Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...
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II. 3. Diskussion<br />
des ersten Jahres aktiv gescreent werden, so dass den Doktoranden Gelegenheit<br />
gegeben werden kann, in den folgenden beiden Jahren erste Kandidaten-Gene der<br />
für sie speziell interessanten Prozesse zu analysieren. Somit muss ein Screener<br />
innerhalb eines Jahres 1500 Gene analysieren. Die vorgestellten Arbeitspläne (Abb.<br />
27, Abb. 28, Abb. 29) und die Methodik (2.1.1) erlauben diesen hohen Durchsatz.<br />
190<br />
Der Pilot-Screen machte deutlich, dass sowohl die pupale als auch die larvale<br />
dsRNA-Injektion (Bucher et al., 2002; Tomoyasu und Denell, 2004) geeignet sind,<br />
auch in großem Maßstab durchgeführt zu werden. Die Methoden sind gut routinisier-<br />
bar, schnell zu erlernen und ohne großen apparativen Aufwand anzuwenden. Die<br />
Injektionen mittels einfacher 1D-Mikromanipulatoren und fein ausgezogener Glaska-<br />
pillaren unter Verwendung mehrerer Kapillarhalter zur Vermeidung von Kreuzkonta-<br />
minationen (s. 4.2.2) erwies sich als praktikable Lösung. Die Größenselektion durch<br />
verschiedene Siebgrößen und die Kryoanästhesie der zu injizierenden Tiere erlau-<br />
ben dabei auch die einfache Durchführung larvaler Injektionen (4.2.3).<br />
Es zeigte sich, dass in beiden Fällen wenige injizierte Tiere ausreichen, um die<br />
nötigen Auswertungen durchzuführen. Im Durchschnitt überleben 86 % der Larven<br />
und 78 % der Puppen die Prozedur (nicht gezeigt), sofern kein spezifischer RNAi-<br />
Effekt zum Tod führt. So stehen meist acht von zehn Larven oder sechs von acht<br />
Puppen zur weiteren Analyse zur Verfügung. Da beide Screener im Rahmen des<br />
Pilot-Screens nicht die Gelegenheit hatten, Routine in dem Unfang zu entwickeln,<br />
wie das im Hauptscreen der Fall sein wird, kann davon ausgegangen werden, dass<br />
diese Quoten in iBeetle noch verbessert werden können. Die Zahl der überlebenden<br />
Tiere ist ausreichend, um sowohl während des pupalen Screenteils die nötige Menge<br />
an Nachkommen für die embryonalen Analysen zu erhalten, als auch während des<br />
larvalen Screens morphologische Veränderungen der Tiere festzustellen. Dies wird<br />
durch die meist hohen Penetranzen der Tribolium-RNAi-Phänotypen möglich (z.B.<br />
Bucher et al., 2002; Konopova und Jindra, 2007). Auch innerhalb des Pilotscreens<br />
waren die Effekte der Injektionen meist in 60 bis 100 % der untersuchten Tiere<br />
beobachtbar (Anhang 6 bzw. nicht gezeigt). Dies gilt sowohl für die larvalen als auch<br />
für die pupalen Injektionen und für die zufällig ausgewählten Fragmente unbekannter<br />
Funktion ebenso wie für die Positiv-Kontrollen. Nur einige wenige der neu gefunde-<br />
nen embryonalen Phänotypen (RNAs # 9, 11, 40) zeigten eine geringere Penetranz<br />
(30 - 50 %). Dies ist aber offensichtlich kein prinzipielles Problem bei embryonalen<br />
Phänotypen, da die als Positiv-Kontrollen verwendeten embryonalen Entwicklungs-