Facharbeit Tamara Bruno - German Weber
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2.2 Extraktion der DNA von Sphagnum mit Hilfe des DNeasy® Plant Kits<br />
Zunächst müssen 20 mg der Moosprobe mit Hilfe von Stickstoff im Mörser zerkleinert<br />
werden; dieses Erzeugnis wird dann in ein steriles Eppendorf-Gefäß gegeben und es<br />
werden 400 μl AP1 und RNase hinzugefügt. Nachdem alles im Vortexer vermengt<br />
wurde, wird es bei 65 °C für 10 Minuten inkubiert.<br />
Hinweis: Wenn mit Stickstoff gearbeitet wird, muss immer eine Schutzbrille getragen<br />
werden, um mögliche Verletzungen am Auge zu vermeiden!<br />
Anschließend werden 130 μl des Puffers AP2 hinzugegeben, durch leichtes Schütteln<br />
vermengt und für 5 Minuten auf Eis gelegt. Danach wird das Eppi 5 Minuten lang<br />
zentrifugiert bei 14000 rpm. Nach 5 Minuten wird die Flüssigkeit in den QIAshredder<br />
Mini spin column pipettiert und dann für 2 Minuten bei maximaler Leistung<br />
zentrifugiert. Nachdem 450μl Flüssigkeit in ein neues steriles Eppi gegeben wurde,<br />
kommt das 1,5 fache des Puffers AP3 hinzu und wird mit Hilfe einer Pipette gemixt.<br />
Nun wird diese Flüssigkeit und der Niederschlag in die DNeasy Mini Spin Column<br />
gefüllt, der Rest aufgehoben; anschließend wird die DNeasy Mini Spin Column 1<br />
Minute lang bei 8000 rpm zentrifugiert, wobei danach der Durchfluss zu verwerfen ist.<br />
Hinweis: Das Cap nicht wegwerfen!<br />
Der Rest, der zuvor aufgehoben wurde, wird nun ebenfalls in den DNeasy Mini Spin<br />
Column gefüllt und für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert, wobei der Durchfluss<br />
wiederum verworfen wird. Nun fügt man 500 μl des Puffers AW hinzu und zentrifugiert<br />
dies erneut bei 8000 rpm.<br />
Hinweis: Nach der Zentrifugation wird lediglich der Durchfluss verwendet!<br />
Anschließend müssen noch einmal 500 μl desselben Puffers hinzugefügt werden, dies<br />
muss dann für 2 Minuten bei 14000 rpm in die Zentrifuge.<br />
Daraufhin wird der DNeasy Mini Spin Column in ein neues steriles Eppi gegeben und<br />
es werden 100 μl des Puffers AE hinzugefügt, dies wird zuerst 5 Minuten bei<br />
Raumtemperatur stehengelassen und dann bei 8000 rpm 1 Minute lang zentrifugiert.<br />
Anschließend wird erneut der Puffer AE beigemischt, bei Zimmertemperatur 5 Minuten<br />
lang stehen gelassen und letztlich noch einmal mit 8000 rpm für 1 Minute zentrifugiert.<br />
Hinweis: Der Puffer AE wird beim zweiten Mal nur mit circa 75 μl beigemengt!
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