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I. 1. Einleitung 40 Um diese Fragen zu klären, sollten durch die in Tribolium etablierten RNA- Interferenz-Methoden die Effekte des Funktionsverlusts beider Gene analysiert werden. Einflüsse auf die Expression verschiedener im Blastoderm aktiver Faktoren und die Morphologie der schlupfreifen Larve sollten helfen, die Rolle von nanos und pumilio innerhalb der frühen Musterbildung von Tribolium einzuordnen.
2. Ergebnisse I. 2. Ergebnisse 2.1. Im Tribolium-Genom konnten eindeutige Orthologe zu nanos und pumilio identifiziert werden Die Identifizierung und molekularbiologische Bearbeitung von Kandidatengenen in Tribolium hat sich durch die Sequenzierung des Genoms (Tribolium Genome Sequencing Consortium, 2008) extrem vereinfacht. Während in nicht sequenzierten Arten die putative Sequenz des jeweiligen Gens aus bekannten homologen Sequen- zen deduziert werden muss und mit Hilfe eines möglichst breit angelegten Primer- gemischs ein Fragment durch PCR amplifiziert wird, erlaubt ein sequenziertes Ge- nom die „in silico“ Identifizierung der Sequenzen über Homologiesuchen (tBLASTx; (Altschul et al., 1997) gefolgt von der Verwendung von genspezifischen Primern in der PCR. Auf diese Art und Weise konnten auch die Tribolium-Orthologe der Dro- sophila Gene nanos und pumilio identifiziert und „kloniert“ werden (s. 4.1). 2.1.1. Tribolium nanos Das Tribolium-nanos-Gen (TC030446) liegt auf der zweiten Komplementati- onsgruppe. Es wurde im Rahmen der automatischen Annotation des NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nicht erfasst, die Integration mehrerer Genvorhersageprogramme am HGSC (Human Genome Se- quencing Center, http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/) des Baylor College of Medicine zu so genannten GLEAN Genmodellen hingegen erlaubte die automatische Annotierung des größten Teils der nanos kodierenden Sequenz. Die Vorhersage dieses Genmo- dells (GLEAN_01298) erkannte allerdings ein im richtigen Leserahmen liegendes Intron nicht, wodurch 5’ der für nanos kodierenden Sequenz mehrere hundert Ba- senpaaren (bp) fälschlicherweise als sinntragend annotiert wurden. Durch Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) Experimente im Rahmen meiner Diplomarbeit (Schmitt, 2005) konnte aber gezeigt werden, dass in vivo jenes kleine Intron (49 bp) gespleißt wird. Erst dieser Vorgang bringt die Nukleotide des Startcodons (ATG) in direkte Folge, während der fälschlich annotierte 5’ Bereich nun nicht mehr in einem durchgängigen Leserahmen mit der kodierenden Sequenz liegt. Die Exongrenze liegt also genau im nanos Startcodon (A - TG). Diese Besonderheit erschwerte, bzw. verhinderte die korrekte automatische Annotierung. 3’ der kodierenden Sequenz 41
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Seite 35 und 36: I. 1. Einleitung Die frühe Regulat
Seite 37 und 38: I. 1. Einleitung wahrscheinlich üb
Seite 39 und 40: I. 1. Einleitung wie in Vertebraten
Seite 41 und 42: I. 1. Einleitung und Wharton, 1999)
Seite 43 und 44: I. 1. Einleitung des nanos-Verlusts
Seite 45 und 46: I. 1. Einleitung Außerdem zeigen n
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Seite 51 und 52: I. 2. Ergebnisse Abb. 6: Sequenzver
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Seite 55 und 56: 2.2.2. nanos-Expression ist nur in
Seite 57 und 58: I. 2. Ergebnisse 2.3. pRNAi für na
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3. Diskussion I. 3. Diskussion 3.1.
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I. 3. Diskussion leider nicht gepr
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I. 3. Diskussion Möglicherweise ve
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I. 3. Diskussion Marques-Souza et a
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I. 3. Diskussion der antennalen Seg
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I. 3. Diskussion Effekt, der erst i
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I. 3. Diskussion Netzwerk, das zur
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I. 3. Diskussion 3.4. Das Zusammens
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I. 3. Diskussion sion als Substrat
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4. Material und Methoden I. 4. Mate
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4.2.1. in situ Hybridisierung I. 4.
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I. 4. Material und Methoden ohne Bl
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II. 1. Einleitung Serie zu beobacht
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II. 1. Einleitung 140 schen Fragest
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II. 1. Einleitung Augen und im zent
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II. 1. Einleitung 1.4.3. Die iBeetl
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II. 1. Einleitung sophila wegen tec
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II. 1. Einleitung 1.5. Ziele des zw
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II. 2. Ergebnisse 152 Im nächsten
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II. 2. Ergebnisse bei 30°C inkubie
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II. 2. Ergebnisse 160
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II. 2. Ergebnisse Abb. 29: Arbeitsp
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II. 2. Ergebnisse von RNAi-Effekten
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II. 2. Ergebnisse 2.3. Es konnten f
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II. 2. Ergebnisse Abb. 32: Zusammen
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II. 3. Diskussion in Tribolium, nic
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II. 4. Material und Methoden bei de
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II. 4. Material und Methoden 218 Ti
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Allgemeine Diskussion Allgemeine Di
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Allgemeine Diskussion und Achsendet
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Anhang ACCCATCCGTACGGCTGCCGGGTCATTC
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Anhang 2. Ergänzende Ergebnisse zu
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Anhang 3. Zeitaufwand der iBeetle-A
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238 43 1000 99 similar to Rab-prote
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Anhang gemischt embryonal letal von
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Literatur Literatur Abdel-Latief, M
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Literatur Bernstein, D., Hook, B.,
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Literatur Ciglar, L. und Furlong, E
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Literatur Falciani, F., Hausdorf, B
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Literatur Gutjahr, T., Vanario-Alon
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Literatur Kiger, A. A., Baum, B., J
Seite 262 und 263:
Literatur Lin, H. und Spradling, A.
Seite 264 und 265:
Literatur binding protein that phys
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Literatur Riddiford, L. M., Hiruma,
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Literatur Schüpbach, T. und Wiesch
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Literatur Tomoyasu, Y., Miller, S.
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Literatur Zhang, X. D. und Heyse, J
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