Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...
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2.2.2. nanos-Expression ist nur in vitro nachweisbar<br />
I. 2. Ergebnisse<br />
Trotz intensiver Bemühungen konnte ich nanos-mRNA-Expression nicht durch<br />
das standardmäßige in situ-Hybridisierungs-Protokoll nachweisen. Auch unterschied-<br />
lichste Variationen der Methode, wie die Verwendung unterschiedlicher Genfragmen-<br />
te als Matrize für die Sondensynthese, hydrolytisch fragmentierte Sonden, stärke-<br />
re/schwächere Fixierungen, Amplifikationsschritte und unterschiedliche Detektions-<br />
methoden führten zu keinem spezifischen Nachweis (vgl. 4.2). Der Vergleich mit<br />
Embryonen, die nicht mit Sonde behandelt, oder mit der sense-Sonde inkubiert<br />
wurden zeigt, dass eine sehr spät einsetzende Färbung in Dotter und embryonalen<br />
Geweben als unspezifische Hintergrungfärbung zu werten ist (nicht gezeigt). Das<br />
Vorhandensein schwacher, ubiquitärer Expression auf dem Niveau des Hintergrund-<br />
signals kann allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden. Ein Polyklonales<br />
Kaninchenserum gegen zwei Peptide des Tribolium NANOS-Proteins (produziert von<br />
der Firma Eurogentec, Köln, Deutschland/Seraing, Belgien) waren nach umfangrei-<br />
chen Tests ebenfalls nicht geeignet, um die Expression von NANOS-Protein in situ<br />
oder auch im Western-Blot zu detektieren. Im Gegensatz zu diesen Methoden war es<br />
allerdings möglich, die Expression von nanos-mRNA in vitro nachzuweisen (Abb. 8).<br />
Durch eine RT-PCR Strategie mit exonischen Primern und verschiedenen cDNAs als<br />
Matritzen (vgl. 4.2.3) konnte ich zeigen, dass nanos über alle getesteten Entwick-<br />
lungsstadien hinweg exprimiert wird. Der Nachweis in unbefruchteten Eiern (Abb. 8,<br />
B, Ansatz 1) zeigt das Vorhandensein maternaler RNA in den Oozyten. Während der<br />
ersten 30 Stunden der Embryonalentwicklung bleibt nanos dann durchgehend kon-<br />
stant exprimiert (Abb. 8, A). Auch in späteren Entwicklungsstadien, also sowohl in<br />
larvalen, pupalen und adulten Tieren, ist mRNA-Expression nachweisbar (Abb. 8, B).<br />
Dies könnte sowohl mit einer Funktion für die Entwicklung und Funktion der Gona-<br />
den, als auch mit einer Rolle für die Entwicklung und Aktivität peripherer Neuronen in<br />
Zusammenhang stehen. Beide Funktionszusammenhänge sind bei Drosophila<br />
bekannt (siehe Einleitung; Kobayashi et al., 1996; Forbes und Lehmann, 1998;<br />
Schweers et al., 2002; Dubnau et al., 2003; Wang und Lin, 2004; Ye et al., 2004).<br />
Eine Quantifizierung der vorhandenen mRNA erlaubt diese Methode allerdings nicht.<br />
Stärkere Signale können zwar ein Hinweis auf eine erhöhte Expression sein, könnten<br />
aber auch auf Schwankungen der Templatequalität zurückzuführen sein.<br />
Obwohl das Vorhandensein der nanos-mRNA in vitro zweifelsfrei gezeigt werden<br />
konnte, war es nicht möglich die räumliche Verteilung in whole mount Färbungen<br />
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