IMMUNHÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGSMETHODEN

IMMUNHÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGSMETHODEN
von Ulrike Velten, J. Fischer, J. Hoch, G. Giers und P. Hanfland
1 Einführung
Als Blutgruppen werden genetisch determinierte Merkmale des Blutes bezeichnet, die vornehmlich
an den zellulären Blutbestandteilen lokalisiert sind. 1m engeren Sinne sind Blutgruppen
membrangebundene Merkmale (vor allem erythrozytäre Blutgruppenantigene). Im weiteren Sinne
sind Blutgruppen auch zelluläre Enzymgruppen (Enzympolymorphismus). HLA-Merkmale (siehe
4.1) und spezifische Antigene der Granulozyten und der Thrombozyten sowie die nicht zellulären
Serumantigene.
Die Kenntnisse über die erythrozytären Blutgruppen sind vor allem für die Transfusionsmedizin
(Behandlung mit Blut und Blutkomponenten), die Transplantationsmedizin, die Geburtshilfe und
die Pädiatrie (Morbus haemolyticus neonatorum = Blutgruppenunverträglichkeit zwischen Mutter
und Kind) so- wie für die forensische Medizin (Abstammungs-ldentitätsbegutachtung) von
Bedeutung. Einige immunhämatologische Untersuchungsmethoden haben einen vorrangigen
Stellenwert in der Diagnostik bestimmter. immunologisch bedingter Erkrankungen (z. B.
Immunhämolysen, Immunthrombozytopenien).
2 Terminologie
Es gibt verschiedene Einteilungsaspekte zur Deskription erythrozytärer Antikörper.
- Empirischer Aspekt
Reguläre/irreguläre Antikörper: Reguläre Antikörper sind bei jedem

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Individuum einer Spezies zu finden, während irreguläre nur bei einigen Individuen auftreten.
- Pathogenetischer Aspekt
Natürlich präformierte Antikörper/Immunantikörper: Natürlich präformierte Antikörper werden
durch unspezifische, meist enterale Sensibilisierung (Darmbakterien mit blutgruppenähnlichen
Antigenen), also nicht durch spezifische Fremderythrozyten-Antigenexposition erworben, während
sogenannte Immunantikörper immer eine spezifische Fremderythrozyten-Antigenexposition
(parenterale Sensibilisierung. d. h. u. a. Transfusion oder Schwangerschaft) voraussetzen.
- Einteilung nach dem in-vitro-Reaktionsverhalten
"Komplette" oder "in komplette" Antikörper: Die Bezeichnungen haben sich eingebürgert. sind
jedoch irreführend. Immer handelt es sich um voll- ständig aufgebaute Antikörper.
Komplette Antikörper bewirken in-vitro eine spontane Hämagglutination oder Hämolyse
bereits im Milieu einer physiologischen Kochsalzlösung. d. h. ohne Zusatz von
Reaktionsverstärkern (Supplement) oder anderen Hilfsmethoden ereignet sich eine unmittelbare
Reaktion. Inkomplette Antikörper lagern sich zunächst nur an einen Erythrozyten an, ohne
Brückenbildung zu anderen Erythrozyten (Agglutination) oder ohne Komplementaktivierung
(Hämolyse). Durch Supplement wird die Abstoßung der Erythrozyten vermindert und somit
manchmal die Brückenbildung (Agglutination) ermöglicht. Meist ist jedoch die Überbrückung der
Distanz zwischen den Erythrozyten nur mit Anti-Humanglobulinen (Anti- Antikörper oder Anti-
Komplement, Prinzip des Coombstest) möglich, hier handelt es sich also um eine mittelbare
Reaktion
3 Transfusionsmedizinisch wichtige erythrozytäre Blutgruppensysteme
Derzeit sind mehr als 88 verschiedene erythrozytäre Blutgruppensysteme mit mehr als 64)
verschiedenen Antigenen bekannt. Transfusionsmedizinisch haben jedoch das AB0-, das Rhesus-
und das Keil-System die größte klinische Relevanz.

3.1 Das AB0-(ABH-)System
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Das beim Menschen wichtigste und am längsten bekannte Blutgruppensystem ist das AB0-System
(Landsteiner 1901/1902). Für Bluttransfusionen hat da~ AB0-Blutgruppensystem die größte
Bedeutung, da es beim Menschen das einzige Blutgruppensystem ist, das reguläre Antikörper (im
allgemeinen als Isoagglutinine bezeichnet) aufweist, die bei AB0-unverträglichen Bluttransfusionen
in der Regel zu schwerwiegenden. z. T. tödlichen Transfusionsreaktionen führen.
3.1.1 Die Antigene des AB0-Systems
Die AB0-Antigene sind auf der Erythrozytenoberfläche angeordnet und sind schon bei 3 Monate
alten Feten nachweisbar. Allerdings entwickelt sich die volle Antigenstärke erst bis zum 18.
Lebensmonat. Darüberhinaus kommen die AB0-Antigene auf den Membranen fast aller anderen
Körperzellen vor.
Je nach Vorhandensein der Antigene A und B unterscheidet man die Blutgruppen A, B, AB und 0,
wobei die Blutgruppe 0 durch das Fehlen der Antigene A und B gekennzeichnet ist.
In der deutschen Population kommen die AB0-Blutgruppen in folgender Häufigkeit vor: 43 % A,
39 % 0, 13 % B, 5 % AB (= Phänotypen).
Auf Grund der Stärke der Antigenausprägung kann man verschiedene Untergruppen (Varianten) der
Blutgruppenmerkmale A und B unterscheiden (z. B. A1 und A2).
3.1.2 Die Antikörper des AB0-Systems
Im Serum jedes menschlichen Individuums finden sich reguläre Antikörper gegen die
Blutgruppenmerkmale A und B des AB0-Systems. die es selbst nicht besitzt (Ausnahme:
Neugeborene und Personen mit Antikörpermangelsyndromen). Diese Antikörper werden
im Laufe des ersten Lebensjahres gebildet. wobei man heute als Antigenstimulus
Strukturen von Bakterien der Darmflora. die denen der AB0-Substanzen ähnlich sind.
verantwortlich macht. Dementsprechend handelt es sich hierbei um natürlich präformierte
Antikörper, die. im Gegensatz zu Immunantikörpern, ohne spezifischen Antigenstimulus
durch erythrozytäre Blutgruppenmerkmale entstehen.

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Anti-A und Anti-B gehören, wie im allgemeinen alle regulären und natürlich präformierten
Antikörper, vorwiegend der lmmunglobulinklasse M (IgM) an. ln-vitro reagieren diese in der Regel
komplett. Ein geringer Anteil der Anti-A und Anti-B wird jedoch auch von der Immunglobulinklasse
G (lgG) gebildet. Dieser IgG-Anteil wurde früher irreführend mit "lmmun-Anti-A"
oder "lmmun-Anti-B" bezeichnet, obwohl auch diese Antikörper natürlich präformiert anzutreffen
sind. Diese IgG-Antikörper sind plazentagängig und können je nach in-vivo Reaktionsverhalten, im
Gegensatz zu irregulären Rhesus-lmmunantikörpern, schon bei der ersten Schwangerschaft einen
Morbus haemolyticus neonatorum aufgrund einer AB0-lnkompatibilitäl auslösen.
Bestimmung der AB0-Blutgruppe und der Isoagglutinine
REAKTION MIT TESTSEREN =
Erythrozyteneigenschaften
REAKTION MIT
TESTERYTHROZYTEN =
Serumeigenschaften
Anti-A Anti-B Anti-AB A1 A2 B 0
+++ ---- +++ ---- ---- +++ ---- A
---- +++ +++ +++ +++ ---- ---- B
---- ---- ---- +++ +++ +++ ---- 0
+++ +++ +++ ---- ---- ---- ---- AB
BLUT-
GRUPPE
Die Verwendung von 0-Testerythrozyten bei der obligaten Bestimmung der Serumeigenschaften
(Isoagglutinine) dient als negative Kontrolle.
3.2 Das Rhesus-System
Das Rhesus-System ist das zweitwichtigste Blutgruppensystem. Es wurde von Levine und Stetson
(1939) sowie Landsteiner und Wiener (1940) entdeckt.
Besonders in der Transfusionsmedizin und der Geburtshilfe/Pädiatrie (Morbus haemolyticus
neonatorum) hat dieses Blutgruppensystem seine vorrangige Bedeutung.

3.2.1 Die Antigene des Rhesussystems
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Im Rhesussystem unterscheidet man 5 serologisch faßbare Hauptantigene (über Antigen-
Antikörperreaktionen nachweisbar): 0, C, c, E, e. Die Antigene C und c sowie E und e werden
kodominant vererbt (sog. Rhesusuntergruppen).
Das klinisch wichtigste Antigen des Rhesussystems ist das Merkmal Rhesus D. Alle Individuen, bei
denen dieses Merkmal nachweisbar ist. werden als Rhesus positiv (0.) bezeichnet (ca. 85 % der
deutschen Bevölkerung). Ist dieses Merkmal nicht nachweisbar. so bezeichnet man das betreffende
Individuum als Rhesus negativ (dd). Man nimmt an, daß diese Individuen zwei amorphe (= stille, d.
h. die Gene bilden kein Genprodukt) Rhe1iu1igenc d besitzen. da bisher noch kein Antikörper
gegen das Rhesusmerkmal d gefunden werden konnte:
Die wichtigste Variante des Rhesusmerkmals D ist die Eigenschaft D". Diese stellt eine schwächere
bzw. unvollständige Ausprägung des Merkmals D dar. Diese Eigenschaft kann nur mit Hilfe einer
etwas spezielleren Technik (COOMBS-Technik; siehe 4.1) sicher nachgewiesen werden. Im
deutschen Sprachraum werden Träger des Merkmals D u in Bezug auf Bluttransfusionen (als
Blutempfänger) und Schwangerschaften als Rhesus negativ betrachtet. Als Blutspender werden
demgegenüber Träger des Merkmals D u als Rhesus positiv betrachtet.
Aus organisatorischen Gründen werden im Bluttransfusionswesen nur Blutspender mit der
Rhesusformel ccddee als Rhesus negativ bezeichnet,
3.2.2- Die Antikörper des Rhesussystems
Der häufigste irreguläre Antikörper gegen Rhesusantigene ist das Anti-D, welches besonders häufig
nach Rhesus-D-ungleichen Bluttransfusionen und nach Schwangerschaften von Rhesus negativen
Individuen gebildet werden kann. Weniger häufig sind die Rhesusantikörper Anti-C, Anti-c, Anti-E
und Anti-e.
3.3 Das Kell-System
Für die Transfusionsmedizin und die Geburtshilfe/Pädiatrie sind die Antigene KeIl (K) und Cellano
(k) in diesem Blutgruppensystem am wichtigsten, da

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diese Antigene sehr immunogenen Charakter haben, das heißt, sie können leicht zur
Antikörperbildung führen.
An Hand des Merkmals KeIl (K) werden die Individuen in Kell positiv (KK und Kk) bzw. Kell
negativ (kk) eingeteilt. In der deutschen Bevölkerung werden diese Merkmale in folgender
Häufigkeit angetroffen:
Keil negativ: 91,0 % (kk)
KeIl positiv: 8,8 % (Kk; heterozygot)
0.2 % (KK; homozygot)
Da es nur wenige homozygote Merkmalsträger KK im Gegensatz zu den homozygoten
Merkmalsträgern kk gibt ist die Bildung eines Anti-Cellanos (Anti-k) seltener als die Bildung eines
Anti-Kells (Anti-K).
3.4 Weitere klinisch relevante, erythrozytäre Blutgruppensysteme
Hierzu zählen:
- Das Duffy-System mit den wichtigsten Antigenen Fy a und Fy b
- Das Kidd-System mit den wichtigsten Antigenen Jk a und Jk b
- Das Lewis-System mit den wichtigsten Antigenen Le a und Le b
- Das MNSs-System mit den wichtigsten Antigenen M, N, S und s
- Das Lutheran-System mit den wichtigsten Antigenen Lu a und Lu b
- Das P-System mit seinem wichtigsten Antigen P1
4 Untersuchungsmethoden
Bei den transfusionsmedizinisch wichtigsten blutgruppenserologischen Untersuchungen
(Blutgruppenmerkmale. Antikörpersuchtest. serologische Verträglichkeitsprobe; s. u.) kommen
Verwechslungen wesentlich häufiger als Fehlbestimmungen vor (1981 waren laut FDA [Food and
Drug Administration; USA] 88 % der letalen Transfusionsreaktionen organisatorisch bedingt). Sie
sind möglich bei der Blutentnahme, der Untersuchung, der Erstellung des Befundberichtes und der
Einleitung der Transfusion. Es ist deshalb unerläßlich, die Identität von Spender und Empfänger zu
sichern, um derartige Verwechslungen auszuschließen. Da eine Fehltransfusion für den Patienten
weitreichende Konsequenzen mit z. T. tödlichem Ausgang haben kann, muß der behandelnde Arzt
die Identität der zu untersuchenden Blutprobe bestätigen! Im Hinblick auf diese möglicherweise
schwerwiegenden Folgen von Bluttransfusion-

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en nehmen die serologischen Voruntersuchungen eine Sonderstellung in der Labormedizin ein,
zumal der transfundierende Arzt außer dem Bedside- Test (siehe 4.2) keine Möglichkeiten hat, auf
Grund von anderen laborchemischen Parametern bzw. dem klinischen Bild des Patienten falsche
Ergebnisse blutgruppenserologischer Untersuchungen zu erkennen, wohingegen z. B. ein erhöhter
Harnstoffwert ohne klinisches Korrelat einer Urämie, einer oligurischen Herzinsuffizienz o. ä.
schnell auf eine mögliche Fehlbestimmung oder Verwechslung hinweisen würde. Zudem werden
solche laborchemischen Parameter ohne klinischen Bezug in der Regel zunächst in
Verlaufskontrollen überprüft, bevor therapeutische Konsequenzen gezogen werden.
4.1 Grundprinzipien der immunhämatologischen Techniken
Bei immunhämatologischen Techniken bedient man sich der Antigen-Antikörperreaktionen. um
unbekannte Antigene mit bekannten Antikörpern nachzuweisen bzw. umgekehrt. Erythrozytäre
Antigen-Antikörperreaktionen werden häufig über eine direkte Hämagglutination (sichtbare
Verklumpung von Erythrozyten durch Antikörper) für das menschliche Auge makroskopisch bzw.
mikroskopisch dargestellt. Dabei kann die Antigen-Antikörperreaktion unmittelbar zur
Hämagglutination führen, sofern es sich um "komplette" Antikörper (meist IgM) handelt. Bei
"inkompletten" Antikörpern (meist IgG) führt die erste Antigen-Antikörperreaktion nur zu einer
Antikörperbeladung (Sensibilisierung) der Erythrozyten (1. Reaktionsphase in vitro). Erst
Reaktionsverstärker (Supplememt. z. B. Albumin) führen über eine Annäherung der Erythrozyten
untereinander zu einer Quervernetzung der Erythrozyten mit Hilfe der Erythrozytenantikörper oder
aber Antihumanglobuline führen bei deren Anlagerung an die bereits gebundenen
Erythrozytenantikörper zu einer interzellulären Brückenbildung (mittelbare Hämagglutination. 2.
Reaktionsphase in vitro). Die COOMBS-Technik ist eine der Haupttechniken, um eine indirekte
Hämagglutination nachzuweisen. Dabei werden Antikörper, die über eine Antigen-
Antikörperreaktion an Erythrozyten gebunden sind, durch ein Antihumanglobulin (= COOMBS-
Serum) nachgewiesen. Dabei reagiert das Antihumanglobulin (= Antikörper gegen menschliche
Antikörper und Komplementfaktoren; von immunisierten Tieren gewonnen) mit den erythrozytär
gebundenen Antikörpern bzw. den gebundenen Komplementfaktoren und führt dadurch zur
Hämagglutination. Darüberhinaus kann eine erythrozytäre Antigen-Antikörperreaktion in selteneren
Fällen statt zur Hämagglutination zur Hämolyse führen.

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4.2 Blutgruppenidentitätstest am Krankenbett (Bedside-Test) 131
Dieser Test dient zur Kontrolle der AB0-Identität der Empfängererythrozyten, um Verwechslungen
und sich daraus ergebende AB0-Inkompatibilitäten zu vermeiden. Dies ist von besonderer
Bedeutung für die Sicherheit der Patienten bei Bluttransfusionen. da die Mehrzahl der tödlich
verlaufenden AB0-Unvenräglichkeiten auf Patienten- bzw. Probenverwechslungen beruhen
(Irrtumshäufigkeit ca. I auf 500 Konserven; über 60 % der transfusionsbedingten Todesfälle sind
auf Verwechslungen zurückzuführen).
In zeitlich gedrängten Notfallsituationen ist die Verwechslungsgefahr besonders groß. deshalb sollte
der Bedside-Test gerade hierbei nie unterlassen werden. Dabei ist darauf zu achten, daß der
Bedside- Test vom transfundierenden Arzt selbst oder unter seiner direkten Aufsicht unmittelbar am
Patientenbett durchgeführt wird.
Anmerkung: Der Bedside-Test ist keine ordnungsgemäße Blutgruppenbestimmung [3], da hier nur
die AB0-Erythrozyteneigenschaften und nicht gleichzeitig die AB0-Serumeigenschaften bestimmt
werden.
4.2.1 Prinzip
Direkter Hämagglutinationstest: Es werden staatlich geprüfte Testseren mit bekannten Antikörpern
gegen die Blutgruppen A (Anti-A) und B (Anti-B) verwendet. Diese führen bei Vorhandensein der
korrespondierenden Antigene auf den Erythrozyten direkt zur Hämagglutination.
4.2.2 Durchführung
a) Die Bedside-Karte ist mit Vor- und Zunamen des Patienten sowie seinem Geburtsdatum zu
kennzeichnen (aktive Identitätssicherung!).
b) Zwei Tropfen des jeweiligen Testserums (Anti-A bzw. Anti-B) werden auf das dafür
vorgesehene Testfeld getropft. Daneben wird ein Blutstropfen des Patienten gegeben. Das
Verhältnis der Größe des Blutstropfens zu der Größe des Antiserumtropfens sollte etwa 1:2
betragen.
c) Mit einem Plastikstäbchen wird der Blutstropfen mit dem Anti-A-Serum vermischt und über
das gesamte Testfeld verteilt. Anschließend wird das Plastikstäbchen gründlich mit einem
Wattetupfer gereinigt und der Vorgang mit dem Anti-B-Serum auf dem nächsten Testfeld
wiederholt.

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d) Anschließend wird die Karte etwa zwei Minuten vorsichtig hin und her geneigt. wobei die
Testgemische nicht über die Ränder der Felder laufen dürfen.
4.2.3 Fehlerquellen
- Probenverwechslungen
- Falsch positives Ergebnis als Folge beschleunigten Eintrocknens
- Unzureichendes Ausstreichen des Antiserum-Blut-Gemisches
- Falsches Mischungsverhältnis zwischen Blut und Antiserum (siehe oben)
- Verlaufen der Testgemische über die Ränder der Testfelder
- Aufrauhen des Kartons der Testkarte durch das Rührstäbchen
- Verschleppen von Antiserum durch das Rührstäbchen
- Gerinnselbildung
- Kontamination der Antiseren
4.2.4 Auswertung
Es wird auf Agglutination abgelesen. Die Reaktionen werden protokolliert
(Dokumentationspflicht!). [3]
4.3 Die Serologische Verträglichkeitsprobe (= "Kreuzprobe". Kompatibilitätstest) [3]
Die Verträglichkeitsprobe soll in vitro (Reagenzglas) die Verträglichkeit (Kompatibilität) einer
Blutkonserve für einen bestimmten Blutempfänger sicherstellen. Ihr Ziel ist die Erfassung von
erythrozytären Antikörpern. die zu einer Transfusionsreaktion führen können. Sie muß vor jeder
Bluttransfusion durchgeführt werden. Von dieser Regel kann nur dann abgewichen wer- den, wenn
nicht genügend Zeit zur Durchführung der serologischen Verträglichkeitsprobe zur Verfügung
steht. da der Patient ohne Bluttransfusion bis zum Vorliegen der Ergebnisse der
Kompatibilitätstestung sonst auf Grund seines Blutverlustes versterben oder schweren Schaden
erleiden würde. Der transfundierende Arzt muß das Risiko der vitalen Gefährdung des Patienten auf
Grund einer nicht durchgeführten Bluttransfusion gegen das Risiko einer inkompatiblen
Bluttransfusion und damit die Gefahr einer möglicherweise tödlichen Transfusionsreaktion
abwägen. .
Bei der Gabe von "ungekreuztem" Blut muß derzeit in ca. .1,1 % der Fälle mit

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einer hämolytischen Transfusionsreaktion gerechnet werden.
4.3.1 Prinzip
Erythrozytäre Antikörper werden über eine direkte oder indirekte Hämagglutination bzw. Hämolyse
nachgewiesen. Dabei werden die Reaktionsbedingungen für die Antigen-Antikörperreaktion so
gewählt, daß möglichst alle transfusionsmedizinisch relevanten Antikörper durch die Melhode
erfaßt werden können.
Man unterscheidet einen Major- und einen Minor-Ansatz.
Als negative Kontrolle wird ein Eigenansatz mitgeführt.
Major-Test
Es wird die Verträglichkeit der Spendererythrozyten mit dem Empfängerserum überprüft. Bei
positivem Ausfall liegt eine Major-Inkompatibilität vor. Sie ist klinisch relevant, da bei einer
Transfusion eine lebensbedrohliche Transfusionsreaktion zu erwarten ist. Hierbei würde eine große
Menge von Antikörpern des Empfängers auf inkompatible Spendererythrozyten treffen und diese
Iysieren.
Minor-Test
Es wird die Verträglichkeit der Empfängererythrozyten mit dem Spenderserum überprüft. Der
Minor-Test kann entfallen. wenn bei dem Spender ein Antikörpersuchtest (siehe 4.4) durchgeführt
worden ist. Bei positivem Ausfall liegt eine Minor-lnkompatibilität vor. Sie ist klinisch weniger
relevant. Hierbei würde eine kleine Menge von Antikörpern des Spenders (Erythrozytenkonzentrat)
auf inkompatible Empfängererythrozyten treffen. Aufgrund der geringen Menge von Antikörpern
und des zusätzlichen Verdünnungseffektes beim Empfänger wird im allgemeinen keine fatale
Transfusionsreaktion ausgelöst.
Eigenprobe
Sie dient als negative Kontrolle und überprüft die "Verträglichkeil der Empfängererythrozyten mit
dem eigenen Empfängerserum.
Die Verträglichkeitsprobe kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden. Der Drei-
Stufentest wird in vielen Labors in verschiedenen Modifika-

tionen angewandt.
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Hier soll nur das prinzipielle Vorgehen dargestellt werden.
4.3.2 Der Drei-Stufentest als Minor-Ansatz: (siehe Abbildung I)
1. Stufe (Auffinden von kompletten Antikörpern): Patientenserum (Empfänger) wird mit
Spendererythrozyten vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird
zentrifugiert und auf Hämolyse und Agglutination (=direkte) geprüft.
2. Stufe (Antikörperbeladungsphase des indirekten COOMBS- Tests; sieht Abbildung 2): Man gibt
nun zu diesem Ansatz einen Reaktionsverstärker (Supplement), der die Antigen-Antikörperreaktion
verstärkt, mischt vorsichtig und inkubiert bei 37° C, zentrifugiert und liest auf Hämolyse und
Agglutination (= indirekte) ab.
3. Stufe (ldentifikation inkompletter Antikörper in der Agglutinationsphase des indirekten
COOMBS-Tests; siehe Abbildung 2): Die Spendererythrozyten des Ansatzes werden 3 mal mit
physiologjscher Kochsalzlösung gewaschen. Antihumanglobulin (COOMBS Serum) wird
zugegeben, vorsichtig gemischt, zentrifugiert und auf Hämolyse und Agglutination (indirekte)
abgelesen. Der Waschprozeß dient dazu, humane Globuline des Empfängerserums, die nicht
spezifisch an die Erythrozyten über eine Antigen-Antikörperreaktion gebunden sind. zu entfernen.
Ohne Waschprozeß würden diese nicht spezifisch gebundenen Globuline das Antihumanglobulin
"neutralisieren" (verbrauchen). Damit könnten die Antikörper, die spezifisch an erythrozytäre
Antigene gebunden sind, nicht über den Antihumanglobulintest nachgewiesen werden.
"4. Stufe" (COOMBS-Kontrolle): Bei negativer 3. Stufe werden COOMBS-Kontrollzellen zum
Ansatz gegeben, vorsichtig gemischt und auf Hämolyse und Agglutination abgelesen. Dieser
Untersuchungsschritt überprüft als positive Kontrolle die Funktionsfähigkeit der 3. Stufe, indem
Testerythrozyten, die mit inkompletten Antikörpern beladen sind, im Anschluß an die 3. Stufe zum
Ansatz gegeben werden und zur Agglutination führen.

4.3.3 Fehlerquellen
- Verwechslung der Blutproben
- Schlechtes Waschen nach der 2. Saufe
- Falsch beschriftete Testansätze
- Falsches Aufschütteln und Ablesen
- Gerinnselbildung
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- Unsauberes Arbeitsmaterial und Reagenzien
- Falsche Blutgruppenbestimmung
- Hämolytisches Blut oder zu alte Blutprobe (siehe 4.3.5)
4.3.4 Auswertung
Die serologische Verträglichkeitsprobe im Drei-Stufentest ist negativ, wenn in den ersten drei
Stufen weder eine Agglutination, noch eine Hämolyse auftritt. Zudem muß die "4. Stufe" (positive
Kontrolle) zur Agglutination führen.
Tritt in einer der drei ersten Stufen eine Agglutination bzw. eine Hämolyse auf, so darf das
Spenderblut in der Regel nicht transfundiert werden. Agglutination bzw. Hämolyse in den einzelnen
Stufen der Verträglichkeitsprobe können vereinfachend dargestellt folgende Ursachen haben:
1. Stufe (Kochsalzmilieu, Raumtemperatur): Unverträglichkeit im AB0-System, Unverträglichkeit
durch komplette Antikörper gegen andere erythrozytäre Antigene, Kälteautoantikörper.
2. Stufe (Aufladungsphase bei 37° C): Unverträglichkeit durch inkomplette Antikörper (am
häufigsten Rhesusantikörper und Anti-Keil), Autoantikkörper.
3. Stufe (COOMBS-Phase): Unverträglichkeit durch inkomplette Antikörper (am häufigsten
Rhesusantikörper und Anti-Kell), Autoantikörper.
Die Eigenprobe muß in allen 3 Stufen der serologischen Verträglichkeitsprobe negativ sein. Bei
positivem Ergebnis müssen weitere Untersuchungen angeschlossen werden (siehe 4.6).

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4.3.5 Bewertung
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Die serologische Verträglichkeitsprobe spiegelt den serologischen Status des Patienten zum
Zeitpunkt der Blutabnahme wider (ausschließlich bzgl. erythrozytärer Antikörper). Primäre
Immunisierungen gegen erythrozytäre Antigene können in der Regel 3-4 Wochen nach der
Antigenexposition serologisch nachgewiesen werden. Wird ein Individuum primär immunisiert, so
nimmt der Antikörpertiter (Antikörperkonzentration) im Laufe der Zeit (Monate bis Jahre) wieder
ab, bis der Antikörper serologisch nicht mehr nachweisbar ist. Bei erneuter Antigenexposition kann
das Individuum innerhalb kürzester Zeit (z. B. innerhalb eines Tages) erneut serologisch
nachweisbare Antikörpennengen bilden (anamnestische Reaktion; Boosterung; sekundäre
Immunisierung).
Um protrahierte Transfusionsreaktionen infolge anamnestischer Antikörperbildung zu verhindern,
ist es wichtig, daß der behandelnde Arzt eine Transfusions- und Schwangerschaftsanamnese erhebt
und diese dem Bluttransfusionsdienst bzw. dem "Kreuzlabor" mitteilt. Dabei ist besonders die
Angabe von früher festgestellten, irregulären Antikörpern wichtig. Eine weitere
Sicherheitsmaßnahme zur Verhinderung von anamnestischen Transfusionsreaktionen ist die
Durchführung der serologischen Verträglichkeitsprobe für weitere Transfusionen nach spätestens 3
Tagen mit einer frisch entnommenen Empfängerblutprobe. [13]
4.4 Antikörpersuchtest
Er dient dem Nachweis von irregulären. erythrozytären Antikörpern im Se- rum eines Probanden.
Er muß bei jeder Blutgruppenbestimmung durchgeführt werden. Außerdem wird der
Antikörpersuchtest im Rahmen der blutgruppenserologischen Mutterschaftsvorsorge eingesetzt
(nach Feststellung der Schwangerschaft. sowie in der 24.- 27. SSW). [4]
4.4.1 Prinzip
Die Antikörper werden über eine Hämagglutination nachgewiesen. Dazu wird das Probandenserum
mit 2-3 verschiedenen Testerythrozytensuspensionen inkubiert. Die zum Antikörpersuchtest
verwendeten Testerythrozyten müssen die klinisch wichtigsten Antigene aufweisen (siehe
3.2.3.3.3:4) und gehören der Blutgruppe 0 an (damit brauchen die Isoagglutinine (siehe 3.1.2) der
Pro-

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banden nicht beachtet werden). Damit eine optimale Antigen-Antikörperreaktion erfolgen kann,
müssen die günstigsten Reaktionsbedingungen ausgewählt werden. In der Regel wird der
Antikörpersuchtest in der Technik des Drei- Stufentests (siehe 4.3.2) durchgeführt.
4.4.2 Auswertung
Siehe 4.3.4. Bei positivem Antikörpersuchtest muß eine Amikörperdifferenzierung angeschlossen
werden. um die Antikörperspezifität (z. ß. Anti-D, Anti-KeIl etc.) festzulegen und die
entsprechenden Konsequenzen für zukünftige Bluttransfusionen (Spenderblut ohne das
korrespondierende Antigen) oder für die Überwachung/Therapie einer bestehenden
Schwangerschaft zu ziehen.
4.5 Antikörperdifferenzierung
Diese Untersuchung hat das gleiche Prinzip wie der Antikörpersuchtest, jedoch werden 8 -12
verschiedene Testerythrozytensuspensionen (u. U. jedoch auch mehr) mit bekanntem
Antigenmuster (z. B. Testzelle 1: CCD.ec, KK, Fy(a+b-), Le(a+b-), ...; Testzelle II: ccddee, kk,
Fy(a-b+), Le(a-b-), ...; etc.) verwendet. Auf Grund der Reaktivität des Probandenserums mit den
verschiedenen (antigenen) Testerythrozyten kann auf die Antikörperspezifität geschlossen werden.
Antikörperdifferenzierungen sind sehr zeitaufwendig und setzen beim Untersucher gute
theoretische Kenntnisse und praktische Erfahrung voraus, so daß diese Untersuchungen meist
speziellen blutgruppenserologischen Laboratorien der Blutransfusionsdienste vorbehalten bleiben.

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4.6 Direkter COOMBS- Test
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Dient zum Nachweis von inkompletten Antikörpern, die bereits in vivo an erythrozytäre Antigene
gebunden worden sind. Außerdem können Komplementfaktoren, die nach einer abgelaufenen
Antigen-Antikörperreaktion an die Erythrozytenmembran gebunden worden sind, nachgewiesen
werden. Der direkte COOMBS-Test wird zur Abklärung von hämolytischen Anämien, zur
Abklärung von Transfusionsreaktionen, zur Abklärung einer positiven Eigenprobe (siehe 4.3.1 u.
4.3.4) und als Screening-Test bei Neugeborenen eingesetzt, wenn die Mutter Rhesus negativ ist
oder die Blutgruppe 0 besitzt. oder bei der Mutter früher irreguläre Antikörper nachweisbar waren
(Mutterpaß, Anamnese).
4.6.1 Prinzip
lnkomplette Antikörper (bzw. Komplementfaktoren), die sich in vivo an Erythrozytenantigene
gebunden haben, werden durch Zugabe von COOMBS-Serum (= Antihumanglobulin) dargestellt.
Dabei reagieren die Antikörper des COOMBS-Serums mit den Antikörpern bzw.
Komplementfaktoren auf den Erythrozyten und führen zu einer Hämagglutination (siehe Abbildung
3).
4.6.2 Durchführung
Die Patientenerythrozyten werden 3mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen,
Antihumanglobulin (COOMBS-Serum) zugegeben, vorsichtig gemischt, zentrifugiert und auf
Hämolyse und Agglutination abgelesen. Der Waschprozeß dient dazu. humane Globuline des
Empfängerserums. die nicht an die Erythrozyten über eine Antigen-Antikörperreaktion gebunden
sind. zu entfernen. Ohne Waschprozeß würden diese nicht spezifisch gebundenen Globuline das
Antihumanglobulin "neutralisieren" (verbrauchen). Damil könnten die Antikörper, die spezifisch an
erythrozytäre Antigene gebunden sind, nicht über den Antihumanglobulintest nachgewiesen
werden.
Bei negativem Reaktionsausfall werden COOMBS-Kontrollzellen zum Ansatz gegeben, vorsichtig
gemischt und auf Agglutination und Hämolyse abgelesen. Dieser Untersuchungsschritt überprüft als
positive Kontrolle den Test. indem Testerythrozyten, die mit inkompletten Antikörpern beladenen
sind, zum Ansatz gegeben werden und zur Agglutination führen.

4.6.3 Fehlerquellen
- Verwechslung der Blutproben
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- Unzureichendes Waschen der Erythrozytensuspension
- Hämolysierte oder zu alte Blutprobe
- Unsauberes Arbeitsmaterial und Reagenzien
- Falsches Aufschütteln und Ablesen
- Gerinnselbildung
- Prozone-Phänomen (Überschusshemmung)
4.6.4 Untersuchungsmaterial und Reagenzien
5 ml EDTA-Blut (möglichst nicht älter als 3 Tage)
4.6.5 Auswertung
Agglutination der Patientenerythrozyten ( =direkter COOMBS-Test) positiv, d. h. die untersuchten
Erythrozyten sind mit inkompletten Antikörpern bzw. Komplementfaktoren in vivo beladen.

4.6.6 Diskussion
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Der direkte COOMBS- Test ist in der Regel bei immunhämolytischen Anämien positiv. Zu den
immunhämolytischen Anämien zählen:
- Autoimmunhämolytische Anämien - Morbus haemolyticus neonatorum
- Hämolytische Transfusionsreaktionen
- Medikamentös bedingte Immunhämolysen
5 Histokompatibilität und HLA-System
5.1 Einführung [110,111]
Das HLA-System (HLA = human leukocyte antigens) stellt den Haupthistokompatibilitätskomplex
(= MHC = major histocompatibility complex) des Menschen dar und beeinflußt damit die
Abstoßung von Organtransplantaten auf Grund von immunologischen Mechanismen. Die Gene des
HLA-Systems sind auf dem kurzen Arm des Chromosom 6 im menschlichen Genom lokalisiert und
weisen eine extrem multiple Allelie auf.
Den verschiedenen Genen (Genotyp) können entsprechende HLA-Antigene (Phänotyp) zugeordnet
werden. Folgende Einteilung ist derzeit üblich [7]:
Klasse-I-Antigene
Hierzu gehören die klassischen serologisch definierten Merkmale folgender Loci (Genorte): HLA-A
(derzeit 24 verschiedene Antigene definiert), HLA-B (50 Antigene). HLA-C (11 Antigene). Diese
Antigene sind auf allen kernhaltigen Zellen des Organismus sowie auf Thrombozyten zu finden.
Klasse-II-Antigene
Hierzu zählen HLA-D (26 Antigene). HLA-DR (20 Antigene), HLA-DQ (9 Antigene). HLA-DP (6
Antigene). Diese Antigene befinden sich hauptsächlich auf B-Lymphozyten, Monozyten,
Makrophagen stimulierten T -Lymphozyten. Epidermiszellen und Spermien.

Klasse-III-Produkte
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Komplementfaktoren C2, C4A, C4B, Properdinfaktor B (Bf).
5.2 Methoden zum Nachweis von HLA-Antigenen und HLA-Antikörpern [18. 10]
HLA-Antigene der MHC-Klassc-I und -II können am sichersten an isolierten lebenden
mononukleären Zellen aus dem Blut, der Milz oder Lymphknotenl nachgewiesen werden. Die
MHC-Klasse-III-Antigene können über Elektrophoresen des Serums nachgewiesen werden.
Es stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Als Beispiele seien folgende Techniken
angeführt:
Lymphozytotoxizitätstest (= LCT)
Dieser Test wird zum Nachweis von HLA-Antigenen oder HLA-Antikörpern eingesetzt.
Prinzip: Lymphozytotoxische Antikörper reagieren mit den korrespondierenden Antigenen auf den
Lymphozyten in-vitro. Die Antigen-Antikörperkomplexe auf den Lymphozyten aktivieren die
Komplementkaskade, was zu einer Zellmembranschädigung der Lymphozyten führt. Durch Zusatz
eines Vitalfarbstoffes (Eosin) wird die Folge der Antigen-Antikörperreaktion sichtbar gemacht: Nur
die letal geschädigten Zellen werden angefärbt. Die Auswertung erfolgt im Phasenkontrast-
Umkehrmikroskop.
Gemischte Lymphozyten-Kultur (MLC = mixed Iymphocyte culture)
Dieser Test wird durchgeführt, um eine immunologische Voraussage über einen
Transplantationserfolg zu treffen.
Prinzip: Lymphozyten, die sich in Antigenen der HLA-D-Region unterscheiden, können sich in der
gemischten Lymphozytenkultur (MLC) gegenseitig zur Proliferation anregen. Das Ausmaß der
Zellproliferation kann bestimmt werden, indem man radioaktiv markiertes Thymidin in die Kultur
einbringt und dessen Einbau in die Zellkerne mißt. Durch Vorbestrahlung einer der beiden
Lymphozytenpopulationen (= Stimulatorzellen) werden diese an der

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Proliferation gehemmt, und man kann selektiv die Reaktion der anderen Zellpopulation (=
Responderzellen) beurteilen. lnkubationsdauer: ca. 7 Tage. Eine positive Reaktion weist auf eine
HLA-D-Unverträglichkeit hin.
5.3 Derzeitige klinische Bedeutung des HLA-Systems
Die Bestimmung der HLA-Antigene und -Antikörper hat derzeit folgende
Hauptanwendungsbereiche [7, 8, 11]
- Auswahl kompatibler Organspender/-empfänger (HLA-A-, -B-, -C-, -DR- Kompatibilität
sowie HLA-Kreuzprobe = crossmatch) für Organtransplantationen (Niere, Leber, Herz,
Knochenmark)
- Spenderauswahl für Transfusionen von Thrombozyten und Granulozyten im Rahmen von
Knochenmarkstransplantationen und im Rahmen der allgemeinen Onkologie (insbesondere, wenn
der Patient gegenüber Thrombozytensubstitutionen auf Grund von HLA-Antikörpern refraktär
geworden ist)
- Abklärung von nichthämolytischen Transfusionsreaktionen (Bei Nachweis von
Iymphozytotoxischen Antikörpern sollte der Patient künftig ausschließlich leuko- und
thrombozytenarme Erythrozytenkonzentrate erhalten.)
- Assoziation von HLA-Antigenen und bestimmten Erkrankungen als zusätzliches
Diagnostikum (z. B. Narkolepsie, Morbus Bechterew, Morbus Reiter, Zöliakie, juveniler Diabetes
mellitus, Psoriasis vulgaris, Sicca-Syndrom, Idiopathische Hämochromatose, Adrenogenitales
Syndrom)
- Abklärung habitueller, immunologisch (HLA) bedingter Frühaborte
6 Literatur
6.1 Einführende Literatur
[1] Frey-Wettstein. M.. Barandun. S., Bucher. U., Büttler. R., Metaxas. M.
Die Bluttransfusion
Ein Vademecum. Karger. Basel (19Mb)
[2] Lenz. W.
Medizinische Genetik, Thieme, Stuttgart 6. Aufl. (1982)
[3] RICHTLINIEN ZUR BLUTGRUPPENBESTIMMUNG UND BLUTTRANSFUSION
Herausgegeben von der Bundesärztekammer, Deutscher Ärzteverlag. Köln (Neufassung 1987)

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[4] Mutterschafts-Richtlinien des Bundesausschusses der Ärzte und Krankenkassen
Fassung vom 09. April 1991, veröffentlicht im Bundesarbeitsblatt 6/1991 vom 31. Mai 1991
[5] Roitl. I. M.
Kurzes Lehrbuch der Immunologie
Thieme, Stuttgart (1987)
[6] Spielmann. W.
Transfusionskunde
Thieme. Stuttgart 3. Aufl. (1982)
6.2 Weiterführende Literatur
[7] Alben. E.D., Baur, M.P., Mayr, W.R.
Histocompatibility Testing 1984
Springer, Berlin (1984)
[8] Mallory, D., Hackel, E., Fawcett, K.
HLA Techniques für Blood Bankers,
AABB, Arlington, Virginia (1984)
[9] Metaxas-Böhler, M.
Blutgruppen und Transfusion: Theorie und Praxix
Huber, Bern (1986)
[10] Müller-Eckhardt. C.
Transfusionsmedizin
Springer, Berlin (1988)
[11] Prokop, 0., Göhler, W.
Die menschlichen Blutgruppen
Fischer, Jena 5. Aufl. (1986)
[12] Reissigl, H., Schönitzerm, D.
Die Bluttransfusion
Karger, Basel (1986)
[13] Schneider, W., Schorer, R.
Klinische Transfusionsmedizin,
edition medizin, Weinheim (1982)