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4. Material und Methoden
II. 4. Material und Methoden
4.1. Synthese doppelsträngiger RNA komplementär zu zufällig
gewählten cDNA Klonen
Die im Pilot-Screen verwendeten dsRNAs wurden auf Basis von amplifizierten
cDNA-Fragmenten einer embryonalen Lamda-Phagen cDNA-Bank synthetisiert, die
ursprünglich von R.Schröder erstellt wurde (Wolff et al., 1995). Diese wurde im
wesentlichen wie in der Herstellerangabe des Uni-ZAP XR Vector Kits (Stratagene,
La Jolla, CA) und in Sambrook and Russel (2001) beschrieben, unter Verwendung
der dort angegebenen Medien und Reagenzien eingesetzt. Der Titer der amplifizier-
ten Phagen betrug 4,9 x 10 7 pfu/ml. Das Äquivalent von 50 pfu wurde mit 200 !l XL1-
blue MRF E. coli (Stratagene) in 3 ml NZY-top-Agar auf 12 x 12 cm LB-Agar-Platten
ausplattiert, um klar voneinander abgegrenzte Plaques zu erhalten.
Einzelne Plaques wurden mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze in einen 20 !l
PCR-Ansatz überführt. Durch Verwendung eines T7-Promotor-spezifischen und
eines T3-Promotor-spezifischen Primers, der zusätzlich eine T7-Promotor-Sequenz
trägt, wurden die Matrizen für die dsRNA-Synthese hergestellt. Dabei wurde die
peqGOLD Taq-Polymerase und Reagientien von Peqlab (Erlangen) verwendet.
Tab. 9: PCR zur Synthese der Matrize für die dsRNA-Synthese
Primer Annealingtemperatur
Zyklen Elongation
T7 5´-TAATACGACTCACTATAGG-3´ 40 °C 5 2 min
T3-T7 5´-TAATACGACTCACTATAGG
AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´
55 °C 30 2 min
Die PCR-Reaktionen mit einem Insert zwischen 450 und 2000 bp wurden aufge-
reinigt (Roche High Pure PCR cleanup Micro Kit) und in 10 !l eluiert. Die Konzentra-
tion wurde durch Gelelektrophorese bestimmt (i.d.R. zwischen 50 und 100 ng/!l) ca.
150 ng jeder Probe zur Sequenzierung eingeschickt (Seqlab, Göttingen) und ca. 250
ng zur RNA-Synthese mit Hilfe des MEGAScript T7 Kits von Ambion verwendet.
Dabei wurde ein Viertel der vom Hersteller empfohlenen Menge an Enzym und
Nukleotiden im halben empfohlenen Volumen eingesetzt. Die RNA wurde in 10 !l
Injektionspuffer (1,4 mM NaCl, 0,07 mM Na2HPO4, 0,03 mM KH2PO4, 4 mM KCL; 4%
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