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II. 4. Material und Methoden
pigmentierung zur Unterscheidung von injizierten Weibchen und nicht inzierten
Männchen im weiteren Screeningverlauf.
4.2.2. Pupale Injektion und darauf folgende Auswertungen
1) Bereitstellung von männlichen Tieren zur Verpaarung
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(H) Wöchentlich sollten black-Puppen nach Geschlecht sortiert und z.B. in Ein-
heiten von ca. 50 Tieren aufbewahrt werden, damit immer männliche Tiere zum
Verpaaren verfügbar sind, und bei Kontamination mit Weibchen nur ein kleine Menge
verworfen werden muss. Eine Kontamination mit Weibchen lässt sich nach 3 Wo-
chen am Vorhandensein von Larven erkennen. Dies sollte von studentischen oder
technischen Assistenten durchgeführt werden.
(P) Ca. 3 Wochen vor der Injektion wurden SB-Puppen nach Geschlecht sortiert.
Der zeitliche Abstand erlaubt die Kontrolle auf Kontamination durch Weibchen an-
hand An- oder Abwesenheit von Larven.
2) Sortieren der Puppen zur Injektion
Männliche und weibliche Puppen werden am effektivsten an einem Stereomikro-
skop mit Durchlichteinrichtung unter Verwendung einer zum Saug-Greifer umgebau-
ten Aquariumspumpe sortiert und Weibchen im injektionsfähigen Alter (ca. 75 – 90 %
der Puppenentwicklung abgeschlossen) gesammelt. Bei einer Stammhaltung bei ca.
23 °C und einer dreitägigen Eiablage zur Etablierung einer Population sind in einer
Population mit ca. 50 % adulten Tieren, wiederum ca. 50 % der weiblichen Puppen
im richtigen Alter für die Injektion. Die restlichen weiblichen Puppen können für
Injektionen späterer Injektionstage herangezogen werden.
3) Injektion (Tag 0)
8 weibliche Puppen pro Gen (ca. 4!l 1 !g/!l RNA pro Gen) werden auf einem
Objektträger (OT) fixiert, und wie von Bucher beschrieben injiziert (Bucher et al.,
2002; Bucher und Klingler, 2004). 1 zusätzliche Puppe wird aufgeklebt um für even-
tuelle Schwierigkeiten zu kompensieren und gegebenenfalls nach der Injektion
wieder entfernt. Als Orientierung für die richtige Lumenweite der Kapillarspitze dient
der Übergang vom distalen, dunklen zum proximalen hellen Bereich der Urogomphi
der Puppe.