Facharbeit Tamara Bruno - German Weber

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Zunächst wird 1 μl des Puffers EcoRI zu 0,1-2 μg der isolierten DNA hinzugefügt.
Nachdem demineralisiertes Wasser bis zu insgesamt 10 ml hinzugefügt wurde, kommen
0,5μl des Restriktionsenzyms EcoRI dazu.
Hinweis: Das Restriktionsenzym darf erst zum Schluss beigemengt werden!
Anschließend wird der gesamte Reaktionsansatz bei 37 °C für ca. 50 Minuten inkubiert.
Ob der Restriktionsverdau erfolgreich war oder nicht, wird anschließend mit Hilfe der
Gelelektrophorese ermittelt.
3.2 Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)
„Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus sind Unterschiede in DNA-Sequenzen,
die als genetische Marker dienen“ (PURVES/SADAVA/ORIANS/HELLER, 2006: S. ?).
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus ist eine Technik, der als Grundlage die
enzymatische Spaltung von DNA durch Restriktionsenzyme dient. Dadurch ist es
möglich, dass DNA durch dasselbe Restriktionsenzym geschnitten werden, jedoch an
unterschiedlichen Sequenzen. Um die Polymorphismen, also die Längenunterschiede,
feststellen zu können, ermittelt man die Basensequenzen zunächst mittels eines
Restriktionsverdaus, wobei die DNA in verschieden lange, je nach Enzym, spezifische
Stellen geschnitten wird. Anschließend dient eine Gelelektrophorese zur Sortierung der
verschieden Basenlängen (siehe 4.2 Gelelektrophorese).
Nach der Gelelektrophorese muss zunächst die DNA, welche doppelsträngig ist, in
einzelne Stränge gespalten werden. Die Übertragung der Trennmuster, die auf dem Gel
entstanden sind, auf eine spezielle Nylonmembran und die dortige Fixierung, nennt man
„Southern-Blot“-Methode. Anschließend bildet die Membran mit Hilfe von radioaktiv
markierten Gensonden, welche meist aus komplementärer RNA bestehen, Basenpaare.
Diesen Vorgang nennt man Hybridisierung.
Um nun die Ergebnisse sichtbar zu machen, wird die Membran zunächst von allen
unspezifischen Bindungen „abgewaschen“ und anschließend auf ein Fotopapier oder auf
einen Röntgenfilm gelegt.
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismen verhalten sich bei der Vererbung wie
normale Gene, da eine feste Verankerung in der Sequenz vorhanden ist, deshalb werden
sie oft als genetische Marker benutzt. Folglich kann aufgrund der RFLPs schon vor der
Geburt die DNA eines Kindes analysiert werden. RFLPs können auch dafür eingesetzt