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I. 2. Ergebnisse Abb. 7: Expression des Tribolium pumilio-Gens A, B, D, F Nachweis von pumilio-mRNA durch in-situ-Hybridisierung (rot in A und A’). C,E Nukleäre Färbung mit Hoechst 33342. Grün in A und A’: Immunfluoreszenz gegen Alpha-Tubulin. A Im Ovar ist das pumilio Transkript in Oozyten, in den Nährzellen und im Follikelepithel nachweisbar. Einzig die jüngsten ca. 3 Zellreihen der aus dem präfollikulären Gewebe hervorgehenden, sich differenzierenden Follikelzellen sind frei von pumilio-Expression (Linien in A’). Gezeigt ist eine einzelne Ovariole. Je fünf bis sechs Ovariolen bilden eine Hälfte des paarig aufgebauten Ovars. Nährzellen im Tropharium (T) produzieren RNAs und verschiedene Proteine für die die wachsenden Oozyten (*), die von somatischen Follikelzellen (FE) umgeben sind (Büning, 1998; Trauner und Büning, 2007). Die Abbildung F wurde freundlicherweise von Daniel Bäumer zur Verfügung gestellt. In sehr frühen Stadien (B) ist pumilio RNA innerhalb des gesamten Embryos nachweisbar und im Bereich um den maternalen Vorkern angereichert (siehe Text). Im differenzierten Blastoderm (laterale Ansicht, D) nimmt das Expressionsniveau in der Serosa ab, in voll gestreckten Keimstreifen (ventrale Ansicht, F) erhöht es sich in den Anlagen der segmentalen Körperanhänge. In allen Abbildungen ist anterior links. pum: pumilio-in-situ-Hybridisierung, S: Serosa, E: Embryoanlage, Md: Mandibuläre Segmentanlage, Mx: Maxilläre Segmentanlage, Lb: Labiale Segmentanlage, T1: erstes thorakales Segment, A“X“: xtes abdominales Segment 46
2.2.2. nanos-Expression ist nur in vitro nachweisbar I. 2. Ergebnisse Trotz intensiver Bemühungen konnte ich nanos-mRNA-Expression nicht durch das standardmäßige in situ-Hybridisierungs-Protokoll nachweisen. Auch unterschied- lichste Variationen der Methode, wie die Verwendung unterschiedlicher Genfragmen- te als Matrize für die Sondensynthese, hydrolytisch fragmentierte Sonden, stärke- re/schwächere Fixierungen, Amplifikationsschritte und unterschiedliche Detektions- methoden führten zu keinem spezifischen Nachweis (vgl. 4.2). Der Vergleich mit Embryonen, die nicht mit Sonde behandelt, oder mit der sense-Sonde inkubiert wurden zeigt, dass eine sehr spät einsetzende Färbung in Dotter und embryonalen Geweben als unspezifische Hintergrungfärbung zu werten ist (nicht gezeigt). Das Vorhandensein schwacher, ubiquitärer Expression auf dem Niveau des Hintergrund- signals kann allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden. Ein Polyklonales Kaninchenserum gegen zwei Peptide des Tribolium NANOS-Proteins (produziert von der Firma Eurogentec, Köln, Deutschland/Seraing, Belgien) waren nach umfangrei- chen Tests ebenfalls nicht geeignet, um die Expression von NANOS-Protein in situ oder auch im Western-Blot zu detektieren. Im Gegensatz zu diesen Methoden war es allerdings möglich, die Expression von nanos-mRNA in vitro nachzuweisen (Abb. 8). Durch eine RT-PCR Strategie mit exonischen Primern und verschiedenen cDNAs als Matritzen (vgl. 4.2.3) konnte ich zeigen, dass nanos über alle getesteten Entwick- lungsstadien hinweg exprimiert wird. Der Nachweis in unbefruchteten Eiern (Abb. 8, B, Ansatz 1) zeigt das Vorhandensein maternaler RNA in den Oozyten. Während der ersten 30 Stunden der Embryonalentwicklung bleibt nanos dann durchgehend kon- stant exprimiert (Abb. 8, A). Auch in späteren Entwicklungsstadien, also sowohl in larvalen, pupalen und adulten Tieren, ist mRNA-Expression nachweisbar (Abb. 8, B). Dies könnte sowohl mit einer Funktion für die Entwicklung und Funktion der Gona- den, als auch mit einer Rolle für die Entwicklung und Aktivität peripherer Neuronen in Zusammenhang stehen. Beide Funktionszusammenhänge sind bei Drosophila bekannt (siehe Einleitung; Kobayashi et al., 1996; Forbes und Lehmann, 1998; Schweers et al., 2002; Dubnau et al., 2003; Wang und Lin, 2004; Ye et al., 2004). Eine Quantifizierung der vorhandenen mRNA erlaubt diese Methode allerdings nicht. Stärkere Signale können zwar ein Hinweis auf eine erhöhte Expression sein, könnten aber auch auf Schwankungen der Templatequalität zurückzuführen sein. Obwohl das Vorhandensein der nanos-mRNA in vitro zweifelsfrei gezeigt werden konnte, war es nicht möglich die räumliche Verteilung in whole mount Färbungen 47
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Die Funktion von Genen der posterio
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II. 1. Einleitung Augen und im zent
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II. 1. Einleitung 1.4.3. Die iBeetl
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II. 4. Material und Methoden bei de
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II. 4. Material und Methoden 218 Ti
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Allgemeine Diskussion Allgemeine Di
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Allgemeine Diskussion und Achsendet
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Anhang ACCCATCCGTACGGCTGCCGGGTCATTC
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Anhang 2. Ergänzende Ergebnisse zu
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Anhang 3. Zeitaufwand der iBeetle-A
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238 43 1000 99 similar to Rab-prote
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Anhang gemischt embryonal letal von
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Literatur Literatur Abdel-Latief, M
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Literatur Bernstein, D., Hook, B.,
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Literatur Ciglar, L. und Furlong, E
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Literatur Falciani, F., Hausdorf, B
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Literatur Gutjahr, T., Vanario-Alon
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Literatur Kiger, A. A., Baum, B., J
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Literatur Lin, H. und Spradling, A.
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Literatur binding protein that phys
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Literatur Riddiford, L. M., Hiruma,
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Literatur Schüpbach, T. und Wiesch
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Literatur Tomoyasu, Y., Miller, S.
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Literatur Zhang, X. D. und Heyse, J
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