FACS Kurs FACS Canto BD 2009

Multicolor Anwendungen in der
Durchflusszytometrie:
Durchflusszytometrie
Keine Angst vor vielen Farben!
Erlangen, 24.02.2009
Dr. rer. nat. Alexandra Pfeiffer

Techniken der Fluoreszenzmarkierung
Jerne, Köhler, Milstein
Nobelpreis 1984
haben als erste die
Hybridomatechnik zur
Produktion von
monoklonalen
Antikörpern beschrieben.
Immortalisierung von
Zellen, die AKs
produzieren (durch
Fusionierung mit
Tumorzellen)

Die Anfänge Anf nge der Diagnostik vor 1970
Beispiele
Anforderungen an die Bildanalyse
Mustererkennung, Erkennung von Eigenschaften,
Parametern, Beschaffenheit, Farbe, Markierungen
Micronuclei Ansätze: Zählung am Mikroskop
HLA B27 Testung: Zytotoxizitätstest nach Terasaki und
McClelland (Inkubation mit unterschiedlichen HLA Spezies,
Inkubation mit Hasen-Complement und Zellschädigung,
Aufnahme von Eosin nur bei den gesuchten Zellen)
Nachteile: langsam, subjektiv, nicht reproduzierbar

5-jährliche hrliche Steigerung von Veröffentlichungen Ver ffentlichungen im
Bereich Durchflusszytometrie
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
10 years
5 years
1976-80 1981-85 1986-90 1991-96 1997-2000 2001-05 2006-10

„Roederer Roederer‘s Gesetz“
Gesetz

1964 Erster Prototyp eines Zellsorters von Mack Fulwyler (links: Nozzle
Anordnung, Küvette mit Hg-Arc Lampe zur Anregung und einem PMT inkl.
Elektronik zur Detektion

Jahr
Der Multicolor Pfad
Gerät
Einführung
Am häufigsten gehörte
Kommentare
1976 FACS II Wann kann ich einen bekommen?
1980 FACS IV/440 Braucht man wirklich 4 Farben?
1991 FACS Vantage Braucht man wirklich 5 Farben?
1998 FACS Vantage SE Braucht man wirklich 6 Farben?
2000 FACS DiVa Braucht man wirklich 8 Farben?
2003+ FACS Aria
LSR II, FACSCanto
Wann kann ich einen
bekommen?

2003 FACSAria
2007 FACSCanto II

• FACSCanto II
Neue Geräteoptionen
Ger teoptionen
– Bringt 8 Farb-Option in ein Standard-
Forschungslabor
– 2 oder 3 Laser
• Blau (488 nm) und Rot (635 nm) Standard
– 4 + 2 (FITC, PE, PerCP, PE-Cy5, PE-Cy7, APC, und APC-
Cy7)
• Violet (405 nm) optional
– 2 Farben (PacificBlue, AmCyan oder ähnlich)
– HTS Loader Möglichkeit (96/384 well Platten)
– CE-IVD Gerät)

Das BD LSR II
• Bis zu 4 unterschiedliche Laser „serienmäßig“
• Blau, Rot, UV, Violet
– Unterschiedliche PMT Konfigurationen erhältlich
• Größte Flexibilität für die meisten Forschungsprojekte
• Aufrüstbar mit Lasern
Aufrüstbar mit mehr PMTs
• HTS Loader Option
• Einfache Handhabung
• Stabile Fluidik (FACSCalibur/Scan)

8 Farben mit dem FACSCanto II– II
Konfiguration 4-2-2
488 nm laser
405 nm laser
633 nm laser

SSC
PE
Das Octagon Design
695/40
655 LP
PE-Cy7
PerCP-Cy5.5
FITC

Warum brauchen wir Multicolor?
Multicolor
Weil die Welt komplex ist!
• Linienzugehörigkeit
• Subset
• Aktivierungsstatus
• Zellzyklus
• Chemokine
Produktion
• Chemokine
Receptor Repertoire
• Migration/Homing

Fluorochrome für monoklonale Antikörperkonjugate
Antik rperkonjugate
• Kleine organische Moleküle: FITC, Cy5, TexasRed, Cy7
• Fluoreszenzproteine: PE, PerCP, APC
• Tandemfarbstoffe: PE-Cy5, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5,
APC-Cy7, APC-H7
• „Violette“ Farben: Pacific Blue, Horizon V450, AmCyan,
Pacific Orange, Dapi (statt Propidiumiodid)
• Quantum Dots

Kriterien für die Fluorochromauswahl
Fluorochromstärke
Antigendichte (niedrige Antigendichte = starkes Fluorochrom)
Laserführung
Hintergrundfärbung der mAb
Eigene Hintergrundfärbung (Haftung) des mAb
Antikörperstärke (Bindung)
Weniger Antikörper, niedrigere Hintergrundfärbung
Erforderliche Kompensation zwischen den Konjugaten
Ein oder mehrere Laser
Filter „set-up“
PMT - Sensitivität

Auswahl der “richtigen richtigen” Fluorochrome
Generell stärkere Fluorochromkonjugate für schwächere
Antikörper oder bei niedriger Antigendichte (z.B.
Aktivierungsantigene wie CD80, CD86, CD25, CD38, CD69)
Verwenden von stärkeren Farbstoffen für Zellpopulationen mit
hoher Autofluoreszenz (z.B. Granulozyten, aktivierte
Lymphozyten, Zelllinien.....)
Verwenden von schwächeren Konjugaten (FITC oder PerCP)
bei hoher Antigenexpression (z.B. CD45, CD4, B220.....)

Stark – Mittelstark– Mittelstark Schwach ... Wer weiss es ?
Es gibt kein absolutes Ranking in der Farbstoffstärke,
aber nach dem sogenannten Stain Index sind ...
• Stark:
– PE, APC, PE-Cy5, PE-Cy7
• Mittelstark:
– FITC, Alexa700, PE-TxRed,
• Schwach:
– APC-Cy7, PerCP, PerCP-Cy5.5,
– PacificBlue, AmCyan, QuantumDots

Wie funktioniert Fluoreszenz?
Fluoreszenz

Wie entsteht Fluoreszenz
Jeder Farbstoff hat ein characteristisches
Excitations- und Emissionspektrum

Übersicht bersicht von Absorptions- Absorptions und
Emissionsspektren diverser Fluorochrome
blauer Laser

Übersicht bersicht von Absorptions- Absorptions und
Emissionsspektren diverser Fluorochrome
roter Laser violetter Laser

Bandpassfilter
Wellenlänge
Lang (700nm)
Kurz (500nm)
Optische Filter
Kurzpass Langpass Bandpass
650 Kurzpass
(650SP)
550 Langpass
(550LP)
Transmittiert 550 nm
600/100 Bandpass
(600/100)
550 - 650 nm
(600±50)
Geblockt >650 nm

Hauptproblem in der Multicolor Analyse
Compensation
aber zuerst mal:
Kurze Pause!

Hauptproblem in der Multicolor Analyse: Analyse:
Compensation
Die Kompensation erlaubt die Korrektur der spektralen Überlappung.
Kompensation ist immer erforderlich, sobald mehr als eine Fluoreszenz
simultan gemessen werden soll.
Die Kompensationswerte sind von den verwendeten Fluorochromen und der
Verstärkereinstellung abhängig.
Ungefärbte Zellen werden zur Berechnung der Negativität und der
Autofluoreszenz der Zellen benötigt:
sie sind keine negative Kontrolle des Experiments.
Isotypkontrollen vermeiden.

FITC
PE
Grundlagen der Compensation
450 500 550 600 650
Erinnern wir uns an die grundlegende Annahme in der Durchflusszytometrie
Signal in FL1 = Signal von FITC und nur von FITC
Signal in FL2 = Signal von PE und nur von PE
FL1 = FITC + % PE
FL2 = PE + %FITC
Das trifft für die Rohdaten nicht zu. Der Vorgang, in dem jeder Fluoreszenzkanal für
den spektralen Überlapp korrigiert wird, wird Compensation genannt
PMT Spannungen und Compensation sind funktionell abhängige Parameter

Relative Intensität
Überlappung (Spillover)
FITC
530/30
PE
585/42
500nm 550nm
600nm
Wellenlänge (nm)
650nm 700nm
FITC PE PerCP-Cy5.5
PerCP-Cy5.5
670 LP
PE-Cy7
PE-Cy7
780/60
750nm 800nm

Relative Intensität
FITC
530/30
PE
585/42
500nm 550nm 600nm
FITC Spillover
Wellenlänge (nm)
650nm 700nm
PerCP-Cy5.5
670 LP
750nm 800nm

FITC Kompensation
Intensität einer Population erniedrigen, Wert erhöhen
Relative Intensität
FITC
530/30
PE
585/42
500nm 550nm 600nm
PerCP-Cy5.5
670 LP
650nm 700nm
Wellenlänge (nm)

8 Farbenpanel und die resultierende Spillover
Matrix bei 3 Laser am FACSCanto
CD4 FITC
CD4 PE
CD28 PerCP-Cy5.5
CD45RA PE-Cy7
CD27 APC
CD8 APC-Cy7
CD3 Pacific Blue
Single-stained controls:
CD4 AmCyan
Autocomp
FITC PE
PerCP-
Cy5.5
PE-
Cy7
APC APC-
Cy7
Pacific
Blue
Am
Cyan
FITC 100.0 23.5 2.1 0.7 0.0 0.0 0.0 3.0
PE 1.6 100.0 12.3 2.7 0.0 0.0 0.0 0.0
PerCP-
Cy5.5
PE-
Cy7
0.2 0.1 100.0 43.0 2.5 5.6 0.0 0.0
0.0 0.6 0.1 100.0 0.0 3.6 0.0 0.0
APC 0.1 0.0 0.3 0.2 100.0 2.7 0.0 0.0
APC-
Cy7
Pacific
Blue
Am
Cyan
0.0 0.0 0.1 3.9 19.9 100.0 0.0 0.1
0.1 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 100.0 18.1
38.1 7.0 1.1 0.6 1.5 0.0 17.1 100.0

Vor/Nach der er Kompensationseinstellung
vorher nachher

PE
10 5
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
Ein Beispiel: Die FMO*-Kontrolle ...
FITC
PE
Cy5PE
Cy7PE
10 0
10 1
Unstained Control FMO Control Fully Stained
10 2
FITC
Courtesy Mario Roederer
Ğ
Ğ
Ğ
Ğ
Isotype Bounds
10 3
10 4
FMO Bounds
*Fluorescence Minus One
10 0
10 1
CD3
Ğ
CD8
CD45RO
10 2
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
CD3
CD4
CD8
CD45RO
10 3
10 4

Warum brauchen wir mehr Farben? Farben
Weil die Welt komplex ist!
• Phänotypisierung
• Aktivierungszustand
Chemokine/Zytokine
• Phosphorylierung
• Zelluläre Entwicklung
• Reporter-Gen-Assays

Entwicklung der Lymphozyten Subpopulationens-
Subpopulationens
Analyse: 6 Farben
6Farb Analyse
Immunologische Identifizierung von Lymphozyten basierend auf CD45
Expression, keine Isotypkontrollen
1 Röhrchen zur gesamten Subtypisierung, 50µl Probe, ~ 45min
Vorbereitungszeit

Warum brauchen wir mehr Farben? Farben
Because the world is complex!
• Phänotypisierung
• Aktivierungszustand
Chemokine/Zytokine
• Phosphorylierung
• Zelluläre Entwicklung
• Reporter-Gen-Assays

Zytokin Detektionssysteme
• Intrazelluläre Färbung für die
Durchflusszytometrie
• ICC (Intrazelluläre Zytokin Zytochemie) Färbung
• ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
• ELISPOT (Ensyme Linked ImmunoSpot Assay)
• CBA (Cytometric Bead Array)
Decreasing Cell
Number
IL
-
2
IL-4 IL
IL-5 IL
IL-10 IL 10 IFN-g IFN TNF- TNF a
=
Maus IFN-gamma
(HRP Färbung)

I/C Färbeprotokolle
F rbeprotokolle – Generelle
Schlüsselschritte Schl sselschritte (Veränderungen (Ver nderungen möglich) m glich)
Stimulation und Ernten der Zellen
Blockierung Fc Rezeptoren
Färbung der Oberflächenantigene
Fixierung und Permeabilisierung
Färbung der Intrazellulären Proteine
oder
Intrazelluläre Kontrollen
Analyse durch Durchflusszytometrie

Intarzelluläre
Intarzellul re Zytokin-Färbung
Zytokin rbung für die
Durchflusszytometrie
• Nicht möglich mit nur 2 Farben!
unstimuliert stimuliert

BD CBA Assay Konfiguration
Bead
Anti-Zytokin
„Catching“
Zytokin
Anti-Zytokin
„Detecting“
PE

Unterschiedliche
Größen
Warum Beads verwenden?
verwenden
Beads ermöglichen eine erweiterbare Plattform bei der
Verwendung eines Durchflusszytometers
Unterschiedliche
Intensitäten
Unterschiedliche Farben mit
untersch. Intensitäten

BD CBA – Assay Spezifikationen
Max. 50 μL Probe
180 min Gesamtinkubation (Unterschiedl in
verschiedenen Assays)
Homogener Assay mit max. 1 Waschschritt
Schnelle Messung: 300 Events/Bead
(i.e., 6 bead Assay – Messung von 1,800
Events)

A
B
C
D
E
F
YY
Y
Y Y
YY
Y
Y Y
YY
YY
Y
Y Y
YY
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y Y
Y
YY
Y
YY
Y
YY
Y
YY
Y
YY
Y
YY
BEADS
Bead Assay Grundlagen
+
Y
Y Y
Y
Y Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
DETEKTOR
ANTIKÖRPER
LYSAT, SERUM oder
Überstand
Waschen
Messung
Y
Y
Y
YY
Y
Y
Y
Y
Y
YY
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y Y
Y
YY
Y
Y
YY
YY
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
YY
YY
Y
Y Y
Y
Y Y
YY
Y
Y Y
Y
Y
Y
YY
Y
YY
Y
Y
YY
Y
Y
Y

Analyse der Daten: Daten:
Bead
Identifizierung

Analyse der Daten: Daten:
Standard Kurven

Erreiche das ganze Bild schneller! schneller
•Exponentieller Anstieg von
Information
•Daten von (1) 6-Farb Färbung
» (15) 2-Farb Färbungen
•Identizierung von neuen/seltenen
Populationen (

Bei wem bekommt man Hilfe?
• Internetseiten der Hersteller für Anregungs- und
Emissionsspektren: www.bdbiosciences.com/spectra
• Lokale Flow-Experten
• Das BD Team
Unser Labor in Basel: Mark Dessing, Joachim Brenner, Jens Fleischer
Heidelberg Flow Support: 06221 305212
Lokale BD Flow Applikationsspezialisten: alexandra_pfeiffer@europe.bd.com
• Kataloge, Bücher, Paper

Der FACSCanto II oder das LSR II
wartet schon ...
...vielen Dank!