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4. Material und Methoden
I. 4. Material und Methoden
Die angewendeten molekularbiologischen Methoden, Lösungen und sonstige La-
borbedarfsmittel richteten sich nach den Herstellerangaben der Produkte, bzw. nach
Sambrook et. al. (Sambrook und Russell, 2001).
Die Experimente wurden mit Tieren des San Bernadino Stammes durchgeführt
(M. Klingler, persönliche Mitteilung).
4.1. Klonierung
Die Tribolium-Orthologe zu nanos, pumilio und brain-tumor wurden über BLAST-
Homologiesuchen (http://beetlebase.org/blast/blast.html, http://www.hgsc.bcm.tmc.
edu/blast.hgsc oder http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) mit den Drosophila Prote-
insequenzen identifiziert. Fragmente der Gene wurden mit Hilfe genspezifischer
Primer aus cDNA amplifiziert und kloniert.
RNA aus unterschiedlichen embryonalen Stadien wurde mit Hilfe von TRIzol Re-
agenz (Invitrogen) nach Herstellerangaben isoliert, die Isolate wurden vereinigt und
davon mit der Superscript II Reversen Transkriptase (Invitrogen) ebenfalls nach
Herstellerangabe cDNA hergestellt. Ein !l der cDNA wurde für PCR eingesetzt.
Tab. 3: Primer und PCR-Bedingungen
Gen/Primer
nanos
Annealingtemperatur
fw 5’-CCCCAAAATGTTACGACT-3’
bw 5’-CATGTTATATACAATGTAATTTGG-3’ 50 °C 810 bp
pumilio (kloniert während der Diplomarbeit)
fw 5’-CAATCACATCGTGGAG-3’
bw 5’-CTCAACGAGTTAAGATGAG-3’ 50 °C 887 bp
brain-tumor
fw 5’-GCAAGTTCGGCGAGTTTGG-3’
bw 5’-GAAACATTGGGCGTGCTTC-3’ 52 °C 713 bp
Fragmentlänge
PCR-Produkte wurden mit einer T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs)
vervollständigt, mit Polynukleotidkinase (New England Biolabs) phosphoryliert,
mittels präparativer Agarosegelektrophorese (MinElute Gelextraction Kit, Quiagen)
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