Facharbeit Tamara Bruno - German Weber

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- 8 - verschiedenen Sequenzen, die während des Restriktionsverdaus entstanden sind, kann man das Muster der Gelelektrophorese nach Individuen und Verwandtschaften untersuchen. 4. Gelelektrophorese „Die Agarose-Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, mit der DNA-Fragmente zwischen 0,5 und 25 kB (= kilo-Basen) Länge voneinander getrennt und identifiziert werden können. Das Prinzip der Elektrophorese beruht darauf, dass geladene Moleküle, wie z.B. DNA im elektrischen Feld wandern. Die Auftrennung erfolgt in einem elektrischen Gleichstromfeld unter konstantem pH-Wert (→ Elektrophoresepuffer), wobei die Fragmente je nach Ladung, Masse und Gestalt unterschiedlich schnell durch das Agarosegel wandern.“ (SCHMITT, 2010: S. 22) Material: • 0,2 g Agarose • TAE-Puffer • Rührfisch • Schraubdeckelflasche aus Glas • Agarosegelkammer • Lederhandschuhe • Kunststoffkamm • 5 μl DNA-Lösung • 2 μl Gelladungspuffer • 5 μl Ladder (= Größenmarker) • Spannungsquelle • Pipetten • Sterile Eppendorfgefäße • Ethidiumbromid • UV-Leuchttisch
- 9 - 4.1 Vorbereitung der Agarosegelelektrophorese Die Agarosegelelektrophorese wird mit den molekularbiologischen Methoden aus dem Biotechnologiekurs von Herrn Schmitt, sowie dem daraus stammenden Skript durchgeführt. Gießen des Gels Zunächst müssen 0,2 g der Agarose abgewogen und mit dem TAE-Puffer auf 20 ml aufgegossen werden. Diese Flüssigkeit wird in der Schraubdeckelflasche aus Glas anschließend mit einem Rührfisch in die Mikrowelle gegeben. Hinweis: Der Deckel darf nicht komplett geschlossen sein Während dieses Vorgangs sollten die dafür bereitliegenden Lederhandschuhe getragen werden, um sich vor möglichen Verbrennungen an der Hand zu schützen! Die Flasche bleibt, unter ständiger Beobachtung, solange in der Mikrowelle, bis keine Rückstände, wie zum Beispiel Klümpchen mehr vorhanden sind. Anschließend wird die Schraubflasche vorsichtig herausgenommen und auf eine schmelzfeste Unterlage gestellt, wobei unverzüglich der Deckel zuzuschrauben ist, damit keine Flüssigkeit aufgrund von Verdunstung entweichen kann. Sobald die Schraubflasche eine zum Anfassen angenehme Temperatur hat, wird die Flüssigkeit vorsichtig in die Agarosegelkammer gegossen. Hinweis: Die Flüssigkeit muss die Gelkammer komplett ausfüllen! Nun muss der Kamm in die Gelkammer eingesetzt werden und zwar dorthin, wo die Kathode ist, da DNA negativ geladen ist und somit in Richtung der Anode wandert. Wenn das Gel abgekühlt ist, nimmt es eine milchige Trübung an und der Kamm kann vorsichtig entfernt werden. 4.2 Durchführung der Gelelektrophorese Als erstes müssen 5 μl der DNA-Lösung mit 2μl des Gelladungspuffers in einem sterilen Eppendorfgefäß vermischt werden. Die Gelkammer sollte nun mit TAE-Puffer angereichert werden, bis sowohl die Kammer, als auch die Geltaschen bedeckt sind. Anschließend wird in die mittlere
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