Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...
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I. 4. Material und Methoden<br />
aufgereinigt und in mit CIP (Invitrogen) dephosphorylierten, mit EcoRV (New England<br />
Biolabs) geöffneten Bluescript II KS Vektor ligiert (T4 DNA-Ligase, New England<br />
Biolabs). Erhaltene Klone wurden durch Kolonie-PCR, unter Verwendung einer<br />
Probe der Kolonie als DNA-Matrizen Quelle, mit vektorspezifischen Primern (5´-<br />
CTATGACCATGATTACGCCAAG-3´, 5´-TAACGCCAGGGTTTTCCCAGT-3´, 58 °C<br />
Annealingtemperatur) verifiziert und schließlich bei der Firma Seqlab (Göttingen)<br />
sequenziert. Primer wurden von Metabion (München) synthetisiert.<br />
124<br />
Ein weiteres nanos Fragment, inklusive aus RACE bekannter 5’ UTR Sequenz<br />
wurde in meiner Diplomarbeit kloniert (Länge: 631 bp), ein dritter Klon, ausschließlich<br />
kodierende Sequenz enthaltend wurde von Dr. Michael Schoppmeier zur Verfügung<br />
gestellt (Länge: 331 bp).<br />
DNA und Protein Sequenzanalysen, sowie Primerdesign wurden unter Zuhilfe-<br />
nahme von online-Datenbanken (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und der folgen-<br />
den Programme durchgeführt: CLC Sequence Viewer, Oligo 4.05, ClustalX, DNASIS<br />
2.0.<br />
4.2. Expressionsanalysen<br />
Tribolium-Embryonen für Expressionsananalysen wurden, wenn nicht anders be-<br />
schrieben, in 50 % Klorix für 2 mal 3 Minuten dechorionisiert, gespült, in einem<br />
Heptanbad aus dem Netzchen (180 !m) gesaugt und für 35 Minuten in 2 ml PEMS-<br />
Puffer, 6 ml Heptan und 350 !l 37% Formaldehydlösung fixiert. Nach der Fixierung<br />
wird die wässrige Phase entfernt und die Embryonen durch Zugabe von 8 ml Metha-<br />
nol und ca. 15 s starkes Schütteln devitellinisiert. Dadurch nicht devitellinisierte<br />
Embryonen können mehrmals durch eine 18g Kanüle gepresst werden um die noch<br />
verbliebene Vitellinhülle mechanisch zu entfernen. Vor allem Keimstreifstadien<br />
lassen sich schlecht devitellinisieren und werden durch diese Prozedur leicht zer-<br />
stört. Somit wurden Keimstreifembryonen, wenn nötig, nach der Fixierung von Hand<br />
aus der Eihülle präpariert. Hierzu werden die Embryonen einzeln aus der Heptan-<br />
phase auf doppelseitiges Klebeband (Tesa Photo Tape) gebracht, nach Verdunsten<br />
des Heptans mit DEPC-behandeltem PBS überschichtet und mit Hilfe von Minutien-<br />
nadeln aus der Eihülle präpariert. Danach werden die Embryonen so schnell wie<br />
möglich in Methanol überführt.