Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...
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4. Material und Methoden<br />
II. 4. Material und Methoden<br />
4.1. Synthese doppelsträngiger RNA komplementär zu zufällig<br />
gewählten cDNA Klonen<br />
Die im Pilot-Screen verwendeten dsRNAs wurden auf Basis von amplifizierten<br />
cDNA-Fragmenten einer embryonalen Lamda-Phagen cDNA-Bank synthetisiert, die<br />
ursprünglich von R.Schröder erstellt wurde (Wolff et al., 1995). Diese wurde im<br />
wesentlichen wie in der Herstellerangabe des Uni-ZAP XR Vector Kits (Stratagene,<br />
La Jolla, CA) und in Sambrook and Russel (2001) beschrieben, unter Verwendung<br />
der dort angegebenen Medien und Reagenzien eingesetzt. Der Titer der amplifizier-<br />
ten Phagen betrug 4,9 x 10 7 pfu/ml. Das Äquivalent von 50 pfu wurde mit 200 !l XL1-<br />
blue MRF E. coli (Stratagene) in 3 ml NZY-top-Agar auf 12 x 12 cm LB-Agar-Platten<br />
ausplattiert, um klar voneinander abgegrenzte Plaques zu erhalten.<br />
Einzelne Plaques wurden mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze in einen 20 !l<br />
PCR-Ansatz überführt. Durch Verwendung eines T7-Promotor-spezifischen und<br />
eines T3-Promotor-spezifischen Primers, der zusätzlich eine T7-Promotor-Sequenz<br />
trägt, wurden die Matrizen für die dsRNA-Synthese hergestellt. Dabei wurde die<br />
peqGOLD Taq-Polymerase und Reagientien von Peqlab (<strong>Erlangen</strong>) verwendet.<br />
Tab. 9: PCR zur Synthese der Matrize für die dsRNA-Synthese<br />
Primer Annealingtemperatur<br />
Zyklen Elongation<br />
T7 5´-TAATACGACTCACTATAGG-3´ 40 °C 5 2 min<br />
T3-T7 5´-TAATACGACTCACTATAGG<br />
AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´<br />
55 °C 30 2 min<br />
Die PCR-Reaktionen mit einem Insert zwischen 450 und 2000 bp wurden aufge-<br />
reinigt (Roche High Pure PCR cleanup Micro Kit) und in 10 !l eluiert. Die Konzentra-<br />
tion wurde durch Gelelektrophorese bestimmt (i.d.R. zwischen 50 und 100 ng/!l) ca.<br />
150 ng jeder Probe zur Sequenzierung eingeschickt (Seqlab, Göttingen) und ca. 250<br />
ng zur RNA-Synthese mit Hilfe des MEGAScript T7 Kits von Ambion verwendet.<br />
Dabei wurde ein Viertel der vom Hersteller empfohlenen Menge an Enzym und<br />
Nukleotiden im halben empfohlenen Volumen eingesetzt. Die RNA wurde in 10 !l<br />
Injektionspuffer (1,4 mM NaCl, 0,07 mM Na2HPO4, 0,03 mM KH2PO4, 4 mM KCL; 4%<br />
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