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II. 3. Diskussion
des ersten Jahres aktiv gescreent werden, so dass den Doktoranden Gelegenheit
gegeben werden kann, in den folgenden beiden Jahren erste Kandidaten-Gene der
für sie speziell interessanten Prozesse zu analysieren. Somit muss ein Screener
innerhalb eines Jahres 1500 Gene analysieren. Die vorgestellten Arbeitspläne (Abb.
27, Abb. 28, Abb. 29) und die Methodik (2.1.1) erlauben diesen hohen Durchsatz.
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Der Pilot-Screen machte deutlich, dass sowohl die pupale als auch die larvale
dsRNA-Injektion (Bucher et al., 2002; Tomoyasu und Denell, 2004) geeignet sind,
auch in großem Maßstab durchgeführt zu werden. Die Methoden sind gut routinisier-
bar, schnell zu erlernen und ohne großen apparativen Aufwand anzuwenden. Die
Injektionen mittels einfacher 1D-Mikromanipulatoren und fein ausgezogener Glaska-
pillaren unter Verwendung mehrerer Kapillarhalter zur Vermeidung von Kreuzkonta-
minationen (s. 4.2.2) erwies sich als praktikable Lösung. Die Größenselektion durch
verschiedene Siebgrößen und die Kryoanästhesie der zu injizierenden Tiere erlau-
ben dabei auch die einfache Durchführung larvaler Injektionen (4.2.3).
Es zeigte sich, dass in beiden Fällen wenige injizierte Tiere ausreichen, um die
nötigen Auswertungen durchzuführen. Im Durchschnitt überleben 86 % der Larven
und 78 % der Puppen die Prozedur (nicht gezeigt), sofern kein spezifischer RNAi-
Effekt zum Tod führt. So stehen meist acht von zehn Larven oder sechs von acht
Puppen zur weiteren Analyse zur Verfügung. Da beide Screener im Rahmen des
Pilot-Screens nicht die Gelegenheit hatten, Routine in dem Unfang zu entwickeln,
wie das im Hauptscreen der Fall sein wird, kann davon ausgegangen werden, dass
diese Quoten in iBeetle noch verbessert werden können. Die Zahl der überlebenden
Tiere ist ausreichend, um sowohl während des pupalen Screenteils die nötige Menge
an Nachkommen für die embryonalen Analysen zu erhalten, als auch während des
larvalen Screens morphologische Veränderungen der Tiere festzustellen. Dies wird
durch die meist hohen Penetranzen der Tribolium-RNAi-Phänotypen möglich (z.B.
Bucher et al., 2002; Konopova und Jindra, 2007). Auch innerhalb des Pilotscreens
waren die Effekte der Injektionen meist in 60 bis 100 % der untersuchten Tiere
beobachtbar (Anhang 6 bzw. nicht gezeigt). Dies gilt sowohl für die larvalen als auch
für die pupalen Injektionen und für die zufällig ausgewählten Fragmente unbekannter
Funktion ebenso wie für die Positiv-Kontrollen. Nur einige wenige der neu gefunde-
nen embryonalen Phänotypen (RNAs # 9, 11, 40) zeigten eine geringere Penetranz
(30 - 50 %). Dies ist aber offensichtlich kein prinzipielles Problem bei embryonalen
Phänotypen, da die als Positiv-Kontrollen verwendeten embryonalen Entwicklungs-