Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...
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I. 4. Material und Methoden<br />
Polyvinylalkohol durchgeführt. Keine dieser Variationen führten zu einem spezifi-<br />
schen Nachweis der nanos-Expression.<br />
4.2.2. Antikörperproduktion und Immunohistochemische Färbungen<br />
126<br />
Zum Nachweis der nanos-Expression in situ wurden von der Firma Eurogentec<br />
Polyklonale Seren gegen in vitro synthetisierte NANOS Peptide hergestellt. Eurogen-<br />
tec hat dabei zwei kurze Peptide der NANOS-Proteinsequenz synthetisiert (H2N-<br />
QNQQFSQDVENYQRPC-CONH2 und H2N-RNQQFSNVLRSIENVQC-CONH2) die<br />
von Fachleuten dort ausgewählt wurden, und eine möglichst hohe Wahrscheinlichkeit<br />
für die Erkennung der Epitope des nativen Proteins durch das polyklonale Serum<br />
gewährleisten sollen. Mit einer Mischung beider Peptide wurden zwei Kaninchen<br />
immunisiert, die anhand des Verhaltens ihrer Präimmunseren in Testfärbungen von<br />
mir aus fünf Tieren ausgewählt wurden. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse<br />
weiterer von mir durchgeführter Testfärbungen während des Immunisierungspro-<br />
gramms, wurden insgesamt sechs Injektionen durchgeführt. Die zweite zwei Wochen<br />
nach der ersten Injektion, jede weitere im Abstand eines Monats. 20 ml der Immun-<br />
seren der finalen Blutungen beider Kaninchen wurden vereinigt, und mittels Affini-<br />
tätschromatographie getrennt gegen beide Peptide von Eurogentec aufgereinigt und<br />
mir zur Verfügung gestellt. Die polyklonalen Immunseren wurden in whole-mount<br />
Immunhistochemischen Färbungen an Tribolium und Drosophila Embryonen unter-<br />
schiedlichen Alters auf ihre Reaktivität getestet. Es war leider nicht möglich durch<br />
diese Experimente NANOS-Protein nachzuweisen. Die Polyklonalen Immunseren<br />
konnten zwar verwendet werden um die an Carrier-Protein gebundenen Peptide zu<br />
detektieren, es konnte aber auch durch Western-Blot verschiedener Tribolium-<br />
Proteinextrakte kein NANOS-Protein nachgewiesen werden. Vorhandene Polyklona-<br />
le Seren gegen OTD-1 oder CAD hingegen (Schulz et al., 1998; Schröder, 2003),<br />
konnten in Western-Blots erfolgreich zum Nachweis ihrer Zielproteine eingesetzt<br />
werden.<br />
Zum Nachweis des NANOS-Proteins in whole mount Färbungen mit Tribolium<br />
Embryonen wurden diverse Variationen des Standardprotokolls für Immunhistoche-<br />
mische Färbungen getestet (Roth et al., 1989). Zunächst wurden Verdünnungen der<br />
Seren zwischen 1:10 und 1:200 getestet. Die Seren wurden mit Tribolium Embryo-<br />
nen präabsorbiert. Die Stärke der Blocking-Schritte wurde zwischen 20 min bis 2 h<br />
mit 3% BSA, 1h mit 8% BSA, 30 min mit 0,5 % Böhringer Blocking Reagenz und