederhandschuhe zu tragen, weil das gekochte Gel nun sehr heiß
ist. Das heiße, flüssige Gel wird nun in die Gelkammer gegossen und sofort danach wird der
Kamm eingesetzt. Wenn das Gel milchig-trübe wird ist es kühl und der Kamm kann wieder
entfernt werden. Jetzt muss man wieder den Marker(“Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM
03131”) links und rechts außen in die Taschen füllen und zwischen die zwei mit dem Marker
gefüllten Taschen kommen die vorbereiteten Lösungen mit den Restriktionsenzymen. Danach
wird die Gelkammer wieder an eine Stromquelle angeschlossen und die Restriktionsenzyme
werden für ca. eine Stunde bei 100 V laufen gelassen. Die nachfolgende Abbildung zeigt eine
schematische Darstellung, wie die Enzyme im Gel laufen sollen.
Abbildung 5: Gelsimulation mit allen verwendeten Enzymen
4.2 Ergebnisse der jeweiligen Enzyme
Als Ergebnis des Restriktionsverdaus müssen folgende Schnittstellen sichtbar sein:

4.2.1 EcoRI
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Abbildung 6: Schnittstelle von EcoRI
Bei EcoRI gibt es eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 450 und 451 Basenpaaren.
4.2.2 HindIII
Abbildung 7: Schnittstelle von HindIII
Bei HindIII gibt es eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 399 und 400 Basenpaaren.
4.2.3 SalI
Abbildung 8: Schnittstelle von SalI
Bei SalI gibt es eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 417 und 418 Basenpaaren.

4.2.4 PvuI
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Abbildung 9: Schnittstellen von PvuI
Bei PvuI gibt es zwei Schnittstellen. Sie befinden sich zwischen den Basenpaaren 279-280
und 2069-2070. Es entsteht ein Fragment aus 896 Basenpaaren und eins aus 1790
Basenpaaren.
4.2.5 Cfr9I oder XmaI
Abbildung 10: Schnittstelle von XmaI
Bei XmaI entsteht eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 434 und 435 Basenpaaren.
4.2.6 TaqI
Abbildung 11: Schnittstellen von TaqI
Bei TaqI gibt es vier Schnittstellen. Sie befinden sich zwischen den Basenpaaren 418-419,
448-449, 906-907 und 2350-2351. Es entstehen Fragmente der Länge 30, 458, 754 und 1444
Basenpaare.

4.2.7 ApaLI
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Abbildung 12: Schnittstellen von ApaLI
Bei ApaLI gibt es drei Schnittstellen. Sie befinden sich zwischen den Basenpaaren 177-178,
1120-1121 und 2366-2367. Es entstehen Fragmente der Länge 497, 943 und1246 Basenpaare.
4.2.8 ScrFI
Bei ScrFI gibt es zwölf Schnittstellen:
Abbildung 13: Schnittstellen von ScrFI
49-83 35 Basenpaare
84-355 272 Basenpaare
356-435 80 Basenpaare
436-436 1 Basenpaar
437-546 110 Basenpaare
547-834 288 Basenpaare
835-955 121 Basenpaare
956-968 13 Basenpaare
969-1186 218 Basenpaare
1187-1882 696 Basenpaare
1883-2233 351 Basenpaare
2234-48 501 Basenpaare

4.2.9 SpeI
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Von SpeI konnten bei dem Plasmid pUC 18 keine Schnittstellen gefunden werden, weil es
pUC 18 wahrscheinlich gar nicht schneidet.
5. Fehleranalyse
Bei der ersten Übernacht-Kultur sind keine Bakterienstämme gewachsen. Mögliche
Fehlerquellen hierbei können sein, dass wir entweder unsauber gearbeitet haben und zum
Beispiel die Pipettenspitze verschmutzt war, oder die tiefgefrorenen Bakterien, die wir benutzt
haben, waren tot. Daraufhin haben wir erneut eine Übernacht-Kultur hergestellt, diesmal aber
mit anderen Bakterien. Diese Bakterien haben wir dann auch für die Plasmidisolation und den
Restriktionsverdau verwendet. Dabei kam dieses Ergebnis heraus:
Abbildung 14: Ergebnis des Restriktionsverdaus im Labor
Auf diesem Foto kann man eigentlich nur die Marker rechts und links am Rand gut erkennen.
Die Bahnen der Restriktionsenzyme sind kaum sichtbar und haben beim Vergleich mit den
vorgegebenen Schnittstellen(www.http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) zu keinem
sinnvollen Ergebnis geführt. Jedoch stellte sich nach dem Restriktionsverdau heraus, dass wir
einen Fehler bei der Plasmidisolation gemacht haben. Wir haben erst den Puffer PE und dann
PB in die Reinigungssäule gegeben. Dies ist aber die falsche Reihenfolge. Es wird erst PB
und dann PE hineingegeben. Daraufhin haben wir nochmals eine Übernacht-Kultur gemacht.
Diesmal mit einer höheren Ampicilinkonzentration, so dass wirklich nur pUC 18 wachsen

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konnte. Mit dieser Übernacht-Kultur haben wir dann eine Plasmidreihenuntersuchung
(Cracking Methode) durchgeführt, um zu prüfen, ob die Bakterien kaputt waren, also das
Plasmid nicht funktioniert. Die Informationen für diesen Versuch habe ich unter www.nugi-
zentrum.de, 2006 b gefunden. Dazu zentrifugiert man 50 µl von der Bakterienlösung. Der
Überstand wird verworfen und dann werden 75 µl Aufschlusspuffer dazugegeben und alles
für 5 Minuten bei 70°C ind den Heizblock gegeben. Jetzt werden die Proben 5 Minuten in
einem Eisbad abgekühlt und nach dem Abkühlen werden die Ansätze 5 Minuten lang
zentrifugiert. Nun ist es wichtig mit dem Überstand weiter zu arbeiten. Es werden 8 µl
Überstand und 2 µl Gelladungspuffer zusammengegeben und dann wird mit den Proben eine
Gelelektrophorese gemacht. Bei dieser Gelelektrophorese kam heraus, dass die Bakterien
entweder kaputt waren, oder zu wenig Plasmide hatten.
Abbildung 15: Cracking-Methode im Labor
Eine weitere Fehlerquelle kann das Kit sein. Jedoch haben wir für die Cracking-Methode ein
neues, noch nie benutztes Kit benutzt, was heißt, dass es nicht daran liegen kann, weil es noch
nicht verschmutzt gewesen ist. Die letzte Fehlerquelle, die noch in Betracht gezogen werden
muss, ist das demineralisierte Wasser, das wir verwendet haben. Es hatte wahrscheinlich nicht
den richtigen pH-Wert.

6. Literaturverzeichnis
- 17 -
MÜLHARDT, Cornel, 2003: Der Experimentator-Molekularbiologie/Genomics, Spektrum
akademischer Verlag Heidelberg, 4. Auflage, ISBN 3-8274-1460-1
SCHMITT Patrick, 2008: Einführung in die Grundarbeitstechniken der Molekularbiologie
Internetquellen
www.fermentas.com [Stand: 20.01.2009]
www.http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php [Stand: 20.01.2009]
www.nugi-zentrum.de, 2006 a: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien
Industrie, Ulm [Stand: 20.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/Plasmid.html
www.nugi-zentrum.de, 2006 b: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien
Industrie, Ulm [Stand: 20.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/cracking.html
www.nugi-zentrum.de, 2006 c: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien
Industrie, Ulm [Stand: 20.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/Restriktion.html
www.nugi-zentrum.de, 2006 d: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien
Industrie, Ulm [Stand: 20.01.2009]
http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/Agarosegel.html

- 18 -
QIAGEN, 2003: Qiagen MinElute® Handbook, MinElute Gel Extraction Kit Protocol using a
microcentrifuge [Stand: 20.01.2009]
www1.qiagen.com
http://de.wikipedia.org/wiki/Agarose-Gelelektrophorese vom 20.01.2009
Abbildungen
Abbildung1:pUC18
(http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.fermentas.com/TechInfo/N
ucleicAcids/img/npuc18_19.gif)
Abbildung 2: chromosomale DNA & Plasmid (http://de.wikipedia.org/wiki/Plasmid)
Abbildung 3: Legende zum verwendeten Größenstandard
(http://www.fermentas.com/catalog/electrophoresis/generulers.htm#1kb)
Abbildung 4: Gelelektrophorese (http://de.wikipedia.org/wiki/Gelelektrophorese)
Abbildung 5: Gelsimulation mit allen verwendeten Enzymen, zusammengestellt mit
www.http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php
Abbildungen 6-13: Schnittstellen der Enzyme
www.http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php
Abbildung 14: Quelle; Schmitt; Patrick: Persönliche Mitteilung
Abbildung 15: Quelle: Schmitt; Patrick: Persönliche Mitteilung

7. Selbstständigkeitserklärung
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Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im
Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe.
Bad Grönenbach, den 30.01.2009 ...............................................................
(Unterschrift des Kollegiaten)

8. Anhang
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= Zentrifuge
= Eppendorfgefäß
= Puffer
= Reinigungssäule
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