Facharbeit Tamara Bruno - German Weber

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Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollegstufe........... 2009/2011
Memmingen Leistungskurs: ......... Biologie
Bewertung:
Facharbeit
Kollegiat: ....... Tamara Bruno
Versuch einer Sphagnum-Klassifikation durch Restriktionsverdau
Abgegeben am 23.12.2010
Facharbeit: Note:________ Punkte:________
Mündliche Prüfung: Note:________ Punkte:________
Gesamtergebnis: Note:________ Punkte:________
Datum und Unterschrift des Kursleiters:_______________________

Inhaltsverzeichnis:
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1. Einführung ................................................................................................................ S. 3
2. DNA-Extraktion ........................................................................................................ S. 3
2.1 Vorbereitungen ................................................................................................... S. 3
2.2 Extraktion der DNA von Sphagnum ( DNeasy® Plant Mini Kit) ...................... S. 4
3. Restriktionsverdau..................................................................................................... S. 5
3.1 Ablauf des Restriktionsverdaus .......................................................................... S. 5
3.2 RFLP .................................................................................................................. S. 6
3.3 AFLP .................................................................................................................. S. 7
4. Gelelektrophorese ..................................................................................................... S. 8
4.1 Vorbereitung der Agarosegelelektrophorese ...................................................... S. 9
4.2 Durchführung der Gelelektrophorese ................................................................. S. 9
5. Ergebnisse ............................................................................................................... S. 10
5.1 Auswertung ...................................................................................................... S. 11
5.2 Fehleranalyse .................................................................................................... S. 11
6. Quellenverzeichnis .................................................................................................. S. 13
7. Erklärung des Kollegiaten ....................................................................................... S. 14

1. Einführung:
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Das Thema, das unserer Gruppe im Laufe eines Praktikums im Biotechnologie Labor
des Bernhard-Strigel-Gymnasiums gestellt wurde, beruht auf der morphologischen
Betrachtung, der DNA-Extraktion, sowie letztlich auf der evolutiven Einordnung von
Sphagnum anhand der DNA.
Unsere Aufgabe war es, Sphagnum nach äußeren Merkmalen, sowie nach der DNA zu
kartieren. Die Hauptfrage, die sich hierbei stellte, war, ob sich verschiedene Arten von
Sphagnum durch spezifische Merkmale unterscheiden lassen, wodurch Rückschlüsse
auf die Evolution zu ziehen wären. Dieser überaus komplexe Auftrag wurde in mehrere
Teilbereiche untergliedert, weshalb ich in meiner Facharbeit besonderes Augenmerk
auf den Restriktionsverdau gelegt habe.
Meine Facharbeit gliedert sich zunächst in die Versuche, die wir im Labor mit
Sphagnum durchgeführt haben, wobei wir versucht haben DNA zu extrahieren und
diese schließlich mit Hilfe einer Agarosegelelektrophorese nachzuweisen.
Des Weiteren gehe ich in meiner Facharbeit näher auf den Restriktionsverdau ein, der
mit Hilfe zweier unterschiedlicher Methoden durchgeführt werden kann.
2. DNA-Extraktion
Desoxyribonukleinsäure, oder kurz gesagt DNA, ist Träger der Erbinformation eines
jeden Individuums. Deshalb ist der erste Schritt, um Sphagnum evolutiv einordnen zu
können, die Extraktion der DNA, das heißt, dass die reine DNA mit Hilfe eines Kits der
Firma QIAGEN (2006) aus dem Torfmoos Sphagnum isoliert werden kann.
2.1 Vorbereitungen:
• Schutzbrille und Schutzkittel anziehen
• Heizblock auf 65°C vorheizen
• Utensilien vorbereiten, Materialien und Kit überprüfen
• Eis in die Styroporbox legen
• Vortexer bereitstellen
• 1-mal Zentrifuge auf 8000 rpm
• 1-mal Zentrifuge auf 14000 rpm

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2.2 Extraktion der DNA von Sphagnum mit Hilfe des DNeasy® Plant Kits
Zunächst müssen 20 mg der Moosprobe mit Hilfe von Stickstoff im Mörser zerkleinert
werden; dieses Erzeugnis wird dann in ein steriles Eppendorf-Gefäß gegeben und es
werden 400 μl AP1 und RNase hinzugefügt. Nachdem alles im Vortexer vermengt
wurde, wird es bei 65 °C für 10 Minuten inkubiert.
Hinweis: Wenn mit Stickstoff gearbeitet wird, muss immer eine Schutzbrille getragen
werden, um mögliche Verletzungen am Auge zu vermeiden!
Anschließend werden 130 μl des Puffers AP2 hinzugegeben, durch leichtes Schütteln
vermengt und für 5 Minuten auf Eis gelegt. Danach wird das Eppi 5 Minuten lang
zentrifugiert bei 14000 rpm. Nach 5 Minuten wird die Flüssigkeit in den QIAshredder
Mini spin column pipettiert und dann für 2 Minuten bei maximaler Leistung
zentrifugiert. Nachdem 450μl Flüssigkeit in ein neues steriles Eppi gegeben wurde,
kommt das 1,5 fache des Puffers AP3 hinzu und wird mit Hilfe einer Pipette gemixt.
Nun wird diese Flüssigkeit und der Niederschlag in die DNeasy Mini Spin Column
gefüllt, der Rest aufgehoben; anschließend wird die DNeasy Mini Spin Column 1
Minute lang bei 8000 rpm zentrifugiert, wobei danach der Durchfluss zu verwerfen ist.
Hinweis: Das Cap nicht wegwerfen!
Der Rest, der zuvor aufgehoben wurde, wird nun ebenfalls in den DNeasy Mini Spin
Column gefüllt und für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert, wobei der Durchfluss
wiederum verworfen wird. Nun fügt man 500 μl des Puffers AW hinzu und zentrifugiert
dies erneut bei 8000 rpm.
Hinweis: Nach der Zentrifugation wird lediglich der Durchfluss verwendet!
Anschließend müssen noch einmal 500 μl desselben Puffers hinzugefügt werden, dies
muss dann für 2 Minuten bei 14000 rpm in die Zentrifuge.
Daraufhin wird der DNeasy Mini Spin Column in ein neues steriles Eppi gegeben und
es werden 100 μl des Puffers AE hinzugefügt, dies wird zuerst 5 Minuten bei
Raumtemperatur stehengelassen und dann bei 8000 rpm 1 Minute lang zentrifugiert.
Anschließend wird erneut der Puffer AE beigemischt, bei Zimmertemperatur 5 Minuten
lang stehen gelassen und letztlich noch einmal mit 8000 rpm für 1 Minute zentrifugiert.
Hinweis: Der Puffer AE wird beim zweiten Mal nur mit circa 75 μl beigemengt!

3. Restriktionsverdau
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Beim Restriktionsverdau wird die zuvor isolierte DNA mit Hilfe von so genannten
Restriktionsendonukleasen oder kurz gesagt Restriktionsenzymen an, je nach Enzym
spezifischen, palindromischen Erkennungsstellen geschnitten. „Sie ermöglichen die
gezielte Herstellung von DNA-Fragmenten, die dann isoliert und zu neuen
Konstruktionen zusammengesetzt werden können. Enzyme, die klebrige Enden
erzeugen, sind dabei besonders hilfreich, da sich die überlappenden Enden leicht
miteinander verbinden lassen.“ (wikipedia.org)
Mit Hilfe der Restriktionsenzyme kann nun eine Kartierung des Genoms durchgeführt
werden. Es gibt zwei unterschiedliche Arten des Restriktionsverdaus:
Amplifizierter Fragment-Längen-Polymorphismus, kurz gesagt AFLP
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus, kurz RFLP.
Zunächst folgt eine Liste der Materialien, die für den Verdau der DNA, mit Hilfe des
Enzyms EcoRI, notwendig sind.
Material:
• Isolierte DNA
• Restriktionsenzym EcoRI
• EcoRI-Puffer (= Puffer entsprechend zum Restriktionsenzym EcoRI)
• Steriles Wasser
• Sterile Eppendorfgefäß
• Pipetten
• Inkubator auf 37°C
3.1 Ablauf des Restriktionsverdaus
Der Ablauf des Restriktionsverdaus wird anhand des Protokolls von Herrn Schmitt
durchgeführt.

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Zunächst wird 1 μl des Puffers EcoRI zu 0,1-2 μg der isolierten DNA hinzugefügt.
Nachdem demineralisiertes Wasser bis zu insgesamt 10 ml hinzugefügt wurde, kommen
0,5μl des Restriktionsenzyms EcoRI dazu.
Hinweis: Das Restriktionsenzym darf erst zum Schluss beigemengt werden!
Anschließend wird der gesamte Reaktionsansatz bei 37 °C für ca. 50 Minuten inkubiert.
Ob der Restriktionsverdau erfolgreich war oder nicht, wird anschließend mit Hilfe der
Gelelektrophorese ermittelt.
3.2 Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)
„Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus sind Unterschiede in DNA-Sequenzen,
die als genetische Marker dienen“ (PURVES/SADAVA/ORIANS/HELLER, 2006: S. ?).
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus ist eine Technik, der als Grundlage die
enzymatische Spaltung von DNA durch Restriktionsenzyme dient. Dadurch ist es
möglich, dass DNA durch dasselbe Restriktionsenzym geschnitten werden, jedoch an
unterschiedlichen Sequenzen. Um die Polymorphismen, also die Längenunterschiede,
feststellen zu können, ermittelt man die Basensequenzen zunächst mittels eines
Restriktionsverdaus, wobei die DNA in verschieden lange, je nach Enzym, spezifische
Stellen geschnitten wird. Anschließend dient eine Gelelektrophorese zur Sortierung der
verschieden Basenlängen (siehe 4.2 Gelelektrophorese).
Nach der Gelelektrophorese muss zunächst die DNA, welche doppelsträngig ist, in
einzelne Stränge gespalten werden. Die Übertragung der Trennmuster, die auf dem Gel
entstanden sind, auf eine spezielle Nylonmembran und die dortige Fixierung, nennt man
„Southern-Blot“-Methode. Anschließend bildet die Membran mit Hilfe von radioaktiv
markierten Gensonden, welche meist aus komplementärer RNA bestehen, Basenpaare.
Diesen Vorgang nennt man Hybridisierung.
Um nun die Ergebnisse sichtbar zu machen, wird die Membran zunächst von allen
unspezifischen Bindungen „abgewaschen“ und anschließend auf ein Fotopapier oder auf
einen Röntgenfilm gelegt.
Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismen verhalten sich bei der Vererbung wie
normale Gene, da eine feste Verankerung in der Sequenz vorhanden ist, deshalb werden
sie oft als genetische Marker benutzt. Folglich kann aufgrund der RFLPs schon vor der
Geburt die DNA eines Kindes analysiert werden. RFLPs können auch dafür eingesetzt

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werden, um Gene zu kartieren, was möglicherweise eine gute Lösung für die
Bearbeitung unserer Facharbeit gewesen wäre.
Jedoch ein Nachteil des Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus ist, dass es sehr
aufwendig ist und mittlerweile eine veraltete Methode hierfür darstellt.
3.3 Amplifizierter Fragment-Längen-Polymorphismus (AFLP)
AFLP wird oft als Methode in der Molekularbiologie verwendet, um einen genetischen
Fingerabdruck zu erstellen. AFLPs werden in einer mehrstufigen Technik angewandt.
Hierbei wird die DNA mit Hilfe zweier Restriktionsenzyme in Fragmente geschnitten,
welche signifikant für jede Restriktionsendonuklease sind. Zunächst wird die DNA mit
Hilfe zweier Restriktionsendonukleasen geschnitten. Anschließend erfolgt eine Ligation
der Adapter an die Enden der DNA-Fragmente. Man benutzt zwei verschiedene Arten
von Restriktionsenzymen, wobei ein Enzym im Abstand von circa 4 Basenpaaren
schneidet und meist noch ein anderes, welches bei je 6 Basenpaaren schneidet. Deshalb
lassen sich hierbei 3 Fragmentarten erkennen:
Fragmente, die ausschließlich von Restriktionsenzym 1 geschnitten wurden
Fragmente, welche nur von der Restriktionsendonuklease 2 geschnitten wurde
Fragmentarten mit Schnittenden von beiden, so genannte Hybride
Als Adapter wird üblicherweise eine einsträngige DNA, welche das Gegenstück zu den
sticky ends der DNA-Fragmente bildet, benutzt.
Anschließend wird eine Amplifikation der Fragmente in der PCR durchgeführt, wobei
diese vervielfältigt werden. Hierbei werden Primer, welche Gegensequenzen der
Adapter sind, hinzugegeben, die am 3’-Ende mit selektiven Oligonukleotiden
ausgestattet sind.
Daraufhin wird erneut eine Ligation durchgeführt, diesmal jedoch mit radioaktiv
markierten oder fluoreszierenden Primern, damit sie im nächsten Schritt, der
Gelelektrophorese, gut zu erkennen sind. Diese Ligation erfolgt deshalb, weil immer
noch zu viele DNA-Fragmente übrig sind. Hierbei werden vor allem diese Fragmente
markiert mit den so genannten gelabelten Primern.
Nun werden die markierten Fragmente mit Hilfe der Gelelektrophorese aufgetrennt und
anschließend, wie oben bei RFLP schon beschrieben, ausgewertet. Durch die

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verschiedenen Sequenzen, die während des Restriktionsverdaus entstanden sind, kann
man das Muster der Gelelektrophorese nach Individuen und Verwandtschaften
untersuchen.
4. Gelelektrophorese
„Die Agarose-Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, mit der
DNA-Fragmente zwischen 0,5 und 25 kB (= kilo-Basen) Länge voneinander getrennt
und identifiziert werden können.
Das Prinzip der Elektrophorese beruht darauf, dass geladene Moleküle, wie z.B. DNA
im elektrischen Feld wandern. Die Auftrennung erfolgt in einem elektrischen
Gleichstromfeld unter konstantem pH-Wert (→ Elektrophoresepuffer), wobei die
Fragmente je nach Ladung, Masse und Gestalt unterschiedlich schnell durch das
Agarosegel wandern.“ (SCHMITT, 2010: S. 22)
Material:
• 0,2 g Agarose
• TAE-Puffer
• Rührfisch
• Schraubdeckelflasche aus Glas
• Agarosegelkammer
• Lederhandschuhe
• Kunststoffkamm
• 5 μl DNA-Lösung
• 2 μl Gelladungspuffer
• 5 μl Ladder (= Größenmarker)
• Spannungsquelle
• Pipetten
• Sterile Eppendorfgefäße
• Ethidiumbromid
• UV-Leuchttisch

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4.1 Vorbereitung der Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese wird mit den molekularbiologischen Methoden aus dem
Biotechnologiekurs von Herrn Schmitt, sowie dem daraus stammenden Skript
durchgeführt.
Gießen des Gels
Zunächst müssen 0,2 g der Agarose abgewogen und mit dem TAE-Puffer auf 20 ml
aufgegossen werden. Diese Flüssigkeit wird in der Schraubdeckelflasche aus Glas
anschließend mit einem Rührfisch in die Mikrowelle gegeben.
Hinweis: Der Deckel darf nicht komplett geschlossen sein
Während dieses Vorgangs sollten die dafür bereitliegenden Lederhandschuhe getragen
werden, um sich vor möglichen Verbrennungen an der Hand zu schützen!
Die Flasche bleibt, unter ständiger Beobachtung, solange in der Mikrowelle, bis keine
Rückstände, wie zum Beispiel Klümpchen mehr vorhanden sind.
Anschließend wird die Schraubflasche vorsichtig herausgenommen und auf eine
schmelzfeste Unterlage gestellt, wobei unverzüglich der Deckel zuzuschrauben ist,
damit keine Flüssigkeit aufgrund von Verdunstung entweichen kann. Sobald die
Schraubflasche eine zum Anfassen angenehme Temperatur hat, wird die Flüssigkeit
vorsichtig in die Agarosegelkammer gegossen.
Hinweis: Die Flüssigkeit muss die Gelkammer komplett ausfüllen!
Nun muss der Kamm in die Gelkammer eingesetzt werden und zwar dorthin, wo die
Kathode ist, da DNA negativ geladen ist und somit in Richtung der Anode wandert.
Wenn das Gel abgekühlt ist, nimmt es eine milchige Trübung an und der Kamm kann
vorsichtig entfernt werden.
4.2 Durchführung der Gelelektrophorese
Als erstes müssen 5 μl der DNA-Lösung mit 2μl des Gelladungspuffers in einem
sterilen Eppendorfgefäß vermischt werden.
Die Gelkammer sollte nun mit TAE-Puffer angereichert werden, bis sowohl die
Kammer, als auch die Geltaschen bedeckt sind. Anschließend wird in die mittlere

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Gelkammer der Ladder pipettiert und in die anderen Taschen die DNA-Proben. Die
DNA-Proben werden aufgeteilt in diejenige, welche mit Restriktionsverdau
durchgeführt wurden und welche ohne Restriktionsverdau. Deshalb wird die DNA nun
jeweils abwechselnd in die Taschen pipettiert
Hinweis: Hierbei ist es wichtig, dass schriftlich festgehalten wird, in welche Tasche
welche Probe pipetiert wurde!
Anschließend muss die Gelkammer an die Spannungsquelle von maximal 7 Volt
angeschlossen werden.
Hinweis: Auf der Seite der Geltaschen der Gelkammer wird die Kathode angeschlossen
und gegenüber davon die Anode, damit die DNA in Richtung der Anode wandern kann.
Nachdem die Spannungsquelle eingeschaltet wurde, dauert es circa 30 - 60 Minuten, bis
die DNA an der Anode angelangt ist. Dies erkennt man daran, dass die „blaue Bande
fast am Ende des Gels angelangt ist.“ (SCHMITT, 2010: S. 25)
Färbung und Auswertung des Gels
Ethidiumbromid ein Farbstoff, der krebserregend ist, deshalb die folgenden Schritte von
der Lehrkraft ausgeführt werden.
Zunächst muss das Gel vorsichtig aus der Gelkammer gelöst werden und dann mit
Ethidiumbromid eingefärbt werden.
Anschließend wird das Gel vorsichtig auf den UV-Leuchttisch übertragen, wobei nun
zu erkennen sein sollte, ob DNA vorhanden ist. Falls dies der Fall ist, lassen sich
Bandenmuster mit Hilfe eines DNA-Größenstandards auswerten.
5. Ergebnisse
Im Folgenden werden nun die Schritte des Versuchaufbaus analysiert und es wird
gegebenenfalls auf ihre Fehler genauer eingegangen.
Zunächst folgt die Auswertung anhand der Gelelektrophorese und anschließend die
Fehleranalyse, in welcher näher auf mögliche Fehlerquellen eingegangen wird.

5.1 Auswertung des Versuchaufbau
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Wie schon bei 4.2 beschrieben, wurde die DNA von der Mitte aus jeweils abwechselnd
einmal mit Restriktionsverdau und einmal ohne Restriktionsverdau in die Taschen
pipettiert.
Abbildung 1: Ergebnis der Gelelektrophorese
Daher lässt sich das Gel in sofern auswerten, als dass die DNA nur dort erkennbar ist,
wo der Restriktionsverdau stattgefunden hat.
Anhand der Abbildung eins erkennt man jedoch auch, dass die DNA fast gar nicht
gewandert ist; der Ladder jedoch ist ziemlich gut zu erkennen.
(Eine genauere Analyse folgt in der Fehleranalyse!)
5.2 Fehleranalyse
Anhand der oben gezeigten Abbildung lässt sich erkennen, dass kaum eine Auswertung
mit Hilfe der Gelelektrophorese möglich ist. Es fällt lediglich auf, dass die DNA-
Proben, bei welchen der Restriktionsverdau durchgeführt wurde, ein wenig zu erkennen
sind. Deshalb lässt sich darauf schließen, dass einige Fehler im Vorfeld der
Elektrophorese passiert sein müssen, sonst wäre vermutlich deutlich weniger zu
erkennen.

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Ein Faktor, wodurch der Versuchsaufbau gescheitert sein könnte, ist die Tatsache, dass
keine RNase vorhanden war, weshalb Schlusszufolgern ist, dass die DNA
„verunreinigt“ war, weshalb nun kaum ein Ergebnis sichtbar ist.
Ein weiterer Grund könnte sein, dass zu wenig DNA extrahiert wurde und dadurch die
Konzentration an DNA in der Gelelektrophorese zu gering war.
Außerdem lässt sich die Möglichkeit, dass unsauber gearbeitet wurde, ebenfalls nicht
ausschließen, da dies unser erster und bisweilen einziger Versuch war DNA zu
extrahieren. Deshalb könnte es sein, dass Bakterien die DNA kontaminiert haben,
wodurch die DNA nicht mehr in der Elektrophorese wandern konnte.
Ein weiterer Fehler könnte während des Restriktionsverdaus passiert sein, da man
anhand der Abbildung zwar DNA erkennen kann, aber hierbei kaum eine
Bandenbildung sichtbar ist.
Die Möglichkeit, dass ein Fehler während der Gelelektrophorese passiert ist, lässt sich
hierbei jedoch ausschließen.
Insgesamt gesehen, wäre es von Vorteil gewesen, hätten wir mehr Zeit in Beanspruch
nehmen können. Dann hätten wir den kompletten Versuchsaufbau noch einmal von
vorne machen, um bessere Vergleichsmöglichkeiten zu haben.
Alles in allem gesehen, war uns die Komplexität der Versuchsreihe nicht bewusst,
wodurch sich letztendlich nur Vermutungen schließen lassen konnten.

6. Quellenverzeichnis
Literatur
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(1) JANNING Wilfried, KNUST Elisabeth, 2004: Genetik: allgemeine Genetik,
molekulare Genetik, Entwicklungsgenetik, S. 270f., Stuttgart, Georg Thieme
Verlag, ISBN 3-13-128771-3
(2) KNIPPERS Rolf, 2006: Molekulare Genetik, S. 502 und S. 477f., 9. komplett
überarbeitete Auflage, Stuttgart, Georg Thieme Verlag, ISBN 3-13-477009-1,
ISBN 978-3-113-477009-4
(3) QIAGEN, Juli 2006: DNeasy® Plant Handbook
(4) SCHMITT Patrick, 2010: Einführung in die Grundarbeitstechniken der
Molekularbiologie
Internetquellen
(1) http://bioweb.usu.edu/wolf/aflp_protocol.htm
(2) http://www.bbz-miesbach.de/Schularten/BOS/Faecher/Biologie/
genet_finger/DNA-Analyse.htm
(3) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7501463?dopt=Abstract
(4) http://www.chemgapedia.de/vsengine/popup/vsc/de/glossar/g/ge/
gelelektrophorese.glos.html
(5) http://www.die-leys.de/downloads/MobO%2002%20Restriktionsverdau.pdf
(6) http://www.fermentas.com/en/support/technical-reference/dna-electrophoresis
(7) http://www.fischdb.de/methoden/rflp
(8) http://www.medizinische-genetik.de/index.php?id=2001
(9) http://wapedia.mobi/de/Animal_forensics
(10) http://de.wikipedia.org/wiki/Restriktionsenzym
(11) http://de.wikipedia.org/wiki/AFLP
(12) http://de.wikipedia.org/wiki/Southern_Blot
(13) http://www.zum.de/Faecher/Materialien/hupfeld/index.htm?/
Faecher/Materialien/hupfeld/methoden/restr-ez/Restr-ez.html
Abbildungen
Deckblatt: http://www.blueplanetbiomes.org/images/sphagnum_moss.jpg
Abbildung 1: WEBER German, 2010

Erklärung des Kollegiaten:
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Ich erkläre hiermit, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die
im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Memmingen, den 22.12.2010 …………………………………
(Unterschrift des Kollegiaten)