Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

1.4 Zielstellung der Arbeit
Einleitung
Gegenstand vorangegangener Untersuchungen war das Gpr1-Protein in Y. lipolytica. Verschiedene
Mutationen im GPR1-Gen verursachen eine erhöhte Sensitivität gegen Essigsäure
und sind trans-dominant über das Wildtypallel. Die Sequenzierung der Mutantenallele von
vier Hefestämmen (B204-12C-38, -112, -124 und -156) ergab, dass der Mutantenphänotyp
durch Aminosäureaustausche sowohl im N- als auch im C-terminalen Teil des Gpr1-Proteins
verursacht wird. Die Expression des GPR1-Gens wurde mittels Reportergenanalysen näher
charakterisiert. Weiterhin wurden die Auswirkungen der teilweisen und fast vollständigen
Deletion des N-Terminus von Gpr1p auf das Wachstum von Transformanden untersucht.
Das Gpr1-Protein konnte in Abhängigkeit von der zur Verfügung stehenden C-Quelle in einer
phosphorylierten und dephosphorylierten Form nachgewiesen werden. Mittels fluoreszenzmikroskopischen
und subzellulären Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass Gpr1p ein
integrales Protein der Cytoplasmamembran ist.
In der vorliegenden Arbeit sollte das Gpr1-Protein in Y. lipolytica und die Gpr1p-Orthologen
in S. cerevisiae näher charakterisiert werden. Damit stellten sich folgende Aufgaben:
1. Suche nach potentiellen Interaktionspartnern des Gpr1-Proteins in Y. lipolytica. Hierfür
sollte geprüft werden, ob in Revertaten von GPR1 d -Mutanten extragene Mutationen, die
zu einer Suppression des Mutantenphänotyps führen könnten, nachweisbar sind.
2. Durch die Einbeziehung der drei Gpr1p-Orthologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp in
S. cerevisiae sollte versucht werden, weitere Informationen über die Regulation der Expression
und der Funktion dieser Proteinfamilie zu erhalten.
3. Untersuchung der Expression der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae. Zur weiteren Funktionsaufklärung
sollte überprüft werden, unter welchen Bedingungen die Expression dieser
Gene erfolgt und wie diese reguliert werden. Dies sollte mit Hilfe von Messung lacZ-
Reportergenanalysen, Northern- und Western-Blots erfolgen.
4. Aufklärung funktionell wichtiger Bereiche in Gpr1p und dessen Orthologen durch Ortspezifische
und zufällige Mutagenese. Von besonderem Interesse waren die Auswirkungen
von Deletionen der C-Termini des Gpr1-Proteins und dessen Orthologen. Ferner
sollten durch zufällige Mutagenese der Orthologen von S. cerevisiae weitere funktionell
wichtige Bereiche identifiziert werden
5. Aufklärung posttranslationaler Modifikationen der Homologen in S. cervisiae. Insbesondere
sollte hierbei untersucht werden, ob diese Proteine möglicherweise einer Glycosylierung
oder Phosphorylierung unterliegen.
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