Aus dem Institut für Tierzucht und Tierverhalten der - Stiftung ...

Aus dem Institut für Tierzucht und Tierverhalten der
Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Molekularbiologische Untersuchungen der
Genexpression der Nonapeptid-Hormone Mesotocin
und Arginin-Vasotocin beim Huhn
THESE
zur Erlangung des Grades eines
PHILOSOPHICAL DOCTOR
- Ph.D. -
im Fachgebiet
Physiologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Almut Köhler
aus Schwelm
Hannover 2000
gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Graduiertenkollegs
„Zell- und Molekularbiologie in der Tiermedizin“ an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Supervisor: Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff und Dr. Roland Großmann
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff
Prof. Dr. Richard Ivell
Prof. Dr. Dr. Edda Töpfer-Petersen
1. Gutachten: Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff
(Institut für Tierzucht und Tierverhalten, Bundesforschungsanstalt für
Landwirtschaft)
Prof. Dr. Richard Ivell
(Institut für Hormon- und Fortpflanzungsforschung, Universität
Hamburg)
Prof. Dr. Dr. Edda Töpfer-Petersen
(Institut für Reproduktionsmedizin, Tierärztliche Hochschule Hannover)
2. Gutachten: Prof. Dr. Rüdiger Gerstberger
(Institut für Veterinär-Physiologie, Justus-Liebig-Universität Giessen)
Datum der mündlichen Prüfung: 8.12.2000

Meiner Mutter und meiner Oma,
die immer für mich da sind

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ...........................................................................................................11
2 LITERATURÜBERSICHT.......................................................................................13
2.1 EVOLUTION DES ARGININ-VASOTOCIN- UND MESOTOCIN-SYSTEMS..............................13
2.2 MORPHOLOGIE DES ARGININ-VASOTOCIN- UND MESOTOCIN-SYSTEMS .........................17
2.3 ONTOGENESE DES HYPOTHALAMO-NEUROHYPOPHYSÄREN SYSTEMS .............................21
2.4 EINFLÜSSE VON STEROIDHORMONEN UND SEXDIMORPHISMUS......................................24
2.5 NEUROHYPOPHYSÄRE HORMONE UND VERHALTEN .......................................................28
2.6 EINFLÜSSE AUF DIE NONAPEPTID-KONZENTRATION IN PLASMA UND ZNS .....................34
2.7 FUNKTIONEN VON NEUROHYPOPHYSÄREN HORMONEN IN DER NIERE UND IM
KARDIOVASKULÄREN SYSTEM ......................................................................................41
2.8 ARGININ-VASOTOCIN, MESOTOCIN UND REPRODUKTION..............................................43
2.9 ARGININ-VASOTOCIN- UND MESOTOCIN-REZEPTOREN..................................................45
3 FRAGESTELLUNG..................................................................................................48
4 MATERIAL...............................................................................................................49
4.1 TIERE UND GEWEBE .....................................................................................................49
4.2 PUFFERLÖSUNGEN........................................................................................................49
4.3 PLASMIDE ....................................................................................................................50
4.4 ENZYME, CHEMIKALIEN, RADIOCHEMIKALIEN, NÄHRMEDIEN, NÄHRLÖSUNGEN...........50
4.5 GERÄTE .......................................................................................................................51
5 METHODEN.............................................................................................................51
5.1 KULTIVIERUNG DER SONDEN-DNA IN BAKTERIEN........................................................51
5.1.1 Herstellung kompetenter Zellen ........................................................................................................... 51
5.1.2 Transformation kompetenter Bakterien mit Plasmid............................................................................. 52
5.1.3 Minipräparation .................................................................................................................................. 52
5.1.4 Maxipräparation.................................................................................................................................. 53
5.1.5 Konzentrationsbestimmung von DNA ................................................................................................... 53
5.2 HERSTELLUNG DER DNA-SONDE AUS DEM ISOLIERTEN PLASMID ..................................54
5.2.1 Restriktion des Plasmids mittels Enzymen ............................................................................................ 54
5.2.2 Auftrennung der Sonden-DNA von der Plasmid-DNA........................................................................... 55
5.2.3 Elutions-Verfahren zur Gewinnung der isolierten Sonden- DNA........................................................... 56
5.2.4 Konzentrationsbestimmung der eluierten DNA..................................................................................... 56
5.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG DER CDNA-SONDE ..........................................................57
5.3.1 Markierung der Gensonde.................................................................................................................... 57
5.3.2 Random Priming.................................................................................................................................. 58
5.4 SOUTHERN BLOT ..........................................................................................................59
5.4.1 Extraktion von DNA aus Hühnerblut.................................................................................................... 59
5.4.2 Konzentrationsbestimmung der DNA.................................................................................................... 60
5.4.3 Restriktion ........................................................................................................................................... 60

5.4.4 Gelelektrophorese................................................................................................................................60
5.4.5 Southern Blotting................................................................................................................................. 61
5.4.6 Hybridisierung..................................................................................................................................... 61
5.4.7 Auswertung der Southern Blots ............................................................................................................ 61
5.5 NORTHERN BLOT..........................................................................................................61
5.5.1 RNA-Extraktion ................................................................................................................................... 61
5.5.2 Konzentrationsbestimmung der RNA .................................................................................................... 63
5.5.3 Auftrennung der RNA im Agarose-Gel ................................................................................................. 63
5.5.4 Northern Blotting................................................................................................................................. 65
5.5.5 Hybridisierung mit mRNA-spezifischen Gensonden.............................................................................. 66
5.5.6 Auswertung der Northern Blots ............................................................................................................ 67
5.5.7 RNase H-Verdau.................................................................................................................................. 68
5.6 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG............................................................................................69
5.6.1 Behandlung von Plastikmaterial, Glaswaren und Metall gegen RNase................................................. 69
5.6.2 Beschichtung der Objektträger............................................................................................................. 70
5.6.3 Anfertigung der Gefrierschnitte ........................................................................................................... 70
5.6.4 Fixierung der Gewebeschnitte.............................................................................................................. 70
5.6.5 Vorbereitung der Sonde ....................................................................................................................... 71
5.6.6 Prähybridisierung und Hybridisierung................................................................................................. 71
5.6.7 Posthybridisierungswaschungen........................................................................................................... 72
5.6.8 Autoradiographie................................................................................................................................. 73
5.6.9 Histologische Färbung und Einbettung ................................................................................................ 73
5.6.10 Mikroskopische Auswertung................................................................................................................. 73
5.6.11 Kontrollen............................................................................................................................................ 74
5.6.12 Quantitative In-situ-Hybridisierung ..................................................................................................... 75
5.7 IMMUNHISTOCHEMIE....................................................................................................76
5.7.1 Präparation der Objektträger .............................................................................................................. 76
5.7.2 Vorbereitung der Tiere und des Gewebes ............................................................................................. 76
5.7.3 Peptid-Detektion.................................................................................................................................. 78
5.8 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR)......................................................................79
5.8.1 Reverse Transkription.......................................................................................................................... 79
5.8.2 PCR ..................................................................................................................................................... 80
5.8.3 Kontrolle der Spezifität der PCR-Produkte .......................................................................................... 84
5.9 STATISTISCHE AUSWERTUNG........................................................................................85
6 ERGEBNISSE ...........................................................................................................86
6.1 RESTRIKTION DER DNA-FRAGMENTE ...........................................................................86
6.2 SPEZIFITÄT DER SONDEN ..............................................................................................88
6.2.1 Southern Blot....................................................................................................................................... 88
6.2.2 Northern Blot....................................................................................................................................... 89
6.2.3 In-Situ-Hybridisierung ......................................................................................................................... 91
6.2.4 Immunhistochemie............................................................................................................................... 93
6.3 ONTOGENESE DER NONAPEPTID-GENEXPRESSION IM HYPOTHALAMUS ..........................94
6.3.1 Morphologie ........................................................................................................................................ 94
6.3.2 Quantitative Analyse.......................................................................................................................... 102
6.4 VERGLEICH ZWISCHEN AVT UND MT MRNA GEHALT IM HYPOTHALAMUS ................109
6.5 MT-GENEXPRESSION IN PERIPHEREN GEWEBEN..........................................................111
6.6 MT-REZEPTOR-GENEXPRESSION IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN..................................113

6.7 EINFLUß PHYSIOLOGISCHER PARAMETER AUF DIE LÄNGE DES POLY(A)-SCHWANZES.. 116
6.8 EINFLUß EINER DEHYDRATATION AUF DIE HYPOPHYSÄRE
MT MRNA-KONZENTRATION.....................................................................................121
7 DISKUSSION ..........................................................................................................123
7.1 KONTROLLEN DER SONDENSPEZIFITÄT........................................................................124
7.2 VERTEILUNG MT-GENEXPRIMIERENDER NEURONE IM HYPOTHALAMUS.....................128
7.3 EXTRASOMATISCHE GENEXPRESSION DER NONAPEPTIDE ............................................130
7.4 ONTOGENESE DES NONAPEPTID-SYSTEMS...................................................................132
7.5 VERGLEICH DER AVT MRNA- UND MT MRNA-SYNTHESE IM HYPOTHALAMUS .........137
7.6 GENEXPRESSION VON NONAPEPTIDEN IN PERIPHEREN GEWEBEN .................................139
7.7 PHYSIOLOGISCHE EINFLÜSSE AUF DIE LÄNGE DES POLY(A)-SCHWANZES ....................141
7.8 EINFLUß EINER OSMOTISCHEN STIMULATION AUF DIE MT-GENEXPRESSION IM
HYPOTHALAMUS ........................................................................................................142
8 ZUSAMMENFASSUNG .........................................................................................145
9 SUMMARY .............................................................................................................147
10 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................149
11 ANHANG.................................................................................................................176
11.1 CHEMIKALIEN-NACHWEIS ..........................................................................................176
11.2 ENZYME UND LÄNGENSTANDARDS.............................................................................179
11.3 KITS...........................................................................................................................180
11.4 RADIONUKLIDE ..........................................................................................................180
11.5 PRIMER......................................................................................................................181
11.6 PUFFER ......................................................................................................................181
11.7 NÄHRBÖDEN UND NÄHRMEDIEN.................................................................................189
11.8 PLASMAWERTE DER TIERE..........................................................................................190
12 PUBLIKATIONSLISTE .........................................................................................193

Abkürzungsverzeichnis
AS Aminosäure
AVP Arginin –Vasopressin
AVT Arginin –Vasotocin
bp Basenpaare
cDNA komplementäre DNA
cpm counts per minute
D Lebenstag
dATP Desoxyadenosintriphosphat
dCTP Desoxycytosintriphosphat
dGTP Desoxyguanosintriphosphat
DNA desoxyribonucleic acid = Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
ds doppelsträngig
dTTP Desoxytymidintriphosphat
E Inkubationstag (embryonal)
HPLC High performance liquid chromatography = Hochleistungs–
Flüssigchromatografie
icv intracerebroventriculär
IHC Immunhistochemie
IR Immunoreaktivität
ISH In situ-Hybridisierung
IT Isotocin
iv intravenös
Kb Kilobasen ( = 1000 Basen)
KO knock out (= Deletion eines Genes)
LB Lohmann Brown (Huhn, Legerasse)
LSL Lohmann Selected Leghorn (Huhn, Legerasse)
LVP Lysin-Vasopressin
LS Längenstandard
M Molar
mosmol Milliosmol
mRNA messenger ribonucleic acid = Boten-Ribonukleinsäure
MSEL Neurophysin der vasopressinergen Linie (Aminosäure-Code)
MT Mesotocin
nm Nanometer
OD optische Dichte
OP Operation
OT Oxytocin
P Phosphor
RIA Radioimmunoassay
RNA ribonucleic acid = Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

S Schwefel
sc subkutan
SEM standard error mean = Standardfehler
ss einzelsträngig (single stranded)
U unit = aktive Einheit
UV ultraviolett
v/v Volumen pro Volumen
v/w Volumen pro Gewicht (weight)
VLDV Neurophysin der oxytocinergen Linie (Aminosäure-Code)
Vol. Volumen
Anatomische Abkürzungen
BnST Bed nucleus der Stria Terminalis
CO Chiasma opticum
HNS Hypothalamo-neurohypophysäres System
ME Median eminence = Eminentia mediana
PVN Nucleus paraventricularis
SCN Nucleus suprachiasmaticus
SOe Nucleus supraopticus, pars externus
SON Nucleus supraopticus
SOv Nucleus supraopticus, pars ventralis
TSM Tractus septomesencephalicus
V III Ventriculus tertius = Dritter Hirnventrikel
VL Ventriculus lateralis = Lateraler Hirnventrikel
ZNS Zentrales Nervensystem

Einleitung 11
1 Einleitung
Mesotocin (MT) und Arginin-Vasotocin (AVT) sind die beiden neurohypophysären Hormone
des Vogels. Sie entsprechen in ihrer Struktur Arginin-Vasopressin (AVP) und Oxytocin (OT)
beim Säugetier. Sie werden hauptsächlich in magnozellulären Neuronen des Hypothalamus
gebildet, axonal in die Terminale in der Neurohypophyse transportiert und von dort in das
Blut abgegeben. Die Synthese erfolgt als Prohormon mit zwei (MT) bzw. drei (AVT)
beteiligten Peptiden bzw. Proteinen: MT / AVT, Neurophysin und einem Glycopeptid (nur
AVT). Der Hypophysenhinterlappen enthält die Terminale der magnozellulären hypophysären
Neurone und bildet zusammen mit dem Hypothalamus das „hypothalamo-neurohypophysäre
System“ (HNS).
Die physiologischen Wirkungen von AVT und MT betreffen sowohl die Reproduktion wie
auch die Homöostase des Wasserhaushaltes. AVT hat, wie AVP bei Säugetieren, eine
antidiuretische Wirkung an der Niere. Dementsprechend ist die Hormonkonzentration im Blut
bei Wassermangel erhöht. Oxytocin ist beim Säugetier ein Hormon mit stark uterotonischer
Wirkung und bewirkt den Milchejektionsreflex durch Kontraktion der Myoepithelien im
Gesäuge, wenn durch das Jungtier ein mechanischer Reiz ausgeübt wird. Beim Huhn ist die
Eiablage von den neurohypophysären Hormonen beeinflußt, jedoch konnte hier bisher im
Blutplasma nur ein Anstieg des AVT-Gehaltes unmittelbar vor der Oviposition festgestellt
werden. Hingegen ist für MT bisher keine direkte physiologische Funktion beschrieben
worden, die spezifisch für dieses Hormon ist. Auch sonst fehlen verläßliche Daten über eine
von AVT unabhängige Regulation von MT.
Außer dem magnozellulären hypothalamischen System mit den Projektionen in die
Neurohypophyse gibt es Zellgruppen mit Zellen geringerer Größe, welche als parvozellulär
bezeichnet werden. Auch einige dieser Zellgruppen im Hypothalamus sind in der Lage, AVT
und MT zu bilden. Die hier gebildeten Peptide werden nicht über die Neurohypophyse
sezerniert, sondern im ZNS ausgeschüttet, entweder direkt am Syntheseort oder an den
synaptischen Endungen in anderen Projektionsgebieten. Im AVT-System konnte ein
Sexdimophismus in der Genexpression und -translation in parvozellulären Neuronen

Einleitung 12
festgestellt werden. Dieser Unterschied scheint durch Geschlechtshormone bedingt zu sein,
jedoch ist die embryonale Entwicklung dieses Unterschiedes bisher nicht genau beschrieben.
Neben der hypothalamischen Lokalisation der AVT-bildenden Zellen gibt es auch Nachweise
extrahypothalamischer Genexpression, sowohl im zentralen Nervensystem als auch in
peripheren Körpergeweben wie dem Ovar. Die Hormone haben nicht nur eine klassisch
endokrine Wirkung, sondern auch eine parakrine oder autokrine Funktion. Im ZNS haben sie
auch typisch neuropeptiderge Wirkungen mit Einfluß z. B. auf Lernfunktionen.
Ziel dieser Arbeit ist es, grundlegende Daten über die Genexpression von MT zu ermitteln.
Dazu muß zunächst abgesichert werden, daß die neu entwickelte Gensonde für MT mRNA
spezifisch is, ohne daß Kreuzhybridisierungen mit AVT mRNA auftreten. Über eine
ontogenetische Untersuchung und einen Vergleich mit dem AVT-System sowie über
Dehydrierunsversuche soll versucht werden, Rückschlüsse auf eine physiologische Funktion
zu ziehen. Eine mögliche Genexpression von MT außerhalb des ZNS sowie die Lokalisation
von MT-Rezeptor mRNA soll ebenfalls Aufschluß über eine möglich Funktion geben.

Literaturübersicht 13
2 Literaturübersicht
2.1 Evolution des Arginin-Vasotocin- und Mesotocin-Systems
In der Evolution entwickelten sich AVT und MT aus dem Hormon Vasotocin, welches bei
Cyclostomen nachgewiesen wurde (ACHER 1996). Dieses besteht aus der Peptiddomäne des
Vasotocin, einem Neurophysin und einem Glykopeptid (Abb. 2-1). Dieses Prohormon wird
anschließend während des axonalen Transports in die einzelnen Bestandteile gespalten.
Vasotocin
Mesotocin
5‘
5‘
Ex o n 1 Ex on 2 Exon 3
Exon 1
Vasotocin AAAAAA
Exo n 2
Ex o n 3
Mesotocin AAAAAA
Signalpeptid
Nonapeptid
Neurophysin
Glycopeptid
Abb. 2-1: Übersicht über die Gen- und Peptidstruktur von AVT und MT
3 '
3 '
Gly-Lys-Arg
Durch Genduplikation mit anschließender Punktmutation ist bei Knochenfischen ein zweites
Hormon entstanden: Isotocin (IT). Außerdem unterscheiden sich die Neurophysine beider
Hormone. Das an IT gekoppelte Neurophysin wird nach der Abfolge der Aminosäuren 2, 3, 6
und 7 als VLDV bezeichnet, das an AVT gekoppelte als MSEL. Beim Übergang zu
Amphibien, Reptilien und Vögeln trat im IT eine Aminosäure-Mutation an Position 8 auf, wo
jetzt Isoleucin statt Arginin stand, gleichzeitig ging das Glykopeptid am 3'-Ende des
Prohormones verloren. Das neue Peptid wird als Mesotocin (MT) bezeichnet. Beim Übergang
zu den Säugetieren schließlich erfolgte sowohl in der AVT- wie auch der MT-Hormonfamilie

Literaturübersicht 14
eine Punktmutation (ACHER 1993). Aus AVT entstand Arginin-Vasopressin (AVP) und aus
MT Oxytocin (OT; Leucin an Position 8). Beim Schwein findet sich anstatt AVP Lysin-
Vasopressin (LVP) mit Lysin statt Arginin an der Position 8. Abb. 2-2 zeigt die Theorie der
Genduplikation in der Evolution.
Die Beuteltiere Australiens und Amerikas nehmen eine Sonderstellung ein. Während in
australischen Beuteltieren (Dasyuridae, Macropodidae, Phalangeridae) als oxytocinerges
Hormon in der Regel nur MT gefunden wurde, kann man in amerikanischen Beuteltieren
(Didelphidae) MT und OT (Nord-Amerikanisches Opossum) oder nur OT finden (Süd-
Amerikanisches Opossum) (ROUILLÉ et al. 1985). Bei Peramelidae (Beuteldachse:
Kurznasenbeuteldachs, Northern Brown bandicoot, Isoodon macrourus) ist eine doppelte
Genverdopplung beschrieben, d.h. es wurden sowohl die vasoaktiven Peptide AVP und LVP
mittels HPLC identifiziert, als auch die uterotonisch wirksamen MT und OT gefunden
(ROUILLÉ et al. 1988). In diesen Tieren hat anscheinend jeweils eine erneute
Genverdopplung in der vasopressinergen und der oxytocinergen Linie stattgefunden, so daß
vier verschiedene Hormone vorhanden sind. Dasselbe Phänomen wurde auch beim
nordamerikanischen Opossum (Didelphis virginiana) beobachtet. Eine Sonderstellung
hinsichtlich des genauen Ablaufs der Evolution nimmt eine sehr primitive Art der Prototherier
(Kloakentiere) ein: bei ihnen konnte bereits OT identifiziert werden. Wie also läßt sich das
Auftreten von MT bei entwicklungsgeschichtlich später entstandenen Tieren erklären? Eine
Möglichkeit ist eine Mutation von Isoleucin zu Leucin vor der Abspaltung der Theria (Beutel-
und Placentatiere; CHAUVET et al. 1984), eine reverse Mutation in den Beutlern oder eine
Abspaltung der Beuteltiere vor den Theria in der Evolution (CHAUVET et al. 1981).
Diskutiert wird auch das Vorliegen eines doppelten Gensatzes, wovon dann MT exprimiert
wird, während das OT-Gen nicht transkribiert wird. Das Auftreten einer Reihe von
Punktmutationen, die noch dazu in verschiedenen Klassen des Tierreichs jeweils stabil sind,
dürfte wohl einzigartig sein.
MT könnte eine Funktion bei der Milchejektion von Beuteltieren haben (SEBASTIAN et al.
1998), jedenfalls existieren in der Milchdrüse laktierender Wallabys MT-Rezeptoren, welche
gleichermaßen empfindlich sind für MT und OT. Die Mutation von MT zu OT kann also eine
neutrale Mutation gewesen sein. Eine Beteiligung an der Reproduktion erscheint nicht ausge-

Literaturübersicht 15
Vasotocin
VT Neurophysin X
Agnatha
(Kieferlose)
C – Y – I – Q – N – C – P – R - G
Isotocin
Vasotocin
IT Neurophysin GP
VT Neurophysin GP
Osteichthyes
(Knochenfische)
C – Y – I – S – N – C – P – I - G
C – Y – I – Q – N – C – P – R - G
Mesotocin
Vasotocin
MT Neurophysin
VT Neurophysin GP
Lungenfische,
Amphibien,
Reptilien, Vögel
C – Y – I – Q – N – C – P – I - G
C – Y – I – Q – N – C – P – R - G
Oxytocin
Vasopressin (AVP bzw. LVP)
Säugetiere
OT Neurophysin
VP Neurophysin GP
C – Y – I – Q – N – C – P – L - G
C – Y – F – Q – N – C – P – R - G
Abb. 2-2: Übersicht über die Evolution und den strukturellen Aufbau der neurohypophysären Nonapeptid-Hormone in Vertebraten (modifiziert nach
BENTLEY 1998). VT = Vasotocin, IT = Isotocin, MT = Mesotocin, VP = Vasopressin, OT = Oxytocin, GP = Glykopeptid, X = Glykopeptid-Vorläufer

Literaturübersicht 16
schlossen, da MT nicht nur im Gehirn von Beuteltieren nachzuweisen ist, sondern auch in den
Reproduktionsorganen wie dem Hoden (BATHGATE et al. 1993) oder in der Prostata
(GEMMELL u. SERNIA 1989). Beim Lungenfisch (Neoceratodus forsteri), einer
Zwischenstufe zwischen Fischen und Amphibien kann bereits MT in der Neurohypophyse
nachgewiesen werden (MICHEL et al. 1993). Bei der primitiven Blindwühle (Typhlonectes
compressicauda) ist sogar ein MT-Überschuß im Vergleich zu AVT feststellbar
(GONZALEZ u. SMEETS 1997). In Gehirnbereichen, in denen bei anderen Amphibien AVT
lokalisiert ist, stellt sich hier immunhistochemisch MT dar. Die Autoren schlagen vor, daß
sich die Gene gegenseitig in einem Neuron hemmen, und daß, abhängig von äußeren und
inneren Einflüssen, ein Umschalten in der Genexpression zwischen beiden Genen möglich
sein könnte.
Die Mutationen in der Gensequenz der Neurophysine, den mit den Nonapeptiden im
Prohormon assoziierten Proteinen, zwischen verschiedenen Vögeln und Säugetieren sind
identisch (LEVY et al. 1987), d.h. sowohl beim Huhn als auch bei der Gans sind zwischen
den beiden Neurophysinen jeweils die Aminosäuren 17, 35 und 41 im Vergleich zum
Säugetier-Neurophysin ausgetauscht. An Position 17 steht Asparagin bei beiden Vögeln
sowohl beim VLDV- als auch beim MSEL-Neurophysin im Gegensatz zu Glycin beim
Säuger. An Position 35 haben die Vögel Tyrosin statt Phenylalanin und an Position 41
Threonin statt Alanin. An Position 18 und 36 stehen bei der Gans Arginin und Leucin statt
Lysin und Valin. Beim Huhn hingegen verhält sich das MSEL-Neurophysin wie bei der Gans,
das VLDV-Neurophysin wie beim Rind. Es handelt sich bei den Abweichungen also um eine
evolutionäre Linie, nicht um eine speziesspezifische oder artspezifische Mutation.
Auch beim Strauß bestehen z. T. große Unterschiede in der Gensequenz im Neurophysin-
Bereich im Vergleich zum Säuger (LAZURE et al. 1987). Bei der Gans, wahrscheinlich sogar
bei allen Vögeln, scheint das MSEL-Neurophysin nur einmal gespalten zu werden, im
Vergleich zum Säuger, wo es zweimal gespalten wird (ROUILLÉ et al. 1989). Das Copeptin
bleibt also am Neurophysin gebunden. Die gleiche Form der Prozessierung findet man auch
beim Frosch (MICHEL et al. 1990).

Literaturübersicht 17
2.2 Morphologie des Arginin-Vasotocin- und Mesotocin-Systems
Mehrfach wurde mittels Immunhistochemie (IHC) oder In-Situ-Hybridisierung (ISH)
nachgewiesen, daß AVT und MT fast ausschließlich in verschiedenen Neuronen des
Hypothalamus exprimiert werden (DIERICKX u. VANDESANDE 1976; VAN VOSSEL et
al. 1976; BONS 1980; TAKEDA et al. 1990; ANDRADES et al. 1994). Dieses Prinzip
scheint sich auf alle Tiere zu beziehen. Ebenso allen Tieren gemein ist das Vorkommen von
MT-Peptid und AVT mRNA und Peptid in Nucleus paraventricularis (PVN) und Nucleus
supraopticus (SON), den beiden großen Kerngebieten des Hypothalamus. Über das
Vorkommen von MT mRNA kann bisher aufgrund fehlender Sonden keine Angabe gemacht
werden. Unterschiede bestehen aber in weiteren Kerngebieten, wobei man die Möglichkeit
unterschiedlicher Benennung eventuell physiologisch identischer Areale durch eine fehlende
Übereinstimmung in der Nomenklatur zwischen den Gehirnatlanten verschiedener Tiere
berücksichtigen muß. Bei Wachtel (Coturnix japonica) und Ente (Anas platyrhinchos) werden
immuncytochemisch auch MT-Neuronen in der preoptischen Region nachgewiesen (BONS
1980). MT-Fasern sind auch in der Eminentia mediana (ME) nachweisbar, wo sie von der
inneren Zone zur Neurohypophyse verlaufen und von der rostralen äußeren Zone zur
Adenohypophyse. MT-Fasern ziehen beim Huhn auch zum Stammhirn (BLÄHSER 1982), so
daß eine Rolle als Neuroregulator möglich ist. Bei verschiedenen Amphibien wird MT in der
Pars intermedia der Hypophyse gefunden (DIERICKX u. VANDESANDE 1976). MT-Peptid
ist auch in einigen extrahypothalamischen Gebieten nachweisbar, so z. B. in der Hypophyse
von Fröschen (GONZALEZ u. SMEETS 1992), wo AVT-Fasern völlig fehlen, und bei der
Blindwühle im Tegmentum des Zwischenhirns (GONZALEZ u. SMEETS 1997). MT ist
mittels Radioimmunoassay (RIA) auch im Kleinhirn von Hähnen detektierbar (ROBINZON
et al. 1988b). Daneben zeigen sich auch Archistriatum, Paleostriatum, Mittelhirn, Pons und
optische Lappen als MT-haltig. Bei der Echse kann immuncytochemisch keinerlei MT
außerhalb des Hypothalamus nachgewiesen werden (THEPEN et al. 1987), wobei diese
Unterschiede auch durch die verschiedenen Detektionsmethoden bedingt sein können. Der
RIA ist in seiner Empfindlichkeit sehr stark von der Spezifität des eingesetzten Antikörpers
abhängig. Er kann sehr geringe Peptidmengen nachweisen (z. B. Picogramm-Bereich für

Literaturübersicht 18
AVT) und ist bei einem guten Antikörper auch sehr spezifisch, jedoch erlaubt er keine
Aussage über eine Lokalisation des Peptids im Gewebe und ist anfällig gegenüber
Kontaminationen. Daher ist eine genaue Gewebeentnahme sehr wichtig, um falsch positive
Ergebnisse zu vermeiden. Kontaminierendes Blut kann zu einer positiven Peptiddetektion
führen. AVT kann bei Amphibien (Molch) und Reptilien (Schildkröte) außer in SON und
PVN vor allem in der Amygdala und im lateralen Septum nachgewiesen werden. Diese
Expression ist sowohl bei der Schildkröte (Pseudemys scripta elegans: SMEETS et al. 1990)
als auch beim Molch (Taricha granulosa: LOWRY et al. 1997) geschlechtsspezifisch.
Bei Hühnern wird AVT extrahypothalamisch im Diencephalon exprimiert. In
Übereinstimmung mit dem Expressionsmuster bei Ratten wurde diese Struktur als Bed
Nucleus der Stria terminalis (BnST) identifiziert (BARTH 1996; JURKEVICH et al. 1997).
Die Genexpression ist sexdimorph: Während bei Hähnen in dem parvozellulären Teil des
Kerngebietes eine deutliche Genexpression zu erkennen ist, fehlt diese bei Hennen völlig.
Auch bei Wachteln ist dieser Sexdimorphismus vorhanden (ASTE et al. 1998).
Im Gegensatz zu AVT konnte bei MT bisher keine geschlechtsspezifische Expression von MT
nachgewiesen werden (Amphibien: THEPEN et al. 1987; GONZALEZ u. SMEETS 1997;
Huhn: ROBINZON et al. 1990b; BARTH et al. 1997).
Auch außerhalb des ZNS wird MT exprimiert: im Reproduktionssystem (s.u.) und im
Gastrointestinaltrakt. So konnte MT in Follikeln, Nebenniere, Oesophagus, Magen, Darm und
Kloake von Hühnern (ROBINZON et al. 1988c) mit RIA identifiziert werden. Der geringe
Gehalt in diesen Organen läßt aber eher auf eine parakrine Rolle schließen. Auch mittels RIA
gelang der MT-Nachweis im Verdauungstrakt (KOIKE et al. 1987). Nicht zu unterscheiden ist
dabei, ob es sich um eine lokale Peptidproduktion handelt, oder ob zirkulierendes Peptid an
lokale Rezeptoren gebunden ist und so nachgewiesen wird.
Teilweise konnten Co-Lokalisationen von AVT und MT mit anderen Hormonen
nachgewiesen werden, so z.B. bei der Schlange (Natrix maura) AVT mit Corticotropin
releasing factor (CRF) (MANCERA et al. 1991) bzw. beim Frosch (Rana catesbeiana;
STOECKEL et al. 1987; SHIODA et al. 1989) mit Thyrotropin releasing hormone (TRH). Es
konnte jedoch kein Einfluß festgestellt werden auf die Expression oder Sekretion der co-

Literaturübersicht 19
lokalisierten Hormone. Auch auf die Hormone, welche von den co-lokalisierten Hormonen
reguliert werden, konnte kein Effekt von AVT oder MT gemessen werden.
Ein Überblick über die Verteilung von AVT und MT in verschiedenen Bereichen des ZNS
von Amphibien, Reptilien und Vögeln gibt Tabelle 1.
Lokalisation Tierart Peptid Methode Autor
Hypophyse Frosch
Frosch
Frosch
Kröte
Blindwühle
Huhn
AVT, MT
AVT, MT
MT
MT
AVT, MT
AVT, MT
Huhn AVT, MT RIA ROBINZON et al. 1988b
Cerebellum Huhn MT RIA ROBINZON et al. 1988b
limbisches System Huhn AVT, MT RIA ROBINZON et al. 1988b
(Septum, Amygdala,
Nc. accumbens)
Wachtel AVT IHC VIGLIETTI-PANZICA et
al. 1992
Frosch
Molch
Schildkröte,
Schlange
Hypothalamus Huhn
Huhn
Huhn
Wachtel,
Stockente
Wachtel, Huhn
Stockente
AVT, MT
AVT
AVT
AVT, MT
MT
AVT
AVT, MT
AVT
AVT, MT
IHC
PAP, EM
IHC
IHC
IHC
RIA
IHC
ISH, IHC
IHC
RIA
ISH
ISH
IF
IHC
IHC
TAKEDA et al. 1990
VAN VOSSEL et al. 1976
SHIODA et al. 1989,
STOECKEL et al. 1987
DIERICKX u.
VANDESANDE 1976
GONZALEZ u. SMEETS
1997
ROBINZON et al. 1990b
GONZALEZ u. SMEETS
1992
LOWRY et al. 1997
SMEETS et al. 1990
ROBINZON et al. 1988b
BARTH et al. 1997
BARTH 1996
BONS 1980
VIGLIETTI-PANZICA
1986
GOOSSENS et al. 1977

Literaturübersicht 20
Schlange
Eidechse
Frosch
Blindwühle
Molch
Schlange
Schildkröte,
Schlange
BnST, Diencephalon Molch
Huhn
Huhn
Wachtel
Wachtel
Wachtel, Huhn,
Stockente
Eidechse
Schildkröte,
Schlange
Tegmentum Frosch
Eminentia
mediana
Blindwühle
Schildkröte,
Schlange
Schildkröte,
Schlange
Wachtel,
Stockente
diverse Vögel
AVT, MT
AVT, MT
AVT, MT
AVT, MT
AVT
AVT, MT
AVT
AVT
AVT
AVT
AVT
AVT
AVT
AVT, MT
AVT
AVT, MT
AVT, MT
AVT
AVT
AVT, MT
AVT
IHC
IHC
IHC
IHC
IHC, ISH
IHC
IHC
IHC, ISH
IHC, ISH
ISH
IHC
IHC
IHC
IHC
IHC
IHC
IHC
IHC
IHC
IF
IHC
ANDRADES et al. 1994
THEPEN et al. 1987
GONZALEZ u. SMEETS
1992
GONZALEZ u. SMEETS
1997
LOWRY et al. 1997
MANCERA et al. 1991
SMEETS et al. 1990
LOWRY et al. 1997
JURKEVICH et al. 1997
BARTH 1996
ASTE et al. 1998
PANZICA et al. 1996
VIGLIETTI-PANZICA
1986
THEPEN et al. 1987
SMEETS et al. 1990
GONZALEZ u. SMEETS
1992
GONZALEZ u. SMEETS
1997
SMEETS et al. 1990
SMEETS et al. 1990
BONS 1980
BLÄHSER 1984
Rhombencephalon Eidechse AVT, MT IHC THEPEN et al. 1987
Epiphyse Huhn AVT, MT RIA ROBINZON et al. 1990b
Tabelle 1: Übersicht über die Verteilung von AVT und MT im ZNS bei verschiedenen Reptilien, Amphibien
und Vögeln.

Literaturübersicht 21
2.3 Ontogenese des hypothalamo-neurohypophysären Systems
Die Entwicklung des hypothalamo-neurohypophysären Systems bei Säugern und anderen
Vertebraten kann Rückschlüsse darüber geben, welche Funktionen ein Gen in der
Entwicklung des Gehirns übernimmt und ab wann der Fetus eigenständig in der Lage ist,
physiologische Funktionen zu regulieren. Daher wurde die Entwicklung des HNS bei einigen
Tierarten untersucht. Dabei sind die Ergebnisse durchaus sehr unterschiedlich.
Die Expression des AVT- und MT-Gens beginnt beim Huhn bereits sehr früh in der
embryonalen Entwicklung. Mittels eines Antikörpers, der AVT und MT gemeinsam
detektiert, können erste Signale bereits am Tag 7,25 der Bebrütung bei Embryonen dargestellt
werden (ARNOLD - ALDEA u. STERRITT 1996). Zwei Gebiete sind dabei sichtbar. Der
Ursprung für die spätere Gruppe im Diencephalon ist die hypothalamische Anlage am III.
Ventrikel. Von dort vollziehen die Neurone eine Migration nach rostral. Dabei scheinen
Neuronen, unabhängig von ihrer späteren Größe (magno- oder parvocellulär) und ihrer
genauen Lokalisation im Diencephalon, denselben Ursprung zu haben. Es gibt ausgehend von
der Anlage zwei Migrationswege. Auf dem dorsalen Weg wandern Neuronen, die später im
BnST, DLAmc und SON, pars externus lokalisiert sind. Ventral bewegen sich Neurone zum
SON, pars ventralis und PVN. Der Nucleus Edinger-Westphal bildet die zweite Anlage im
Mesencephalon am IV. Ventrikel mit Signalen von E7,25 bis E10. Das Kerngebiet war in
älteren Entwicklungsstadien nicht mehr nachweisbar. Abb. 2-3 zeigt eine Skizze der
Migration der Nonapeptid-Hormone im Diencephalon.

Literaturübersicht 22
b
a
1
Abb. 2-3: Theorie der Migration von vasopressinergen und oxytocinergen Neuronen im ZNS (nach
ARNOLD - ALDEA u. STERRITT 1996). Dargestellt sind ein dorsaler (1) und ein ventraler (2) Weg. Aus dem
dorsalen entstammen die Neurone des BnST (a), des DLAmc (b) und des SON, pars externus (c). Aus dem
ventralen wandern die späteren Neurone im SON, pars ventralis (a) und PVN (b).
Ähnlich früh konnte beim Huhn nicht nur immuncytochemisch die Peptidproduktion
nachgewiesen werden. Bereits an E6 treten in der ISH erste Signale für Genexpression von
AVT am III. Ventrikel auf (MILEWSKI et al. 1989), von wo aus die Neuronen bis E12 in
PVN und SON zu migrieren scheinen. Das Phänomen der Neuronenmigration ist bisher eine
Theorie, die nicht schlüssig belegt ist. Man müßte einzelne Neuronen in Gehirnschnitten
anfärben und diese Schnitte sehr lange in Kultur lebend erhalten und permanent aufzeichnen,
um den sicheren Beweis zu haben, daß Neuronen tatsächlich während der Ontogenese
wandern. Statt einer Migration kann es sich auch im eine wechselnde Genexpression in
verschiedenen Zellen handeln. Im embryonalen Gehirn haben die Neurone aber noch keine
b
c III.
2
Ventrikel
a
lateraler
Ventrikel
Chiasma opticum

Literaturübersicht 23
langen Axone und Dendriten ausgebildet, so daß eine Ortsbewegung möglich wäre. Ob dann
AVT und MT eine Leitfunktion für die Bewegungsrichtung haben, bleibt noch zu klären. Die
Peptidsynthese beginnt noch vor der vermuteten Migration der Zellen (TENNYSON et al.
1985; 1986), da erste Signale für die Translation mittels ICC bereits an E7/8 detektierbar sind.
An E12 entspricht die Verteilung beim Huhn bereits der von erwachsenen Tieren, und auch die
physiologische Wirkung als antidiuretisches Hormon entwickelt sich in der letzten Phase der
embryonalen Entwicklung, so daß beim Küken am Schlupftag die Osmoregulation
funktionsfähig ist (GROSSMANN et al. 1995).
Auch beim Krallenfrosch (Xenopus laevis) ist eine sehr frühe embryonale Peptidsynthese
festzustellen (GONZALEZ et al. 1995), woraus eine Bedeutung von MT für die neuronale
Entwicklung hervorgehen könnte. Die MT-Peptidsynthese entwickelt sich hier stellenweise
schneller als AVT (Stammhirn), was aber bei adulten Tieren wieder umgekehrt ist. In allen
anderen Gehirnbereichen, in denen beide Peptide vorkommen, hat die Entwicklung des AVT-
Systems immer einen Vorsprung gegenüber der MT-Synthese. Die Neuronenzahl nimmt nur
langsam zu. Es sind keine Entwicklungssprünge sichtbar.
Im Gegensatz zu den Vögeln und Amphibien scheint die Genexpression bei den Säugetieren
später in der vorgeburtlichen Entwicklung einzusetzen und braucht auch länger, um eine
Morphologie ähnlich einem erwachsenen Tier zu erreichen. Trotzdem hat Vasopressin in
Ratten auch pränatal wichtige Funktionen zu erfüllen: In Brattleboro-Ratten wird durch eine
Punktmutation im Neurophysinbereich des AVP der Leserahmen verschoben, wodurch es zu
einem Verlust des Stopcodons kommt. Diese Mutanten haben eine gestörte Entwicklung des
Gehirns, besonders im Bereich des Cerebellums. Diese Erscheinung läßt sich durch pränatale
Vasopressin-Substitution verhindern (BOER 1985). In der Regel kann bei Säugetieren ein
Zeitverzug der OT-Genexpression und –translation gegenüber AVP beobachtet werden
(WHITNALL et al. 1985; FEHR et al. 1989; JING et al. 1998). Dieser Zeitversatz spielt sich
hauptsächlich im letzten Drittel der Trächtigkeit ab. Ratten haben eine der Bebrütungszeit des
Huhns vergleichbare Trächtigkeitsdauer von 21 – 23 Tagen. Trotzdem wird eine OT-
Transkription oft erst im letzten Viertel der Trächtigkeit beschrieben (LAURENT et al. 1989;
JING et al. 1998). Allerdings ist auch bei der Ratte die Ausbildung der einzelnen Kerngebiete
hinsichtlich der AVP- und OT-positiven Neurone bereits pränatal (E17) soweit

Literaturübersicht 24
fortgeschritten, daß die Verteilung adulten Tieren gleicht (WHITNALL et al. 1985). Hingegen
ist die Bildung von AVP mRNA und OT mRNA nach quantitative Gesichtspunkten
hauptsächlich ein postnatales Ereignis der ersten zwei Lebenswochen (ALMAZAN et al.
1989). Das entspricht auch dem Zeitpunkt der Etablierung synaptischer Verbindungen an den
AVP- und OT-Neuronen. In extrahypothalamischen Gebieten (BnST und mediale Amygdala)
ist AVP mRNA erst postnatal detektierbar (SZOT u. DORSA 1993). Dabei gibt es einen
Sexdimorphismus, da bei männlichen Ratten die ersten Signale an D3-5 sichtbar sind, bei
weiblichen Tieren jedoch erst an D14 (BnST) bzw. D35 (mediale Amygdala). Im Alter von 1
(BnST) bzw. 2 Monaten (Amygdala) entspricht die Stärke des Signals dem von erwachsenen
Tieren. Auch die OT mRNA-Synthese ist steroidabhängig. In der Pubertät kommt es zu einer
Zunahme der mRNA-Bildung, welche während der Laktation weiter gesteigert wird
(MILLER et al. 1989c). Ovariektomie dagegen vermindert die OT mRNA-Konzentration in
adulten weiblichen Ratten. Beim Schwein kann zwar mit Antikörpern schon eine
Neurophysin-Synthese an E25 festgestellt werden (ELLENDORFF et al. 1990), jedoch sind
LVP mRNA und OT mRNA erst an E40 sichtbar. Diese Diskrepanz kann einerseits in einer
LVP-/OT-unabhängigen Synthese von Neurophysin liegen, oder die Stabilität der LVP und
OT mRNA ist vermindert, so daß die in der Zelle vorhandenen mRNA-Konzentrationen nicht
detektierbar sind. Im Gegensatz zum Huhn, wo zuerst der PVN und erst später der SON
Signale für die Nonapeptide zeigen, entwickelt sich beim Schwein der SON früher als der
PVN (MILEWSKI 1989).
2.4 Einflüsse von Steroidhormonen und Sexdimorphismus
Die Genexpression der vasopressinergen Hormonlinie zeigt eine geschlechtliche
Differenzierung. Dabei haben die männlichen Tiere in der Regel Signale, welche bei
weiblichen Tieren stark reduziert sind oder fehlen. Dieses Phänomen ist auf bestimmte
Kerngebiete des Gehirns begrenzt. Daher werden in der Literatur über eine Lokalisation dieser
Strukturen oft Homologien in den Gehirnatlanten verschiedener Tierarten und -stämme
hergestellt. Zuerst beschrieben wurde dieses Phänomen in verschiedenen Säugetieren,

Literaturübersicht 25
darunter Ratten (VAN LEEUWEN et al. 1985; MILLER et al. 1989a), Hamster (BUIJS et al.
1986; FERRIS et al. 1990) und Wühlmaus (BAMSHAD et al. 1993; WANG et al. 1994a). Bei
männlichen Tieren kann eine Kastration die Genexpression bzw. die Dichte AVP-
immunoreaktiver Zellen und Nervenfasern bzw. die Bildung von AVP mRNA verringern oder
völlig unterdrücken (DE VRIES et al. 1984; MILLER et al. 1989b). Dabei folgt der Verlust
der immunoreaktiven Peptide der Abnahme der Genexpression mit ca. 3 Wochen Verspätung
(MILLER et al. 1992). Dieser Effekt konnte durch die Gabe von Testosteron-Implantaten
wieder umgekehrt werden (VAN LEEUWEN et al. 1985; BROT et al. 1993). Bei einem
Geschlechtsunterschied von Regulationsmechanismen sind daher offensichtlich Steroide
direkt oder indirekt an der Ausbildung dieses Dimorphismus beteiligt. Auch natürliche
Schwankungen des Testosteronspiegels führen zu Veränderungen in der Genexpression und
Translation der Neuropeptide in diesen Gehirnarealen. So ist beim Europäischen Hamster eine
Zunahme der AVP-Innervation im Frühjahr zur Brunstzeit sichtbar, welche parallel zur
Veränderung des zirkulierenden Testosterons verläuft (BUIJS et al. 1986). Allerdings hängt
das Expressionsmuster nicht allein von der Menge an zirkulierendem Steroid ab. So kann
Testosteron nicht immer den ursprünglichen Zustand wiederherstellen, noch kann durch
alleinige Testosterongabe bei weiblichen Tieren ein männliches Expressionsmuster erreicht
werden (DE VRIES et al. 1986; 1994). Vielmehr scheint es bereits in der Entwicklung dieses
Sexdimorphismus Phasen zu geben, in denen die spätere Reaktionsfähigkeit auf die
zirkulierenden Hormonlevel festgelegt wird (WANG et al. 1993; JURKEVICH et al. 1999b).
Bei dem geschlechtsspezifisch regulierten Kerngebiet handelt es sich um den Bed Nucleus der
Stria terminalis (BnST). Die Neuronen dieses Kerngebiets projezieren zum lateralen Septum
(DE VRIES u. BUIJS 1983), was auch durch eine verminderte Faserdichte in diesem Bereich
bei einer verringerten AVP-Produktion im BnST deutlich wird. Bei der Ratte ist im BnST
eine Co-Lokalisation von AVP und Androgen-Rezeptor nachgewiesen (ZHOU et al. 1994), so
daß ein direkter Einfluß von Testosteron auf die AVP-Synthese möglich ist.
Bei weiblichen Ratten hat die Ovariektomie einen negativen Einfluß auf die Gesamt-mRNA-
Menge an OT im Hypothalamus im Northern Blot, jedoch läßt sich morphologisch kein
Unterschied zwischen intakten und operierten Tieren feststellen, was Lokalisation und Anzahl
der exprimierenden Neurone betrifft (MILLER et al. 1989c). Die Unterschiede in der

Literaturübersicht 26
Genexpression beruhen auf einer unterschiedlichen Stärke der Transkription im einzelnen
Neuron. Dieser Befund ist vielleicht überraschend, da bisher im Säuger für OT eigentlich nur
eine Rolle in der Reproduktion (Uteruskontraktion, Milchejektion) bei weiblichen Tieren
bekannt ist. Eine Rolle von OT aus magnozellulären Neuronen bei männlichen Tieren ist
bisher unbekannt. Daher wären morphologische Unterschiede in den ovariektomierten Tieren
in der Lokalisation ähnlich dem BnST denkbar gewesen.
Später folgten dann Beobachtungen über einen Sexdimorphismus bei verschiedenen
Vogelspezies wie beim Kanarienvogel (VOORHUIS et al. 1988), Wachtel (ASTE et al. 1998)
und Huhn (JURKEVICH et al. 1997). Ein Sexdimorphismus ist auch bei der Schildkröte
(Pseudomys scripta elegans) in den Bereichen des lateralen Septum, Amygdala, Habenula,
Tegmentum und Substantia nigra (SMEETS et al. 1990) beschrieben. Auch bei der Wachtel
ist der Sexdimorphismus abhängig vom zirkulierenden Testosteron-Siegel im Plasma
(VIGLIETTI-PANZICA et al. 1992, 1994). Dieser Effekt wird ausgelöst durch
Veränderungen der Tageslichtlänge und kann auch künstlich ausgelöst werden. Der Bezug
zum BnST der Ratte kann auch bei der Eidechse (Lizzard gekko gecko) in den Arealen des
lateralen Septum und im ventrocaudalen Telencephalon hergestellt werden, da entsprechend
bei männlichen Tieren deutlich mehr AVT-Peptid detektierbar ist . Dagegen sind beim Vogel
die AVT-produzierenden Neurone in den sexdimorphen Strukturen negativ für den Androgen-
Rezeptor (JURKEVICH et al. 1999b). Daher muß beim Vogel die Steroidabhängigkeit anders
reguliert sein als beim Säugetier: Eine mögliche Regulation erfolgt entweder über
Interneuronen, welche, aktiviert über einen Androgen-Rezeptor mit Ligand, die AVT-
Neuronen steuern, oder über eine Aromatisierung des Testosterons in Östrogen. Tatsächlich
konnte bei der Wachtel Aromatase-Protein mit AVT-Peptid co-lokalisiert werden (ASTE et
al. 1998) und die Applikation von Östrogen in einer bestimmten Phase der embryonalen
Entwicklung (E8) konnte bei männlichen Tieren ein weibliches Expressionsmuster im
erwachsenen Tier hervorrufen (GROSSMANN et al. 1999). Umgekehrt kann eine Applikation
des Aromatase-Hemmers Fadrazol beim weiblichen Tier den Verlust der AVT-Synthese in
der Pubertät verhindern (JURKEVICH et al. 2000b). Dabei ist die Zahl der AVT-
produzierenden Zellen bei der Henne gegenüber dem Hahn vermindert. Diesen Umweg des
Testosteron-Effekts über Aromatisierung liegt wahrscheinlich die anders regulierte

Literaturübersicht 27
Geschlechtsdifferenzierung des Vogels gegenüber dem Säuger zugrunde. Während beim
Säugetier der männliche Organismus geschlechtsbestimmend ist (fehlender Testosteron-
Einfluß in der Embryonalentwicklung führt zur Feminisierung des Embryos; SCHNORR
1989), ist beim Vogel der weibliche Embryo aktiv: ein fehlender Östrogen-Einfluß führt zur
Maskulinisierung des Tieres (MARAUD et al. 1972).
Beim Ochsenfrosch (Rana catesbeiana) bewirkt eine Gonadektomie eine Verminderung der
AVT-Konzentration im Gehirn in den Bereichen der lateralen Amygdala, dem Nc. septalis
und der Habenula, bei männlichen Tieren auch im Tectum opticum. Eine Hormonsubstitution
mit Östrogen kann den AVT-Gehalt bei männlichen und weiblichen Tieren im Nc. septalis
und der Habenula wieder herstellen. In der Amygdala bei weiblichen Tieren wird die
Ausgangskonzentration wieder erreicht. Bei männlichen Tieren ist hier die Wiederherstellung
nur teilweise (BOYD 1994). Das zeigt, daß die vollständige Regulation nicht nur vom
Geschlecht, sondern auch von der Region der Genexpression abhängig ist.
Beobachtungen über einen morphologischen Sexdimorphismus im BnST fehlen bei MT
gänzlich (THEPEN et al. 1987; ROBINZON et al. 1990b; BARTH et al. 1997; GONZALEZ
u. SMEETS 1997). Jedoch kann ein Einfluß von Steroiden auf die Peptidmenge von MT in
einzelnen Kerngebieten des Huhnes nachgewiesen werden (ROBINZON et al. 1992). So läßt
sich bei Hähnen, die an E10 mit Antiöstrogenen (Tamoxifen) behandelt werden, mittels RIA
ein Anstieg der MT-Menge im vorderen Hypothalamus im Alter von 26 Wochen feststellen,
während die gleiche Behandlung bei weiblichen Tieren ohne Einfluß ist. Auch ohne die
Behandlung haben männliche Tiere mehr hypothalamisches MT als Weibchen. In der
Neurohypophyse hat die Behandlung mit Antiöstrogenen und Antiandrogenen (Flutamid), bei
Männchen auch mit Aromatase-Hemmern (ATD) einen stimulierenden Effekt auf die MT-
Menge. Ob der Anstieg des MT-Gehaltes jedoch auf einer vermehrten Produktion oder einem
verminderten axonalen Transport beruht, bleibt offen. In der Zirbeldrüse sinkt der MT-Gehalt
bei Weibchen nach der Behandlung mit Antiandrogenen (ROBINZON et al. 1992). Der MT-
Gehalt kastrierter Männchen im Hypothalamus liegt zwischen dem von intakten Männchen
und Weibchen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Literaturübersicht 28
Behandlung Hypothalamus Neurohypophyse Epiphyse
ohne Behandlung MT: MT: AVT:
Antiöstrogen
MT (
AVT
Antiandrogen MT
AVT
Aromatase-Hemmer
Tabelle 2: Einfluß Steroid-modulierender Substanzen in der Embryonalphase auf den AVT- und MT-Gehalt
in verschiedenen Gehirnarealen des Huhnes. Die Tiere wurden an E10 mit der jeweiligen Substanz durch in
ovo-Injektion behandelt. Die Auswertung erfolgte im Alter von 26 Wochen nach dem Schlupf. Antiöstrogen =
Tamoxifen, Antiandrogen = Flutamid, Aromatase-Hemmer = ATD (nach ROBINZON et al. 1992)
2.5 Neurohypophysäre Hormone und Verhalten
Der Sexdimorphismus auf morphologischer Ebene wirkt sich auf viele physiologische
Regulationsmechanismen aus, so auch auf die Regulation des Verhaltens. Schon lange ist
bekannt, daß OT beim Säugetier nicht nur für den Geburtsvorgang verantwortlich ist und die
Milchejektion durch Kontraktion der Myoepithelien in der Mamma fördert, sondern auch das
Pflegeverhalten beim Muttertier für das Neugeborene fördert (KENDRICK et al. 1987). Aber
nicht nur OT, sondern auch AVP ist an der Regulation des Verhaltens bei weiblichen und
männlichen Tieren beteiligt. Diese Wirkungen werden aber nicht, wie die peripheren
Aufgaben, durch eine Abgabe in das Blut und eine endokrine Funktion ausgelöst, sondern
beruhen auf einer lokalen, neuropeptidergen Wirkung. AVP und OT wirken somit nicht nur
extraneuronal in peripheren Organen, sondern können auch als Neuromodulatoren direkt im
ZNS das arttypische Verhalten steuern.
Bei der Untersuchung geschlechtsspezifischer Verhaltensmuster stehen zunächst die
Steroidhormone im Vordergrund. Östrogen und Androgen in der Blutzirkulation können die
Blut-Hirn-Schranke durch ihre ausgesprochenen Lipophilität leicht überwinden und im Gehirn
ihre Wirkung entfalten. Dazu müssen Rezeptoren vorhanden sein. Steroidhormonrezeptoren
sind intrazellulär lokalisiert und wirken direkt durch Bindung an sog. „Response-Elemente“

Literaturübersicht 29
als Transkriptionsfaktoren auf der DNA stimulierend oder inhibierend auf die Genexpression.
So steuern sie die Transkription verschiedener Gene positiv oder negativ. Bei OT wurde
bereits ein Östrogen- response element (ERE) nachgewiesen (RICHARD u. ZINGG 1990).
Diese beeinflußten Gene wiederum führen zur Bildung anderer Proteine (z. B. Ovalbumin,
Vitellogenin, Prolaktin, OT). So können Schaltkreise des Verhaltens beeinflußt werden. Wie
bereits dargestellt, wird die Testosteron-Wirkung auf vasopressinerge Zellen über Aromatase
vermittelt. Abb. 2-4 zeigt einen schematischen Überblick über einige der möglichen
Schaltkreise, mit denen Steroide auf das AVT-System einwirken können.
Testosteron löst bei männlichen Wachteln Kopulationsverhalten aus (VIGLIETTI-PANZICA
et al. 1992). Bei kastrierten Hähnen sind weder AVT-positive Zellen oder Fasern im lateralen
Septum und im BnST nachzuweisen, noch zeigen die Tiere Kopulationsverhalten. Bei Hennen
läßt sich durch Testosterongabe mittels Implantat kein maskulines Verhalten auslösen, was
darauf hindeutet, daß die Regulation dieses Verhaltens nicht auf einem reinen Einfluß
zirkulierenden Testosterons im erwachsenen Tier basiert, sondern daß funktionelle oder
morphologische Unterschiede im Gehirn vorhanden sein müssen.. Zwischen der Dichte der
AVT-positiven Fasern im lateralen Septum und dem Auslösen des Kopulationsverhaltens
besteht eine positive Korrelation. Testosteron kann aber beide Effekte (größere Faserdichte im
ZNS und Kopulationsverhalten) auch unabhängig von einander auslösen. Schon 1972 wurde
aber gezeigt, daß die ip Injektion von AVT und OT in Hähnen und männlichen Tauben eine
kurzzeitige Steigerung des Paarungsverhaltens auslösen kann (KIHLSTRÖM u. DANNIGE
1972). Im Gegensatz dazu steht bei der Wachtel ein hemmender Effekt von AVT bei einer icv
Injektion auf das Balz- und Kopulationsverhalten (CASTAGNA et al. 1998). Daneben wurde
ein V1-Antagonist verabreicht, was zu einer Stimulation des Paarungsverhaltens führte, so
daß ausgeschlossen werden kann, daß AVT eine stimulierende Wirkung über einen anderen
Rezeptor ausübt. Testosteron hat aber bei der Wachtel ebenfalls morphologisch einen
stimulierenden Effekt auf die AVT-Peptidsynthese im BnST und im medialen Nc. preopticus,
und dieser Sexdimorphismus wird embryonal durch zirkulierendes Östrogen manifestiert

Literaturübersicht 30
Verhalten
Gehirn
AV T
BHS /
Neurohypophyse
Blut
periphere Organe
Abb. 2-4: Modell der Wirkung von Sexualsteroiden auf das AVT-System und die weitere Verarbeitung in der Peripherie und zentral. T = Testosteron,
E = Östrogen, A = Aromatase, BHS = Blut-Hirn-Schranke.

Literaturübersicht 31
(PANZICA et al. 1998, 1999). Die Autoren spekulieren, daß die verabreichten Dosen
außerhalb des physiologischen Bereichs liegen. Einen solchen Interpretationsansatz verfolgt
auch LANDGRAF (1995). Die beobachteten Effekte könnten aber auch nicht im BnST
reguliert werden, sondern die Injektion beeinflußt andere Gehirnbereiche, welche einen
inhibierenden Effekt auf den BnST haben, und eine direkte Injektion in den BnST könnte
durchaus aktivierend wirken. Beim Bootsmannsfisch (Porichthys notatus) wird in ähnlicher
Weise beobachtet, daß bei Typ I-Männchen, welche die Brut betreuen, AVT einen
hemmenden Effekt auf die Dauer der Zellaktivierung im vorderen Hypothalamus hat. AVT-
Neurone feuern phasisch, und diese Phasendauer wird durch die Injektion von AVT in Area
preoptica und den Hypothalamus vermindert. Die aufgezeichneten Zellen sind für die
Steuerung der Vokalisation zuständig. Bei weiblichen Tieren hingegen und bei Typ II-
Männchen, welche sich nicht an der Brut beteiligen, bleibt eine AVT-Gabe in diese
Gehirnregion ohne Veränderung auf die Aktionspotentiale (GOODSON u. BASS 2000). Ein
weiteres männliches Verhalten, welches am Reproduktionsgeschehen beteiligt ist, ist der
Gesang des Kanarienvogels. Bei dieser Vogelspezies wurde auch zuerst ein Sexdimorphismus
bei Vögeln nachgewiesen. Dieser Unterschied tritt saisonal auf. Werden juvenile oder adulte
Männchen täglich über 3 Tage mit einem AVT-Analog sc behandelt, kann 1 - 4 Wochen
später eine Veränderung der Gesangsdauer innerhalb 30 min Meßzeit festgestellt werden: im
Herbst ist die Dauer verlängert, im Winter hingegen verkürzt (VOORHUIS et al. 1991). Alle
Tiere hatten Testosteron-Implantate, um auszuschließen, daß Unterschiede auf saisonal
verschiedenen Steroid-Konzentrationen im Plasma beruhen. Daher bleibt zumindest bei
Nichtsäugern die eigentliche Wirkung von AVT auf das männliche Reproduktionsverhalten
noch zu klären.
Bei Säugetieren sind bereits mehrere Untersuchungen zur Verknüpfung der Neuropeptide mit
dem Verhalten vorhanden. Ein Vorteil dabei ist, daß KO-Tiere gute Möglichkeiten für die
Darstellung physiologischer Verhaltensweisen darstellen. So hat das Fehlen von OT in OT - / - -
Mäusen einen hemmenden Effekt auf die soziale Erkennung (FERGUSON et al. 2000). Ein
Nachteil von KO-Tieren ist, daß das zu untersuchende Gen und sein Produkt in dem Tier
vollständig fehlen. Dadurch kann die normale Entwicklung des Tieres gestört sein, so daß der
physiologische Zusammenhang zerstört ist. Oder das Tier ist nicht lebensfähig ab einem vom

Literaturübersicht 32
Gen abhängigen Entwicklungszeitpunkt. Deshalb wird versucht, die Entfernung des Genes auf
einen bestimmten Ort und einen bestimmten Entwicklungszeitpunkt zu begrenzen. Dazu muß
ein Genkonstrukt erzeugt werden, in welchem das zu untersuchende Gen von sog. „loxP“-
Sequenzen flankiert ist. Dieses Konstrukt muß über embryonale Stammzellen in das Tier
einkloniert werden. Dazu benötigt man einen zweiten transgenen Tierstamm, welcher Cre-
Rekombinase unter der Steuerung eines Gewebe- und/oder altersspezifischen Promotors
exprimieren kann. Bei der Kreuzung beider Stämme erhält man Tiere, welche sowohl loxP als
auch Cre-Rekombinase besitzen. Bei Aktivierung des Cre-Rekombinase-Gens durch den
Promotor wird die DNA anschließend an den beiden loxP-Stellen geschnitten und so das Gen
aus dem Genom entfernt (CHAMBERS 1994). Diese Mutantenerzeugung ist jedoch sehr
aufwendig und wenig effizient. Ein einfacherer Ansatz zum Ausschalten einzelner Gene ist
die Verabreichung von antisense-Oligonukleotiden. Dies hat den Vorteil, daß während
kritischer Phasen der Entwicklung das Peptid zur Verfügung steht, so daß die zelluläre
Umgebung eher dem physiologischen Zustand entspricht. Außerdem kann der Ort der
Wirkung durch Injektion genau bestimmt werden, ohne daß vorher Genkonstrukte erstellt
werden müssen, die eine zeitliche und örtliche down Regulation des Gens auslösen. Die
Antisense-Oligonukleotide binden die komplementäre mRNA und verhindern so die
Translation (NEUMANN et al. 1995).
Bei einer direkten Gabe hypertoner Salzlösung in den SON kommt es zu einer Zunahme lokal
sezernierten AVPs im SON und lateralen Septum und einer Korrelation mit sozialem
Wiedererkennen (LANDGRAF 1995), welche durch einen Rezeptorantagonist blockiert
werden konnte. Bei diesem Verhaltenstest werden Jungtiere wiederholt zu einem adulten Tier
in den Käfig gesetzt und die Zeit, die das ältere Tier für die Untersuchung des jüngeren
aufwendet, gemessen. Ist die Zeit bei den Wiederholungen verringert, deutet das auf einen
Wiedererkennungseffekt hin. Verhaltensregulation scheint also nicht nur in den
parvozellulären Neuronen des limbischen Systems gesteuert zu werden, sondern auch in den
klassischen Syntheseorten, den magnozellulären Neuronen im SON. Blockiert man die
Bildung des V1-Rezeptors im Septum durch Antisense-Oligonukleotide, so kann das
geförderte Sozialverhalten und die verminderte Angstreaktion durch Gabe von AVT icv
gehemmt werden. Damit wird klar, daß die AVP-Reaktion nicht über eine Kreuzreaktion mit

Literaturübersicht 33
dem OT-Rezeptor oder über den V2-Rezeptor vermittelt wird, sondern auf einer Stimulation
des V1-Rezeptors beruht.
Bei Wühlmäusen ist das reproduktionsbezogene Verhalten zwischen den einzelnen Arten
unterschiedlich. Während bei den Präriewühlmäusen beide Eltern Aufgaben in der Betreuung
der Neugeborenen übernehmen, nehmen männliche Wiesenwühlmäuse an dieser Aufgabe
nicht teil. Bei einer Untersuchung des AVP-Systems mittels IHC fiel ein Sexdimorphismus
bei beiden Arten auf im lateralen Septum und lateralen Nc. habenularis, welche beide eine
Projektion vom BnST erhalten. Bei Präriewühlmäusen kommt es bei männlichen Tieren bei
Einsatz der Pflegetätigkeiten an den Neugeborenen zu einer Reduktion der AVP-
immunoreaktiven Fasern, so daß sie mehr den weiblichen Tieren ähneln (BAMSHAD et al.
1993). Bei diesen traten keine Veränderungen auf. Die mRNA-Gehalt im BnST jedoch war
nach dem Zusammenführen von Männchen und Weibchen erhöht, so daß das Peptid scheinbar
sehr schnell freigesetzt wird (WANG et al. 1994a). Bei den Wiesenwühlmäusen dagegen war
die Faserdichte bei den Männchen im lateralen Septum nicht verändert, im Nc. habenularis
sogar noch erhöht (BAMSHAD et al. 1993). Bei den Präriewühlmäusen erhöhte auch eine icv
Injektion von AVP ins laterale Septum die Zeit, die männliche Tiere mit der
Kontaktaufnahme zu Neugeborenen verbringen. Dieser Effekt konnte über die Injektion eines
V1a-Rezeptorblockers verhindert werden, was nahe legt, daß dieser Rezeptor an der
Regulation der Verhaltensweisen beteiligt ist (WANG et al. 1994b).
Neben der Wühlmaus dient auch der stark territoriale Goldhamster als ideales Versuchtier zur
Untersuchung reproduktionsbezogener Verhaltensweisen. Zwar ist bei diesem Tier kein BnST
mit parvozellulären Neuronen identifiziert, aber ein AVP-Sexdimorphismus besteht im
Bereich des vorderen Hypothalamus, welcher in die Regulation des Markierungsverhaltens
involviert ist, und im Nc. preopticus medialis (MPO), wo auch bei der Wachtel
geschlechtsspezifische AVT-Genexpression vorhanden ist. Injiziert man AVP in den MPO,
steigert das die Frequenz des Absetzens von Markierungen in männlichen und weiblichen
Goldhamstern (FERRIS et al. 1984). Dieser Mechanismus ist über V1-Rezeptoren vermittelt
(FERRIS et al. 1988).

Literaturübersicht 34
2.6 Einflüsse auf die Nonapeptid-Konzentration in Plasma und ZNS
Beim Säugetier gibt es eine Funktionsteilung zwischen den beiden Hormonen AVP und OT.
AVP ist ein antidiuretisches Hormon und ist beteiligt an der Regulation des Wasser- und
Elektrolythaushaltes. Oxytocin löst Kontraktionen der Uterusmuskulatur aus und bedingt die
Milchejektion und ist somit an der Geburt und Aufzucht beteiligt (ACHER et al. 1970). Beim
Vogel hingegen hat AVT sowohl eine vasopressinerge wie oxytocinerge
Wirkungskomponente, d. h. es ist an der Regulation der Nierentätigkeit beteiligt und hat
zusätzlich Einfluß auf die Oviposition. Dagegen ist eine physiologische Funktion von
Mesotocin beim Vogel bisher nicht beschrieben (Abb. 2-5).
Mesotocin Vasotocin
?
Reproduktion Osmoregulation
Oxytocin Vasopressin
Abb. 2-5: Klassische physiologische Funktionen der neurohypophysären Hormone.
Die meisten bisherigen Untersuchungen beziehen sich auf den Einfluß von Blutdruck,
Blutvolumen oder Streß auf den AVT- und MT-Gehalt im Plasma. So löst eine
Immobilisation und Katheterisierung von Beuteltieren einen Anstieg der MT-

Literaturübersicht 35
Plasmakonzentration für 3 Tage aus (BATHGATE et al. 1990, 1995). Auch eine Anästhesie
kann bei Hühnern den MT-Wert erhöhen (BOTTJE et al. 1990), der dann innerhalb von 6
Stunden post OP wieder den Normalwert erreicht. Bei Fröschen scheint Immobilisation
keinen Einfluß auf MT im Plasma zu haben (NOUWEN u. KÜHN 1985).
Kälteeinfluß auf nicht adaptierte Echsen führte zu einer Anreicherung von MT und AVT in
der inneren Zone der Eminentia mediana (BONS 1983). Im ventralen PVN sind zunehmend
kleine Neurone zu finden. Wie bereits berichtet, konnte AVP bzw. AVT mit CRF in Neuronen
des hypothalamo-hypophysären Systems co-lokalisiert werden (MANCERA et al. 1991;
BARTANUSZ et al. 1993). Daher wird jetzt gezielt nach einem Zusammenspiel der Streß-
induzierten Hormone mit den Nonapeptiden geforscht. CRF war dabei überwiegend in
parvozellulären Neuronen des PVN lokalisiert. Aber auch in magnozellulären Neuronen war
AVT bzw. MT und CRF co-lokalisiert (MANCERA et al. 1991). Plasma-OT steigt nach einer
Immobilisierung von Ratten oder nach Zwangsschwimmen stark an, während der AVP-Gehalt
unverändert bleibt (LANG et al. 1983). Da CRF an der Vermittlung einer generellen „Streß-
Antwort“ beteiligt ist, scheint hier ein Zusammenhang zu bestehen. Injiziert man CRF in den
III. Ventrikel, kann ein Anstieg von Plasma-OT in dosisabhängiger Weise beobachtet werden
(HIGUCHI et al. 1990). Da diese Reaktion jedoch nicht mit Dexamethason geblockt werden
konnte, kann nicht freigesetztes Adrenocorticotrophin (ACTH) für diese Reaktion
verantwortlich sein, sondern die Regulation muß auf hypophysärem Niveau ablaufen, also
steuern CRF-Neurone im Hypothalamus die OT-Freisetzung. Umgekehrt übt OT ein
negatives Feedback aus auf die Hypothalamo-Adenohypophysen-Nebennieren-Achse
(NEUMANN et al. 2000).
Einfacher Immobilisationsstreß oder Zwangsschwimmen konnte keinen Plasmaanstieg von
AVP auslösen. Trotzdem ist auch parvozelluläres AVP in den Kreislauf der Streß-Antwort
eingebunden. Eine Kombination aus physischem und emotionalem Streß gleichzeitig erhöht
selektiv die Menge an intracerebral freigesetztem AVP (ENGELMANN et al. 2000). Auch in
diesem Regelkreis zeigt sich, daß ein fehlender Anstieg des Plasmaspiegels nicht
gleichzusetzen ist mit Wirkungslosigkeit. Vielmehr ist beim AVP-System zu beobachten, daß
die Neuropeptid-Freisetzung von Dendriten bzw. Soma und Synapsen getrennt reguliert wird
(WOTJAK et al. 1998). Auch Immobilisation als Streßauslöser kann im Gehirn eine lokale

Literaturübersicht 36
AVP-Freisetzung aus parvozellulären Neuronen bewirken (BARTANUSZ et al. 1993). Diese
wird über ein negatives Feedback durch Glukokortikoide reguliert (HERMAN 1995).
Katecholamine hingegen scheinen keinen Einfluß auf die streßbedingte Freisetzung von AVT
und MT zu haben (ROBINZON et al. 1991). Abb. 2-6 gibt einen Überblick über die
Hypothalamus-Adenohypophysen-Nebennieren-Achse und die Beteiligung von AVP und OT.
Abb. 2-6: Einbindung von AVP und OT in die Streßregulation.
Die Untersuchungen zum Einfluß von Blutdruck und Blutvolumen auf die AVT- und MT-
Konzentrationen im Plasma zeigen z. T. sehr unterschiedliche Ergebnisse. In der Tendenz
deutet sich ein Abfall der MT-Plasmakonzentration bei Hyperosmolalität und ein Anstieg bei
Hypoosmolalität des Plasmas an, jedoch schwanken die Ergebnisse je nach Tierart oder
verwendeter Nachweismethode. Bei hyperosmolalem Plasma ist bei Beuteltieren mittels RIA
ein Anstieg des Plasma-MT zu verzeichnen (BATHGATE u. SERNIA 1995). Den gleichen

Literaturübersicht 37
Effekt kann man auch immunhistologisch bei Vögeln beobachten (BLÄHSER 1982).
Dagegen fällt MT im Plasma bei steigender Osmolalität beim Huhn im RIA (BOTTJE et al.
1990), bei sinkendem Ionendruck dagegen nimmt es zu. Die Reaktion von MT auf die
Osmolalität kann dosis-abhängig sein (KOIKE et al. 1985). Bei Infusion von 0,1 M NaCl
(schwach hyperton) über 30 min stieg der MT-Gehalt, bei Infusion von 1M NaCl fiel er.
SHIMADA et al. (1991) dagegen fanden bei Infusion von 0,1 M NaCl bei Legehühnern
keinen Einfluß, aber einen Abfall bei 1 M NaCl. NOUWEN u. KÜHN (1982) schließlich
zeigten einen MT-Abfall bei Infusion von 0,1 M (6 %) NaCl-Lösung beim Frosch. Tabelle 3
faßt diese Ergebnisse zusammen.
Tierart Behandlung ApplikaNachweis- AVP/AVT MT/OT Literatur
tionsartmethode Opossum 2,5M NaCl, iv RIA (
BATHGATE u.
2h
Huhn Blutentzug
ca. 10%
Huhn 0,1M & 1 M
NaCl, 30 min
Huhn 0,1M NaCl,
30 min
intra-
arteriell
SERNIA 1995
RIA ( BOTTJE et al.
iv RIA
1990
KOIKE et al. 1985
iv RIA = = SHIMADA et al.
1991
Frosch 0,1M NaCl ? HPLC NOUWEN u.
Frosch 50%
Blutentzug
Frosch 50-60%
Blutentzug
Huhn 1M NaCl,
30 min
KÜHN 1982
? HPLC - NOUWEN u.
KÜHN 1982
? RIA NOUWEN u.
KÜHN 1985
iv RIA KOIKE et al. 1985,
SHIMADA et al.
1991
Tabelle 3: Wirkungen verschiedener Infusion auf den Plasma-Gehalt von neurohypophysären Hormonen.

Literaturübersicht 38
Diese widersprüchlichen Ergebnisse sind einerseits zu begründen mit den verschiedenen
Tierarten, andererseits mit unterschiedlichen Nachweismethoden. Selbst wenn mehrere
Arbeiten sich auf einen RIA berufen, so ist doch bei jeder Arbeitsgruppe ein anderer
Antikörper verwendet worden, was durchaus zu unterschiedlichen Ergebnissen führt.
Unterschiedliche Tierrassen und –arten und unterschiedliche Altersstufen können auch die
Ergebnisse beeinflussen. In der Mehrzahl der Fälle scheint MT eher ein diuretisch wirksames
Hormon zu sein, dessen Plasmakonzentration sich bei osmotischem Streß mit ansteigender
Osmolalität verringert.
Die Reaktion auf osmotische Stimuli wird vornehmlich durch magnozelluläre Neurone in
SON und PVN vermittelt. Die mRNA-Synthese nimmt zu (SAITO u. GROSSMANN 1998).
Dehydrierung verändert aber nicht nur die Menge, sondern auch die Länge der mRNA. Bei
der Ratte nimmt die Länge des Poly(A)-Schwanzes von AVP mRNA von ca. 250 bp auf ca.
400 bp zu (CARRAZANA et al. 1988). Diese Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes ist eine
akute Reaktion auf den osmotischen Stimulus (CARTER u. MURPHY 1991) und wird
unabhängig von der gesteigerten mRNA-Bildung gesteuert (CARTER u. MURPHY 1989b).
Da die Adenylierung der mRNA diese stabilisiert und vor schneller Degradierung schützt
(BREWER u. ROSS 1988), sowie die Translation fördert (PALATNIK et al. 1984), hilft diese
Reaktion, den Zeitverzug zwischen dem Stimulus und der vermehrten Peptid-Synthese zu
überbrücken. Während die Antwort auf die Dehydratation hauptsächlich ein transkriptionelles
Ereignis ist, hat die Kastration von Ratten in den Neuronen des BnST post-transkriptionell
Einfluß auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes (CARTER u. MURPHY 1993). Auch das Alter
kann die Länge des Poly(A)-Schwanzes beeinflussen (FEHR et al. 1989), so daß bei adulten
Tieren der Poly(A)-Schwanz länger ist als bei Embryonen.
Neben der Dehydrierung gibt es noch verschiedene andere physiologische Situationen, in
denen der Grad der Adenylierung variabel ist. Aber auch parvozelluläre Neurone sind an der
Antwort auf osmotische Stimuli beteiligt. Ihre Aktivierung wird aber über andere Schaltkreise
reguliert. In diesen Zellen ist fast kein Peptid, sondern nur mRNA zu detektieren. Ob das an
einer verminderten Translation oder einem schnelleren Transport des Peptids liegt, ist nicht
geklärt. Die Zahl der Neurone wird durch den osmotischen Stimulus erhöht und bleibt auch
größer als vor dem Stimulus. In den magnozellulären Neuronen ist Peptid detektierbar, aber

Literaturübersicht 39
unter Stimulation nimmt es ab. Die erhöhte Zahl exprimierender Neurone in dehydrierten
Tieren nimmt nach Rehydratation wieder ab (AMAYA et al. 1999). Das System reagiert
damit auf die veränderten Plasmaverhältnisse und ist sehr flexibel. Offensichtlich können
unter osmotischem Streß zusätzlich Neurone zur Hormonsynthese rekrutiert werden, welche
bei Rückkehr zur normalen Plasmaosmolalität wieder ausgeschaltet werden.
Dieser Anstieg der Neuropeptide im Plasma scheint über Opioide modulierbar zu sein. Die
Gabe von Naloxon, einem Antagonisten, erhöht die Plasmaspiegel von AVT (XU et al. 1991)
und MT bei Küken nach Injektion hyperosmolarer Salzlösung. Der Effekt beim Vogel wird
über den µ-Rezeptor vermittelt, da DAMGO, ein selektiver Blocker dieses Rezeptors, diese
Antwort verhindern kann (SAITO et al. 1999). Endogene Opioide können die hypothalamo-
neurohypophysäre Achse so hemmen und als Gegenspieler bei osmotischer Stimulation
wirken. Auch beim Säugetier sind Dynorphin und Neo-Endorphine als endogene Opioide an
der Reaktion auf osmotische Stimuli beteiligt. Sie sind in der Neurohypophyse mit AVP co-
lokalisiert und werden zusammen mit dem Nonapeptid freigesetzt (HÖLLT et al. 1981;
LORENZ et al. 1985; ZAMIR et al. 1985). Systemisch und zentral üben Opioide einen
hemmenden Effekt auf die Freisetzung von AVP und OT aus. Die beteiligten Rezeptortypen
- und µ-Rezeptoren (VAN DE HEIJNING 1991). Die Aktivierung der Rezeptoren führt
zu einer verminderten Freisetzung von OT und damit zu einer bevorzugten Freisetzung von
AVP im Falle der osmotischen Stimulation. Dynorphin, welches zusammen mit AVP
-Rezeptoren der OT-haltigen Neurone in der Neurohypophyse
binden und so in einer parakrinen Wirkungsweise die Freisetzung von AVP fördern.
Hypovolämie hat bei Beuteltieren einen stimulierenden Einfluß auf die MT-Sekretion
(BATHGATE u. SERNIA 1995). Bei mehr als 50 % Blutverlust ist auch beim Huhn ein
solcher Einfluß nachweisbar (BOTTJE et al. 1989). MT verhielt sich hier proportional zur
Nierendurchblutung. Jedoch ist die physiologische Relevanz dieser Ergebnisse fraglich, da bei
50 % Blutverlust viele physiologische Regelmechanismen außer Kraft gesetzt sind. Bei
ähnlich starkem Blutverlust gilt dies auch für den Frosch (NOUWEN u. KÜHN 1985). Bei
geringerem Blutverlust aber bleibt der MT-Gehalt unverändert (NOUWEN u. KÜHN 1982).
Zahlreiche Versuche zur Dehydrierung von Tieren zeigen ebenfalls unterschiedliche Effekte.
Vier Tage Wasserentzug bei 5 Monate alten Hähnen der Rasse Weiße Leghorn bewirkt nur

Literaturübersicht 40
ein MT-Anstieg im vorderen Hypothalamus, während die Werte im Plasma, in der
Neurohypophyse und im Proventrikulus unverändert sind (ROBINZON et al. 1990a). AVT
hingegen steigt im Plasma zu Beginn stark an, fällt aber nach 3 Tagen wieder um ca. 25 % ab.
In der Neurohypophyse nimmt AVT stark ab. Der Translationsapparat der Zelle scheint die
vermehrte Freisetzung nicht so schnell ausgleichen zu können. Im Plasma kann keine
Korrelation gefunden werden zwischen AVT und Osmolalität, eine negative Korrelation
besteht jedoch zwischen Osmolalität und neurohypophysären AVT-Gehalt. Diese mangelnde
Korrelation zwischen Plasma-AVT und Osmolalität ist begründet in der Plateauphase und
dem anschließenden Abfall von Plasma-AVT im Verhältnis zu einer zunehmenden
Osmolalität während der gesamten Versuchsdauer. Inwieweit aber solche Werte aber eine
physiologische Relevanz haben, bleibt fraglich. Vier Tage Wasserentzug sind in dieser
Hinsicht eher kritisch zu bewerten. In adulten Rhode-Island Hühnern führt 4 Tage dauernde
Dehydrierung zu einem Anstieg an Plasma-AVT und -MT (NOUWEN et al. 1984). Während
MT über die gesamte Dauer der Dehydrierung erhöht bleibt, erreicht der AVT-Gehalt nach 3
Tagen auch bei anhaltender Dehydrierung wieder die Konzentration der Kontrolltiere. MT
kann durch Rehydrierung im Plasma wieder auf die Ausgangswerte gebracht werden. Hier
sieht es so aus, daß MT durchaus eine antidiuretische Wirkung parallel zu AVT haben kann.
Der Effekt der Dehydrierung auf den Plasma-AVT-Gehalt kann ab ca. 8 h nach Einsetzen des
Stimulus beobachtet werden und wird begleitet von einem Anstieg der hypophysären mRNA
(SAITO u. GROSSMANN 1998).
Bei Injektion von Norepinephrin in den III. Ventrikel zeigen MT und AVT im Plasma keine
Veränderung; wird dagegen Serotonin in den vorderen Bereich des Ventrikels injiziert, so
steigt MT sofort an, bei Injektion in den hinteren Ventrikelbereich erst nach 60-120 min
(ROBINZON et al. 1991). AVT im Plasma läßt sich nur durch eine Serotonin-Injektion in den
hinteren Teil des III. Ventrikels erhöhen. Diese Reaktion tritt aber erst zwei Stunden nach der
Injektion auf, was scheinbar das Ergebnis der Diffusion des Serotonin in den vorderen
Bereich des III. Ventrikels ist. Die Wirkung kann aber auch im hinteren Bereich des III.
Ventrikels über Zwischenschritte vermittelt werden, welche diese Verzögerung begründen
können.

Literaturübersicht 41
2.7 Funktionen von neurohypophysären Hormonen in der Niere und im
kardiovaskulären System
Nachdem bisher keine physiologischen Bedingungen identifiziert werden konnten, unter
denen MT mit zentraler oder peripherer Zu- oder Abnahme reagiert, ist ein zweiter Ansatz auf
der Suche nach einer Funktion die Verabreichung von AVT und MT und die Kontrolle
diverser Körperfunktionen als Reaktion darauf. Im Zentrum der Beobachtungen stehen dabei
Niere und Reproduktionsorgane, in Homologie zu den Neuropeptid-Funktionen im Säugetier.
Bei Amphibien (Ochsenfrosch) scheint die Wirkung von MT iv auf die Niere dosisabhängig
zu sein. Bei Infusion von 500-1000 ng/kg tritt im Ochsenfrosch zunächst eine Antidiurese auf,
die von einer diuretischen Wirkung gefolgt wird (CASALS et al. 1974). Dabei ist die GFR
erhöht, die Gefäße sind dilatiert. Ähnlich ist der Effekt, wenn MT zusammen mit AVT
verabreicht wird. Die zunächst eintretende antidiuretische Wirkung von AVT wird von MT
aufgehoben. Eine sofortige diuretische oder keine Wirkung von MT beim Salamander tritt auf
bei Infusion von rund der 5- bzw. 10-fachen Menge, also 5 µg/kg, abhängig vom Lebensraum
der Amphibien und ihrem phylogenetischen Status (HARTENSTEIN u. STIFFLER 1981).
Auch bei Amphibien (Chilenische Kröte, Furchenmolch, Ochsenfrosch) ist die physiologische
Reaktion dosisabhängig: bei Infusion von 1/10 – 1/2 der beim Ochsenfrosch verwendeten
Dosis (50 - 250 ng/kg) erfolgt die Diurese je nach infundierter Dosis, ab 500 ng/kg läßt dieser
Effekt nach (PANG u. SAWYER 1976; GALLI - GALLARDO et al. 1979). Die Infusion von
5 µg/kg MT kann die GFR und den Urinfluß wieder auf physiologische Werte bringen, wenn
sie zuvor durch Hypophysektomie abgefallen waren (Tigersalamander, Wassermolch
(HARTENSTEIN u. STIFFLER 1990). MT hat aber keinen Einfluß auf die verminderten
Plasmakonzentrationen von Natrium und Kalium. Dafür steigt der Urin-Natriumgehalt. Dieser
Effekt war bei Kontrolltieren nicht nachweisbar (STIFFLER 1981). Bereits 100 µg/kg MT
können beim Ochsenfrosch eine Vasodilatation bedingen (STIFFLER et al. 1984), wobei
Glutaminsäure an der Position 4 in MT wirksamer war als Serin an gleicher Stelle in Isotocin.
Es scheint deutlich, daß MT in Amphibien eine diuretische Wirkung hat. Bei diesem
Tierstamm ist eine gute diuretische Regulation durchaus sinnvoll, da sie an verschiedene
Lebensräume angepaßt sein müssen. Einige Entwicklungsstadien leben im Wasser, und eine

Literaturübersicht 42
funktionierende Wasserausscheidung ist somit zwingend. Ob sich aber diese Funktion in
anderen Stämmen wie Reptilien und Vögeln erhalten hat, läßt sich aus diesen Studien nicht
ableiten.
Bei Hähnen erzeugt eine MT-Infusion von 2 µg/kg (2 nmol/kg) eine kurze Vasodilatation, die
bei mehrfacher Versuchswiederholung immer geringer wurde (ROBINZON et al. 1994).
Dafür kommt es nach wiederholter Injektion von MT zu einer leichten Vasokonstriktion.
Auch AVT löst kurzfristig eine Vasodilatation aus, bevor der eigentliche vasopressorische
Effekt des Hormons einsetzt. Beide Antworten (AVT und MT) schwächen sich bei
wiederholter Gabe ab. Durch die Gabe eines OT-Rezeptor-Antagonisten kann jegliche
vasodilatatorische Reaktion unterbunden werden, ein V1-Rezeptor-Antagonist dagegen war
ohne Wirkung. Das kann aber auch an molekularen Unterschieden von AVP- und AVT-V1-
Rezeptor liegen, so daß der Antagonist den AVT-Rezeptor nicht blockieren kann.
Bei Infusion von 10 mU = 17,6 ng/kg/min MT ist eine verstärkte Atmung bei Hähnen
auffällig gewesen (ROBINZON et al. 1988a). Auch die Körpertemperatur wird beeinflußt.
Bereits ab 1 mU = 1,76 ng/kg/min sank die Schenkel- und Kamm-Temperatur, was auf einen
schlechten Blutfluß vom Kern in die Peripherie hindeutet, z. B. durch zentrale Vasodilatation.
0,1 mU MT = 176 pg und 1 mU = 1,76 ng/kg/min können den Aldosteron-Gehalt im Plasma
absenken, 10 mU = 17,6 ng/kg/min steigern den von AVT (ROBINZON et al. 1988a ). AVT–
Infusionen haben den gleichen Effekt auf Kamm- und Schenkeltemperatur (ab 1 mU = 5,24
ng/min/kg). Die Korrelation zum Plasma-MT ist negativ (0,1 bzw. 1 mU). Plasma-Prolaktin
wird durch 1 mU AVT erhöht, Plasma-Aldosteron durch 10 mU AVT erniedrigt (ROBINZON
et al. 1988a ). AVT und MT können sich gegenseitig beeinflussen. Die verminderte Kamm-
und Schenkeltemperatur deutet auf eine schlechte Durchblutung der Peripherie hin, ein
Mechanismus, der an der Thermoregulation beteiligt sein kann.

Literaturübersicht 43
2.8 Arginin-Vasotocin, Mesotocin und Reproduktion
Beim Säugetier hat OT eine uterotonische Wirkung. Daher wäre anzunehmen, daß MT eine
ähnliche Funktion bei niederen Tieren übernimmt. Allerdings stellen Säugetiere auch eine
Besonderheit hinsichtlich ihrer Reproduktion im Tierreich dar. Bei keinem anderen Stamm
gibt es diese Form der plazentaren Entwicklung. Daher ist es schwierig, bei anderen Stämmen
anatomische und funktionelle Übereinstimmungen zu finden, die wirklich einem Säugetier-
Uterus entsprechen. Beim Huhn wird der Vorgang der Eiablage oft mit der Geburt bei
Säugern gleichgesetzt. Daher wurde hier zuerst nach einer Wirkung von MT geforscht.
Entgegen den Erwartungen bleiben die Plasmakonzentrationen von MT vor, während und
nach der Eiablage jedoch unverändert. Stattdessen kommt es unmittelbar vor und während der
Eiablage beim Vogel zu einer 5 - 7fachen Zunahme des Plasma-AVT (NOUWEN et al. 1984;
KOIKE et al. 1988). Die Erhöhung kann auch noch nach der Oviposition für kurze Zeit
bestehen bleiben. Dabei handelt es sich wahrscheinlich um die Zeitverzögerung des Feedback-
Mechanismus, der die Hormonsynthese und –Freisetzung steuert. Auch in Bioassays hat AVT
eine deutlich größere uterotonische Potenz als MT (SAWYER 1977; KOIKE et al. 1988).
Zumindest eine systemische Wirkung von MT in der Regulation der Oviposition beim Vogel
erscheint damit unwahrscheinlich. Damit rücken lokale Wirkmechanismen an den
Reproduktionsorganen oder zentral im Gehirn in den Vordergrund. Tatsächlich läßt sich MT
in peripheren Organen lokalisieren. OT kann in den Ovarien verschiedener Säuger
nachgewiesen werden, darunter Schaf und Rind (WATHES et al. 1982, 1984). Dabei ist der
OT-Gehalt deutlich größer als der von AVP. Große Mengen (ca. 2 ng/Gewebe) AVT können
in Theca- und Granulosazellen des Huhnes von Legehennen nachgewiesen werden (SAITO et
al. 1990). Dabei ist zwischen Oviposition und AVT-Gehalt in den Thecazellen der Bezug
herzustellen, daß der lokale Peptidgehalt kurz vor der Oviposition abnimmt. Der MT-Gehalt
in diesen Zellen liegt um ca. eine Potenz niedriger als die von AVT und ist um die Ovulation
herum in F1-Follikeln deutlich erhöht. In Lutealzellen kann beim nicht-tragenden Rind nur
OT, nicht aber AVP nachgewiesen werden (GULDENAAR et al. 1984). Die OT-
Konzentration nimmt unter Einwirkung von Prostaglandin beim Schaf in vivo zu (FLINT u.
SHELDRICK 1982). Das die Involution des Gelbkörpers mit steigender Menge OT mRNA

Literaturübersicht 44
einhergeht, untersuchten auch WATHES u. DENNING-KENDALL (1992), wobei die direkte
Stimulation der Genexpression nur während der Ovulation stattfindet (FEHR et al. 1987). Wie
genau dann die Lutealphase die erneute Genexpression steuert, ist unklar. Dagegen hat OT bei
Weißpinseläffchen (Callithrix jacchus) in vitro luteotrophe Wirkung (EINSPANIER et al.
1997b). Es fördert die Progesteron-Bildung in Granulosazellen von präovulatorischen
Follikeln.
Viele Untersuchungen liegen zum Einfluß von MT bei Beuteltieren vor. Bei diesen Tieren
gibt es eine Plazenta, und gleichzeitig besitzen sie oft MT bzw. MT und OT zusammen. MT
hat, mit HPLC und RIA gemessen, keinen Einfluß auf Progesteron-Konzentration, Geburt,
Paarung oder Zusammensetzung des Vaginalschleims bei Beuteltieren (CURLEWIS et al.
1988). Es konnte mit Immuncytochemie, RIA und HPLC im Corpus luteum festgestellt
werden (SERNIA et al. 1994; GEMMELL 1995). Der Gehalt ist jedoch sehr gering mit
8,7 pg/g Gewebe (8,7 pmol/g), so daß nur eine lokale Wirkung, evtl. auf die Luteolyse,
wahrscheinlich ist. Das MT aus der Hypophyse wäre demnach nicht zur Luteolyse notwendig
(SERNIA et al. 1994).
Bei hypophysektomierten Beuteltieren tritt nach normaler Trächtigkeit keine Geburt ein
(PARRY et al. 1996). Bei Infusion eines OT-Rezeptor-Antagonisten verzögert sich die
Geburt, und auch die Prostaglandin-Kaskade ist verzögert (RENFREE et al. 1996). Bei
Känguruhs (Wallaby: Macropus eugenii) kann unmittelbar nach der Geburt ein MT-Anstieg
im Plasma festgestellt werden, welcher 15 min dauert, bevor innerhalb von 2 Stunden wieder
die Ausgangskonzentration erreicht wird (PARRY et al. 1996). Vorher ist eine Zunahme an
MT-Rezeptoren ab E23 im trächtigen Horn des Uterus bipartus feststellbar, während er im
nicht-trächtigen Horn zunächst gleich bleibt und 3 Tage vor der Geburt sogar abfällt. Die
Trächtigkeit dauert 26 – 27 Tage. Die Rezeptor-Konzentrationen in der Vagina sind nur
gering (PARRY et al. 1997). Damit ist die Rezeptor-Konzentration innerhalb eines Organs
ganz unterschiedlich verteilt. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf lokale und nicht systemische
Einflüsse.
Bei männlichen Känguruhs konnte MT nicht im Hoden, wohl aber in der Prostata
nachgewiesen werden (GEMMELL u. SERNIA 1989), was evtl. den Sperma-Transport im
weiblichen Tier beeinflussen kann. Allerdings gibt es keine Untersuchungen, ob das in der

Literaturübersicht 45
Prostata gebildete MT überhaupt in die Sperma-Flüssigkeit übertritt. Die verbesserte
Spermien-Beweglichkeit ist daher nur eine Theorie.
Bei Hühnern sind nur wenige Ergebnisse verfügbar. Das MT-Maximum im Follikel tritt
unmittelbar bei der Oviposition auf (SAITO et al. 1988), während der AVT-Gehalt 5 Stunden
danach am höchsten ist (SAITO et al. 1990). Hypophysäres AVT scheint ebenfalls an der
Oviposition beteiligt zu sein, da der AVT-Plasma-Gehalt langsam ansteigt, während der
Gehalt in der Hypopyhse abnimmt. Im Follikel findet man MT in Thecazellen (100-300 pg/mg
Protein) und auch in Granulosazellen (40-100 pg/mg Protein). Der MT-Gehalt im größten
präovulatorischen Follikel (F1) nimmt unmittelbar nach der Oviposition zu, wobei unklar ist, ob
es sich um eine lokale Produktion handelt, oder ob es eine Aufnahme aus dem Blut ist (SAITO
et al. 1990). Die Uterus-Sensibilität für AVT ist am größten unmittelbar nach der Oviposition,
jedoch ist das Myometrium immer wesentlich empfindlicher für AVT als für MT (SAITO u.
KOIKE 1992). Da diese gesteigerte Sensitivität aber auch bei einer mit PGE2 induzierten
Eiablage vorkommt, scheint es sich eher um eine Reaktion auf die Kontraktionen der
Uteruswand und weniger um einen Einfluß der Hormone zu handeln.
2.9 Arginin-Vasotocin- und Mesotocin-Rezeptoren
Nonapeptid-Rezeptoren für AVP / AVT und OT / MT gehören in die Klasse der G-Protein
gekoppelten Rezeptoren (ZINGG 1996). Es handelt sich um hochmolekulare Rezeptoren mit
7 transmembranen Einheiten. Die Wirkung wird über second messenger vermittelt, welche je
nach Rezeptorsubtyp unterschiedlich sein können. Vom Vasopressin-Rezeptor sind bisher 3
Subklassen identifiziert worden: V1, V2 und zuletzt V3 (DE KEYZER et al. 1994). Second
messenger sind für V1 Phosphoinositol (PI), für V2 cAMP und für V3 Phospholipase C. Bei
den V1-Rezeptoren gibt es noch zwei Subtypen: V1a und V1b. V1a kommt ubiquitär vor,
V1b in der Hypophyse, V2 in der Niere, V3 in Hypophyse und Niere. OT-Rezeptoren sind
wie V1 Phosphoinositol-gekoppelt und sind hauptsächlich im Myometrium, Milchdrüse und
im ZNS lokalisiert. Außerdem sind sie vorhanden in Hypophyse, Niere, Thymus, Ovar und

Literaturübersicht 46
Hoden. Während über die Rezeptoren beim Säuger schon relativ viele Daten vorliegen, sind
die Ergebnisse zum Vorkommen und zur Funktion in anderen Vertebraten begrenzt.
Bei der Kröte konnten MT-Rezeptoren in Harnblase, Niere, Muskel und Gehirn nachgewiesen
werden (AKHUNDOVA et al. 1996), was auf eine Funktion bei Wasser- und Salztransport
hindeutet. Bei Injektion von MT waren verstärkte Cl-Ströme feststellbar, so daß eine
Beteiligung von Inositolphosphat und Kalzium wahrscheinlich ist. Der Effekt ließ sich durch
Gabe eines OT-Antagonisten hemmen, jedoch nicht durch einen VP-Antagonisten.
Bei Hühnern gibt es bisher wenige Informationen über das Vorkommen von MT- Rezeptoren.
Mittels Bindungsstudien mit J 125 -markiertem MT wurden Bindungsstellen nachgewiesen
besonders in der Niere (TAKAHASHI et al. 1996; 1997a), aber auch im Reproduktionstrakt
(TAKAHASHI et al. 1993). In der Niere waren die Bindungsstellen besonders in der Medulla
lokalisiert.
AVT-Rezeptoren konnten in der Schalendrüse, einem Legedarmabschnitt des Huhnes, der
dem Uterus beim Säugetier homolog ist, mittels Bindungsstudien identifiziert werden
(TAKAHASHI et al. 1992). Bei allen Tieren konnte ein 67 kDa großes Protein MT und AVT
binden. Jedoch war die Affinität für AVT deutlich größer als für MT. Bei Legehennen war
unmittelbar vor und während der Oviposition ein zweites Protein nachzuweisen von 95 kDa
Größe (TAKAHASHI et al. 1997b). Bindungsaffinität und -kapazität änderten sich in
Abhängigkeit von Eiablagezyklus (TAKAHASHI et al. 1998). Die maximale
Bindungskapazität ist bei nicht-legenden Tieren größer als bei legenden (0,81 ± 0,01 pmol/mg
Protein bzw. 0,41 pmol/mg Protein), schwankte bei Legehennen aber um die Eiablage herum
und stieg 6 h nach der Oviposition an, also kurz nach Eintritt des neuen Eies in den Uterus.
Kürzlich gelang auch der Nachweis von mRNA für einen V1-Rezeptor in der Schalendrüse
(TAN et al. 2000). Die Bindungsaffinität für AVT war größer als für MT (AVT/AVP >
OT/MT > IT). Der Rezeptor ist außerdem im Gehirn nachweisbar. Bei Zugabe von AVT auf
transfizierten COS7-Zellkulturen kommt es zu einem Anstieg an Inositolphosphat und [Ca 2+ ]
intrazellulär. Damit ähnelt dieser Rezeptor dem V1-Rezeptor der Säugetiere. Durch die
Identifikation eines entsprechenden Rezeptors im Uterus des Huhnes, wenn man diese
anatomische Homologie so ziehen kann, scheint klar, daß beim Huhn AVT wirklich das

Literaturübersicht 47
uterotonische Hormon ist und keine Wechselwirkung zwischen dem AVT- und MT-System
die Oviposition auslöst.

Fragestellung 48
3 Fragestellung
Aus den dargestellten Daten ergibt sich, daß bisher für Mesotocin nur spärliche Informationen
über eine physiologische Funktion vorliegen. Es erscheint möglich, daß es eine Zwischenstufe
darstellt vom diuretischen Hormon der Amphibien zum uterotonischen Hormon OT beim
Säuger. Die bisherigen Untersuchungen basieren auf Antikörper-Techniken, deren Spezifität
sehr stark vom jeweils eingesetzten Antikörper abhängt und damit zwischen verschiedenen
Arbeitsgruppen, verschiedenen Vogelarten und Hühnerrassen variiert. Die Mehrzahl der
Daten über MT wurde nicht in Hühnern oder anderen Vögeln erhoben und sind daher nicht
zwangsläufig wirklich übertragbar. Neben den systemischen Wirkungen können AVT, MT,
AVP und OT auch lokal, z. B. als Neuropeptide wirken. Daher sind nicht nur Plasmaspiegel
aussagekräftig, sondern es muß auch die lokale Bildung der Nonapeptide untersucht werden,
um eine Aussage über eine physiologische Funktion treffen zu können.
Folgende Fragestellungen ergeben sich aus dem bisher Dargestellten:
1.) Sind die Gensonden für MT und AVT spezifisch, so daß die Genexpression beider
Gene getrennt untersucht werden kann?
2.) Wie verläuft die Genexpression während der Ontogenese, da zu bestimmten
Entwicklungsstufen unterschiedliche Ansprüche an die körpereigene
Hormonregulation gestellt werden?
3.) Wie verhalten sich AVT- und MT-Genexpression zueinander, sind sie getrennt
reguliert? Oder werden sie durch die gleichen physiologischen Stimuli aktiviert?
4.) Gibt es eine extrahypothalamische Genexpression von MT beim Huhn?
5.) Hat Dehydratation einen Einfluß auf die MT-Genexpression?
Die eingesetzten Verfahren sind Northern und Southern Blot, ISH, IHC und RT-PCR.

Material & Methoden 49
4 Material
4.1 Tiere und Gewebe
Für die Versuche wurden Tiere der Hybrid-Linien Lohmann Selected White Leghorn (LSL)
und Lohmann Brown (LB) verwendet. Die Tiere wurden nach dem Schlupf teilweise nach
Geschlechtern getrennt, z. T. aber auch in gemischten Gruppen gehalten, bevor sie im Alter
von 16 bis 18 Wochen getrennt aufgestallt wurden. Die Hennen kamen in Einzelkäfige, die
Hähne in Gruppen von ca. 6 Tieren in Bodenhaltung. Alle Tiere erhielten Standardfutter und
Wasser ad libitum. Der Licht-/Dunkelzyklus war aufgeteilt in 14 h Licht, 10 h Dunkelphase.
Die Embryonen wurden in einem handelsübliche Brüter 1 ausgebrütet. Zur Gewinnung der
Gewebe wurden die Tiere in Gruppen bis max. 6 Tiere gleichzeitig aus dem Stall in einen
Schlachtraum gebracht und nacheinander mit einem Schlag auf den Kopf betäubt. Unmittelbar
nach dem Entbluten wurden die entsprechenden Gewebe so schnell wie möglich entnommen
und auf Trockeneis gefroren. Zur Gewinnung des Hypothalamus wurde das Gesamtgehirn erst
auf einen Block mit Trockeneis gefroren, bevor bei noch schnittfähigem Zustand der
Hypothalamus herausgeschnitten wurde. Zur Orientierung dienten dabei die folgenden
Gehirnstrukturen: rostral der Tractus septomesocephalicus (TSM), dorsal die vordere
Komissur (CA), caudal der XI. Gehirnnerv.
Anschließend wurden die Proben in Parafilm 2 eingewickelt, in Aluminiumfolie verpackt und
bei -70 °C gelagert (max. für 1 Jahr). Bei Tieren, bei denen das Geschlecht adspektorisch
nicht eindeutig zu ermitteln war, wurde die Bauchhöhle eröffnet und aus dem
Größenvergleich der Gonaden auf das Geschlecht zurückgeschlossen.
4.2 Pufferlösungen
Angaben über die verwendeten Puffer sind im Anhang aufgelistet.
1 Kleinbrüter, TE_1; WERNER SCHUHMACHER, Grünberg
2 Parafilm; AMERICAN NATIONAL CAN, Neenah,Wi, USA

Material & Methoden 50
4.3 Plasmide
Folgende Plasmide wurden für die Versuche eingesetzt: pBKS AVT3', pGEM MT und
pGEM T MTR wurden freundlicherweise von Prof. Richard Ivell und Ross Bathgate, Institut
für Hormon- und Fortpflanzungsforschung der Universität Hamburg, zur Verfügung gestellt.
Abb. 4-1 zeigt die Position der Sonden von AVT und MT in der mRNA.
Vasotocin
Mesotocin
5‘
5‘
Ex o n 1 Exon 2 Exo n 3
Vasotocin AAAAAA
Exon 1 Exo n 2 Ex o n 3
Mesotocin AAAAAA
Signalpeptid
Nonapeptid
Neurophysin
Glycopeptid
3‘
Sonde (2 7 0 bp)
3‘
Sonde (184 bp)
Gly-Lys-Arg
Abb. 4-1: Position der Sonden von AVT und MT innerhalb der mRNA anhand der Gen- und Peptidstruktur
4.4 Enzyme, Chemikalien, Radiochemikalien, Nährmedien, Nährlösungen
Angaben zu den verwendeten Enzymen, Chemikalien, Radiochemikalien, Nährmedien und
Nährlösungen finden sich im Anhang der Arbeit.

Material & Methoden 51
4.5 Geräte
Die eingesetzten Geräte werden im Rahmen der Methodenbeschreibung angeführt.
5 Methoden
5.1 Kultivierung der Sonden-DNA in Bakterien
Die Sonden-DNA wird in Form des Plasmid-Vektors Blueskript in Bakterien des Stammes E.
coli JM 107 vermehrt.
5.1.1 Herstellung kompetenter Zellen
Bei der Herstellung kompetenter Zellen werden die Bakterien auf die Aufnahme des Plasmids
mit der Sonde vorbereitet. Das Prinzip besteht in der Anlagerung von CaCl2 an Zellwände bei
niedrigen Temperaturen (AUSUBEL et al. 1992). Die zu übertragende DNA kann daran
binden. In Folge eines Hitzeschocks wird die Zellmembran durchlässig und nimmt die DNA
somit auf. Bei der anschließenden Kühlung stabilisiert sich die Zellwand wieder.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
100 µl Bakterienkultur werden in 60 ml 2JT- Medium überimpft und 3-4 Stunden bei 37 °C
im Schüttelinkubator 3 mit 180 U/min angezüchtet bis auf eine OD550 nm = 0,4000. 10 ml
Aliquots der Bakteriensuspension werden auf Eis gekühlt und anschließend 10 min bei 3500
U/min und 4 °C zentrifugiert 4 . Das entstandene Pellet wird in 10 ml CaCl2 resuspendiert und
30 min auf Eis gestellt. Anschließend wird erneut 10 min bei 3000 U/min und 4 °C
zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird in 1 ml CaCl2 resuspendiert und so alle Aliquots
wieder zusammengeführt. Die Kulturen werden vor der Transformation 24 h bei 4 °C
gelagert.
3 Schüttelinkubator GFL 3032; GFL, Großburgwedel
4 Sigma 4K10, Rotor 11140; SIGMA, Deisenhofen

Material & Methoden 52
5.1.2 Transformation kompetenter Bakterien mit Plasmid
Die Bakterienkultur wird in 200 µl - Portionen in vorgekühlte Eppendorf - Cups aufgeteilt.
100 µl DNA (Plasmid) werden zugegeben und 30 min auf Eis gelagert. Danach wird 1 min
auf 42 °C erwärmt und anschließend 3 min erneut auf Eis abgekühlt. Zu jedem Ansatz werden
800 µl Medium gegeben und bei 37 °C 30 min im Schüttelinkubator 3 inkubiert. Die
Bakteriensuspension wird anschließend auf LB- Agar- Platten mit Ampicillin ausgestrichen.
Die Agar- Platten werden über Nacht bei 37 °C im Brutschrank 5 bebrütet.
5.1.3 Minipräparation
Sinn der Minipräparation von DNA ist die rasche Erfolgskontrolle nach einer Transformation.
Man erhält einen schnellen Überblick, ob das richtige Fragment nach der Restriktion
nachzuweisen ist. Im Gegensatz zur Maxipräparation werden jedoch nur geringe Mengen
DNA analysiert.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Die Minipräparation wurde mit einem Kit der Fa. BioRad ® durchgeführt. 2 ml
Bakteriensuspension werden 1 min bei 5000 U/min zentrifugiert 6 . Das Pellet wird in 200 µl
Cell Resuspension Solution ® gelöst, danach werden 250 µl Cell Lysis Solution ® zugegeben.
Diese Lösung zerstört die Zellwand der Bakterien und legt den Zellkern frei. Nach dem
Mischen werden 250 µl Neutralization Solution ® zugegeben, wodurch dann die Kernmembran
zerstört wird. Anschließend wird 5 min bei 12 000 U/min zentrifugiert 6 . Die DNA befindet
sich anschließend im Überstand und wird in ein neues Gefäß übertragen. Die Reste der
Bakterienkultur werden als Pellet verworfen. 100 µl Matrix- Suspension ® werden auf 37 °C
erwärmt und mit dem Überstand vermischt. Diese Suspension bindet die DNA im Überstand.
Die Suspension wird auf einen Spinfilter übertragen, 1 min zentrifugiert. Der Filter wird
anschließend 2x mit 500 µl ethanolhaltiger Wash Solution ® gewaschen. Anschließend wird
die DNA mit 30 µl A. bidest. aus dem Filter eluiert.
5 Brutschrank Incubat; MELAG; Berlin
6 Hettich, Mikrorapid K, Rotor 1395; HETTICH, Tuttlingen

Material & Methoden 53
5.1.4 Maxipräparation
Die Maxipräparation dient der Gewinnung größerer DNA- Mengen, ähnelt aber im Ablauf der
Minipräparation.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Die Maxipräparation wurde mit einem Kit (Firma Qiagen ® ) durchgeführt.
Einzelne Klone der Transformation werden in 50 ml LB- Medium mit 128 µl Ampicillin über
Nacht im Schüttelinkubator 3 angezüchtet. Die Suspension wird anschließend 15 min bei
4000 U/min abzentrifugiert 7 . Das entstandene Pellet wird in 8 ml Puffer P1 ® gelöst. Dazu
werden 8 ml Puffer P2 ® zur Zerstörung der Bakterienwand gegeben und 5 min bei
Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach Zugabe von 8 ml eiskaltem Puffer P3 ® zur Zerstörung
der Kernmembran wird das Lysat in spezielle Cartridges überführt. Nach einer erneuten
Inkubation von 10 min bei RT setzt sich unten ein klares Lysat ab, worüber ein flockiger
Überstand geschichtet ist. Die Filter werden mit 8 ml Puffer QBT ® gespült, anschließend wird
das Lysat mittels eines Stempels auf die Filter überführt und tropft ab. Die im Filter
festgehaltenen DNA wird 2x mit je 20 ml Puffer QC ® gewaschen und in 10 ml Puffer QF ®
gelöst und in einem Zentrifugenröhrchen 8 aufgefangen. Die DNA wird mit 7 ml eiskaltem
Isopropanol bei RT gefällt. Anschließend wird eine halbe Stunde bei 23000 U/min
zentrifugiert. Das Pellet wird 2x mit 1,8 ml 70 % Ethanol gewaschen, 5 min in der Vakuum-
Zentrifuge 9 getrocknet und in 200 µl TE- Puffer pH 8,0 gelöst.
5.1.5 Konzentrationsbestimmung von DNA
Die Konzentration der DNA wird im UV- Photometer 10 bei einer Wellenlänge von 260 nm
bestimmt. Dabei entspricht eine OD-Einheit einer Konzentration von 50 µg/ml
doppelsträngiger (ds) DNA.
7 Christ KJ3; CHRIST, Osterode/ Harz
8 50 ml Zentrifugenröhrchen, No. 210261, GREINER, Frickenhausen
9 Savant Speedvac Concentrator, SVC 200H; SAVANT Farmingdale, NY, USA

Material & Methoden 54
5.2 Herstellung der DNA-Sonde aus dem isolierten Plasmid
Zum Gewinn der einsatzfähigen DNA- Sonde muß diese aus dem Plasmid isoliert werden und
die Konzentration bestimmt werden.
5.2.1 Restriktion des Plasmids mittels Enzymen
Mit Hilfe von Restriktionsenzymen wird die Sonden-DNA aus dem Plasmid
herausgeschnitten. Die entsprechenden Enzyme sind in der Tabelle 4 aufgelistet. Für die
Enzympaarungen muß jeweils der günstigste Puffer, der für beide eingesetzten Enzyme die
richtigen Reaktionsbedingungen herstellt, verwendet werden. Die Menge an Enzym berechnet
sich aus der Annahme, daß 1 Enzym-Einheit pro Stunde 1 µg DNA verdauen kann (BROWN
1996).
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Der gesamte Ansatz sollte ein Volumen von 20 µl haben:
- 16 µl Plasmid- DNA
- 2 µl Restriktionspuffer
- je 1 µl Restriktionsendonuklease A und B
Dieses Gemisch wird mind. 3- 4 Stunden oder über Nacht bei 37 °C im Wasserbad 11 inkubiert.
Sonde Enzym 1 Enzym 2 Puffer
AVT 3' PstI XhoI H
AVT 5' EcoRI PstI H
MT PstI PstI H
MTR NcoI NotI H
Tabelle 4: Verwendete Sonden und die zu ihrer Herstellung benötigten Restriktionsenzyme mit Puffern
10 Pharmacia, Ultrospec III; PHARMACIA, Freiburg
11 Schüttelwasserbad, GFL 1083; GFL, Großburgwedel

Material & Methoden 55
5.2.2 Auftrennung der Sonden-DNA von der Plasmid-DNA
Die Auftrennung erfolgt in einem 1 % TBE-Gel. Dazu werden 1 g Agarose in 100 ml TBE
unter Kochen gelöst und nach Abkühlung auf 60 °C in einer horizontalen Elektrophorese-
Kammer 12 ausgegossen. Ein vorher eingesetzter Kamm bildet dabei Kammern im erstarrenden
Gel, in die die Proben eingefüllt werden. Über das erstarrte Gel werden 700 ml 1x TBE als
Laufpuffer gegeben.
Zu den aus der Restriktion gewonnenen Proben werden je 2,5 µl Blue Juice zur
Probenbeschwerung sowie zum Sichtbarmachen der Lauffront während der Elektrophorese
gegeben. Gleichzeitig werden je Gel ein oder zwei Längenstandards vorbereitet:
- 16 µl Längenstandard- DNA ( DNA III oder DNA VI )
- 4 µl A. bidest.
- 2,5 µl Blue Juice
Die Proben sowie die Standards werden in die Gelkammern eingefüllt und die Elektrophorese
bei 5 V/cm für 3-4 Stunden durchgeführt. Anschließend wird das Gel 15 min in
Ethidiumbromid gefärbt (15 µl Ethidiumbromid in 200 ml A. dest. ), danach 2x 5 min in
A. dest entfärbt und anschließend auf einem UV-Transilluminator 13 oder mittels einer UV- Gel-
Kamera 14 sichtbar gemacht und auf Polaroidfilm 15 oder mittels eines Videoprinters 16
archiviert. Durch Abgleich der einzelnen Fragmente mit den DNA-Längenstandards kann die
Fragmentgröße bestimmt werden.
12
BioRad Wide Minisub Cell 170-4343; BIORAD, Richmont, Ca, USA
13
Transilluminator TF 20-M; INTAS, Göttingen
14
BioRad Gel Doc 1000; BIORAD, Richmont, Ca, USA
15
Polaroid MP-4 Land Camera und B & W Instant Pack Film No. 667; POLAROID, Cambridge, USA
16 Mitsubishi Video Copy Processor; BIORAD, Richmont, Ca, USA

Material & Methoden 56
5.2.3 Elutions-Verfahren zur Gewinnung der isolierten Sonden- DNA
Bei der Elution wird das gesuchte Fragment aus dem Agarose-Gel eluiert, so daß es für die
weitere Anwendung zur Verfügung steht.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Die Fragmente mit der der Sonde entsprechenden Größe werden mit einem Skalpell aus dem
Gel herausgeschnitten und in Eppendorfgefäßen gesammelt. Das Elutions-Verfahren basiert
auf einem Kit der Fa. Qiagen ® (QIAEX II ® ). 4-5 ausgeschnittene Banden werden mit 5 ml
Puffer QX1 ® versetzt, welcher die Agarose auflöst, sowie 150 µl QIAEX II ® zur DNA-
Bindung. Es folgt unter mehrmaligem Mischen eine 10minütige Inkubation bei 50 °C. Je nach
Inhaltsstoffen kann es zu einer Umfärbung der Suspension kommen, wenn der pH-Wert zu
alkalisch wird. Dieser Effekt wird durch Zugabe von 150 µl 3 M Natriumacetat-Lösung mit
pH 5,0 ausgeglichen. Die Lösung wird 1 min zentrifugiert 17 . Das Pellet wird mit 1 ml Puffer
QX1 ® gewaschen. Anschließend wird es 2x mit ethanolhaltigem Puffer PE ® gewaschen und
10 min bei RT getrocknet. Die DNA wird in 100 µl A. bidest. bei RT für 5-10 min gelöst.
Nach einer weiteren Zentrifugation (1 min) wird der Überstand in ein neues Gefäß pipettiert.
Zurück bleibt Puffer QIAEX II ® (Glasmilk).
5.2.4 Konzentrationsbestimmung der eluierten DNA
4 µl der so gewonnenen DNA werden mit 20 µl A. bidest. und 2,5 µl Blue Juice versetzt.
Dazu werden ein passender Längenstandard sowie ein Mass Ladder entsprechend vorbereitet
und alle Proben erneut auf einem 1 % TBE-Gel aufgetrennt. Anhand des Längenstandards
kann noch einmal die richtige Größe des gewonnenen Fragments kontrolliert werden. Mit
Hilfe des Mass Ladder erfolgt eine für die Markierung hinreichend genaue
Konzentrationsabschätzung. Die einzelnen Banden im Mass Ladder entsprechen jeweils einer
vorgegebenen Konzentration und durch Vergleich der Bandenstärke des Fragmentstückes mit
denen des Mass Ladder kann die Konzentration geschätzt werden.

Material & Methoden 57
5.3 Radioaktive Markierung der cDNA- Sonde
5.3.1 Markierung der Gensonde
Hybridisierungen von Nukleinsäuren beruhen auf dem Prinzip der komplementären
Basenpaarung zwischen Adenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin. Aus einer
vorliegenden Sequenz kann daher immer der entsprechende Gegenstrang ermittelt werden.
Bei der Hybridisierung gibt man ein Sequenzstück mit der komplementären Basenfolge im
Vergleich zur gesuchten Sequenz zu dem zu untersuchenden Material. Unter ausgewählten
Temperatur- und Salzbedingungen kann diese Sonde spezifisch an die gesuchte Sequenz
binden. Je größer die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen, je geringer die
Salzkonzentration und je höher die Reaktionstemperatur gewählt werden, desto spezifischer
ist die Bindung. Die Sonde kann vor dem Versuch markiert werden, so daß sie nach der
Hybridisierung mit ihrem Gegenstrang wieder identifiziert werden kann. Dazu stehen sowohl
radioaktive, als auch nicht radioaktive Verfahren zur Verfügung. Bei der radioaktiven
Markierung stehen verschiedene Radioisotope zur Verfügung, die an ein Nukleotid gebunden
werden. Aufgrund der Eigenschaften wurde wegen der kurzen Expositionszeit und der hohen
Sensitivität für den Northern Blot 32 P ausgewählt. Für die In-situ-Hybridisierung wurde 33 P
eingesetzt, da dieses eine bessere zelluläre Auflösung erreichen kann als 32 P, ein Vorteil, der
sich für die morphologische Untersuchung besonders eignet.
35 S liegt mit seinen
Eigenschaften zwischen den beiden Isotopen. Es eignet sich gut für morphologische
Untersuchungen, jedoch ist die Expositionszeit gegenüber 33 P deutlich länger (um ca. 2 – 3
Wochen).
17 Heraeus Christ Biofuge 15, Rotor 2150; HERAEUS, Hanau

Material & Methoden 58
5.3.2 Random Priming
Bei der Methode des Random Priming (FEINBERG u. VOGELSTEIN 1983) wird ein
Hexamer-Gemisch mit der Sonden-DNA hybridisiert und anschließend wird der angelagerte
Strang mit Klenow-Enzym entlang der DNA-Matrize verlängert. Der Vorteil des Klenow-
Enzyms als einem Teil der DNA-Polymerase I im Vergleich zum ganzen Enzym beruht auf
der fehlenden Exonuklease-Aktivität am 5'-3'-Ende der DNA. So werden gerade angelagerte
Nukleotide nicht sofort wieder entfernt. Ein Nukleotid wird in radioaktiver Form zugegeben
und so in den entstehenden Strang mit eingebaut. Die Reaktion wird durch eine Aufreinigung
der Matrize von den freien Nukeotiden mittels einer Sephadex-Säule beendet. Anschließend
wird die Sonden-DNA gekocht, um die aneinander gelagerten Stränge zu trennen. Durch
schnelles Abkühlen in Eis nach dem Kochen kann eine erneute Zusammenlagerung der
Stränge verhindert werden.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---
Im einfachen Ansatz von 50 µl werden eingesetzt:
- 25 ng DNA
- 5 µl Primer-Gemisch
- DEPC-Wasser (Volumen zum Endvolumen von 50 µl, abhängig von der Konzentration der
Sonde)
5 min denaturiert im Wasserbad 11 mit 100 °C, anschließend auf Eis gekühlt.
- 12 µl Nukleotid-Gemisch (je 4 µl / Nukleotid)
- 5 µl Reaktionspuffer
- 5 µl radioaktives Nukleotid (α-[P 32 ]dCTP für Northern- oder Southern-Blot; α-[P 33 ]dCTP
- 2 µl Klenow-Enzym
für In-Situ-Hybridisierung)
Inkubation für 30 min bei 37 °C im Wasserbad

Material & Methoden 59
Äquilibrieren der Sephadex G-50 Säulen 18 mit 3 ml TE-Puffer, pH 7,5
Abzentrifugieren des Reaktionsgemisches
Auftragen der Sonde auf die Säule und Laufmittel 400 µl TE-Puffer, pH 7,5 zugeben
Auffangen der ersten Fraktion in einem Eppendorf-Cup und verwerfen
Zugabe von 450 µl TE-Puffer, pH 7,5
Auffangen der zweiten Fraktion in einem neuen Eppendorf-Cup
Messen von 2µl des Eluats in 20 ml Scintillationsflüssigkeit im ß-Counter 19
Denaturierung der Sonde für 5 min im Wasserbad (100 °C)
Sonde bei –20 °C einfrieren und binnen 3 Tagen verbrauchen
5.4 Southern Blot
Beim Southern Blot wird elektrophoretisch aufgetrennte DNA auf eine Membran gebracht
und kann mit Hilfe spezifischer Gensonden hybridisiert werden (SOUTHERN 1975). Dabei
kann eine Identifizierung des DNA-Fragmentes vorgenommen werden, welches die Genkopie
des gesuchten Gens trägt.
5.4.1 Extraktion von DNA aus Hühnerblut
Die kernhaltigen Erythrozyten der Vögel machen eine DNA-Gewinnung aus dem Blut
möglich.
Dazu werden 400 µl Hühnerblut mit 15 Vol. STE-Puffer, 150 µl 20 % SDS und 650 µl
Proteinase K (10 mg/ml in STE-Puffer) vermischt und über Nacht bei 50 °C im
Schüttelwasserbad 11 inkubiert. Nach Zugabe von 1 Vol. Phenol / Chloroform (1:1) und
Mischen wird die Lösung 5 min bei 5000 U/min 7 zentrifugiert. Der Überstand wird
abpipettiert und mit 1 Vol. Ammoniumacetat-Lösung 7,5 M versetzt. Nach dem Mischen
werden 2 Vol. Ethanol zugesetzt, gemischt und 10 min bei RT inkubiert. Das DNA- Pellet
18 Pharmacia, Nick columns, Sephadex G 50, PHARMACIA, Freiburg
19 Pharmacia, Wallac 1410 Liquidscintillationcounter; PHARMACIA, Freiburg

Material & Methoden 60
wird von der Oberfläche abgehoben, mit 70 % Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge 9
getrocknet und in TE- Puffer, pH 8,0 oder in A. bidest. gelöst.
5.4.2 Konzentrationsbestimmung der DNA
Die Konzentration der DNA wird im Photometer 10 bei 260 nm bestimmt. Die gemessene
Extinktion wird mit dem Faktor 50 multipliziert und um den Faktor der Verdünnung beim
Messen korrigiert.
5.4.3 Restriktion
14 µg DNA wurden mit je 3 U Enzym über Nacht bei 37 °C geschnitten. Dabei wurden
folgende Enzyme (Puffer) verwendet:
PstI (H) BamHI (B)
Hind II (B) XhoI (H)
PvuII (H) EcoRI (H)
XbaI (H) SalI (H)
5.4.4 Gelelektrophorese
Die DNA wird im Agarose- Gel aufgetrennt. Dazu wird ein 1 % TBE-Gel gegossen (1 g
Agarose in 100 ml TBE-Puffer aufkochen lassen und in eine waagerechte Gelkammer 12
einfüllen). Das Gel wurde nach dem Erkalten mit 1x TBE-Puffer als Laufpuffer überschichtet.
Die geschnittene DNA wurde mit 2,5 µl Stop-Puffer vermischt und auf das Gel aufgegeben.
Bei einer Stromstärke von 60 V wurde die Elektrophorese für ca. 3 h durchgeführt (weitere
Anmerkungen zur Elektrophorese von Nukleinsäuren s. 2.5.3). Anschließend wird die DNA
mittels Ethidiumbromid (20 µl Ethidiumbromid-Lösung in 200 ml A. bidest.) in 15 min

Material & Methoden 61
angefärbt und 2x für 5 min in A. bidest. entfärbt. Die angefärbte DNA kann auf dem UV-
Schirm 13 sichtbar gemacht werden. Zum leichteren Transfer der DNA auf die Blotmembran
wird das Gel 2x mit je 250 mJ im Gene-Linker 20 bestrahlt, um kleinere Fragmente zu erhalten.
5.4.5 Southern Blotting
Das Gel wird vor dem Blot je 1 h im Denaturierungspuffer (NaCl 0,6 M; NaOH 0,4 M) und
im Neutralisationspuffer (NaCl 1,5 M; Tris 0,5 M) geschwenkt. Das eigentliche Blot-
Verfahren ist unter 2.5.4 beschrieben.
5.4.6 Hybridisierung
Das Verfahren entspricht dem bei RNA und ist unter 2.5.5 beschrieben.
5.4.7 Auswertung der Southern Blots
Die Auswertung erfolgte mittels Phosphorimager 21 und Röntgenschirm wie unter 2.5.6
beschrieben.
5.5 Northern Blot
5.5.1 RNA-Extraktion
Zur Gewinnung der RNA zur Verwendung z. B. für den Northern Blot muß die RNA zunächst
aus den Zellen extrahiert werden. Dies geschieht mit Hilfe der Methode von
CHOMCZYNSKI u. SACCHI (1987). Dazu muß das Gewebe zunächst homogenisiert
20 BioRad, GS Gene Linker, UV Chamber; BIORAD, Richmond,Ca, USA
21 BioRad GS-363 Molecular Imaging System; BIORAD, Richmond,Ca, USA

Material & Methoden 62
werden. Das geschieht in GTC-Puffer, welcher zusätzlich zur mechanischen Zerkleinerung
auch für eine chemische Auflösung der Zellwand sorgt. Bei einer anschließenden
Zentrifugation über Phenol und Isoamylalkohol/Chloroform wird die RNA im Überstand der
wäßrigen Phase angereichert, während DNA und Protein sich in der organischen Phase
absondern. Auf diese Weise wird die RNA von den restlichen Zellbestandteilen isoliert. In
nachfolgenden Fällungen und Waschungen wird die RNA von Phenolresten gereinigt und
aufkonzentriert, so daß schließlich eine konzentrierte Lösung vorliegt.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-- Gewebe mit 10 ml GTC-Puffer /g Gewebe homogenisieren
- Zugabe 100 µl Natrium-Acetat, pH 5,2 /ml GTC
- Zugabe 1 ml Tris-gesättigtes Phenol /ml GTC
- Zugabe 200 µl Isoamylalkohol / Chloroform (49:1) pro ml GTC
30 min bei 4 °C und 5500 U/min 4 zentrifugieren
Überstand abnehmen
- Zugabe 1 Vol. eiskaltes Isopropanol
1 h bei –20 °C lagern
30 min bei 4 °C und 5500 U/min zentrifugieren
Überstand verwerfen
- Pellet lösen in 1 ml GTC /g Gewebe
- Zugabe 100 µl Natriumacetat /ml GTC
- Überführen in Eppendorf-Cups
- Zugabe 1 Vol. Isopropanol
1 h bei –20 °C lagern
30 min bei 4 °C und 12000 U/min 6 zentrifugieren
Pellet 2x mit 1 ml 75 % Ethanol in DEPC-Wasser waschen

Material & Methoden 63
Pellet 15 min bei RT in 1 ml 75 % Ethanol stehen lassen, dann erneut waschen
Pellet in der Vakuumzentrifuge 9 trocknen und in 200 µl DEPC-Wasser lösen
Die RNA wird bei –70 °C gelagert.
5.5.2 Konzentrationsbestimmung der RNA
Ähnlich wie bei DNA wird auch die Konzentration der RNA im Photometer 10 bestimmt.
Zuvor wird die Probe 15 min auf 65 °C im Wasserbad 22 erwärmt, um eine vollständige
Lösung der RNA im DEPC-Wasser zu erreichen. Die Konzentration der RNA wird dann im
UV- Photometer bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Dabei entspricht eine OD-
Einheit einer Konzentration von 40 µg/ml RNA.
5.5.3 Auftrennung der RNA im Agarose-Gel
Die RNA muß vor dem Gellauf konzentriert werden. Dazu wird die benötigte RNA-Menge
mit DEPC-Wasser auf 100 µl aufgefüllt und mit 10 µl Natriumacetat, pH 5,2 versetzt. Dann
wird 1 Vol. Isopropanol zugegeben. Nach einer Stunde bei –70 °C wird die Probe 20 min bei
12000 U/min und 4 °C zentrifugiert 6 und anschließend einmal in 75 % Ethanol/ 25 %
Natriumacetat gewaschen. Das Pellet wird in der Vakuumzentrifuge 9 getrocknet und in 6 µl
DEPC-Wasser gelöst.
Im Gegensatz zur DNA muß RNA in einem denaturierenden Agarose-Gel aufgetrennt werden,
um eine zu starke Aufknäuelung der RNA zu verhindern. Zur Denaturierung werden
Formamid und Formaldehyd verwendet.
----------------------------------------------------------------------------------------------------
6 µl RNA
2,5 µl MOPS-Puffer (10x)
4 µl Formamid
12 µl Formaldehyd
22 Schüttelwasserbad, GFL 1012; GFL, Großburgwedel

Material & Methoden 64
15 min bei 65 °C im Wasserbad denaturieren
2,5 µl Stop- Puffer
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Als Gel wurde ein 1,4 % MOPS-Agarose-Gel verwendet. Bei der Elektrophorese wird die
Polarität der RNA ausgenutzt. Da die Phosphatgruppen der RNA als Protonendonatoren
dienen, ist RNA negativ geladen. Im elektrischen Feld wandert sie daher in Richtung Anode.
Je höherprozentig das Gel ist, desto langsamer wandert die RNA und desto stärker werden die
einzelnen Fragmente nach ihrer Länge aufgetrennt. Große Fragmente laufen aufgrund ihres
höheren Molekulargewichts und ihrer größeren Unbeweglichkeit weniger weit als kleine
Fragmente. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist auch abhängig von der Spannung zwischen
den beiden Polen. Je höher die Spannung, desto schneller läuft das Gel. Eingeschränkt wird
die Wahl der Spannung aber durch die entstehende Wärme. Wird das Gel zu heiß, kann es
schmelzen. Die angelegte Spannung wird gemessen in V/cm, wobei in cm die Strecke
zwischen den beiden Polen gemessen wird.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1,4 % Agarose
81,92 % A. dest
zum Lösen aufkochen, abkühlen lassen auf 60 °C
13,25 % MOPS-Puffer
3,43 % Formaldehyd
einfüllen in die Gelkammer 23 und erkalten lassen
Das Gel wird mit 1x MOPS-Puffer als Laufpuffer überschichtet und die vorbereiteten Proben
werden eingefüllt.

Material & Methoden 65
Die Laufzeit beträgt 3 h bei 5 V/cm angelegter Spannung.
Anschließend wird das Gel wie ein DNA-Gel mit Ethidiumbromid gefärbt (s. 2.2.2.) und auf
dem UV-Schirm 13 mit Hilfe einer Kamera 24 fotografiert. Anschließend wird das Gel im Gene-
Linker 20 2x mit 250 mJ UV-Licht bestrahlt. Dabei wird die RNA in kleinere Fragmente
zerlegt, die leichter beim Blotverfahren auf die Membran übertragen werden kann.
5.5.4 Northern Blotting
Beim Northern Blot-Verfahren wird die RNA aus dem Gel auf eine Membran übertragen, wo
sie fixiert werden kann (ALWINE et al. 1977). Unterschiedliche Membranen sind für die
verschiedensten Zwecke entwickelt worden. Der Vorteil der hier verwendeten Nylonmembran
liegt in der großen Stabilität, die eine mehrfache Hybridisierung möglich macht.
Das Gel wird umgekehrt auf einer festen Unterlage auf Filterpapier 25 gelegt. Darauf wird eine
positiv geladene Nylonmembran 26 gelegt, sowie zwei Lagen Filterpapier. Alle Schichten
wurden vorher im Blotpuffer angefeuchtet. Als oberste Schicht wird ein ca. 10 cm hoher
Stapel Papiertücher trocken aufgelegt. Der Blot wird rundherum mit
flüssigkeitsundurchlässigem Material abgedichtet, um sicherzustellen, daß Flüssigkeit nur
durch das Gel hindurch in die trockenen Tücher gesogen werden kann und kein Kurzschluß
um das Gel herum entsteht. Der Blot wird anschließend mit 1,2 kg Gewicht beschwert. Als
Blotpuffer dient 10x SSC- Puffer, der in ausreichender Menge am Boden des Geles eingefüllt
wird. Das Blotting findet über Nacht statt. Anschließend wird die Membran vom Gel
abgenommen und 2x im Gene Linker mit 150 mJ UV-Licht bestrahlt, um die RNA-Fragmente
auf der Membran zu fixieren.
23
BioRad Wide Minisub Cell 170-4343 oder DNA Sub Cell 170-4300; BIORAD, Richmont, Ca, USA
24
Polaroid MP4 Land Camera; INTAS; Göttingen
25
Schleicher & Schuell, Gel Blotting Paper GB 002, No. 426693; SCHLEICHER & SCHUELL, Dassel
26
Amersham, Hybond-N+ Nylon Transfer Membrane, RPN 303B; AMERSHAM, Braunschweig

Material & Methoden 66
5.5.5 Hybridisierung mit mRNA-spezifischen Gensonden
Die Membran wird zwei Stunden in einer verschließbaren Glasflasche im
Hybridisierungsofen 27 bei 42 °C mit Prähybridisierungpuffer unter ständiger Bewegung
gespült. Anschließend werden 3,5 x 10 7 cpm spezifischer Aktivität in den Puffer
hineingegeben und 16 h unter gleichen Bedingungen wie bei der Prähybridisierung
hybridisiert. Nach dem Hybridisieren wird die Membrane 2x 30 min bei 42 °C mit 1x SSC
incl. 0,1 % SDS gespült. Daran schließt sich ein Waschvorgang von 15 min bei 60 °C mit
0,2x SSC incl. 0,1 % SDS an. Der Filter wird getrocknet und unter einem Phosphorschirm 28
exponiert 29 . Die Expositionszeit ist abhängig von der gemessenen Radioaktivität auf dem
Filter. Bei der quantitativen Ontogenese wurden Filter, die untereinander verglichen wurden,
immer mit der gleichen Expositionszeit behandelt. Das Prinzip des Phophorschirms beruht auf
der Anregung von Elektronen durch die radioaktive Strahlung. Der Schirm wird anschließend
in einem Phosphor-Imager 21 abgelesen, wobei die Elektronen wieder auf ihr ursprüngliches
Energieniveau zurückkehren und dabei eine Energie abstrahlen, die vom Gerät auf den
Computer übertragen wird. Die Energie wird in Form von schwarzen Punkten wiedergegeben.
Zur Dokumentation der realen Signalstärke unabhängig von digitaler Bearbeitung wurden die
Filter zusätzlich mit Hilfe von Röntgenfilmen 30 archiviert. Dabei wurden sie unterschiedlich
lange bei -70 °C exponiert. Die Röntgenfilme wurden 4 min in Filmentwickler entwickelt.
Die Reaktion wurde 3 min in 3 % Essigsäure gestoppt, bevor der Film 5 min entwickelt
wurde.
Die Membran wurde danach 5 min in Stripp-Lösung bei 95 °C abgekocht, um die gebundene
Sonde zu entfernen. Zur Standardisierung der aufgetragenen RNA-Mengen diente die
Rehybridisierung mit der Sonde für ein "housekeeping gene", hier ribosomale 18S-RNA.
Dabei wurden 1,5 x 10 7 cpm/Filter eingesetzt.
27 Hybridisierungsinkubator GFL- 7601; GFL, Großburgwedel
28 BioRad Molecular Imaging Screen - BI, No. 170-7320; BIORAD, Richmond, Ca, USA
29 BioRad, Exposure Platform GS-505, BIORAD, Richmond, Ca, USA
30 Amersham Hyperfilm - MP, RPN 1675; AMERSHAM, Braunschweig

Material & Methoden 67
5.5.6 Auswertung der Northern Blots
Die digitalisierten Bilder des hybridisierten Blots werden mit dem Programm Molecular
Analyst 31 ausgewertet. Um die jeweils sichtbaren Banden wird ein Meßrahmen angelegt, der
jeweils an der größten Bande ausgerichtet wird. Anschließend wird die Signalstärke in Form
des Schwärzegrades vom Computer ermittelt. Die entsprechenden Werte werden um den
Faktor des unterschiedlichen Auftrags korrigiert, der mit Hilfe des "housekeeping gene", der
ribosomalen RNA (rRNA) von der 18S-Ribosomen-Untereinheit, ermittelt wird. Bei diesen
Genen geht man davon aus, daß sie immer in allen Tieren und allen Altersstadien prozentual
den gleichen Anteil an der Gesamt-RNA haben (BARBU u. DAUTRY 1989; BHATIA et al.
1994; DE LEEUW et al. 1989). Die statistische Auswertung erfolgt mittels ANOVA.
Für eine quantitative Untersuchung der Genexpression während der Ontogenese werden alle
Altersstadien jeweils auf einem Gel aufgetrennt, mit gleichem Puffer geblottet und mit
derselben Sondenmarkierung hybridisiert. Hybridisierungs- und Expositionszeit waren auch
jeweils identisch: Hybridisierungsdauer 16 h, Expositionsdauer bei Markierung mit MT 21,5
h, mit AVT 21,5 h, mit 18S 2 h. Ausgewertet werden je 3 Wiederholungen von 3 Gruppen mit
2 Tieren / Gruppe. Der gesamte Versuch wird zweimal wiederholt. Die Werte wurden mittels
eines Korrekturfaktors, der aus dem Vergleich der 18S-Hybridisierungssignale ermittelt
wurde, korrigiert.
Größenmessungen von hybridisierter mRNA (sog. Profilanalyse) für Vergleiche der mRNA-
Größe mit bzw. ohne Poly (A)-Schwanz wird mit dem Programm Molecular Analyst (Fa.
BioRad®) anhand gleichfalls hybridisierter Längenstandards berechnet.
31 BioRad, Molecular Analyst Version 2.0; BIORAD, Richmond,Ca, USA

Material & Methoden 68
5.5.7 RNase H-Verdau
20 µg Gesamt-RNA
48 µl Lösung 1
2 µl Oligo(dT)12-18 (5 µg/µl)
----------------------------------------------------------------------------------------------------
2 min bei 65 °C inkubiert, auf Eis kurz abgekühlt
----------------------------------------------------------------------------------------------------
50 U RNase Inhibitor (40 U/µl)
----------------------------------------------------------------------------------------------------
30 min bei Raumtemperatur inkubiert
----------------------------------------------------------------------------------------------------
60 µl Lösung 2
8 µl RNase H (1 U/µl)
68 U RNase Inhibitor (40 U/µl)
----------------------------------------------------------------------------------------------------
30 min bei 37 °C inkubiert, danach auf 4 °C abgekühlt
----------------------------------------------------------------------------------------------------
100 µl Lösung 3
221 µl Phenol / Chloroform (1:1)
----------------------------------------------------------------------------------------------------
30 min zentrifugiert bei 12000 U/min, 4 °C 6
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Der Überstand wurde mit Ethanol 30 min gefällt, einmal gewaschen und in DEPC-H2O gelöst.
Bis zur Verwendung wurden die Proben bei –70 °C gelagert. Die Proben wurden anschließend
auf einem 1 % denaturierenden Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde
geblottet und die Nylonmembran anschließend mit AVT- und MT-Sonde hybridisiert.

Material & Methoden 69
5.6 In-situ-Hybridisierung
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) dient der Lokalisierung der mRNA in zellulären
Kompartimenten und in verschiedenen Bereichen von Geweben (BRAHIC et al. 1984).
Gegenüber der Immunhistochemie erkennt die ISH das Produkt schon auf transkriptioneller
Ebene. Man bekommt genauere Informationen über eine Veränderung der Genexpression. Da
schon im Verhältnis zum Northern Blot geringe mRNA-Mengen nachgewiesen werden, ist die
Methode sehr anfällig gegenüber RNasen. Daher müssen alle Instrumente und Geräte vorher
gegen eine Kontamination mit den degradierenden Enzymen behandelt werden. Zusätzlich
wird nur mit DEPC behandeltes Wasser in den Versuchen eingesetzt und, falls möglich,
sollten alle Lösungen autoklaviert werden. Das Tragen von sauberen Handschuhen während
der Prozedur ist nötig. Da die DNA-RNA-Hybride gegen den Abbau durch RNasen
unempfindlich sind, ist nach der Hybridisierung eine solche Behandlung nicht mehr
erforderlich.
5.6.1 Behandlung von Plastikmaterial, Glaswaren und Metall gegen RNase
Alle Plastikmaterialien, die bei der Prozedur zur Verwendung kommen, werden 24 h in 2 %
Extran- Lösung eingelegt, anschließend mit heißem Leitungswasser abgespült und 2 h darin
eingelegt. Nach 4-5 h Lagerung in A. dest. werden sie bei 50 °C im Trockenschrank 32
getrocknet. Die Lagerung muß so erfolgen, daß eine Kontamination mit Staub vermieden
wird.
Glaswaren und Metall werden 30 min autoklaviert 33 bei 120 °C und 1 bar Druck.
32 Heraeus T 12; HERAEUS SEPATECH, Hanau
33 Webeco Dampf- Sterilisator, Model C; WEBECO, Bad Schwartau

Material & Methoden 70
5.6.2 Beschichtung der Objektträger
Die Objektträger werden 24 h in 2 % Extran- Lösung eingelegt und nach Abspülen mit
heißem Wasser 2 h in A. dest. gelagert. Es wird eine 1 % (v/v) 3-Aminopropyl-trietoxysilan-
Lösung angesetzt. Die Objektträger werden nach erneutem Abspülen 5 sec in diese Lösung
eingetaucht, anschließend 2x 5 sec in Aceton z. A., zum Abschluß kurz in autoklaviertes
A. bidest. Es folgt eine Trocknung hochkant bei 50 °C. Die Objektträger werden in Kästen
einsortiert bis zur Verwendung.
5.6.3 Anfertigung der Gefrierschnitte
Die Gehirne werden mit einem Einbettmedium 34 auf einem Schneideblock fixiert, in einer
Schnittdicke von 12 µm in einem Kryostat 35 bei -12 bis -15 °C geschnitten und sofort auf die
beschichteten Objektträger aufgezogen.
5.6.4 Fixierung der Gewebeschnitte
Die Fixierung dient der Erhaltung der morphologischen Strukturen während der
Hybridisierung und der Erhöhung der Durchlässigkeit des Gewebes.
Die Schnitte werden jeweils 5 min eingetaucht in:
a) 4 % Paraformaldehyd- Lösung (w/v) in 1x PBS, pH 7,2
b) 2x in 1x PBS
c) 60 % Ethanol
d) 80 % Ethanol
e) 100 % Ethanol
34 Jung Tissue Freezing Medium; JUNG, Nussloch
35 Reichert Jung, Frigocut 2800; LEIKA, Benzheim

Material & Methoden 71
Die Schnitte werden anschließend 2 h im Vakuumofen 36 getrocknet. Unter Zugabe von
Kieselgel erfolgt die Lagerung der Schnitte bis zur Verwendung bei 4 °C (max. 1 Woche).
5.6.5 Vorbereitung der Sonde
Die Markierung erfolgt entsprechend der vorher beschriebenen Methode (s. 2.3.2), jedoch
wird 33 P statt 32 P eingesetzt, da es bei der ISH eine bessere zelluläre Auflösung bietet
(s. 2.3.1). Nach der Bestimmung der spezifischen Aktivität der Sonde wird diese mit
Hybridisierungspuffer verdünnt. Dabei handelt es sich um Prähybridisierungspuffer, dem 1 %
(w/v) Dextransulfat als Reaktionsbeschleuniger zugesetzt wurde. Dextransulfat ist darüber
hinaus noch in der Lage, die Sonde über dem Schnitt zu konzentrieren. Die Verdünnung
erfolgt so lange, bis eine Aktivität von 3000-3500 cpm/µl erreicht ist. Die Sonde wird dann in
Eppendorf- Cups überführt und bei -20 °C eingefroren. Sie ist innerhalb von 3 Tagen zu
verwenden. Eine spätere Verwendung ist durch Verlust der Radioaktivität und die Zersetzung
der Sonde unter der energetischen Strahlung ungünstig.
5.6.6 Prähybridisierung und Hybridisierung
Die Prähybridisierung dient der Vorbereitung des Gewebes auf die Hybridisierung. Die Zellen
werden durchlässig gemacht für die Sonde und unspezifische Bindungen mit Heringssperma-
DNA abgedeckt. Das Formamid senkt die notwendige Hybridisierungstemperatur, welche
üblicherweise für eine ISH von DNA-RNA-Hybriden 20-25 °C unterhalb der
Schmelztemperatur tm liegt, also bei ca. 50-55 °C. Die Hybridisierung kann so bei
Temperaturen durchgeführt werden, die das Gewebe nicht schädigen. Zusätzlich wirkt sich
Formamid auch günstig auf die Stringenz, also die Anzahl korrekt gepaarter Basenpaare, aus.
Die Hybridisierungssalze stabilisieren die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den
Nukleinsäuren. Ficoll als Makromolekül dient der Beschleunigung der
36 Vakuumtrockenschrank Heraeus VTR 5036, HERAEUS SEPATECH, Hanau

Material & Methoden 72
Hybridisierungsreaktion und konzentriert die Sonde über dem Schnitt. Bovines Serumalbumin
hat wie Heringssperma die Aufgabe, unspezifische Bindungen zu vermindern. SDS kann die
Durchlässigkeit des Gewebes für die Sonde verbessern (LEITCH et al. 1994).
Der vorher erwärmte Prähybridisierungspuffer wird auf die Schnitte aufgegeben, so daß sie
vollständig bedeckt sind. Anschließend werden die Schnitte mind. 3,5 h bei 52 °C in einer
feuchten Kammer prähybridisiert.
Die Sonde wird vor der Verwendung aufgetaut und durchmischt. Der
Prähybridisierungspuffer wird von den Schnitten entfernt und 80 µl Sonde werden
aufgegeben. Die Schnitte werden mit Deckgläschen abgedeckt und über Nacht bei 52 °C in
einer feuchten Kammer hybridisiert.
5.6.7 Posthybridisierungswaschungen
Die Waschungen dienen dem Entfernen der überschüssigen Sonde. Durch Temperatur und
Salzkonzentration kann die Stringenz beeinflußt werden.
Die Deckgläschen werden in 5x SSC abgeschwemmt und die Schnitte anschließend je 5 min
eingetaucht in:
a) 5x SSC (3x)
b) 2x SSC (3x)
c) 60 % Ethanol
Sie werden 2 h im Vakuuminkubator getrocknet.

Material & Methoden 73
5.6.8 Autoradiographie
Bei der Autoradiographie werden die Schnitte mit Silberemulsion bedeckt. Die radioaktive ß-
Strahlung ist in der Lage, die in der Emulsion vorhandenen Silberionen in elementares Silber
umzuwandeln, welches nach fotografischer Entwicklung sichtbar wird.
Die Schnitte werden einzeln in Silberemulsion eingetaucht und 3 h an der Luft getrocknet. Die
Emulsion muß vorher leicht erwärmt werden (42 °C), damit sie ausreichend flüssig ist, um
eine einheitliche Beschichtung zu erreichen.
Die Objektträger werden zusammen mit Kieselgel in lichtdichte Boxen verpackt und bei 4 °C
gelagert. Die Expositionszeit beträgt in der Regel 10 Tage, bei anderen Zeiträumen sind diese
im Ergebnisteil extra angegeben.
Die Entwicklungszeit beträgt 3 min, die Fixierdauer 4 min. Überschüssige Reste der
Silberemulsion werden durch Spülen in Leitungswasser und vorsichtiges Abwischen entfernt.
Nach einem kurzen Eintauchen in A. dest. werden die Schnitte an der Luft getrocknet.
5.6.9 Histologische Färbung und Einbettung
Zur Darstellung der Gewebemorphologie wird über Nacht eine Gegenfärbung mit
Toluidinblau (1 ml 0,5 % (w/v) in 1 l Wasser ) durchgeführt, dann erfolgt die Versiegelung der
getrockneten Schnitte mit einem Klebstoff und Deckgläschen.
5.6.10 Mikroskopische Auswertung
Die Schnitte werden mittels Hellfeld 37 - oder Dunkelfeld 38 -Mikroskopie ausgewertet.
37 Nikon, Diaphot 300, Objektive Plan Apo2, Plan 4, Plan 10, Plan 20, Plan 40; NIKON, Düsseldorf
38 Nikon, Epiphot, Objektive Plan5, Plan 20, Plan 40; NIKON, Düsseldorf

Material & Methoden 74
5.6.11 Kontrollen
RNase- Vorbehandlung
Zum Nachweis, daß auch wirklich RNA und kein anderer Zellbestandteil nachgewiesen wurde,
erfolgte bei einigen Schnitten zwischen Prähybridisierung und Hybridisierung eine
Behandlung mit RNase A. Dieses Enzym zerstört spezifisch mRNA.
Dazu wurde ein RNase-Puffer (0,5 M NaCl, 0,01 M Tris- HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) mit
50 µg/ml RNase A hergestellt. Die Schnitte wurden nach der Prähybridisierung mit RNase-
haltigem Puffer beschichtet und für 10 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte eine
erneute Inkubation mit Puffer ohne RNase unter gleichen Bedingungen. Zur Kontrolle, daß
der Puffer nicht unerwünschte Wirkungen auf die Hybridisierung hat, die unabhängig von der
RNase-Aktivität ist, wurden jeweils auch Schnitte zweimal nur mit Puffer inkubiert. Nach der
Inkubation wurde der Puffer abgekippt und die Schnitte normal hybridisiert.
Kompetitive Hemmung der Nukleinsäure- Bindung
Um nachzuweisen, daß die Sonde spezifisch für MT ist und nicht mit AVT kreuzreagiert,
wurden einige Schnitte vor der Hybridisierung mit der AVT-Sonde vorhybridisiert. Dazu
wurde bei der AVT-Sonde die Markierungsreaktion imitiert, jedoch wurde kein radioaktives
Nukleotid eingesetzt. Diese "kalte" Sonde wurde im normalen Verfahren hybridisiert, wobei
der gesamte Sondenansatz verwendet wurde, um einen Überschuß im Verhältnis zur später
verwendeten MT-Sonde zu erreichen. Die Schnitte wurden danach wie beschrieben (2.6.7)
gewaschen, jedoch wurde die letzte Behandlung mit Ethanol ausgelassen. Danach erfolgte
eine erneute Prähybridisierung und eine Hybridisierung mit der MT-Sonde mit der
beschriebenen Konzentration (2.6.6).

Material & Methoden 75
5.6.12 Quantitative In-situ-Hybridisierung
Die quantitative In-situ-Hybridisierung diente der Lokalisation quantitativer Unterschiede aus
dem Northern Blot, welche mit dem herkömmlichen Verfahren der Autoradiographie über die
Silberemulsion nicht aufgedeckt werden konnten, da der Sättigungsgrad der Emulsion zu
schnell erreicht war. Das Verfahren entspricht der qualitativen ISH (s.o.) mit folgenden
Abwandlungen: Die zu vergleichenden Schnitte wurden auf einen Objektträger aufgezogen
und dabei die zu vergleichenden Gehirnareale so dicht zu einander orientiert wie möglich, so
daß die Fläche mit einer möglichst gleichmäßig verteilten Sonde so klein wie möglich
gehalten wurde. Zur Hybridisierung wurde eine Multipette 39 verwendet, um den individuellen
Pipettierfehler so klein wie möglich zu halten. Die Posthybridisierungswaschungen wurden
stringenter durchgeführt, um den Hintergrund zu reduzieren: 4x SSC (3x je 5 min) und 1x
SSC (3x je 5 min bei 37 °C unter leichtem Schütteln). Anschließend wurden die Schnitte
dehydriert mit 60 % Alkohol und unter Vakuum getrocknet. Dann erfolgte die Exposition im
Mikroimager 40 für 1 Stunde. Zum Abschluß wird von jedem Schnitt ein optisches Bild
angefertigt, um später die radioaktiven Signale einem Gehirnareal zuweisen zu können. Die
Exposition zu vergleichender Schnitte erfolgte zeitlich hintereinander. Es wurden von jedem
Gehirn 24 Schnitte herangezogen: Bei einer Schnittstärke von 20 µm wurden 500 µm,
nachdem der TSM den Gehirnboden erreichte, jeder 8. Schnitt aufgezogen. Durch diesen
Rhythmus war es möglich, sowohl SON als auch PVN mit 24 Objektträgern abzudecken.
Zum Abschluß wurden alle Schnitte auch mit Silberemulsion beschichtet und nach 3 Wochen
entwickelt, um zusätzlich ein autoradiografisches Bild zu erhalten.
Zur Auswertung wurden im SON die 4, im PVN die 6 verschiedenen Schnitte mit der
höchsten Expressionsrate herangezogen. Über die relevanten Regionen wurde ein Gitter mit
0,04 mm 2 Kästchenfläche gelegt. Innerhalb dieses Gitters wurden dann die 4 (SON) bzw. 8
(PVN) Neurone mit der höchsten Expression ausgewählt.
39 Impact, 8-Kanal-Pipette, 800-345-0206, MATRIX TECHNOLOGIES CORP., Cowell, USA
40 Micro Imager, Meßfläche 1 cm 2 , No. 43576, Biospace Mesures, ZINSER, Frankfurt

Material & Methoden 76
5.7 Immunhistochemie
Die Immunhistochemie dient der Lokalisation von Peptiden bzw. Proteinen in zellulären
Strukturen mittels spezifischer Antikörper, welche mit Farbstoffen, aktiviert durch
enzymatische Reaktionen oder Fluoreszenzlicht, sichtbar gemacht werden (COONS et al.
1941).
5.7.1 Präparation der Objektträger
Es wurden mit Gelatine beschichtete Objektträger verwendet.
Die Objektträger wurden über Nacht in A. bidest. eingelegt, anschließend 5 min in Alkohol
eingetaucht und luftgetrocknet, 2 min in Gelatine-Lösung getaucht und tropften dann ab. Die
Trocknung erfolgt bei 37 °C. Die Lagerung findet in sauberen, trockenen Boxen statt.
5.7.2 Vorbereitung der Tiere und des Gewebes
Bei der IHC für den Hypothalamus bekommen die Tiere 24 h vor dem Schlachttermin eine icv
Injektion von Colchicin. Dazu werden die Tiere mit Pentobarbital iv (Narcoren ® , Rhone
Merieux GmbH, Laupheim, BGA-Reg. Nr. N 208) in die V. brachialis narkotisiert (Dosierung
nach Wirkung, ca. 1,5 ml). Bei ausreichender Narkosetiefe, charakterisiert durch
Reflexlosigkeit bei Kamm- oder Zwischenzehenreflex, erfolgt eine Fixierung des Tieres im
stereotaktischen Apparat 41 . Anhand des Gehirnatlas von KUENZEL u. MASSON (1988) kann
die Position des dritten Ventrikels als Injektionsort bestimmt werden. Die Überprüfung der
theoretischen Werte wird mittels blauer Tinte durchgeführt. Die Bestimmung der richtigen
Koordinaten ergibt bei erwachsenen Hennen eine Injektionsstelle von 7,8 mm rostral vom
Nullpunkt bei einer Tiefe der Führungsnadel von 7 cm und der Injektionsnadel von 9 cm, bei
Hähnen liegt dieser Punkt 1,5 mm caudal des Nullpunkts mit einer Tiefe der Führungsnadel
von 8,5 cm und der Injektionsnadel von 10,5 mm. Nach der Eröffnung der Haut unter
41 Model 1430 von KOPF, BILANEY CONSULTANTS GMBH, Düsseldorf

Material & Methoden 77
Schonung des Kammes wird an der rostro-caudalen Position der Injektion mit einer Kanüle
ein Loch in den Schädel gebohrt. Durch dieses Loch wird eine Hohlnadel als Führung
vorgeschoben. Die Injektionsnadel einer Hamilton-Spritze 42 wird durch diese Hohlnadel
geführt und ragt 2 cm in der Tiefe aus der Hohlnadel. 10µl Colchicin werden über eine Dauer
von 4 min langsam injiziert. Beide Nadeln bleiben nach Absetzen der gesamten Flüssigkeit
noch für ca. 2 min liegen, um ein Verteilen der Lösung zu erreichen, ohne daß bei
Zurückziehen der Nadeln Flüssigkeit durch den erzeugten Unterdruck wieder angesaugt wird.
Nach dem Entfernen der Nadeln wird das Loch im Schädelknochen mit Klebstoff 43
verschlossen. Die Haut wird mit einer Knopfnaht verschlossen. Nach einem Tag werden die
Tiere erneut mit Pentobarbital narkotisiert. Die A. carotis wird beidseitg freipräpariert und ein
Katheter 44 eingeführt. Unter Spülen mit 0,02M PBS-Lösung mit 0,3 % Heparin und 0,1 %
Natriumnitrit zur Gefäßdilatation mittels Pumpe 45 erfolgt das Töten des Tieres durch
Durchtrennung der V. jugularis beidseits und Entbluten. Die Hennen bekommen 120 ml PBS
pro Seite, die Hähne 200 ml. Die Fixierung erfolgt mit 240 ml (Hennen) bzw. 320 ml (Hähne)
Zamboni’s Fixativ. Das herauspräparierte Gehirn wird ca. 1 Tag in Zamboni’s Fixativ
postfixiert und in 15 % Sucrose-Lösung gefriergeschützt. Die Lagerung in dieser Lösung wird
durch das Aufschwimmen des Organs beendet. Die Lagerung des Gewebes erfolgt bei –70 °C
bis zur Verwendung.
Im Kryostat 35 werden vom Gewebe in 40 µm dicke Schnitte angefertigt und diese in 0,02M
PBS-Lösung überführt.
42
705N, Hamilton BONADUZ AG, Bonaduz, Schweiz
43
Schnellkleber A, GREVEN, Mannheim
44
Intravenous canula 2FG oder 3FG, PORTEX LIMITED, Kent, Großbritannien
45
Harvard Apparatus 22, Model 55-5920, HARVARD APPARATUS INC., Holliston, USA

Material & Methoden 78
5.7.3 Peptid-Detektion
Dauer Behandlung
6x15 min Waschen in PBS
30 min 0,02M PBS mit 0,6 % H2O2
30 min 0,02M PBS mit 5 % Esel-Serum, 0,1 % Natriumazid, 0,2 % Triton
42 h Mesotocin-Antikörper (AB 42), 1:5000; in 0,02M PBS mit 0,2 % Triton und 1 %
Esel-Serum; 4°C (Der Antikörper wurde freundlicherweise von C. Sernia
überlassen).
6x15 min 0,02M PBS
60 min Esel-anti-Schaf IgG, Biotin-markiert, 1:400 in 0,02M PBS mit 0,2 % Triton
4x15 min PBS
60 min Avidin-biotinylierter Meerrettich-Peroxidase-Komplex (AB-Komplex / HRP), 1:4,
4x15 min PBS
in PBS mit 0,2 % Triton
15 min 0,1M Natriumacetat-Puffer, pH 6,0
6-9 min Glucoseoxidase-Nickel-Diamino-Benzidin (Dauer nach Stärke der Färbung unter
dem Mikroskop beurteilt)
15 min 0,1M Natriumacetat-Puffer, pH 6,0
15 min A. bidest.
Die Schnitte werden anschließend, in A. bidest. schwimmend, auf die Objektträger
aufgezogen und getrocknet. Die Versiegelung erfolgt mit Entellan und Deckglas.

Material & Methoden 79
5.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Polymerasen-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) dient der
Vervielfältigung von DNA bzw. als RT-PCR der Amplifikation von RNA (MULLIS et al.
1986). Die Reaktion wird durch eine Polymerase ermöglicht. Da für die Amplifikationsphasen
verschiedene Temperaturphasen durchlaufen werden müssen (95 °C zur Denaturierung der
DNA-Stränge, eine sequenzspezifische Annealing-Temperatur, 72 °C bei der
Kettenverlängerung), wurde die PCR erst praktikabel mit der Entdeckung thermostabiler
Polymerasen, welche alle diese Temperaturen ohne Aktivitätsverlust und Denaturierung
überstehen (SAIKI et al. 1988). Die Spezifität der PCR für eine bestimmte DNA wird über die
Auswahl der Primer gesteuert. Für die Primer-Auswahl müssen folgende Eigenschaften
berücksichtigt werden (FLACH et al. 1994):
• eine Länge von 18-30 bp
• GC-Gehalt 50-60 %
• Tm zwischen 55 und 80 °C
• keine Sekundärstrukturen
• keine komplementäre Basenpaare an den Primerenden, um Primerdimerisierung zu
vermeiden.
Das entstehende PCR-Produkt wird mittels Gel-Elektrophorese in einem TBE-Agarose-Gel
untersucht. Die Fragment-Größe gibt einen Anhaltspunkt, ob die Primer spezifisch sind. Eine
sichere Diagnose ist aber nur möglich entweder über ein Blotting-Verfahren mit
anschließender Hybridisierung oder mittels Sequenzierung des PCR-Produktes. Dazu ist in
der Regel vorher eine Klonierung des Produktes in einen geeigneten Vektor nötig.
5.8.1 Reverse Transkription
Während der reversen Transkription wird die isolierte mRNA (s. 5.5.1) in cDNA
umgewandelt. Als Enzym wird entweder eine reverse Transkriptase von aviären
Myeloblastosis-Virus (AMV), vom Molony murinen Leukämie-Virus (MMLV), vom
humanen Immundefizienzvirus (HIV) oder eine Omniscript reverse Transkriptase eingesetzt.

Material & Methoden 80
Das sind natürlich vorkommende reverse Transkriptasen, welche von Retroviren produziert
werden.
Bei der analytischen PCR wird Oligo(dT) als Primer eingesetzt, damit alle mRNA mit
poly(A)-Schwanz hybridisiert und in cDNA umgeschrieben wird.
Die reverse Transkription wird mit Hilfe des Omniscript RT-Kit der Firma Qiagen
durchgeführt.
- 2 µl 10x RT-Puffer (Endkonzentration 1x)
Analytische PCR
- 2 µl dNTP - Mix (je 5 mM, Endkonzentration je 0,5 mM)
- 2 µl Oligo(dT)12-18-Primer (10 µM, Endkonzentration 1 µM)
- 1 µl RNase-Inhibitor (10 U/µl)
- 1 µl Omniscript Reverse Transkriptase (4 U)
- bis 2 µg Gesamt-RNA (Volumen variabel)
- Aqua bidest. Nuclease-frei (Volumen variabel)
Gesamtvolumen: 20 µl
Die RNA wird zunächst 5 min bei 65 °C erwärmt, um Sekundärstrukturen zu zerstören,
anschließend auf 4 °C abgekühlt und das Wasser hinzugegeben. Die anderen Komponenten
werden als Mastermix in entsprechender Menge je nach Probenzahl vorbereitet und zu der
RNA hinzugefügt. Die Reaktion dauert 1 h bei 37 °C. Abschließend erfolgt eine Inaktivierung
der reversen Transkriptase durch 5 min bei 93 °C.
5.8.2 PCR
Bei der PCR erfolgt die Amplifikation der cDNA aus der reversen Transkription. Theoretisch
kommt es ab dem dritten Zyklus einer PCR-Reaktion in jedem Zyklus zu einer Verdopplung
der DNA-Sequenz, welche unendlich weiterläuft. In der logarithmischen Darstellung ergibt
sich dabei eine Gerade. In der Realität jedoch kommt es durch die Anreicherung der DNA,

Material & Methoden 81
den Verbrauch der freien Nukleotide und den zunehmenden Aktivitätsverlust des Enzyms zu
einer Sättigung. Für eine quantitative PCR ist es aber nur möglich, eine exakte Bestimmung
der Mengenverhältnisse zu erhalten, wenn die Reaktion sich noch nicht in der Sättigungsphase
befindet. Aus diesem Grund ist eine genaue Bestimmung des linearen
Amplifikationsbereiches vor der quantitativen PCR notwendig (KÖHLER et al. 1995). Bei
einer analytischen PCR kann dagegen auch in diesen Bereich hinein amplifiziert werden.
Im folgenden sind die verwendeten Primer grafisch und in der Sequenz dargestellt, sowie ein
Zyklusablauf mit den eingestellten Temperaturen. Die genaue Zyklusanzahl schwankt je nach
Experiment und wird daher zusätzlich im Ergebnisteil dieser Arbeit bei jedem Experiment mit
angegeben.
Mesotocin-PCR
Upstream-Primer: 5' - TGC CCC ATC GGG GGT AAG CGT G - 3' (Position 78)
Downstream-Primer: 5' - ATG GTG CTG GGT GCT GCG CTG G - 3' (Position 420)
Fragmentgröße: 364 bp
Die beiden Primer sind Intron-überspannend (angedeutet durch die schwarzen Pfeile über dem
kodierenden Genstrang), daher kann kontaminierende DNA in der mRNA-Probe anhand des
größeren Fragmentes unterschieden werden.
5' SP MT Neurophysin
3'
364 bp
Abb. 5-1: Grafische Darstellung der eingesetzten Primer für die MT-PCR anhand des MT-Precursor-
Moleküls. Die Position der Primer ist dargestellt durch die unteren Pfeile, dazwischen ist die Fragmentgröße
beschrieben. Die oberen Stellen markieren die Spleißstellen der Introns in Analogie zum AVT-Gen. Das MT-
Gen ist bisher nur in der cDNA-Sequenz bekannt. SP = Signalpeptid, MT = Mesotocin

Material & Methoden 82
Zyklusverlauf:
Temperatur 95°C 58°C 72°C 95°C 58°C 72°C 95°C 58°C 72°C
Dauer 5 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 5 min
Zykluszahl 1 x 1
Vasotocin-PCR
Upstream-Primer: 5'- CTG GGT GAT ACA GCC TTG CGG CA - 3' (Position 140)
Downstream-Primer: 5' - GGC GTC CAT GGC ACA TGT GTC A - 3' (Position 385)
Fragmentgröße: 246 bp
Die beiden Primer sind ebenfalls Intron-überspannend (s.o.), daher kann kontaminierende
DNA in der mRNA-Probe anhand des größeren Fragmentes unterschieden werden.
5' SP VT Neurophysin GP
3'
Abb. 5-2: Grafische Darstellung der eingesetzten Primer für die AVT-PCR anhand des AVT-Precursor-
Moleküls. Die Position der Primer ist dargestellt durch die unteren Pfeile, dazwischen ist die Fragmentgröße
beschrieben. Die oberen Stellen markieren die Spleißstellen der Introns. SP = Signalpeptid, VT = Vasotocin;
GP = Glykopeptid
Zyklusverlauf:
246 bp
Temperatur 95°C 55°C 72°C 95°C 55°C 72°C 95°C 55°C 72°C
Dauer 5 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 5 min
Zykluszahl 1 x 1

Material & Methoden 83
Mesotocin-Rezeptor-PCR
Upstream-Primer: 5'- GCT GAG CGT CTG CTA CGG CCT C - 3' (Position 58)
Downstream-Primer: 5' - CGC CAG CAC GAT GAT GAA GGT C - 3' (Position 224)
Fragmentgröße: 188 bp
Von der cDNA des MT-Rezeptors sind bisher erst 248 bp kloniert. Durch Vergleich mit der
Datenbank-Sequenz des OT-Rezeptors handelt es sich wahrscheinlich um ein Fragment
zwischen der dritten und vierten transmembranen Domäne des Rezeptors. Bisher ist kein
Intron-überspannendes Fragment kloniert, daher ist vor der PCR ein Verdau der mRNA mit
DNase I nötig, um eine Amplifikation kontaminierender DNA zu verhindern.
Zyklusverlauf:
Temperatur 95°C 60°C 72°C 95°C 60°C 72°C 95°C 60°C 72°C
Dauer 5 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 5 min
Zykluszahl 1 x 1
Verdau von mRNA mit DNase I zur Eliminierung kontaminierender DNA
- 20 µg präzipitierte Gesamt-RNA
- 95 µl DNase-Lösung
- 1 µl 0,1 M DTT-Lösung
- 2 µl RNase-Inhibitor RNasin
- 2 µl DNase I
Lösung 30 min bei 37 °C inkubieren. Anschließend die Reaktion stoppen mit 2 µl 0,5 M
EDTA-Lösung, 2 µl 10 % SDS-Lösung und 200 µl DEPC-Wasser. Anschließend folgt eine

Material & Methoden 84
Phenol / Chloroform-Extraktion mit einem Reinigungsschritt in 25 % 0,1 M Natriumacetat- /
75 % Ethanol-Lösung.
5.8.3 Kontrolle der Spezifität der PCR-Produkte
Um sicherzustellen, daß mit den entsprechenden Primern auch wirklich spezifisch MT, AVT
und MT-Rezeptor-Fragmente amplifiziert wurden, wurden jeweils die PCR-Aliquots einmal
kloniert und anschließend sequenziert. Zur Klonierung der PCR-Produkte mit den glatten
Enden, wie sie bei Verwendung der Vent Polymerase entstehen, wurde ein Kit der Fa.
Invitrogen ® verwendet (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit).
Die DNA- Konzentration des PCR-Produktes wird mit sterilem Wasser eingestellt auf 10 –
20 ng/µl. Dieser Ansatz mit einem Volumen von 0,5 bis 3 µl wird mit 1 µl TOPO-Vektor und
A. bidest. auf ein Gesamtvolumen von 5 µl eingestellt, gemischt und 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgt die weitere Aufbewahrung auf Eis. Zu den
aliquotierten kompetenten Zellen des Kits werden 2 µl ß-Mercaptoethanol gegeben. Von dem
PCR-Vektor-Ansatz-Gemisch werden 2 µl zu den Zellen pipettiert, vorsichtig gemischt und
30 min im Eis inkubiert. Ein Hitzeschock von 30 s bei 42 °C ermöglicht die Aufnahme des
Vektors in die Zellen. Durch anschließendes Abkühlen für 2 min auf Eis werden die
geöffneten Poren der Zellmembran wieder geschlossen. 250 µl Medium werden
hinzugegeben, und die Suspension wird 1 h bei 37 °C im Brutschrank 46 unter Schütteln
inkubiert. Je 50-100 µl des Ansatzes wird dann auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin
ausgespatelt und über Nacht im Brutschrank inkubiert.
Nach einer Maxipräparation (s. 5.1.4) wurde der Vektor mit dem klonierten PCR-Fragment
mittels ALF-Sequenzierung am Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
analysiert. Dabei handelt es sich um eine automatisierte Sequenzierung nach der Sanger-
Coulson-Methode. Hierzu wird ein M13-Primer eingesetzt, welcher an einer bestimmten
Sequenz des linearisierten Vektors rechts bzw. links der Klonierungsstelle binden kann. Durch
diese Hybridisierung wird eine Synthese eines Komplementärstranges mittels des Klenow-
Enzyms ermöglicht. Jedoch wird von einem der vier freien Nukleotide ein radioaktives

Material & Methoden 85
Didesoxynucleotid eingesetzt. Das führt dazu, daß nach Einbau dieses modifizierten
Nukleotids die Strangsynthese abgebrochen wird. Das Verhältnis zwischen modifiziertem und
normalem Nukleotid bestimmt, wie weit die Strangsynthese erfolgen kann. Für jedes der vier
Nukleotide muß ein getrennter Ansatz gemacht werden. Anschließend werden die
entstandenen Fragmente auf hochauflösenden Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt. Nach
Autoradiographie kann dann die Gensequenz abgelesen werden.
5.9 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm „Statistica“ (SoftStat Inc., Tulsa,
USA). Für die ontogenetische Untersuchung wurde der student’s t-Test verwendet für die
Untersuchung der Geschlechtsunterschiede in den einzelnen Altersstufen. Für die Bewertung
der Altersunterschiede wurde eine ANOVA-Analyse mit anschließendem LSD-Test benutzt.
Die Untersuchung der Unterschiede zwischen AVT und MT sowie die quantitative
Untersuchung der ISH wurde mit dem student’s t-Test bewertet. Die Signifikanzgrenze lag
jeweils bei p
46 Melag Brutschrank Incubat, Typ 80, MAX RUDSCHUK GMBH, Celle

Ergebnisse 86
6 Ergebnisse
Zuerst mußte die Spezifität der eingesetzten Sonden kontrolliert werden, bevor sie jeweils für
die Versuche eingesetzt wurden. Es folgte zunächst eine ontogenetische Untersuchung der
MT-Genexpression, um Anhaltspunkte für den Verlauf des mRNA-Gehaltes und die
Morphologie des MT-Systems zu bekommen. Diese Daten wurden dann mit denen des AVT-
Systems bezüglich Entwicklung und Quantität der Genexpression verglichen. Anschließend
wurde nach MT-Genexpression in extraneuronalen Geweben gesucht, um über eine solche
Expression Hinweise auf eine mögliche physiologische Bedeutung des Mesotocins zu
bekommen. Mit in diese Untersuchungen einbezogen wurde auch die Auswirkung
verschiedener physiologischer Stimuli auf die Länge des poly(A)-Schwanzes von AVT
mRNA und MT mRNA. Zum Schluß sollte die Auswirkung osmotischer Stimulation auf die
hypothalamische Genexpression von MT untersucht werden.
6.1 Restriktion der DNA-Fragmente
Die eingesetzten Sonden wurden zur Lagerung in Plasmide in E. coli-Bakterienstämme
transformiert. Um sie einsetzen zu können, müssen sie aus den isolierten Plasmiden mittels
Restriktionsenzymen herausgeschnitten werden. Abb. 6-1 zeigt das Ergebnis einer solchen
Restriktion für die eingesetzten Sonden für AVT, MT und MTR.

Ergebnisse 87
A
bp
2176
298
234 /
220
LS VI AVT MT MTR LS III
Abb. 6-1: Restriktion der Sonden-DNA aus Plasmiden. A: Gel einer Plasmidpräparation. LS VI =
Längenstandard VI, AVT = AVT 3’-Sonde: Restriktion mit PstI und XhoI ergibt ein Sondenfragment von 270
bp und ein Bluescript-Fragment von 2,9 Kb, MT = MT-Sonde, Restriktion mit PstI, Fragment 220 bp, Vektor 3
kb, MTR = MTR-Sonde, Restriktion mit NcoI und NotI;, Fragment 290 bp, Vektor 3 kb, LS III =
Längenstandard III; B: Schematische Darstellung des Plasmidaufbaus und der Enzymschnittstellen. Amp =
Ampicillin-Resistenzgen
Alle Plasmide besitzen ein Gen für Ampicillin-Restistenz, um eine Selektion plasmid-
tragender Klone auf einem Selektivnährboden mit Ampicillin zu ermöglichen.
bp
B
3530
2027
pBluescript
PstI XhoI
pGEM
PstI
PstI
pGEM T
NcoI NotI
Amp
Amp
Amp

Ergebnisse 88
6.2 Spezifität der Sonden
6.2.1 Southern Blot
In dieser Arbeit wurde der Southern Blot benutzt, um zu kontrollieren, ob die Mesotocin- und
AVT-Sonden unterschiedliche Sequenzen hybridisieren und somit spezifisch für das jeweilige
Gen sind. Da jeweils ein großer Teil des 3'-Endes des Gens im Exon 3 codiert wird, und die
cDNA-Sonden nur einem Bereich innerhalb des Exon 3 komplementär und nicht
intronüberspannend sind, können die Sonden auch für den Southern Blot verwendet werden.
Da die Sonden doppelsträngig sind und mit Random Priming markiert werden, ist auch der
komplementäre Strang zur DNA vorhanden. Die DNA wurde mittels zufällig ausgewählter
Restriktionsenzyme in zahlreiche Fragmente zerlegt. Bei der Hybridisierung der Southern
Blots mit der MT-Sonde (Abb. 6-2A) und der AVT-Sonde (Abb. 6-3B) zeigte sich ein sehr
ähnliches Restriktionsmuster für beide Gene.
1 2 3 4 5 6 7 8
A
bp
21226
5148
2027
1584
947
1 2 3 4 5 6 7 8
Abb. 6-2: Restriktionsmuster von Hühnerblut-DNA. A) Blot hybridisiert mit Mesotocin 3’ cDNA-Sonde;
B) Blot hybridisiert mit AVT 3’ cDNA-Sonde. Restriktionsenzyme: 1 = PstI, 2 = BamHI, 3 = HindII, 4 = XhoI,
5 = PvuII, 6 = EcoRI, 7 = XbaI, 8= SalI
Unterschiedlich große Fragmente ergaben sich jedoch bei Restriktion mit HindII. Hier ist die
mit der AVT-Sonde markierte Bande größer ist (ca. 23 kb) als die mit der MT-Sonde (ca.
10 kb). Bei der Restriktion mit PvuII gibt es mit der AVT-Sonde zwei Fragmente (ca. 0,3 und
ca. 1,4 kb), jedoch nur eines mit der Mesotocin-Sonde (ca. 6 kb). Da beide Sonden jedoch das
3'-Ende des Gens hybridisieren, müßten die Signale, sollte es sich um das gleiche Gen
B
bp
21226
5148
2027
1584
947

Ergebnisse 89
handeln, auch an gleicher Stelle hybridisieren. Eine unterschiedliche Gensequenz ist Ursache
dieser Unterschiede.
6.2.2 Northern Blot
Bei der Northern Hybridisierung kann ein Fragment in der Größe von ca. 600 bp identifiziert
werden (Abb. 6-3A). Auch mit höherprozentigen Agarose-Gelen konnte aber im Vergleich zu
AVT (Abb. 6-3B) keine unterschiedliche Größe der mRNA identifiziert werden.
A
1 2 3 4 5 6
Abb. 6-3: Northern Blot hybridisiert mit A) Mesotocin cDNA-Sonde; B) AVT cDNA-Sonde. Die
Markierung bezeichnet die Lage der 18S- rRNA Bande (1,2 kb). 1= adulter Hahn, LB; 2 = adulte Henne, LB; 3
= D42 LSL weiblich; 4 = D42 LSL männlich; 5 = D42 LB männlich; 6 = D42 LB weiblich
Wurde dagegen die RNA vor der elektrophoretischen Auftrennung mit RNase H behandelt
und so der Poly(A)-Schwanz der mRNA entfernt, so ist bei einer Auftrennung in
niedrigerprozentigen denaturierenden Agarosegelen ein Größenunterschied von ca. 50 bp
zwischen AVT mRNA und MT mRNA sichtbar (Abb. 6-4A). Außerdem wird der
Größenunterschied zur unbehandelten mRNA durch die Entfernung des poly(A)-Schwanzes
deutlich. Auch hier ist für AVT ein Größenunterschied von ca. 50 bp, für MT von ca. 100 bp
sichtbar. Der poly(A)-Schwanz der MT mRNA ist damit länger als der der AVT mRNA.
B
1 2 3 4 5 6

Ergebnisse 90
A
1 2 3 4 5 6
AVT MT
2176
1766
1230
1033
Abb. 6-4: RNaseH-Verdau von Gesamt-RNA. A) Northern Blot hybridisiert mit Mesotocin cDNA-Sonde und
AVT cDNA-Sonde. mRNA aus dem Hypothalamus, 2: hybridisiert mit AVT cDNA; 3: nach Verdau mit RNase
H, hybridisiert mit AVT cDNA; 4: nach Verdau mit RNase H, hybridisiert mit MT cDNA; 5: hybridisiert mit
MT cDNA. Bahn 1, 6: DNA-Längenstandard 6. B) Dazugehörendes Agarosegel.
bp
653
517
B
1 2 3 4 5 6
B

Ergebnisse 91
6.2.3 In-Situ-Hybridisierung
RNase A- Behandlung
Bei Vorbehandlung der Gewebeschnitte mit RNase A vor der Hybridisierung konnten keine
Hybridisierungssignale in den Zellen nachgewiesen werden (Abb. 6-5A). Auch nach einer
verlängerten Expositionszeit von 16 Tagen waren keine Granula sichtbar. Wurden die
Schnitte hingegen zweimal mit Puffer ohne RNase A behandelt, war kein Unterschied zu
normal hybridisierten Schnitten sichtbar (Abb.6-5B).
A B
Abb. 6-5: Kontrollen bei In situ Hybridisierung im Gehirn mit RNase A-Verdau vor der Hybridisierung.
Beispielhaft gezeigt ist der PVN, hybridisiert mit MT-Sonde. A) Behandlung mit RNase A ; B) Behandlung
mit RNase-Puffer ohne RNase. Der Pfeil bezeichnet den III. Ventrikel. Längenmaßstab: 400 µm

Ergebnisse 92
Kompetitive Hemmung der Sondenhybridisierung
Wurde vor der Zugabe der markierten Sonde eine Hybridisierung mit unmarkierter MT-Sonde
durchgeführt, so konnte bei Einsatz von radioaktiver MT-cDNA-Sonde eine deutliche
Signalreduktion festgestellt werden (Abb. 6-6A), während bei Verwendung von AVT-Sonde
bei der ersten Hybridisierung Signale normaler Stärke mit radioaktiver MT-cDNA-Sonde
sichtbar waren (Abb.6-6B). Wurde statt mit Sonde nur mit Hybridisierungspuffer
vorhybridisiert, ergab sich keine Reduktion der Signalstärke.
A B
Abb. 6-6: Kontrolle der Sondenspezifität mittels kompetitiver Hemmung. A) Hybridisierung mit
unmarkierter und anschließend mit markierter MT-Sonde; B) Hybridisierung mit unmarkierter AVT-Sonde
und anschließend mit radioaktiver MT-Sonde. Der Pfeil zeigt auf den III. Ventrikel. Längenmaßstab: 400 µm.
Ziel des Versuches war es, durch eine Absättigung der vorhandenen mRNA mit unmarkierter
Sonde eine Hybridisierung der markierten Sonde zu verhindern. Die unmarkierte Sonde
wurde in 100fachem Überschuß im Verhältnis zur markierten Sonde eingesetzt, um eine
ausreichende Absättigung zu erreichen.

Ergebnisse 93
6.2.4 Immunhistochemie
Zum Nachweis der Spezifität der mRNA-Detektion in der ISH wurde eine
immunhistochemische (IHC) Untersuchung des Hypothalamus durchgeführt. Da bei einer
einfachen IHC keine Antikörper-Bindung an ein Peptid-Produkt nachzuweisen war, wurde
mittels Colchicin der axonale Peptid-Transport in die Neurohypophyse unterbunden. Einen
Tag nach der icv Injektion von Colchicin wurde das Material gewonnen.
Nach der Colchicin-Behandlung ließ sich Peptid in den Regionen der mRNA-Transkription
nachweisen (Abb. 6-7).
A B
B
Abb. 6-7: A) Immunhistochemischer Nachweis von MT im Hypothalamus (PVN), Längenstandard: 500 µm.
B) Ausschnitt aus A), Längenstandard: 200 µm

Ergebnisse 94
6.3 Ontogenese der Nonapeptid-Genexpression im Hypothalamus
Mittels Northern Blot wurde eine quantitative und mittels ISH eine morphologische
Untersuchung der Genexpression im Hypothalamus von Legehühnern durchgeführt. Dazu
wurden Tiere der embryonalen (E) und postnatalen (D) Stadien untersucht, d.h. am 14., 18.
und 21. Tag der Inkubation (E14, E18, E21) sowie postnatal an D14, D35, D49, D70, D112
und im adulten Stadium (älter als 6 Monate) nach dem Schlupf. Der Northern Blot wurde zur
Quantifizierung verwendet, da er im Vergleich zur ISH eine größere Möglichkeit der
Standardisierung bietet (Kontrollhybridisierung mit 18S rRNA) und die gleichzeitige
Untersuchung mehrerer Proben gleichzeitig unter gleichen Bedingungen erlaubt. Zusätzlich
entfällt die subjektive visuelle Auszählung von Hybridisierungssignalen auf Objektträgern.
6.3.1 Morphologie
Silbergranula waren über den Zellkörpern folgender Kerngebiete im Zwischenhirn erkennbar:
Nucleus supraopticus (SON), Nucleus paraventricularis (PVN), Bed nucleus der Stria
terminalis (BnST) und Nucleus dorsolateralis anterior, pars magnocellularis (DLAmc).
Nucleus supraopticus
Im Nucleus supraopticus (SON) ist eine Gruppe von MT mRNA-positiven Neuronen
lokalisiert (Abb. 6-8A, B). In der rostro-caudalen Schnittfolge ist dies die rostrale Zellgruppe,
die MT mRNA exprimiert Die Zellen in diesem Kernbereich sind sowohl im ventralen wie
auch im externen Teil lokalisiert. Es handelt sich fast ausschließlich um magnozelluläre
Neurone. Zwischen männlichen und weiblichen Tieren ist hier kein offensichtlicher
Unterschied in der Zahl der markierten Zellen sichtbar. Eine Zellzählung erfolgte nicht. Bei
jüngeren Tieren (Abb. 6-8A) ist die Entfernung zum ventralen Gehirnboden größer als bei
älteren Tieren.

Ergebnisse 95
A
B
SONe
SONe
SONv
SON
Chiasma
opticum
TSM
lateraler
Ventrikel
III.
Ventrikel
SONv
Abb. 6-8: Hybridisierungssignale im SON. A) E14, männlich; B) adulter Hahn. SONe = externer Teil des
SON, SONv = ventraler Teil des SON; TSM = Tractus setomesencephalicus. Längenstandard: 400 µm

Ergebnisse 96
Nucleus paraventricularis
In diesem Kerngebiet sind die Zellen in einem typischen Schmetterlingsmuster angeordnet
(Abb. 6-9B). Hinsichtlich des Geschlechts der Tiere sind keine Unterschiede sichtbar. Die
Größe des PVN erscheint bei Hähnen und Hennen gleich. Eine genaue Zählung der
exprimierenden Zellen erfolgte nicht. Bei jüngeren Tieren sind nur wenige Zellen und diese
auch nur mit einer geringen Menge Silbergranula markiert (Abb. 6-9A). Auch im PVN sind
vor allem magnozelluläre Neurone an der Genexpression des MT-Gens beteiligt. Die
Übergänge zwischen SON und PVN sind fließend, es werden auch Zellen im Nucleus
suprachiasmaticus (SCN) markiert. Eine genaue Abgrenzung ist nicht immer möglich.

Ergebnisse 97
B
SCN
A
Nucleus paraventricularis
( PVN )
Abb. 6-9: MT-Zellen im PVN. A) E14 männlich, B) Hahn adult. Deutlich wird die Schmetterlingsstruktur
der Zellverteilung. Der Pfeil zeigt den III. Ventrikel an. SCN = Nucleus suprachiasmaticus.
Längenstandard: 400 µm
.
lateraler
Ventrikel
III.
Ventrikel
Chiasma
opticum

Ergebnisse 98
Besonders im PVN kann gezeigt werden, daß die Silbergranula im Zytoplasma der Zelle
lokalisiert sind. Die cDNA-Sonde bindet somit an mRNA (Abb. 6-10A). Allerdings ist neben
einer Lokalisation im Perikaryon auch eine axonale Lokalisation in Zellen nachzuweisen
(Abb. 6-10B-D).
A B
C
*
Abb. 6-10: A) Lokalisierung der Signale im Zytoplasma der Neuronen, Längenstandard: 100 µm; B) Signal
im Axon, Längenstandard: 100 µm; C) Signale in den Zellfortsätzen, Längenstandard: 400 µm;
D) Vergrößerung aus C). Die sich entsprechenden Zellen sind mit Pfeil bzw. Stern gekennzeichnet,
Längenstandard: 100 µm.
D
*

Ergebnisse 99
Nucleus dorsolateralis anterior, Pars magnocellularis
In diesem Kernbereich lassen sich jeweils nur einige wenige Zellen nachweisen, jedoch sind
bei jedem Geschlecht und in jedem Altersstadium MT exprimierende Zellen in diesem
Kernbereich erkennbar (Abb. 6-11).
A
B
lateraler
Ventrikel
Chiasma
opticum
DLAmc
III.
Ventrikel
Abb. 6-11: MT mRNA Neurone im DLAmc. A) adulter Hahn, B) adulte Henne. Das Kerngebiet besteht bei
beiden Geschlechtern aus ca. 3-8 Neuronen. Längenstandard: 400 µm.

Ergebnisse 100
Bed nucleus der Stria terminalis (BnST)
Der BnST des Huhnes setzt sich zusammen aus einem magnozellulären (BnSTmc) und einem
parvozellulären Anteil (BnSTpc). Markierte Zellen können nur im magnozellulären Bereich
unmittelbar unterhalb des lateralen Ventrikels identifiziert werden (Abb. 6-12A, B). Dabei
sind bei Hähnen (Abb. 6-12A) und bei Hennen (Abb. 6-12B) jeweils 5-8 MT mRNA-positive
Neurone pro Schnitt erkennbar. Ein Sexdimorphismus ist nicht erkennbar.
Rostro-ventral vom magnozellulären Bereich liegen parvozelluläre Neurone unmittelbar über
der vorderen Komissur, der dorsalen Begrenzung des Hypothalamus. In diesen
parvozellulären Neuronen sind im Gegensatz zu den Neuronen im BnSTmc in keinem
Altersstadium und bei keinem Geschlecht Signale mit den hier angewandten Methoden
nachweisbar (Abb. 6-12C, D). Auch hier besteht kein Unterschied zwischen Hähnen (Abb. 6-
12C) und Hennen (Abb. 6-12 D). Dagegen wird AVT mRNA auch im parvozellulären BnST
erwachsener männlicher Tiere exprimiert (Abb. 6-12E).
lateraler Ventrikel
lateraler Ventrikel
a) b)
lateraler Ventrikel
lateraler Ventrikel

Ergebnisse 101
A B
C
E
lateraler
Ventrikel
PVN
lateraler
Ventrikel
BnSTmc
lateraler
Ventrikel
lateraler
Ventrikel
lateraler
Ventrikel
vordere
Kommissur
Chiasma
opticum III.
Ventrikel
Chiasma
opticum
lateraler
Ventrikel
Abb. 6-12: Nonapetid mRNA im Bed nucleus der Stria terminalis: MT mRNA im Pars magnocellularis A)
bei adultem Hahn; B) bei adulter Henne. MT mRNA im Pars parvocellularis: C) bei adultem Hahn, D) bei
adulter Henne. E) AVT mRNA im Pars parvocellularis eines adulten Hahnes (Pfeile). Der Umriß des lateralen
Ventrikels wurde nachgezeichnet. Längenstandard: 400 µm
D
lateraler
Ventrikel

Ergebnisse 102
6.3.2 Quantitative Analyse
Mesotocin
Bei der quantitativen Analyse der Genexpression mittels Northern Blot kann ein
kontinuierlicher Anstieg an MT mRNA in den Zellen des Hypothalamus nachgewiesen
werden. Bis auf die adulten Tiere ist in keiner Altersstufe ein signifikanter Unterschied
zwischen männlichen und weiblichen Tieren nachweisbar. Im adulten Stadium hingegen ist
bei Hähnen ca. die dreifache Menge mRNA im Vergleich zu Hennen meßbar (Abb. 6-13).
Beim Vergleich der Altersstadien untereinander ist auch nur eine Signifikanz zwischen
adulten Tieren und den jüngeren Stadien zu ermitteln, verglichen mit dem jeweils eine Stufe
jüngeren Alter. Auch im Verhältnis zu den jüngeren Alterstufen ist der Anstieg der MT
Genexpression im Hypothalamus der adulten Hähne signifikant. Dabei stellen sich die
Unterschiede wie folgt da:
Altersstadium p-Wert Signifikanz
E14 0,000074 ***
E18 0,000160 ***
D1 0,000154 ***
D14 0,000216 ***
D35 0,003437 ***
D49 0,03858 *
D70 0,1148
D112 0,003093 ***
Tabelle 5: Einfluß des Alters auf die Genexpression von MT mRNA im
Hypothalamus. Die Altersstadien werden mit den adulten Hähnen verglichen.

Ergebnisse 103
3000
2500
2000
1500
1000
500
A
0
% MT mRNA (E14 männlich = 100 %)
männlich
weiblich p = 0,019
E14 E18 D1 D14 D35 D49 D70 D112 adult
1 2 3 4 5 6 7 8 9 LS
B
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 LS
Alter der Tiere
1 2 3 4 5 6 7 8 9 LS
Abb. 6-13: A) Quantitative Untersuchung der MT Genexpression im Hypothalamus von Hühnern; n= 3
Pools. Mittelwert und SEM. B) Gel eines Blots; C) Hybridisierung mit MT cDNA-Sonde, Expositionszeit:
21,5 h; D) Hybridisierung mit 18S-Sonde als Kontrolle (2 h). (E = embryonal, D = nach dem Schlupf). (1 +
2 = adult , 3 + 4 = D112, 5 + 6 = D70, 7 + 8 = D49, 9 = D35; 1, 3, 5, 7, 9 = männlich, 2, 4, 6, 8 = weiblich),
LS = Längenstandard
C

Ergebnisse 104
Bei der qualitativen ISH sind keine Unterschiede in der Verteilung der Signale erkennbar
(Abb. 6-14). Unterschiede lassen sich jeweils nur in Bezug auf die Anzahl der Signale pro
Zelle bzw. in der Anzahl der Zellen pro Kerngebiet feststellen, aber in keinem der
beschriebenen Kerngebiete ist eine sexuell unterschiedliche Expression des MT-Gens
sichtbar, sofern nur die grobe mikroskopische Untersuchung ohne Quantifizierung
herangezogen wird.
A
a) b)
Abb. 6-14: MT-Genexpression im PVN: A) Henne, B) Hahn. Der Pfeil bezeichnet die Lage des III.
Ventrikels.
Um diese Diskrepanz zwischen der Northern Blot-Analyse und der radioaktiven ISH mit
Silberemulsion-Detektion zu untersuchen, wurde daher die ISH quantitativ durchgeführt.
Dazu wurden 2x 3 Gehirne pro Geschlecht simultan geschnitten und gleichzeitig hybridisiert.
Die Schnitte wurden dann mittels Mikroimager ausgewertet. So kann man die schnelle
Sättigung des Silberemulsions-Signals umgehen, da hier kein Silber oder ein Film geschwärzt
B

Ergebnisse 105
wird. Vielmehr bewirkt die direkte Auszählung freigesetzter Elektronen, daß keine Sättigung
eintreten kann und so eine quantitative Auswertung erleichtert wird. Vergleicht man die
Genexpression in SON und PVN zwischen adulten männlichen und weiblichen Tieren, so ist
auch nach Abzug des Hintergrundes in nicht hybridisierenden Gewebearealen ein
quantitativer Unterschied meßbar. Auffällig ist zudem aber auch, daß der Hintergrund bei
männlichen Tieren deutlich höher ausfällt als bei Hennen.
A
B
Abb. 6-15 (Anfang)
5 30 5 30
30
C D
E F
B

Ergebnisse 106
G
I K
L M
Abb. 6-15 (Fortsetzung)
H
5 30 5 30

Ergebnisse 107
N
2000
1500
1000
500
0
SON PVN
NUCLEUS
Abb. 6-15 : Quantitativer Vergleich der MT-Genexpression im Hypothalamus nach einer Stunde
Expositionszeit im Mikroimager. A) Stärke der Radioaktivität im SON eines erwachsenen Hahns; B) Stärke der
Radioaktivität im SON einer erwachsenen Henne C) korrespondierendes optisches Bild zu A;
D) korrespondierendes optisches Bild zu B; E) korrespondierendes autoradiografisches Bild zu A;
F) korrespondierendes autoradiografisches Bild zu B; G) Stärke der Radioaktivität im PVN eines erwachsenen
Hahns; H) Stärke der Radioaktivität im PVN einer erwachsenen Henne; I) korrespondierendes optisches Bild
zu E; K) korrespondierendes optisches Bild zu F; L) korrespondierendes autoradiografisches Bild zu G;
M) korrespondierendes autoradiografisches Bild zu H; N) grafische Darstellung der Unterschiede; n=6,
Mittelwert und SEM; . Der Rahmen in den optischen Bildern zeigt jeweils den Ausschnitt für das
autoradiografische Bild an. Längenstandard A-D und G-K: 1 mm; Längenstandard E-F und L-M: 500 µm
Während die Größe der Kerngebiete SON und PVN bei Hahn und Henne ungefähr gleich groß
ist, läßt sich ein quantitativer Unterschied in der Signalstärke pro Zelle ausmachen.
Arginin-Vasotocin
counts / 0,04 mm 2 männlich
p = 0,004
Die Ontogenese der AVT-Genexpression verläuft parallel, allerdings ist der quantitative
Unterschied zwischen adulten männlichen und weiblichen Tieren nicht so groß wie bei der
Ontogenese von MT. An D35 besteht ein signifikanter Unterschied zugunsten der Hennen.
Auch im Verlauf der AVT-Genexpression kommt es kurz vor Eintritt der Geschlechtsreife zu
einer Verminderung der mRNA-Synthese, bevor dann bei adulten Tieren die maximale
Expression erreicht wird (Abb. 6-16).
weiblich
p = 0,02

Ergebnisse 108
4000
3000
2000
1000
0
% mRNA (E14 männlich = 100 %)
männlich
weiblich
Abb. 6-16: Quantitative Untersuchung der AVT Genexpression im Hypothalamus von Hühnern
(E = embryonal, D = nach dem Schlupf); n= 3 Pools; Mittelwerte und SEM.
Die Genexpression in den verschiedenen Altersstadien ist auch eine Funktion des Alters, die
Unterschiede in den einzelnen Stadien zu den adulten Tieren ist in allen Stufen der
männlichen Tiere und in den meisten Stadien der weiblichen Tieren signifikant.
Alterstufe
männlich
p-Werte
p = 0,023
E14 E18 D1 D14 D35 D49 D70 D112 adult
Alter der Tiere
Signifikanzen
weiblich
p-Werte
Signifikanz
E14 0,0016 *** 0,00015 ***
E18 0,0036 *** 0,00032 ***
D1 0,0035 *** 0,00024 ***
D14 0,0047 *** 0,00881 ***
D35 0,02568 ** 0,00703 ***
D49 0,5225 n.s. 0,17314 n.s.
D70 0,1756 n.s. 0,57077 n.s.
D112 0,0034 *** 0,0046 ***
Tabelle 6: Einfluß des Alters auf die AVT Genexpression im Hypothalamus im Vergleich zu
adulten Tieren.

Ergebnisse 109
6.4 Vergleich zwischen AVT und MT mRNA Gehalt im Hypothalamus
Bei der ISH treten in der rostro-caudalen Schnittfolge durch den Hypothalamus zuerst die
AVT-Neurone auf, die im Vergleich zum MT eine größere rostro-caudale Ausbreitung haben.
Außerdem ist der PVN in seiner Schmetterlingsformation ausladender als bei MT. Zusätzlich
kommen einige Neuronengruppen, die eine Markierung für AVT mRNA zeigen, jedoch nicht
für MT mRNA. Ein Beispiel dafür ist der parvocelluläre BnST, welcher AVT Neurone
(Abb. 6-17A), jedoch keine MT Neurone (Abb. 6-17B) enthält
A
PVN
Abb. 6-17: A) AVT mRNA im BnSTpc bei adultem Hahn, B) fehlende MT mRNA im BnSTpc bei einem
adulten Hahn. Längenstandard: 400 µm.
Beim quantitativen Vergleich zwischen AVT und MT Genexpression mittels Northern Blot-
Technik wird deutlich, daß AVT, verglichen mit MT, einen größeren Anteil an der Menge der
gesamten mRNA des Hypothalamus hat. Der Unterschied zwischen den Mengen der beiden
Genprodukte ist zu jedem der untersuchten Altersstadien innerhalb des Geschlechts nach dem
Schlupf signifikant (Abb. 6-18), während in den embryonalen Alterstadien dieser Unterschied
noch geringer ist.
lateraler
Ventrikel
B lateraler
Ventrikel
AVT MT

Ergebnisse 110
A
1500
1250
1000
B
750
500
250
counts / mm 2 (x10 3 )
Alter der Tiere
AVT männlich
AVT weiblich
E14 E18 D1 D14 D35 D49 D70 D112 adult
1 2 3 4 5 6 7 8
MT männlich
MT weiblich
AVT
Abb. 6-18 : A) Quantitativer Vergleich der AVT- und MT-Genexpression in verschiedenen Altersstadien.
n = 3 Pools, Mittelwerte und SEM; B) Vergleich der Signalstärken auf dem Röntgenfilm. AVT- und MT-Filter
wurden über die gleiche Zeitdauer (3 Tage) exponiert, 18S für 1 Tag. (E = embryonal, D = nach dem Schlupf).
(1 + 2 = adult , 3 + 4 = D112, 5 + 6 = D70, 7 + 8 = D49, 9 = D35; 1, 3, 5, 7, 9 = männlich, 2, 4 , 6, 8 =
weiblich)
MT
18S

Ergebnisse 111
6.5 MT-Genexpression in peripheren Geweben
Die RT-PCR ergibt nach 35 Zyklen mit den Primern für MT lediglich eine deutliche Bande
im Hypothalamus (Abb. 6-19). In der Niere ist eine schwache Bande zu erkennen, welche in
den anderen untersuchten Geweben (Leber, Muskel, Hoden, Ovar und den unterschiedlichen
Abschnitten des Eileiters) nicht sichtbar ist. Eine Reamplifikation mit 2µl des ersten PCR-
Produktes ergibt dagegen eine deutliche Bande in der cDNA der Niere, während die anderen
Gewebe negativ sind. Der Hypothalamus wurde wegen der deutlichen Bande in der ersten
PCR-Runde nicht reamplifiziert. Die Richtigkeit der PCR-Produkte wurde über die Größe der
Fragmente, eine Restriktion und eine Klonierung der Hypothalamus-Bande verifiziert.
A
a)
B
H M L K T O In Ma Is U V H2O
K M T O In Ma Is U V H2O H2O
alt neu
Abb. 6-19: RT-PCR für MT mit der RNA verschiedener Gewebe A) nach 35 Zyklen PCR, B) nach
Reamplifikation von 2 µl des ersten PCR-Produktes in 35 PCR-Zyklen. H = Hypothalamus, M = Muskel,
N = Niere, L = Leber, T = Testis, O = Ovar, In = Infundibulum, Ma = Magnum, Is = Isthmus, U = Uterus,
V = Vagina.

Ergebnisse 112
Bei einer ISH von Nierengewebe mit MT-Sonde sind bei einer Expositionsdauer von 4
Wochen Signale in den Zellen der Nierentubuli erkennbar (Abb. 6-20).
A
B
Abb. 6-20: Genexpression von MT-mRNA in der Niere eines adulten normohydrierten Hahnes.
A) Dunkelfeld-Aufnahme eines Nierenschnittes; Längenstandard: 400 µm. Der Rahmen zeigt den Ausschnitt
von B). B) Hellfeld-Aufnahme des Ausschnitts von A). MT mRNA ist lokalisiert in Zellen der Nierentubuli.
Längenstandard: 100 µm.
Bei Dehydratation der Tiere für 48 h ändert sich die Zahl der radioaktiven Signale pro Schnitt
nicht signifikant.
Eine immunhistochemische Untersuchung der Niere auf MT-Peptid verlief negativ, was
allerdings im Hinblick auf die sehr niedrige Transkription des Gens nicht überraschend ist.
B

Ergebnisse 113
6.6 MT-Rezeptor-Genexpression in verschiedenen Geweben
Es lag ein ca. 248 bp-großes cDNA-Fragment aus Hypothalamus mRNA vor. Bei Vergleich
mit der Datenbank von MEDLINE ergeben sich folgende Homologien (Tabelle 7):
Tierart Rezeptor Expectation-Wert
maximale Homologie
von
Sequenzausschnitten
Rhesus-Affe OT 5x10 -14 91 %
Kaninchen OT 5x10 -14 89 %
Mensch OT 5x10 -14 92 %
Weißbüscheläffchen OT 5x10 -14 92 %
Aga-Kröte MT 3x10 -12 84 %
Schwein OT 1x10 -11 91 %
Rind OT 1x10 -11 91 %
Schaf OT 3x10 -9 89 %
Ratte OT 1x10 -8 97 %
Maus OT 8x10 -4 91 %
Tabelle 7: Homologien mit den 10 ähnlichsten Basenpaarsequenzen des MT-Rezeptor-Fragmentes gemäß
BLAST search in MEDLINE.
Aufgrund dieser Homologien wurde angenommen, daß es sich um ein Genfragment des MT-
Rezeptors handelt.
Ein Dot Blot soll erste Hinweise auf eventuell exprimierende Gewebe geben. Dabei zeigten
Hypothalamus, Ovidukt und (schwach) die Leber ein sichtbares Signal (Abb. 6-21).

Ergebnisse 114
Abb. 6-21: Dot Blot mit dem Fragment des MT-Rezeptors. Eingesetzt wurden 20 µg Gesamt-RNA
verschiedener Gewebe.
Im Northern Blot jedoch hybridisiert die Sonde mit einer mRNA von ca. 20000 bp Größe
(Abb. 6-22). Vermutlich hybridisiert hier genomische DNA, während die mRNA mit einer
erwarteten Größe von ca. 2,5 – 6 kb nicht in ausreichender Menge vorlag, um sie mit dem
Northern Blot nachzuweisen.
Aus diesem Grund wurde eine PCR entwickelt, welche einen Teil dieses Fragments
amplifizieren sollte. Da das Fragment nicht Intron-übergreifend ist, kann anhand der
Fragmentgröße eine Amplifikation genomischer DNA auch nicht ausgeschlossen werden.
Daher wurde die Gesamt-RNA vorher mit DNase I behandelt, um möglichst reine RNA zu
erhalten. Durch das Priming mit Oligo(dT) in der reversen Transkription sollte außerdem auch
eine zusätzliche Selektion auf mRNA erfolgen. Als Negativkontrolle dient hypothalamisches
und uterines Gewebe von Schwein.
Hypothalamus
Leber
Niere
Muskel
Testis
Ovar
Ovidukt

Ergebnisse 115
LS III Hypoth. Leber Niere Muskel Testis Ovar Ovidukt LS III LS I
Abb. 6-22: Northern Blot mit der MT-Rezeptor-Sonde. LS III = Längenstandard III DNA, Hypoth. =
Hypothalamus, LS I = Längenstandard I RNA.
Ein amplifiziertes Fragment in der erwarteten Größe von 188 bp konnte im Agarose-Gel
dargestellt werden, dabei waren folgende Gewebe positiv: Hypothalamus, Muskel, Niere
weiblich, Ovar, Infundibulum, Uterus, Vagina (Abb. 6-23). Proben ohne mRNA und mit
Schweine mRNA aus Hypothalamus bzw. Uterus waren negativ.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Abb. 6-23: PCR mit MT-Rezeptor-spezifischen Primern über 35 Zyklen. 1 = Hypothalamus, 2 = Muskel,
3 = Leber, 4 = Niere ♂, 5 = Niere ♀, 6 = Hoden, 7 = Ovar, 8 = Infundibulum, 9 = Magnum, 10 = Isthmus,
11 = Uterus, 12 = Vagina, 13 = Hypothalamus Schwein, 14 = Uterus Schwein, 15 = ohne RNA

Ergebnisse 116
6.7 Einfluß physiologischer Parameter auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes
Zur Untersuchung, ob unterschiedliche physiologische Parameter, die Länge des Poly(A)-
Schwanzes beeinflussen, wurde Gesamt-RNA mit RNase H verdaut. Gleichzeitig wurde
unverdaute RNA auf ein Gel aufgetragen, welches durch eine geringe Dichte (0,9 %) und eine
große Strecke der Auftrennung (> 20 cm) zur Darstellung geringer Größenunterschiede im
Bereich von 600 bis 700 bp geeignet ist.
Einfluß des Geschlechtes
MT
Das Geschlecht der Tiere hat keinen Einfluß auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von MT.
Sowohl bei unverdauter wie auch bei verdauter RNA sind die Banden bei männlichen und
weiblichen Tieren in der gleichen Höhe auf dem Gel lokalisiert (Abb. 6-24).
LS ƒ ‚ ‚ ƒ LS
nativ
RNase H
1230 bp
1033 bp
653 bp
Abb. 6-24: Einfluß des Geschlechtes auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes. nativ = ohne RNase H-, RNase
H = mit RNase H-Behandlung. LS = Längenstandard.
Die Profilanalyse ergibt für die männlichen Tiere eine Länge von 571 bp, für weibliche Tiere
von 589 bp.

Ergebnisse 117
AVT
Auch bei der AVT mRNA hat das Geschlecht keinen Einfluß auf die Länge des Poly(A)-
Schwanzes (Abb. 6-25).
Abb. 6-25: Einfluß des Geschlechtes auf die Länge des poly(A)-Schwanzes von AVT mRNA. nativ = ohne
RNase H-, RNase H = mit RNase H-Behandlung. LS = Längenstandard.
Die Profilanalyse ergibt eine Länge von 603 bp bei männlichen und 596 bp bei weiblichen
Tieren.
LS ƒ ‚ ‚ ƒ LS
nativ RNase H
1230 bp
1033 bp
653 bp

Ergebnisse 118
Einfluß des Alters
AVT
Die Länge des Poly(A)-Schwanzes wird vom Alter des Tieres beeinflußt. Bei den jüngeren
Tieren ist die mRNA ca. um 30 - 40 bp kürzer als die von erwachsenen Tieren (Embryo
männlich 588 bp, adulte Hähne 615 bp, Embryo weiblich 598 bp, adulte Hennen 639 bp).
Jedoch ist dieser Unterschied nach Verdau mit RNase H nicht mehr sichtbar (männliche
Embryonen 539 bp, Hähne adult 546 bp bzw. weibliche Embryonen 566 bp, Hennen 573 bp).
Daher ist die unterschiedliche Länge im Poly(A)-Schwanz lokalisiert (Abb. 6-26).
1230 bp
1033 bp
653 bp
LS E14 adult E14 adult LS E14 adult E14 adult
ƒ ‚
RNase H native RNA native RNA RNase H
Abb. 6-26: Einfluß des Alters auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von AVT mRNA. nativ = ohne RNase
H-Behandlung, RNase H = mit RNase H-Behandlung, LS = Längenstandard.

Ergebnisse 119
Einfluß des Wasser- und Elektrolythaushaltes
MT
Eine moderate Zunahme der Länge des Poly(A)-Schwanzes von MT mRNA läßt sich unter
Dehydrierung verzeichnen (Abb. 6-27).
LS NH DH NH DH LS
RNase H native RNA
Abb. 6-27: Einfluß von Dehydrierung auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von MT mRNA beim Hahn. NH
= normohydriert, DH = dehydriert, LS = Längenstandard
Die Zunahme der Länge des Poly(A)-Schwanzes ist aber gering (ca. 30 bp).
1230 bp
1033 bp
653 bp

Ergebnisse 120
AVT
Der Hydrierungszustand hat keinen sichtbaren Einfluß auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes
von AVT mRNA. Unter Normo- und Dehydratation beträgt der gemessene Unterschied in der
Länge des Poly(A)-Schwanzes nur ca. 10 bp (Abb. 6-28).
NH D NH DH LS NH DH NH DH
ƒ
Abb. 6-28: Einfluß einer Dehydrierung auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von AVT mRNA. 1,3=
normohydrierter Hahn, 2,4 = dehydrierter Hahn, 5, 7 = normohydrierte Henne, 6, 8 = dehydrierte Henne. LS =
Längenstandard
‚
RNase H nativ nativ RNase H
1230 bp
1033 bp
653 bp

Ergebnisse 121
6.8 Einfluß einer Dehydratation auf die hypophysäre MT mRNA-Konzentration
Um den Einfluß von osmotischem Stress auf die MT-Genexpression im Hypothalamus zu
untersuchen, wurde je 4 erwachsenen Hähnen und Hennen der Rasse LSL (10 Monate) für 48
Stunden das Wasser entzogen. Jede Probe wurde zweimal getestet, im zweiten Filtersatz
waren die Proben auf dem Gel zufällig verteilt (Abb. 6-29).
A
B
LS 1 2 3 4 5 6 7 8 LS
Abb. 6-29: MT-Genexpression im Hypothalamus normo- und dehydrierter Hähne und Hennen. A) Filter
hybridisiert mit MT-Sonde. LS = Längenstandard, Bahn 1 + 5 = männlich normohydriert, Bahn 2 + 6 =
männlich dehydriert, Bahn 3 + 7 = weiblich normohydriert, Bahn 4 + 8 = weiblich dehydriert. B)
Kontrollhybridisierung mit 18S-Sonde.
Zwischen den einzelnen Banden besteht lediglich ein quantitativer Unterschied zwischen den
männlichen und weiblichen Tieren. Damit wird das Ergebnis aus der ontogenetischen
Untersuchung bestätigt, jetzt mit einer anderen Hühnerlinie (LSL statt LB). Beim Vergleich
der Geschlechter ergibt im student’s t-Test ein deutlich signifikanter Unterschied zwischen
männlichen und weiblichen Tieren (p = 0,008).

Ergebnisse 122
250
200
150
100
50
0
% MT mRNA (Hahn normohydriert = 100 %)
Abb. 6-30: Einfluß von 48 h Dehydrierung auf die hypothalamische MT mRNA-Konzentration; n = 4,
Mittelwerte und SEM
Bei Hähnen ist unter 48 h Dehydrierung eine geringe Zunahme der MT mRNA im
Hypothalamus festzustellen, jedoch verfehlt er deutlich die Signifikanz (p = 0,38). Bei
Hennen ist dagegen ist kein Unterschied in der MT mRNA-Konzentration im Hypothalamus
unter Dehydrierung meßbar.(p = 0,91).
normohydriert dehydriert
männlich
weiblich

Diskussion 123
7 Diskussion
Die neurohypophysären Hormone des Huhnes, AVT und MT, sind entwicklungsgeschichtlich
sehr alt. Schon bei Cyclostomen wird Isotocin, ein Nonapeptid mit sehr ähnlicher
Aminosäure-Sequenz, gebildet. Durch verschiedene Punktmutationen und eine
Genduplikation bildeten sich zwei Hormongruppen, die vasopressinerge mit Vasotocin bei
Reptilien, Amphibien und Vögeln und Vasopressin bei den Säugetieren, und die oxytocinerge
mit Mesotocin und Oxytocin. Während die „klassischen“ physiologischen Funktionen bei den
Säugetieren für beide Gruppen schon gut beschrieben sind, liegen bisher bei den anderen
Vertebraten fast ausschließlich Daten über AVT vor. Gesicherte Daten und eine Funktion für
MT dagegen fehlen. Einerseits liegt das begründet in der großen strukturellen Homologie der
beiden Peptide. Beide unterscheiden sich nur in einer einzigen AS: bei AVT steht Arginin an
Position 8, bei MT Isoleucin. Das führt dazu, daß Antikörper-basierten Techniken gewisse
Grenzen gesetzt sind, da Kreuzreaktionen schwer zu vermeiden sind. Bei Rezeptorstudien
kann darüber hinaus auch eine kreuzreaktive Bindung der Hormone nicht ausgeschlossen
werden. Andererseits ergaben sich bisher bei ersten Studien der MT-Funktion sehr
widersprüchliche Ergebnisse durch unterschiedliche Methoden. Daher ist eine definierte
Funktion bis heute unbekannt (s. 2.).
Ein Ziel dieser Arbeit ist es, durch die Charakterisierung einer Gensonde für MT die
Möglichkeit für eine spezifische Untersuchung von MT darzustellen. Dazu sollten Eckdaten
über die MT-Genexpression erhoben und mit AVT verglichen werden.
Folgende Ergebnisse stehen zusammengefasst zur Diskussion:
- Die beiden cDNA-Sonden für AVT und MT, welche im 3’-Bereich der mRNA binden,
sind jeweils spezifisch und zeigen keine Kreuzreaktion.
- MT genexprimierende Neurone sind im Hypothalamus in den Kerngebieten des
Nucleus supraopticus, Nucleus paraventricularis, Nucleus dorsolateralis anterior, pars
magnocellularis und im Bed nucleus der Stria terminalis, pars magnocellularis
lokalisiert.

Diskussion 124
- Die MT-Genexpression ist im Hypothalamus überwiegend im Perikaryon lokalisiert,
jedoch gibt es auch in geringem Maße eine axonale und dendritische Expression.
- Im parvocellulären Anteil des BnST gibt es keine Genexpression von MT.
- Es wird mehr AVT mRNA als MT mRNA im Hypothalamus gebildet.
- Die MT-Genexpression nimmt mit dem Alter kontinuierlich zu. Um den Zeitraum der
Pubertät herum gibt es einen kurzfristigen leichten Rückgang der mRNA-Bildung,
beim adulten Tier werden die höchsten Konzentrationen MT mRNA im Hypothalamus
produziert.
- Die einzelnen Kerngebiete sind bereits in der Embryonalphase angelegt und
exprimieren mRNA, allerdings in einer geringen Intensität und in wenigen Zellen.
- Es gibt im MT-System keinen Sexdimorphismus im Hypothalamus, der eine
Expression in bestimmten Kerngebieten nur bei einem Geschlecht zeigt. Der
Geschlechtsunterschied bei adulten Tieren beruht auf einer unterschiedlichen
Expressionsleistung der magnozellulären Neurone.
- MT wird auch in peripheren Geweben (außerhalb des ZNS) gebildet.
- MT-Rezeptor mRNA wird in der Niere und in Teilen des weiblichen
Reproduktionstraktes gebildet.
7.1 Kontrollen der Sonden-Spezifität
Die strukturelle Ähnlichkeit der beiden neurohypophysären Hormone AVT und MT, sowohl
in der Nukleinsäure- als auch der Aminosäure-Sequenz, bedingt, daß die Spezifität der
eingesetzten Sonden sorgfältig geprüft werden muß, bevor sie für eine spezifische
Untersuchung herangezogen werden können. Der Einsatz von cDNA-Sonden erlaubt den
Einsatz einer Sonde in verschiedenen Methoden (Northern und Southern Blot, ISH).
Außerdem läßt sich mit Hilfe des random priming eine größere spezifische Aktivität erzielen
als mit anderen Markierungsmethoden (FEINBERG u. VOGELSTEIN 1983), so daß gerade
bei gering exprimierenden Geweben eine Detektion mit Hilfe des Northern Blot möglich ist.
Zuerst sollte mittels DNA-Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen ein Unterschied in
der DNA-Sequenz ermittelt werden. Beim Southern Blot zeigen 6 von 8 Restriktionsmustern

Diskussion 125
sowohl für die AVT- Sonde wie auch für die MT-Sonde das gleiche Restriktionsmuster,
während sich jedoch zwei Bandenmuster (HindII, PvuII) deutlich unterscheiden. Das kann ein
Hinweis sein auf eine große räumliche Nähe der zwei Gene. Je näher die zwei Gene
zueinander auf einem Chromosom lokalisiert sind, desto geringer ist die Chance, eine
Schnittstelle zwischen ihnen zu finden. Bei der Maus ist die Genposition bereits genauer
untersucht worden, wobei die zwei Gene für AVP und OT auf den jeweils komplementären
Strängen in entgegengesetzter Richtung zueinander direkt hintereinander lokalisiert wurden
(HARA et al. 1990). Zu dem gleichen Ergebnis kommen Untersuchungen beim Mensch
(SAUSVILLE et al. 1985) und bei der Ratte (SCHMITZ et al. 1991). Auch Untersuchungen
bei Hühnern, die zeigen, daß MT und AVT häufig gleichzeitig durch die gleichen Stimuli mit
vermehrter Genexpression bzw. Peptidsekretion reagieren (NOUWEN et al. 1984; 1985;
KOIKE et al. 1985, 1988; WANG et al. 1989; BOTTJE et al. 1989, 1990; ROBINZON et al.
1990a; SHIMADA et al. 1991; KOIKE et al. 1997), können ein Hinweis auf eine ähnliche
Situation beim Huhn im Vergleich zur Maus sein. Endgültige Schlüsse wären aber nur über
eine molekularbiologische Untersuchung der Genposition mittels weiterer
Restriktionsversuche, DNA-ISH, Sequenzierung und genomischer Kartierung möglich.
So ähnlich auch die Gensequenzen von AVT und MT sind, so besteht doch ein Unterschied:
Am 3’-Ende des AVT-Gens befindet sich ein ca. 50 bp großes Glykopeptid, welches beim
MT-Gen fehlt. Sind die vorliegenden Sonden (MT bzw. AVT) spezifisch, führt das zu
unterschiedlich großen Banden im Northern Blot. Bei einer Kreuzreaktion der AVT-Sonde
mit MT mRNA und umgekehrt sieht man zwei Banden. Die unterschiedliche Größe von RNA
kann durch elektrophoretische Auftrennung auf Agarose-Gelen dargestellt werden. Allerdings
können Poly(A)-Schwänze, welche bei Eukaryonten zur Stabilisierung an die mRNA dienen
(PALATNIK et al. 1984; BRAWERMAN 1987), zu Veränderungen in der mRNA-Länge
führen, ohne daß die Gensequenz selber verändert ist. Auch kann es bei unterschiedlichen
physiologischen Bedingungen (Dehydrierung, Hungern, Alter) zu einer unterschiedlichen
Länge des Poly(A)-Schwanzes kommen (CARTER u. MURPHY 1990; MURPHY u.
CARTER 1990; CARTER u. MURPHY 1991; CHOOI et al. 1992; CARTER u. MURPHY
1993; WALLER et al. 1993). Um dann unterschiedliche mRNA identifizieren zu können bzw.

Diskussion 126
um nachzuweisen, daß Größenunterschiede auf unterschiedlich langen Poly(A)-Schwänzen
beruhen, kann ein Verdau der mRNA mit RNase H erfolgen. RNase H ist ein Enzym, welches
spezifisch dsRNA abbaut. Durch Hybridisierung mit Oligo d(T) vor dem Verdau wird ssRNA
im Bereich des Poly(A)-Schwanzes doppelsträngig. Oligo (dT) ist ein Gemisch
unterschiedlich langer Ketten dT. Diese Ketten hybridisieren mit dem Poly(A)-Schwanz der
mRNA. Anschließend wird nur der Poly(A)-Schwanz mit den hybridisierten dT beim Verdau
mit RNase H abgebaut, während die eigentliche mRNA unverdaut bleibt.
Im Agarose-Gel konnte mit verschiedenen Volumenanteilen von Agarose zunächst kein
Unterschied in der Länge zwischen AVT mRNA und MT mRNA nachgewiesen werden. Das
der zu erwartende Unterschied von 50 bp in einem Größenbereich von ca. 600 bp jedoch nicht
darstellbar ist, könnte an einem längeren Poly(A)-Schwanz der MT mRNA liegen. Daher
wurde ein Verdau der mRNA mit RNase H vor der elektrophoretischen Auftrennung
durchgeführt. Jetzt war dieser Größenunterschied darstellbar, der durch unterschiedlich lange
Poly(A)-Schwänze der beiden mRNA-Typen verdeckt wurde.
Die MT-Sonde weist auch bei der ISH eine andere Sequenz als die von AVT nach, wie die
Ergebnisse der verschiedenen Kontrollen zeigen. Bei der kompetitiven Hemmung mit
unmarkierter Sonde wurde ein Gewebeschnitt mit einem großen Überschuß entweder an MT-
oder AVT-Sonde oder nur mit Hybridisierungspuffer behandelt und anschließend wurde
radioaktive Sonde in einem zweiten Hybridisierungsschritt eingesetzt. Wurde ein Schnitt mit
unmarkierter und dann mit radioaktiver MT-Sonde hybridisiert, trat eine deutliche
Signalreduktion bis hin zum völligen Fehlen der Signale auf, welche bei Einsatz der
unmarkierten AVT-Sonde oder des Hybridisierungspuffers fehlte. Gleiches gilt umgekehrt für
die Verwendung von unmarkierter AVT-Sonde mit radioaktiver AVT-Sonde. Versuche dieser
Art wurden bereits mehrfach eingesetzt, um die Spezifität von Sonden nachzuweisen
(HYODO et al. 1988). Allerdings muß die unmarkierte Sonde in einem großen Überschuß
eingesetzt werden, da die Schnittdicke bei der ISH eine komplette Absättigung der
Bindungsstellen schwierig macht. Sollte eine Kreuzreaktion einer Sonde mit der anderen
mRNA auftreten, wäre die Signalreduktion, insbesondere mit der relativ leicht zu sättigenden
Methode der Detektion mit Silberemulsion, kaum feststellbar.

Diskussion 127
Ein traditioneller Nachweis in der mRNA-ISH ist der Einsatz von RNase A vor der
Hybridisierung zum Verdau der Zielstrukturen, um auszuschließen, daß die gewählte Sonde
an DNA bindet. Besonders beim Einsatz von cDNA-Sonden ist ein solcher Versuch
notwendig, da hierbei beide komplementären Stränge in der Sonde enthalten sind, so daß eine
Bindung an DNA grundsätzlich möglich ist.
Ein weiterer Beweis für das Binden von mRNA ist die Lokalisation der
Hybridisierungssignale im Cytoplasma. Bei Hybridisierung von DNA wären die Silberkörner
auch im Zellkern nachweisbar. Allerdings ist zu berücksichtigen, daß die zelluläre Auflösung
der radioaktiven ISH sehr stark abhängig ist von der spezifischen Aktivität des gewählten
Isotops. Tabelle 8 zeigt die physikalischen Eigenschaften von vier häufig eingesetzten
Nukleotiden.
Radioisotop Halbwertszeit Max.
Emmissionsenergie
(MeV)
Maximale spezifische
Aktivität (Ci/mmol)
32 P 14,3 Tage 1,71 6000
33 P 25,4 Tage 0,249 3000
35 S 87,4 Tage 0,167 1500
3 H 12 Jahre 0,018 100
Tabelle 8: Physikalische Eigenschaften ausgewählter Radioisotope (EVANS u. READ 1992).
Isotope mit einer hohen Energie (z.B. 32 P) ermöglichen zwar eine schnelle Detektion von
mRNA, allerdings bedingt die energiereiche Strahlung auch eine größere Streuung der
Strahlung, so daß die zelluläre Auflösung deutlich herabgesetzt ist. Isotope mit niedriger
Energie ( 3 H, 35 S) zeigen zwar eine bessere Auflösung, jedoch dauert die Signalbildung sehr
lange (Wochen). 33 P stellt eine neue Alternative dar. Die zelluläre Auflösung ist deutlich
besser als mit 32 P, jedoch schlechter als mit 3 H, dafür liegt die Expositionszeit mit ca. 2
Wochen in einem akzeptablen Rahmen.

Diskussion 128
Daneben gibt es auch die Möglichkeit der nicht-radioaktiven Markierung, die wegen der
geringeren Biogefährdung eine zunehmende Bedeutung hat. Man kann dabei
fluoreszenzgestützte und enzymatische Verfahren unterscheiden. Bei den
fluoreszenzgestützten Methoden wird ein Fluoreszenzfarbstoff unmittelbar an das Nukleotid
angehängt und kann unter einer definierten Wellenlänge durch polarisiertes Licht zum
Leuchten angeregt werden. Bei enzymatischen Verfahren wird meist Biotin oder Avidin an
das Nukleotid gekoppelt. Avidin wird mittels Streptavidin gebunden, woran dann ein Enzym
gebunden wird (Meerettichperoxidase), welches ein Substrat zu einem Farbstoff umsetzt. Da
aber gerade bei ontogentischen Untersuchungen die Sensitivität der radioaktiven Markierung
noch nicht erreicht wird, wurde hier auf die radioaktiven Verfahren zurückgegriffen. Bei den
enzymatischen Verfahren besteht zudem der Nachteil hinsichtlich der quantitativen
Untersuchung, daß der Einbau eines zusätzlichen Detektionsschrittes eine weitere Variable in
den Versuch einbringt, die Einfluß auf die Ergebnisse nehmen kann.
7.2 Verteilung MT-genexprimierender Neurone im Hypothalamus
Die Verteilung MT mRNA exprimierender Zellen ähnelt sehr stark der AVT mRNA
produzierender Neurone (BARTH et al. 1997). Markierte Neurone liegen im Nucleus
paraventricularis (PVN), Nucleus supraopticus (SON), Nucleus dorsolateralis anterior, pars
magnocellularis (DLAmc) und Bed nucleus der Stria terminalis, pars magnocellularis
(BnSTmc). PVN und SON sind klassische Syntheseorte, welche schon länger in der Literatur
für die Genexpression von AVT und für die Peptidsynthese von MT bekannt sind
(VIGLIETTI-PANZICA 1986; CHATURVEDI et al. 1994).
Der DLAmc ist ein thalamischer Nucleus, welcher in der Umschaltung von optisch
aufgenommen Reizen zum Zentralnervensystem involviert ist. Dabei werden optisch
aufgenommene Informationen von der Retina weitergeleitet an den DLAmc und dort auf den
Wulst (JASSIK-GERSCHENFELD et al. 1976; NIXDORF u. BISCHOF 1982) (contralateral
über supraoptische Decussation) umgeleitet. Die Aufnahme optischer Impulse ist u.a. wichtig
für die Steuerung diurnaler und saisonaler Zyklen. Die Plasmakonzentration von AVT zeigt
beim dehydrierten Huhn einen diurnalen Rhythmus, welcher bei normohydrierten Tieren nicht

Diskussion 129
auftritt (GROSSMANN 1998). Wie dieser Effekt vermittelt wird, ist bisher unbekannt. Eine
Beeinflussung des Nucleus suprachiasmaticus (SCN) durch AVP über Vermittlung von
Corticosteroiden besteht (ISOBE u. ISOBE 1998). So erhöht bei Ratten eine Injektion von
Dexamethason intraperitoneal den AVP-Gehalt im SCN, besonders während der Nachtzeit.
Der DLAmc kann durch neuronale Inputs in der Weiterleitung der aufgenommenen Signale
beeinflußt werden, und die AVP-synthetisierenden Neurone des SCN sind sicherlich
Kandidaten für die Einflußnahme.
Der BnST wurde bereits sowohl bei Säugern (VAN LEEUWEN et al. 1985) als auch bei
Vögeln (VIGLIETTI-PANZICA et al. 1992; BARTH 1996; JURKEVICH et al. 1997) als
geschlechtsspezifisch in Bezug auf die Genexpression von AVP bzw. AVT beschrieben.
Anatomisch läßt sich der BnST in zwei größere Gruppen einteilen, einen magnozellulären und
einen parvozellulären Anteil. Der magnozelluläre Teil liegt unmittelbar ventral des lateralen
Ventrikels und caudal des parvozellulären Anteils. Hier wurde bisher kein geschlechtlicher
Unterschied in der Genexpression dokumentiert. Anders verhält es sich im parvozellulären
Teil. Hier liegt eine unterschiedliche Transkription und Translation bei weiblichen und
männlichen Tieren vor. Diese Subregion des BnST kann in zwei weitere Untergruppen
eingeteilt werden: einen ventromedialen und einen dorsolateralen Anteil. MT und AVT
mRNA lassen sich beide im magnozellulären Kerngebiet des BnST nachweisen. Allerdings
sind keine MT-exprimierenden Neurone in den parvozellulären sexdimorphen Kerngruppen
nachzuweisen, wohingegen im AVT-System beim Huhn ein deutlicher Sexdimorphismus
auffällig ist (JURKEVICH et al. 1997), wie er bereits bei verschiedenen Säugern (VAN
LEEUWEN et al. 1985; SZOT u. DORSA 1993), Wachteln (VIGLIETTI-PANZICA et al.
1992) und Singvögeln (VOORHUIS et al. 1988) beschrieben ist. Zumindest dieser
parvozelluläre Bereich des BnST wird unterschiedlich reguliert im Verhältnis zum
magnozellulären AVT-System. Dehydratation steigert die Genexpression von AVT im
magnozellulären Bereich (MÜHLBAUER et al. 1992), jedoch bleibt der BnSTpc unbeeinflußt
in seiner Transkriptionsrate (BARTH 1996).
Im Hypothalamus sind magnozelluläre Neurone für die MT-Gentranskription verantwortlich,
von denen beschrieben ist, daß ihre Axone in die Hypophyse projezieren (VIGLIETTI-
PANZICA u. PANZICA 1991; FERRIS 1992). Dort wird das Hormon in den Blutkreislauf

Diskussion 130
freigesetzt. Inwieweit auch Mesotocin parakrine Wirkungen zugeschrieben werden können,
wie dies bei Oxytocin (MAAS et al. 1992; IVELL et al. 1995; EINSPANIER et al. 1997a, b;
LIOUTAS et al. 1997), Vasopressin (REPPERT 1987; IVELL et al. 1990) und Vasotocin
(MOORE et al. 1994) möglich ist, muß mit anderen Methoden geklärt werden. Die Anzahl
parvozellulärer Neurone, denen meist die Produktion lokal und neuropeptiderg wirksamer
Hormone zugeschrieben wird, ist allerdings bezüglich der MT-Transkription gering.
7.3 Extrasomatische Genexpression der Nonapeptide
Neben der somatischen Expression von MT mRNA gibt es auch axonale und dendritische
Lokalisationen. Ähnlich wie bei AVT (BARTH u. GROSSMANN 2000) wird auch MT
teilweise in Axonen gebildet. Es liegen bisher keine spezifischen Untersuchungen über MT
mRNA in extrasomatischen Lokalisationen vor, daher ist eine Bewertung nur vergleichend
mit dem AVT-System des Vogels oder dem AVP- und OT-System der Säugetiere möglich.
OT mRNA ist nicht nur im Perikaryon lokalisiert, sondern kann auch im Axon nachgewiesen
werden (JIRIKOWSKI et al. 1990). Ob es sich dabei um einen zufälligen Befund oder aber
eine funktionelle Lokalisation handelt, konnte von den Autoren noch nicht geklärt werden.
Denn eine axonale Lokalisation von Organellen, welche für die Translation nötig sind, galt
lange Zeit als nicht vorhanden (LASEK u. BRADY 1981). Aber später gelang KOENIG u.
GIUDITTA (1999) der Nachweis von an der Translation beteiligte Molekülen im Axon,
besonders im kortikalen Bereich des Axons, angeordnet als sog. periaxoplasmatische Plaques.
Es findet tatsächlich eine axonale Proteinsynthese statt. Besonders der langsame axonale
Transport spielt in der Lokalisierung der einzelnen Synthesebestandteile eine wichtige Rolle.
Von daher scheint eine funktionelle Lokalisierung wahrscheinlicher als ein rein zufälliger
Transport von cytoplasmatischer mRNA in das Axon. Die Transkription selbst und erste
posttranskriptionelle Schritte wie das Splicing finden aber im Nukleus bzw. im Perikaryon
statt, da im Hypophysenhinterlappen zwar AVP mRNA, nicht aber hnRNA nachweisbar ist
(MOHR et al. 1991). Damit stammt die nachgewiesene mRNA in der Neurohypophyse nicht
aus umgebenden Gliazellen. Außerdem kommt es nach einer Durchtrennung des
Hypophysenstiels zu einem Verlust der mRNA im Hypophysenhinterlappen (MOHR et al.

Diskussion 131
1990). Das ist kein Ergebnis fehlender neuronaler Einflüsse der magnozellulären Neurone auf
umgebende Gliazellen, sondern ist tatsächlich Folge des unterbrochenen axonalen Transports,
da auch die Verabreichung von Colchicin als einem Blocker des axonalen Transports
(DAHLSTROM 1968) zu einem Verlust der AVP mRNA in der Neurohypophyse von Ratten
führt (LEVY et al. 1990). Der Transport in das Axon ist tatsächlich ein gezielter Vorgang, wie
sich in Brattleboro-Ratten nachweisen läßt. Diese Ratten haben eine Punktmutation im
Bereich des AVP-Neurophysins (IVELL et al. 1986), wodurch es zu einem Frame shift mit
Verlust des Stopcodons kommt. Hat man heterozygote Tiere, welche sowohl die mutierte als
auch die Wildtyp-Form von AVP produzieren, so kann man nur die Wildtyp-Form im Axon
vorfinden, nicht jedoch die mutierte Form (MOHR et al. 1995). Hingegen sind beide Formen
in Dendriten nachweisbar. Die Autoren schließen daraus, daß die axonale mRNA
posttranslationelle mRNA ist, welche nach der Proteinsynthese von den Ribosomen
freigesetzt wird. Dieser Vorgang wäre bei der mutierten Form der AVP mRNA blockiert.
Hingegen handelt es sich bei der dendritischen mRNA um prätranslationelle Stufen, welche
noch nicht als Matrizen für die Proteinbiosynthesen verwendet wurden. Und auch in
Dendriten ist rauhes endoplasmatisches Retikulum zur Proteinbiosynthese lokalisiert
(PRAKASH et al. 1997). Gerade diese Dendriten sind wichtig für die lokale Freisetzung von
Nonapeptiden. Sie enthalten mehr Vesikel mit AVP und OT als der Zellkörper und sind zur
Exocytose befähigt (MORRIS et al. 1997). Diese Exocytose erfolgt kontrolliert (z. B. unter
dem Einfluß von Östrogen) und ist unabhängig von der synaptischen Exocytose in der
Neurohypophyse. Während für MT noch keine physiologische Funktion bekannt ist, steigert
dendritisch freigesetztes OT die Sensitivität hypothalamischer OT-Neurone auf den
Saugstimulus durch das Jungtier. Die lokalen OT-Konzentrationen können Konzentrationen
im Mikromol-Bereich erreichen (LANDGRAF 1995). Para- und autokrine Prozesse scheinen
hier im Vordergrund zu stehen.
Hypoosmolalität führt zu einer Abnahme der axonalen mRNA (SVANE et al. 1995) von AVP
während OT unbeeinflußt bleibt.

Diskussion 132
7.4 Ontogenese des Nonapeptid-Systems
Ein Untersuchungsziel war die Ontogenese der MT-Genexpression. Es sollte untersucht
werden, ob Mesotocin in der Entwicklung eine Rolle spielt und zu einem bestimmten
Zeitpunkt der Entwicklung vermehrt exprimiert wird.
Die Untersuchungen ergeben eine kontinuierliche Steigerung der Genexpression über die
Entwicklung ohne stärkere Veränderungen der Genexpression zu einem bestimmten
Entwicklungsstadium. Lediglich zum Zeitpunkt der Pubertät, vor Einsetzen der Legetätigkeit
der Hennen und der Reproduktionsfähigkeit der Hähne nimmt die Genexpression im
Vergleich zum vorher untersuchten Alterstadium D70 etwas ab, bevor dann bei den Hähnen
die Genexpression deutlich ansteigt, während sie bei den Hennen annähernd auf dem Niveau
bleibt.
Als frühestes untersuchtes Alterstadium wurden Embryonen an Tag 14 der Bebrütung
gewählt. Dies ist ca. der Zeitpunkt, zu welchem im AVT-System des Huhnes der
Sexdimorphismus ausgebildet wird. Da in der Regel die oxytocinergen Neurone in ihrer
Entwicklung den vasopressinergen Neuronen nachfolgen, kann ein möglicher
Sexdimorphismus des MT-Systems mit erfasst werden. Bereits zu diesem Stadium, nach 2/3
der Brutzeit, ist Mesotocin mRNA in den einzelnen Nuclei nachweisbar. Allerdings ist die
Größe der einzelnen Nuclei kleiner als später bei adulten Tieren. Besonders beim SON fällt
auf, daß die Neuronen in den jüngeren Altersstufen deutlich dorsal der Lokalisation bei
älteren Tieren liegen. Außerdem ist die Verteilung im PVN entgegen der späteren
Schmetterlingsstruktur eher ventral ausgerichtet. Die Neurone des SON stammen aus der
hypothalamischen Anlage am III. Ventrikel (ARNOLD - ALDEA u. STERRITT 1996), von
wo aus sie eine ventro-rostral gerichtete Migration zu ihrem Bestimmungsort im SON
machen. In dieser Studie kann bereits an Tag 7,25 der Bebrütung immunhistochemisch
detektierbares Peptid nachgewiesen werden, allerdings mit einem Antikörper, welcher nicht
zwischen AVT und MT unterscheiden kann. VT mRNA tritt in der ISH erstmalig an E6 auf
(MILEWSKI et al. 1989) und gleichzeitig ist in homogenisierten Gesamtgehirn-Extrakten
AVT-Peptid (MÜHLBAUER et al. 1993) nachweisbar. Die Hormonsynthese folgt damit sehr
schnell der ersten Transkription. Damit ist die vollständige Hormonsynthese schon während

Diskussion 133
der Migration der Zellen möglich, und nicht erst, wenn die Neurone ihre Ziellokalisation
erreicht haben. Die spätere Lokalisation der Neurone ist unabhängig vom Ursprungsort. Alle
AVT/MT-produzierenden Nervenzellen des SON, PVN, DLAmc und BnST stammen aus dem
Bereich der periventrikulären Zone am III. Ventrikel (ARNOLD – ALDEA u. STERRITT
1996). Dieser gemeinsame Ursprung der Nonapeptid-synthetisierenden Neurone aus einer eng
definierten Zone unterscheidet sich deutlich von anderen Kerngruppen des Gehirns, wo Zellen
an verschiedenen Orten gebildet werden, bevor sie sich an der späteren Lokalisation zu einem
Kerngebiet organisieren.
Bei Ratten sind die Ergebnisse über das erste Auftreten von AVP / OT mRNA sehr
unterschiedlich. Einige Autoren beschreiben ein erst relativ spätes Einsetzen der Transkription
(VAN TOL et al. 1986; ALMAZAN et al. 1989), während andere von einer relativ frühen
Transkription oder Peptidproduktion sprechen. Neurophysin-Bestandteile werden sogar schon
am 1. Tag postcoitus mit immunologischen Methoden gefunden (KHACHATURIAN u.
SLADEK 1980), die meisten Autoren sprechen aber von ersten Signalen um ca. E15 bei der
Ratte (WHITNALL et al. 1985; ALTSTEIN u. GAINER 1988; FEHR et al. 1989; LAURENT
et al. 1989). Insgesamt aber wird das adulte Verteilungsmuster bei Säugetieren erst später im
Verhältnis zum Vogel etabliert. Beim Huhn zeigt MT schon nach 2/3 der Bebrütungszeit das
adulte Verteilungsmuster. Das läßt vermuten, daß sowohl AVT als auch MT einen Rolle für
die Neurogenese spielen können, zumal bereits für AVP Einflüsse auf die Gehirnentwicklung
nachgewiesen werden konnten (BOER 1985). So ist bei Brattleboro-Ratten die
Gehirnentwicklung sowohl morphologisch als auch funktionell beeinträchtigt. Dieser Effekt
läßt sich durch Applikation von AVP verhindern. Zu berücksichtigen ist bei dieser
Feststellung sicherlich, daß Hühnerembryonen sehr früh in ihrer Entwicklung für die
physiologischen Regelmechanismen selbst zuständig sein müssen, da keinerlei maternale
Regulation mehr möglich ist. Im Gegensatz dazu steuert bei Säugetieren der mütterliche
Organismus eine Vielzahl der fötalen Funktionen (ZEROBIN 1987). Das bei Vögeln die
eigene Osmoregulation schon bei Embryonen einsetzt, konnte bereits gezeigt werden
(GROSSMANN et al. 1995).
Obwohl morphologisch das adulte Verteilungsmuster schon früh vorhanden ist, nimmt die
Genexpression quantitativ immer noch zu. Bis zur Pubertät ist der Anstieg auch

Diskussion 134
kontinuierlich. Zum Zeitpunkt der Pubertät kommt es zu einem Abfall. Zu diesem Zeitpunkt
sowie in der Alterstufe davor, D70, ist die Standardabweichung in den einzelnen Gruppen im
Verhältnis zu den anderen Altersstadien relativ groß. Da nur jeweils einzelne Tage
exemplarisch für die Messungen ausgewählt wurden, kann der Zeitpunkt der Änderung der
Genexpression nicht genau bestimmt werden. Vom Verlauf der Genexpression und der
entsprechenden Standardabweichung läßt sich vermuten, daß die down-Regulation der
Genexpression ab ca. D70 einsetzt. Da keine Inzuchttiere verwendet wurden, sondern eine für
die Geflügelwirtschaft gezüchtete Legerasse, ist auch die individuelle Streuung zwischen
Einzeltieren größer als bei Inzuchttieren. Die Zucht erfolgte auf die verschiedenen Kriterien
der Legeleistung (Eizahl, Eiqualität, Futterverwertung etc.). Es ist davon auszugehen, daß
andere physiologische Parameter nicht ingezüchtet sind, so daß die genetische Variabilität
höher liegt als bei typischen Versuchstieren, wie Ratte und Maus, die durch die Zucht sehr
homogen in ihrer Erbsubstanz sind. Gerade Änderungen in physiologischen Parametern
dürften daher bei Hühnern als Versuchstieren mit einer höheren Varianz behaftet sein. Es
liegen aber keine Ungenauigkeiten in der Präparation vor, denn wenn man die AVT- mit der
MT-Genexpression vergleicht, sind die Varianzen in den verschiedenen Altersgruppen
unterschiedlich. Das zeigt, daß die Varianz sich auf eine bestimmte Genexpression auswirkt.
Die beiden Gene werden unterschiedlich reguliert, und ein solcher Effekt zeigt sich auch in
diesen Unterschieden.
Bei adulten Tieren schließlich ist ein signifikanter Unterschied der Genexpression zwischen
männlichen und weiblichen Tieren im Northern Blot meßbar. Jedoch fällt in der ISH kein
Unterschied auf, der dem im Northern Blot entspricht. Hier kann der Unterschied in der
Transkriptionsaktivität der einzelnen Zellen liegen oder in einer geringeren Anzahl der
transkribierenden Zellen pro Kerngebiet. Eine weitere Möglichkeit liegt aber auch darin, daß
Zellen der weiblichen Tiere evtl. das Transkript schneller translatieren als die der männlichen
Tiere. Da aber auch in immunhistochemischen Versuchen die Signalstärke bei männlichen
Tieren größer ist als bei Hennen, so müßte auch die Freisetzung des Hormons bei Hennen sehr
viel schneller erfolgen, um diesen Unterschied zu erklären. Die Plasmaspiegel für MT sind
hingegen bei weiblichen und männlichen Tieren ähnlich (KOIKE et al. 1986, 1988).

Diskussion 135
Daher sollte über einen quantitativen Ansatz der ISH versucht werden, diesen Unterschied
zwischen Hähnen und Hennen im MT-System genauer darzustellen. Jedoch ist die Methode
der Färbung mit Silberemulsion für eine solche Untersuchung schlecht geeignet. Die relativ
dickflüssige Emulsion muß auf zu vergleichende Schnitte in der gleichen Schichtdicke
aufgetragen werden, was aber nicht genau zu kontrollieren ist. Außerdem ist die
Expositionsdauer schwierig zu wählen: lang genug, um ein Signal in ausreichendem Signal-
zu-Rausch-Verhältnis zu bekommen, jedoch nicht zu lange, da sonst zu viele Silberkörner von
der Beta-Strahlung umgesetzt werden. Die Quantifizierung erfolgt dann über die Anzahl der
Silberkörner, nicht über die Stärke der Schwarzfärbung. Entsprechend ist es schwierig, genaue
Zellgrenzen zu wählen, da die Strahlung auch eine radiale Ausbreitung hat. Daher wurde eine
direkte Meßmethode gewählt über einen Mikroimager, der die Stärke der radioaktiven
Strahlung unmittelbar auf dem Schnitt messen kann. Dazu wird ein fester Szintillator direkt
auf dem Schnitt plaziert, und die von der Beta-Strahlung des 33 P freigesetzten Elektronen
werden über zwei Fotomultiplier verstärkt, bevor sie von einer Fotodiode direkt gemessen
werden. Vorteil dieser Methode ist, daß keine Sättigung eintreten kann, da kein Film oder eine
Emulsion geschwärzt wird. Zudem erlaubt es die Software, jeden beliebigen Zeitabschnitt
während der Exposition auch später noch auszuwählen. Die Darstellung der Signalstärke
erfolgt über Falschfarben, deren Farbskala frei wählbar ist. Wendet man diese Methode der
Quantifizierung an, so wird deutlich, daß die Signalstärke in gleichen Gewebearealen von
vergleichbarer Größe bei männlichen Tieren deutlich größer ist als bei weiblichen. Allerdings
ist auch der Hintergrund bei den Hähnen stärker als bei den Hennen. Dieses Phänomen läßt
sich auch in der Immunhistochemie beobachten (Aleksandr Jurkevich, persönliche
Mitteilung). Ein möglicher Grund kann sein, daß beim Anfertigen der Gefrierschnitte
Zellbestandteile aus exprimierenden Zellen verwischt werden. Da Hähne mehr MT mRNA in
den Zellen des Hypothalamus haben, wäre auch der „Schmiereffekt“ größer als bei Hennen.
Bisher ist ein Geschlechtsdimorphismus im AVT-System der Vögel beschrieben, ebenso wie
im AVP-System bei Säugetieren (VAN LEEUWEN et al. 1985). Jedoch handelt es sich dabei
stets um Kerngebiete mit einer Peptidbildung in nur einem Geschlecht, während bei dem
anderen Geschlecht die Genexpression ganz fehlt. Am häufigsten wird dabei das Gebiet des
Bed nucleus der Stria terminalis erwähnt. Sowohl bei Hühnern (JURKEVICH et al. 1997), als

Diskussion 136
auch bei Wachteln (VIGLIETTI-PANZICA et al. 1992), Kanarien (VOORHUIS et al. 1988)
und Zebrafinken (KIMURA et al. 1999) liegt eine Genexpression nur bei männlichen Tieren
vor, welche auch durch Testosteron beeinflußbar ist, wie sich mittels Kastration und
nachfolgender Substitution mit Testosteron darstellen läßt (VOORHUIS et al. 1988;
ROBINZON et al. 1990b). Bei weiblichen Tieren fehlt diese Peptidbildung vollständig. Eine
Injektion des Aromatasehemmers Fadrazol in einem definierten Entwicklungsstadium (E8)
kann zu einer Feminisierung männlicher Tiere führen (JURKEVICH et al. 2000a). Daher ist
anzunehmen, daß nicht Testosteron selber, sondern die aromatisierte Form Östrogen die
Entwicklung des Sexdimorphismus steuert. Der Geschlechtsunterschied wird damit schon
sehr früh in der embryonalen Entwicklung angelegt, sichtbar wird er jedoch erst an E14
(JURKEVICH et al. 1999a). Dabei fällt allerdings ein Unterschied auf zwischen Transkription
und Translation. Während mittels IHC der Unterschied anhand der Zellzahlen meßbar ist
(Hähne mehr positive Zellen als Hennen), sind die Geschlechter in der ISH nicht zu
unterscheiden. Dieser Geschlechtsunterschied hebt sich aber um den Schlupf herum auf. Auch
postnatal tritt eine solche Diskrepanz in den Methoden auf: Ab D14 ist der Unterschied
immunhistochemisch wieder sichtbar, erneut aber nicht in der ISH. In der Transkriptmenge
wird der Sexdimorphismus erst mit der Pubertät nachweisbar.
Während sich die überwiegende Zahl der Publikationen mit Sexdimorphismus im AVP- oder
AVT-System bezieht, sind nur wenige Publikationen verfügbar über einen
Geschlechtsunterschied im OT / MT-System. Mittels IHC konnte bei der Eidechse kein
Sexdimorphismus im MT-System dargestellt werden (THEPEN et al. 1987). Allerdings ist
nachgewiesen, daß bei OT im Hypothalamus je nach Reproduktionsstatus weiblicher Ratten
quantitative Unterschiede im OT-System vorhanden sind, welche durch Östrogen zu
beeinflussen sind (MILLER et al. 1989c). Wie der Sexdimorphismus in der MT-
Genexpression beim Huhn beruhen auch diese Änderungen der Genexpression in einer
Änderung der Expressionsleistung der Zellen. Der fehlende Sexdimorphismus bei der
Eidechse kann mehrere Ursachen haben:

Diskussion 137
1) tierartliche Unterschiede: nicht zwangsläufig kann man Ergebnisse einfach auf andere
Tierarten übertragen. Der Goldhamster zeigt z.B. eine ganz andere Verteilung der
AVT-Genexpression, besonders im parvozellulären System, im Hypothalamus als die
Ratte (DELVILLE et al. 1994; FERRIS et al. 1995)
2) methodische Ungenauigkeiten: reicht die Sensitivität der angewandten Methode aus,
um einen solchen Unterschied zu detektieren?
3) regulatorische Unterschiede: mRNA-Gehalt und Peptidbildung müssen nicht
unbedingt parallel laufen.
Bei Wachteln ist eine geschlechtsspezifische Osmoregulation nachzuweisen (CHATURVEDI
et al. 2000). Dabei zeigen männliche Tiere eine empfindlichere Reaktion des Plasma-AVT-
Gehaltes im Verhältnis zur Plasmaosmolalität auf Dehydratation als weibliche Tiere. Der
hypothalamische Anstieg der AVT mRNA-Konzentration ist bei weiblichen Tieren größer als
bei männlichen. Ob diese Unterschiede das Ergebnis einer schnelleren Translation beim Hahn
im Verhältnis zur Henne ist, oder ob bei weiblichen Tieren AVT-Peptid im Blutplasma
schneller verstoffwechselt wird, ist bisher nicht geklärt.
7.5 Vergleich der AVT mRNA- und MT mRNA-Synthese im Hypothalamus
Vergleicht man die Expressionsstärke von AVT und MT, fällt ein deutlicher quantitativer
Unterschied zugunsten von AVT auf. Dieser Unterschied zwischen AVT mRNA und
MT mRNA ist zum einen in der größeren rostro-caudalen Verteilung von AVT zu MT
begründet. Andererseits kann aber auch eine größere Transkriptionsrate pro Zelle dafür
verantwortlich sein. Das Vorkommen von AVT mRNA in parvozellulären, sexdimorphen
Strukturen, denen die MT-Transkription fehlt, reicht auf jeden Fall nicht aus, um den im
Northern Blot beschriebenen quantitativen Unterschied zu begründen. Im Gegensatz dazu gibt
es eine Untersuchung, die einen doppelt so hohen MT-Gehalt im mittleren und hinteren
Hypothalamus im Vergleich zu AVT beim Huhn zeigt (ROBINZON et al. 1988b). Das konnte
hier morphologisch nicht bestätigt werden. Allerdings wurde dieser Unterschied mittels RIA
nachgewiesen. Ein wichtiger Punkt ist die exakte anatomische Isolierung der einzelnen
Kerngebiete, dazu kommt die Spezifität des eingesetzten Antikörpers, die eingesetzte

Diskussion 138
Hühnerrasse und die Versuchsdurchführung (Streß, Uhrzeit etc.). Alle diese Punkte können zu
einer anderen Interpretation führen. In dieser Arbeit wurde der quantitative Unterschied nur
mittels Northern Blot dargestellt, da in der ISH mit Detektion mittels Silberemulsion kein
Unterschied sichtbar war. Es ist daher nicht ausgeschlossen, daß ein solcher quantitativer
Unterschied in einzelnen Gehirnarealen durchaus vorkommen kann.
Um zwei unterschiedliche Sonden direkt miteinander vergleichen zu können, muß
berücksichtigt werden, daß bei der Methode des random priming eine unterschiedliche Anzahl
radioaktiver dNTPs eingebaut wird. Entscheidend ist die Sondenlänge und der dGTP-Gehalt
(da mit radioaktivem dCTP markiert wurde) des Sondentemplates. Daher wurden die
erhaltenen Werte um den prozentualen Unterschied an dGTP in der Sequenz zwischen beiden
Sonden korrigiert. Nicht ausgeschlossen werden kann aber der Effekt, daß beide Sonden in
der Methode des random priming unterschiedlich lange Sondenfragmente bilden können, die
dann mit Überlappung an die mRNA binden können. Je mehr dieser Überlappungen
vorkommen und je mehr dCTP diese Überlappungen enthalten, desto größer wird die doppelt
gemessene Radioaktivität an der mRNA. Geht man davon aus, daß bei beiden Sonden der
prozentuale Anteil an diesen „overlaps“ gleich ist, wurde der Effekt bereits mit der Korrektur
erfaßt. Eine wirklich sichere Unterscheidung wäre aber nur durch eine PAGE-
Gelelektrophorese der erzeugten Fragmente möglich. Allerdings erhält man auch dann immer
noch keine Information über die wirkliche Hybridisierungsfähigkeit unterschiedlich langer
Fragmente. Da die Frage nach dem tatsächlichen Unterschied so also auch nicht abschließend
zu klären ist, wurde auf diese Methode verzichtet, da sie keinen echten Informationsgewinn
darstellt. Die quantitativen Unterschiede zwischen den beiden Sonden erschienen so groß,
daß, abgesehen von den absoluten Werten, sich an der Feststellung der stärkeren
Genexpression von AVT im Verhältnis zu MT nichts ändern dürfte.
Entgegen den gemessenen Unterschieden der mRNA-Mengen im Hypothalamus ist der
Peptidgehalt von MT im Plasma größer als der von AVT (KOIKE et al. 1977; NOUWEN et
al. 1984; KOIKE et al. 1986). Aber nicht allein die Transkriptmenge entscheidet über die
Translationshäufigkeit. Einen positiven Einfluß auf die Lebensdauer der mRNA in der Zelle
hat der poly(A)-Schwanz (PALATNIK et al. 1984; BRAWERMAN 1987). Danach hat der
Adenylierungsgrad einen stabilisierenden Einfluß auf die mRNA und fördert die Translation.

Diskussion 139
Ein längerer poly(A)-Schwanz würde somit eine geringere Menge an Transkript ausgleichen,
um gleiche Translationsraten zu erreichen. Die Tatsache, daß MT mRNA einen längeren
poly(A)-Schwanz hat im Vergleich zu AVT mRNA (s. 6.2.2), kann erklären, daß die
Plasmawerte von AVT- und MT-Peptid sich umgekehrt verhalten zum im Hypothalamus
gemessenen Gehalt an mRNA. Eine Änderung der Genexpression geht nicht unweigerlich mit
einer Änderung der Peptid-Plasmakonzentration einher. Umgekehrt kann aber sehr wohl eine
Änderung der Peptid-Synthese vorliegen, ohne daß eine unterschiedliche Genexpression
nachweisbar wäre (JURKEVICH et al. 1999a).
Für einen schnellen Transport des Translationsproduktes vom Hypothalamus in die
Neurohypophyse sowohl bei Hähnen als auch bei Hennen spricht die schlechte
Detektierbarkeit des Peptids im Hypothalamus, welche mit Colchicin deutlich zu verbessern
ist. Colchicin ist ein Inhibitor des axonalen Transports (DAHLSTROM 1968;
KREUTZBERG 1969; LEVIN u. SAWCHENKO 1993). Eine icv Injektion dieses Stoffes
verhindert somit den Tranport von MT in die Neurohypophyse und ermöglicht so den
Nachweis des Peptids im Hypothalamus. Hingegen ist AVT auch ohne eine solche
Vorbehandlung immunhistochemisch zu detektieren. Dieser größere AVT-Pool in den
Neuronen des Hypothalamus gibt dem System eine größere Flexibilität, um auf
physiologische Stimuli zu reagieren. Gerade akute Stimulationen, wie z. B. Dehydrierung,
können so schneller vom endokrinen System beantwortet werden.
7.6 Genexpression von Nonapeptiden in peripheren Geweben
Die Genexpression von MT mRNA in der Niere konnte mittels RT-PCR nachgewiesen
werden. Die Mengen an mRNA waren so gering, daß die Detektion von Peptid in der Niere
nicht möglich war. Es wäre daher möglich, daß es sich nicht um ein funktionierendes
Transkript handelt. Allerdings lassen die Effekte von AVT- und MT-Injektionen auf die
Nieren-Funktion eine lokale Produktion durchaus möglich erscheinen (NOUWEN et al. 1984;
UCHIYAMA u. MURAKAMI 1984; BOTTJE et al. 1989; SHIMADA et al. 1991;
TAKAHASHI et al. 1993, 1995, 1996, 1997a; KOIKE et al. 1997). Die geringen Mengen
würden dann aber eher für eine parakrin-lokale als für eine endokrine Wirkung der Hormone

Diskussion 140
sprechen. Bestätigt wurden diese Ergebnisse auch durch eine ISH im Nierengewebe. Nach 3
Wochen Expositionszeit waren in den proximalen Tubuli der Nephrone Signale zu erkennen.
Zwar war die Signaldichte sehr gering, aber die Lokalisation war immer identisch. Sowohl bei
Hähnen wie auch bei Hennen waren diese Signale sichtbar. Allerdings hatte Dehydrierung für
48 h keinen sichtbaren Einfluß auf die Lokalisation oder Quantität. Die Anatomie und die
Histologie der Vogelniere unterscheidet sich deutlich von der Säugerniere. Es besteht keine
genaue Aufteilung in eine Rinden- und eine Markzone. Vielmehr sind die Nephrone relativ
gleichmäßig über die gesamte Niere verteilt (WAIBL 1992). Außerdem lassen sich zwei
Klassen von Neuronen unterscheiden: medulläre und kortikale. Medulläre Nephrone
entsprechen in ihrem Aufbau den Säugetier-Nephronen (mammalian type), d.h. sie haben ein
ausgeprägtes Tubulussystem mit Henlescher Schleife. Diese Nephrone durchziehen das
gesamte Nierengewebe. Kortikale Nephrone (reptilian type) dagegen besitzen keine
Henlesche Schleife und nur schlecht entwickelte Tubuli. Diese Nephrone sind fast
ausschließlich in der Rinde lokalisiert. Das Verhältnis der beiden Nephrontypen ist je nach
Vogelart verschieden. Vogelarten mit einem guten Konzentrierungsvermögen besitzen einen
größeren Anteil medullärer Nephrone. Die Osmoregulation wird aber mehr über die
glomeruläre Filtrationsrate (GFR) und über die Anzahl aktiver Nephrone vom Reptilien-Typ
gesteuert (BRAUN u. DANTZLER 1972). Aufgrund der Lokalisation der gefundenen Signale
im hochprismatischen Epithel der proximalen Tubuli sind in diesem Fall die medullären
Nephrone der Ort der lokalen MT-Transkription.
Eine parakrine MT-Produktion kann nur sinnvoll sein, wenn auch Rezeptoren im Organ
vorhanden sind, um das Peptid binden zu können. Dieser Rezeptor konnte mittels
Rezeptorbindungsstudien auch bereits nachgewiesen werden. (TAKAHASHI et al. 1993,
1996, 1997a). Auch in der PCR konnte eine Produktion von Rezeptor mRNA dargestellt
werden. Bei Vergleich mit der Datenbank von MEDLINE besteht eine hohe Homologie zum
OT-Rezeptor der Säugetiere, während die Homologie zum Vasopressin- und AVT-Rezeptor
deutlich geringer ist. Danach scheint eine physiologische Funktion von MT an der Niere sehr
wahrscheinlich.
Auf den Gelen der MT-PCR fällt bei den negativen Proben in diversen Geweben besonders
nach hohen Zykluszahlen die Anreicherung hochmolekularer Strukturen auf. Diese

Diskussion 141
verschwanden aber immer, wenn in einer Probe spezifisches Produkt zu detektieren war.
Daher handelt es sich bei diesen Produkten wahrscheinlich um Fehlreaktionen von Primern
und Nukleotiden, die sich zu einem hochmolekularen Produkt zusammenschließen unter
Ermangelung geeigneter Reaktionspartner.
7.7 Physiologische Einflüsse auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes
Es wurden die Einflüsse von Geschlecht, Alter und Hydrierungszustand auf die Länge des
Poly(A)-Schwanzes von MT mRNA und AVT mRNA untersucht. Es ist bekannt, daß die
Länge des Poly(A)-Schwanzes die Stabilität (BRAWERMAN 1987) und die
Translationseffizienz (PALATNIK et al. 1984) von mRNA erhöht. Daher ist die Länge der
Polyadenylierung auch entscheidend für die Translationsraten einer mRNA. Deshalb wurde
die Frage untersucht, ob verschiedene physiologische Stimuli Einfluß haben auf den Grad der
Polyadenylierung. Bei Vögeln und anderen Nicht-Säugern gibt es dazu bisher kaum
Ergebnisse, so daß unklar ist, wie sich die Steuerung der Polyadenylierung als physiologischer
Regelmechanismus in der Evolution entwickelt hat. Bei Säugern (Ratte) zeigte sich eine
Zunahme der Größe der AVP und OT mRNA unter Dehydrierung (CARTER u. MURPHY
1989b), ein Effekt der unabhängig von der allgemeinen Aufregulation des Gens ist. Dabei
scheint es sich in erster Linie um eine Sofortreaktion zu handeln, da ein Anstieg der
Polyadenylierung bereits festzustellen ist, wenn Plasmaosmolalität oder Hämatokrit noch
nicht verändert sind (CARTER u. MURPHY 1991). Andere Arbeitsgruppen berichten über
eine langfristige Veränderung der Polyadenylierung, z. B. nach 6 Tagen Verabreichung
hypertonen Trinkwassers (ZINGG et al. 1988). Allerdings bewirken hypertone Lösungen
nicht unbedingt die gleichen physiologischen Reaktionen wie Dehydratation. Auch das Alter
führt zu einer Verlängerung des AVP mRNA Poly(A)-Schwanzes in Ratten (FEHR et al.
1989), was sich auch, in geringerem Maße, für das AVT-Gen im Huhn zeigen läßt. Diese
Regulation hat sich über diese Evolutionsstufe erhalten. Im Gegensatz dazu war bei
dehydrierten Tieren bei AVT längerer Poly(A)-Schwanz nachweisbar. Ein Grund kann sein,
daß die eingesetzten Tiere bereits 48 h dehydriert waren, während bei der Ratte die Zunahme
der Poly(A)-Schwanz-Länge unter Dehydrierung eine akute Reaktion darstellt. Außerdem ist

Diskussion 142
die Auflösung eines Northern Blots für Unterschiede dieser Größenordnung (30 bp) bei einer
Gesamtgröße von ca. 600-700 Basenpaaren relativ gering, der tatsächliche Effekt kann größer
sein. Dazu kommt, daß die Länge des Poly(A)-Schwanzes auch mit der Tageszeit schwankt
(CARTER u. MURPHY 1989a), so daß der Entnahme-Zeitpunkt der Proben im
tageszeitlichen Verlauf wichtig ist. Bisher liegen aber keine Untersuchungen über eine
solchen diurnalen Verlauf der Transkriptlänge beim Huhn vor. Es ist aber bekannt, daß die
Tageszeit Einfluß nimmt auf die Menge an Plasma-AVT bei dehydrierten Hühnern
(GROSSMANN 1998) und bei Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss; GILCHRIEST et
al. 1998). Eine Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes kann also durch eine tageszeitliche
Rhythmik überdeckt sein kann. Hier ist ein Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen in Bezug
auf Dauer der Dehydrierung und den Untersuchungszeitpunkt. Die Tatsache, daß
Dehydrierung eher die Länge der MT mRNA als der AVT mRNA zu beeinflußen scheint,
kann aber auch wieder ein Hinweis auf eine Beteiligung von MT an der Osmoregulation bei
Hühnern sein. Insgesamt sind die hier beobachteten Änderungen in der Länge des Poly(A)-
Schwanzes jedoch eher gering. Beim Säuger wurde in der Regel eine Längenänderung von ca.
100 bp gefunden. Hier jedoch betrug der Unterschied nur ca. 30 bp. Dies mag ein Effekt sein
von unterschiedlichen Stimulationen bzw. technischen Methoden, kann aber auch die sich
entwickelnde Plastizität des Systems in der Evolution widerspiegeln.
7.8 Einfluß einer osmotischen Stimulation auf die MT-Genexpression im
Hypothalamus
Zwar läßt sich bei den Hähnen eine Zunahme der MT-Genexpression während Dehydrierung
feststellen, dieser Effekt ist jedoch nicht signifikant. Damit ist die Regulation der
hypothalamischen MT mRNA-Menge scheinbar nicht oder nur gering beteiligt an der
physiologischen Reaktion auf eine osmotische Stimulation durch Dehydrierung. Vom
Säugetier ist bekannt, daß OT auf osmotische Stimulation reagieren kann, und damit auch die
oxytocinerge Hormonfamilie an der Osmoregulation beteiligt ist (VAN TOL et al. 1987). Im
Vergleich zu AVP ist die Zunahme an OT mRNA aber geringer (LEMOULLEC et al. 1997).
OT, aber auch MT wurden auch nach Streß (Immobilisation) vermehrt exprimiert (HIGUCHI

Diskussion 143
et al. 1990; BATHGATE u. SERNIA 1995). Der Anstieg an OT mRNA im Hypothalamus
kann also auch durch den Streß der Dehydrierung entstehen und muß nicht durch die
physiologischen Veränderungen der Dehydratation ausgelöst werden. Darauf deuten auch
Versuche hin, die nur einen ca. zweifachen Anstieg an OT mRNA im Hypothalamus nach
zweiwöchiger Verabreichung hyperosmolaren Trinkwassers feststellen können (VAN TOL et
al. 1987). Unter chronischem Streß wie diesem kann es zu einer falsch interpretierten
Korrelation von Stimulus und Reaktion kommen. Die physiologische Relevanz solcher
Versuche muß daher genauer untersucht werden. Dazu muß z. B. ein Verlauf der
Genexpression über eine bestimmte Dauer der Dehydrierung bestimmt werden, um den
Beginn und die Steilheit der Zunahme der Genexpression bestimmen zu können.
Abschließend läßt sich feststellen, daß der Verlauf der Genexpression während der
Ontogenese von AVT und MT auf eine physiologische Funktion beider Hormone in der
pränatalen oder perinatalen Phase hindeutet. Beide Hormone werden im letzten Drittel der
embryonalen Phase gebildet, zumindest AVT auch schon an Tag 6 der Inkubation. Genauere
Aussagen über eine physiologische Funktion sind nur möglich durch Untersuchung von
Tieren, bei denen diese Gene defekt sind oder ausgeschaltet werden. Aus dem Verlauf der
embryonalen Entwicklung kann dann eine Funktion der Gene während der Ontogenese
bestimmt werden. Postnatal ist deutlich mehr AVT als MT mRNA im Hypothalamus
lokalisiert. Pränatal dagegen ist der Gehalt noch deutlich ähnlicher. Für AVP ist eine
Steuerung der neuronalen Entwicklung bereits nachgewiesen. Daher ist zu vermuten, daß auch
AVT einen ähnlichen Effekt haben könnte, bei der relativ ähnlichen mRNA-Konzentration
von MT kann ein entwicklungsfördernder Einfluß von MT durchaus möglich sein. Beide
Gene werden unterschiedlich reguliert, vergleicht man die Stärke der Genexpression während
der Entwicklung und die Antwort auf physiologische Stimuli. MT wird nicht durch eine
Aktivierung des AVT-Systems mit aufreguliert. Trotz der nur mäßigen bis fehlenden Reaktion
von MT im Hypothalamus als Antwort auf Dehydrierung scheint MT in die Osmoregulation
involviert zu sein. Allerdings erfolgt die Wirkung eher lokal auf parakriner Ebene in der
Niere. Der genaue Aktivierungsmechanismus bleibt allerdings noch offen. Auch an der

Diskussion 144
Eiablage kann MT beteiligt sein, wie die PCR andeutet mit MT-Rezeptor Genexpression in
einzelnen Abschnitten des Eileiters.
In Zukunft muß daher Wert gelegt werden auf eine weitergehende Klonierung des MT-
Rezeptors (wichtig sind intron-übergreifende Sequenzen) mit der Möglichkeit der
Lokalisierung der Rezeptoren in den Zielgeweben. Es gibt in der Niere und im Ovidukt bereits
Untersuchungen über eine dort lokalisierte MT-Rezeptor-Synthese.
Außerdem soll eine Untersuchung der diurnalen Rhythmik der AVT und MT Genexpression
erfolgen, zusammen mit dem Einfluß von typischen Genen für die tageszeitliche Steuerung
physiologischer Reaktionen.

Zusammenfassung 145
8 Zusammenfassung
Die Nonapeptide Arginin-Vasotocin (AVT) und Mesotocin (MT) sind die neurohypophysären
Hormone des Vogels. Während bei den analogen Hormonen des Säugetiers, Arginin-
Vasopressin (AVP) und Oxytocin (OT), jedes einer physiologischen Funktion zugeordnet
werden kann, ist beim Vogel bisher nur die antidiuretische Funktion des AVT und die
Stimulation der Uteruskontraktion bei der Oviposition gesichert. Hingegen fehlen für MT
bisher gesicherte Ergebnisse über eine physiologische Bedeutung.
Die neurohypophysären Hormone werden in Neuronen des Hypothalamus gebildet und
gelangen über axonalen Transport in die Neurohypophyse. Dort erfolgt die Freisetzung in das
Blut. Neben dieser klassischen endokrinen Funktionsweise sind für die Nonapeptide auch
neuromodulatorische Wirkungen innerhalb des ZNS beschrieben.
In dieser Arbeit sollten mit Hilfe einer neu entwickelten Gensonde für Mesotocin
verschiedene physiologische Parameter auf ihre Beeinflussung der MT-Genexpression
untersucht und das hypophysäre MT mRNA-System mit dem von AVT verglichen werden.
Periphere Gewebe wurden auf das Vorkommen von MT mRNA und MT-Rezeptor mRNA
untersucht. Für letztere lag ein kloniertes Teilstück des MT-Rezeptorgens vor.
Die verwendeten Sonden für AVT und MT mRNA binden beide im 3’-Bereich der mRNA.
Die MT-Sonde ist in Northern Blot und ISH spezifisch für MT mRNA und zeigt keine
Kreuzreaktion mit der AVT mRNA. Im Northern Blot ist ein ca. 600 bp großes Fragment
darstellbar. Bei der ISH liegen die Signale eindeutig im Cytoplasma der Neurone und sind
durch RNase A-Behandlung zu eliminieren. Die morphologische Untersuchung der MT
mRNA-Expression zeigt genexprimierende Neurone in den hypothalamischen Kerngebieten
des SON und PVN sowie den extrahypothalamischen Kerngebieten BnST, pars
magnocellularis, und DLA, pars magnocellularis. Nur magnozelluläre Neuronen bilden MT
mRNA. Bei adulten Tieren ist morphologisch, im Gegensatz zum AVT-System, kein
Sexdimorphismus nachweisbar. Bereits an E14 sind alle MT exprimierenden Kerngebiete des
Hypothalamus positiv für MT mRNA. Es ändern sich im Laufe der Ontogenese Zahl und
Größe der exprimierenden Neuronen. Im Vergleich zum AVT-System ist die rostro-caudale
und laterale Ausbreitung des MT-Systems kleiner. Im Northern Blot ist im Verlauf der

Zusammenfassung 146
Ontogenese eine kontinuierliche Zunahme der Genexpression festzustellen, ohne daß das
Alter einen besonderen Einfluß auf die Transkriptionsrate zu haben scheint. Bei adulten
Tieren zeigt sich quantitativ ein Sexdimorphismus bei der MT-Genexpression. Dieser beruht
nach Analyse einer quantitativen ISH auf einer verstärkten Expressionsleistung der Zellen und
nicht auf einer unterschiedlichen Zellzahl. Ein Vergleich der AVT- mit der MT-
Genexpression zeigt im Verlauf der Ontogenese einen sehr ähnlichen Verlauf, allerdings ist in
allen postnatalen Lebensstadien signifikant mehr AVT mRNA im Hypothalamus lokalisiert
als MT mRNA. Ebenso wie bei AVT kann auch bei MT eine axonale und dendritische
Lokalisation von mRNA gezeigt werden. Das ermöglicht die sehr schnelle Bereitstellung von
mRNA für eine Translation am Ort der Sekretion.
Eine zweitägige Dehydratation hat keinen Einfluß auf die hypothalamische MT mRNA-
Konzentration von weiblichen Tieren. Bei Hähnen ist ein Anstieg unter Wasserentzug
sichtbar, dieser ist jedoch nicht signifikant. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes ist bei AVT
und MT mRNA nur geringfügig vergrößert. Dagegen tritt mit zunehmendem Alter eine
Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes der AVT mRNA auf. Außerhalb des ZNS kann MT
mRNA mit der RT-PCR in der Niere identifiziert werden. Die Zahl der exprimierenden Zellen
ist durch Dehydratation aber scheinbar unverändert. Außer MT mRNA kann auch MT-
Rezeptor mRNA in der Niere und in verschiedenen Bereichen des Reproduktionstraktes
(Ovar, Infundibulum, Uterus, Vagina) nachgewiesen werden. Eine Beteiligung von MT an der
Osmoregulation, sowohl über einen systemischen als auch einen lokalen Wirkmechanismus
ist anzunehmen. Die Identifizierung von MT-Rezeptor im Reproduktionstrakt weist auf eine
Beteiligung an der Oviposition hin. Ähnlich wie AVT kann also auch MT beim Vogel in zwei
verschiedenen physiologischen Regelkreisen (Osmoregulation und Reproduktion) involviert
sein.
Mesotocin erfüllt somit beim Huhn die klassischen neurohypophysären Hormonwirkungen,
unterstützt durch eine lokale Synthese in der Niere, ohne wie AVT über parvozelluläre
Hormonsynthese an Verhaltensregulationen im BnST beteiligt zu sein.

Summary 147
9 Summary
The avian nonapeptide hormones arginine-vasotocin (AVT) and mesotocin (MT) are the
homologues of the mammalian vasopressin (AVP) and oxytocin (OT). While there is a clearly
defined function for the mammalian hormones in osmoregulation (AVP) and reproduction
(OT) in avian species AVT is involved in both regulation of water balance and oviposition.
No information is available about a clear physiological function for MT.
The neurohypophysial peptides are synthesized in hypothalamic neurons and they are
transported axonally to the neurohypophysis where they are released into the blood. Beside
this classical endocrine also neuromodulatory functions of the nonapeptides within the CNS
are described.
In this thesis several physiological parameters were investigated by using a newly developed
MT cDNA probe in order to test their effect on MT gene expression. The hypothalamic MT
system was compared with the well described AVT system. Additionally peripheral tissues
were investigated for their expression of MT and MT receptor gene. For the latter a gene
probe containing a part of the receptor gene was available.
Both cDNA probes for AVT and MT detect the 3’ end of the peptide mRNA. In the Northern
blot and ISH the MT probe is specific without any cross reactivity to the AVT mRNA. In the
Northern blot the probe binds to a mRNA fragment of about 600 bp. The signals are localized
in the cytoplasm of the neurons as shown by ISH and could be abolished by RNase A
treatment of the tissue sections before hybridization. The morphological investigations of MT
gene expression reveals MT mRNA expressing neurons in the hypothalamic SON and PVN
and in the extrahypothalamic magnocellular parts of DLAmc and BnST. Only magnocellular
neurons were found to produce MT mRNA. In adult animals no sex dimorphism was
detectable at the level of the number of gene expressing neurons, in contrast to previous
findings in the AVT system. Around day 14 of embryonic development all MT gene
expressing nuclei are positive for MT mRNA. Compared with the AVT system the rostro-
caudal and lateral extensions of the neurons are smaller in the MT system. In the Northern
blot a continuously increasing amount of brain MT mRNA is detectable. No age dependent
gene expression was obtained. Moreover, in adult animals a sex dimorphism exists in the MT

Summary 148
system. A quantitative ISH reveals higher transcriptional activity within magnocellular
neurons of PVN and SON in males compared with females. A comparison of AVT and MT
gene expression shows a similar pattern throughout development, but in all postnatal stages
AVT mRNA is significantly higher expressed than MT mRNA. Like in the AVT system MT
mRNA is also detectable in axon and dendrites. Hence a rapid local translation and secretion
is possible.
The hypothalamic mRNA content in female chickens was not influenced by water
deprivation. In males there was a slight increase in gene transcription, but a significant level
was not reached. The length of the poly(A) tails of AVT and MT mRNA were only little
changed by dehydration. However, in adult animals the AVT poly(A) tail was increased
compared with embryonic stages.
Outside of the CNS MT mRNA could be identified in the kidney by RT-PCR. Dehydration
doesn’t seem to influence the number of expressing cells. Also MT receptor mRNA could be
detected in the kidney, and it was also apparent in parts of the reproductive system, namely
the ovary, infundibulum, uterus and vagina. A function of MT in osmoregulation could be
transmitted via systemic and/or local influences. The identification of MT receptor mRNA in
reproductive tissues also indicates a physiological role of this peptide in oviposition.
Like AVT in birds MT seems to be involved in both physiological circuits of osmoregulation
and reproduction.
Thus, Mesotocin might be involved in the classical functions of neurohypophysial hormones
also in birds, supported by a local synthesis in the kidney. There might be no function of MT
on behaviour regulation in the BnST like it has been shown for the AVT system.

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In: A. SCHEUNERT u. A. TRAUTMANN: Lehrbuch der Veterinär-Physiologie
Verlag Parey, Berlin, Hamburg
ZHOU, L., J.D. BLAUSTEIN und G.J. DE VRIES (1994):
Distribution of androgen receptor immunoreactivity in vasopressin- and oxytocinimmunoreactive
neurons in the male rat brain.
Endocrinol., 134, 2622 - 2627
ZINGG, H.H. (1996):
Vasopressin and oxytocin receptors.
Baillieres. Clin. Endocrinol. Metab., 10, 75 - 96
ZINGG, H.H., D.L. LEFEBVRE und G. ALMAZAN (1988):
Regulation of poly(A) tail size of vasopressin mRNA.
J. Biol. Chem., 263, 11041 - 11043

Anhang 176
11 Anhang
11.1 Chemikalien-Nachweis
Name Hersteller, Ort Bestellnummer
Aceton reinst MERCK, Darmstadt 1.00013.2500
Agarose Electrophoresis grade GIBCO BRL, Eggenstein 15510-027
Agfa G150 Entwickler (Röntgenfilme) HEILAND, Hamburg 325.100
Agfa G350 Fixierer (Röntgenfilme) HEILAND, Hamburg 325.106
3-Aminopropyltriethoxysilan SIGMA, Deisenhofen A-3648
Ammonium-nickelsulfat Hexahydrat FLUKA, Neu-Ulm 09885
Ampicillin-Trihydrat ROTH, Karlsruhe 6342
Bacto-Agar DIFCO, Detroit, Michigan, USA 0140-01
Bacto-Hefeextrakt DIFCO, Detroit, Michigan, USA 0127-17-9
Bacto-Trypton DIFCO, Detroit, Michigan, USA 0123-17-3
Borsäure z. A. Merck, Darmstadt 1.00165.1000
bovines Serumalbumin SIGMA, Deisenhofen A-7888
Bromphenolblau MERCK, Darmstadt 9283
Calciumchlorid pure SERVA, Heidelberg 15585
Chloramphenicol krist. ROTH, Karlsruhe 6295
Chloroform FLUKA, Neu-Ulm 25690
Chrom (III)-kaliumsulfatdodecahydrat MERCK, Darmstadt 1036
Colchicin SIGMA, Deisenhofen C-9754
D(+)-Glucose research grade SERVA, Heidelberg 22720
DEPC = Diethylpyrocarbonat SIGMA, Deisenhofen D-5758
Deoxynucleotide Triphosphat Set,
PCR Grade
BOEHRINGER, Mannheim 1969064
Dextransulfat FLUKA, Neu-Ulm 31395

Anhang 177
3,3’-
Diaminobenzidintetrahydrochlorid
Di-Natriumhydrogenphosphat
wasserfrei z. A.
Di-Natriumhydrogenphosphat-
Dihydrat z. A.
Di-Natriumhydrogenphosphat-
Heptahydrat reinst
SIGMA, Deisenhofen D-5637
MERCK, Darmstadt 6586.0500
MERCK, Darmstadt 1.06580.1000
MERCK, Darmstadt 1.06574.1000
1,4-Dithiothreit MERCK, Darmstadt 1.12013.0010
EDTA = Tritiplex III DAB MERCK, Darmstadt 1.08421.1000
Entellan MERCK, Darmstadt 1.07961.0100
Esel-anti-Schaf IgG, biotinyliert SIGMA, Deisenhofen B-7390
Eselserum SIGMA, Deisenhofen D-9663
Essigsäure 96 % z. A. RIEDEL DE HAËN, Hannover 33206
Ethanol DAB, 99,6 % ROTH, Karlsruhe 5054.2
Ethanol Rotipuran ≥ 99,8 % ROTH, Karlsruhe 9065.2
Extran MA03 phosphatfrei MERCK, Darmstadt 1.07550.9025
Ficoll 400 SIGMA, Deisenhofen F-4375
Formamid für Molekularbiologie MERCK, Darmstadt 1.12027.1000
Gelatine MERCK, Darmstadt 104078
Glycerin DAB MERCK, Darmstadt 1.04093.1000
GTC = Guanidinthiocyanat FLUKA, Neu-Ulm 50990
Heringssperm DNA Na-Salz BOEHRINGER, Mannheim 83672723.35
Hypam Fixierer ILLFORD, Cheshire, England 758285
Isoamylalkohol SIGMA, Deisenhofen I-1885
Kaliumacetat reinst MERCK, Darmstadt K-10198820
Kaliumchlorid z. A. MERCK, Darmstadt 4936
Kieselgel MERCK, Darmstadt 1925.5000
Magnesiumchlorid-Hexahydrat z. A. ROTH, Karlsruhe 2189

Anhang 178
MOPS = Morpholin-Propan-
Schwefelsäure
SERVA, Heidelberg
SIGMA, Deisenhofen
29836
M-1254
Natriumacetat-Trihydrat z. A. MERCK, Darmstadt 106267.1000
Natriumacetat wasserfrei z. A. MERCK, Darmstadt 6268.1000
Natriumazid reinst MERCK, Darmstadt 6688.0100
Natriumchlorid reinst MERCK, Darmstadt 1.06400.5000
Natriumdihydrogenphosphat-
Monohydrat z. A.
MERCK, Darmstadt 6346.0500
Natriumhydroxid z. A. MERCK, Darmstadt 6469.1000
Natriumjodid FLUKA, Neu-Ulm 71710
ROTH, Karlsruhe 8783.2
Natriumnitrit SIGMA, Deisenhofen S-2252
Natriumtricitrat-Dihydrat z. A. MERCK, Darmstadt 1.06448.1000
Nickelsulfat-Hexahydrat FLUKA, Neu-Ulm 72280
Oligo P(dT) 12-18
AMERSHAM PHARMACIA
BIOTECH, Freiburg
27-7858-01
Paraformaldehyd reinst MERCK, Darmstadt 1.04005.1000
Pentobarbital (Nembutal ®)
Phenisol Entwickler für In situ
Hybridisierung
ILLFORD, Cheshire, England 757635
Pikrinsäure z.A. MERCK, Darmstadt 1.00623.0500
PIPES SIGMA, Deisenhofen P-3768
Polyvinylpyrrolidon SIGMA, Deisenhofen PVP-40
2-Propanol Solv HPLC ROTH, Karlsruhe 7343.1
Resin AG ® 501-X8(D) BIO-RAD, München 142-6425
Rialuma Scintillationsflüssigkeit JT.T. BAKER B.V., Deeventer,
Holland
8582
RNasin Ribonuclease Inhibitor PROMEGA, Mannheim 2511
Rotiphenol ROTH, Karlsruhe 0038.2

Anhang 179
Salzsäure rauchend, 37 % z. A. MERCK, Darmstadt 317.2500
Sarcosyl = N-Lauroylsarcosin SIGMA, Deisenhofen L-5125
Sodiumsodecylsulfat FLUKA, Neu-Ulm 71727
Sucrose SIGMA, Deisenhofen S-0389
Toluidinblau MERCK, Darmstadt 15930
Tris = Trizma-Base SIGMA, Deisenhofen T-1503
Triton SIGMA, Deisenhofen X-100
Wasserstoffperoxid, 30 % ALDRICH, Steinheim 21676-3
Xylol ROTH, Karlsruhe 9713
11.2 Enzyme und Längenstandards
Produkt Hersteller Bestell-Nummer
DNA Molecular Weight
Marker III
DNA Molecular Weight
Marker IV
DNA Molecular Weight
Marker VI
DNA Molecular Weight
Marker VIII
RNA Molecular Weight
Marker I
RNA Molecular Weight
Marker III
BOEHRINGER, Mannhein 84062622-27
BOEHRINGER, Mannheim 83810920-07
BOEHRINGER, Mannheim 83944520-41
BOEHRINGER, Mannheim 84026221-40
BOEHRINGER, Mannheim 84523820-33
BOEHRINGER, Mannheim 84027021-20
Glucose-Oxidase, Typ VII SIGMA, Deisenhofen G-2133
Pst I BOEHRINGER, Mannheim 83436921-10
Nco I BOEHRINGER, Mannheim 84139721-47

Anhang 180
Not I BOEHRINGER, Mannheim 84135122-61
RNase A BOEHRINGER, Mannheim 83910528-69
RNase H BOEHRINGER, Mannheim 84106321-06
VentR ® DNA Polymerase NEW ENGLAND BIOLABS, 254S
11.3 Kits
Name Hersteller Bestell-Nummer
AB-Komplex / HRP DAKO, Hamburg K 0355
Megaprime DNA-Labelling System AMERSHAM, Braunschweig RPN 1604
Quantum Prep Plasmid Miniprep
Kit
BIO-RAD, Richmond, Ca, USA 732-6100
Omniscript RT Kit (200) QIAGEN, HILDEN 205113
18S Quantum AMBION,
Zero Blunt TOPO PCR Cloning
Kit
11.4 Radionuklide
INVITROGEN, NV Leek,
Niederlande
Nuklid Hersteller Bestell-Nummer
[α 32 P] dCTP DUPONT, Dreieich NEG 513-H
[α 33 P] dCTP DUPONT, Dreieich NEG 613-H
K2800-20

Anhang 181
11.5 Primer
Name Sequenz Hersteller
MT upstream TGC CCC ATC GGG GGT AAG CGT G MWG BIOTECH GMBH,
Ebersberg
MT downstream ATG GTG CTG GGT GCT GCG CTG G MWG BIOTECH GMBH,
AVT upstream CTG GGT GAT ACA GCC TTG CGG
CA
Ebersberg
MWG BIOTECH GMBH,
Ebersberg
AVT downstream GGC GTC CAT GGC ACA TGT GTC A MWG BIOTECH GMBH,
Ebersberg
MTR upstream GCT GAG CGT CTG CTA CGG CCT C MWG BIOTECH GMBH,
Ebersberg
MTR downstream CGC CAG CAC GAT GAT GAA GGT C MWG BIOTECH GMBH,
Ebersberg
Random NNN NNN MWG BIOTECH GMBH,
11.6 Puffer
10x MOPS
41,8 g MOPS in A.bidest. lösen
pH 7,0 einstellen
Zugabe 16,6 ml 3 M DEPC-Natriumacetat
Zugabe 20 ml 0,5 M DEPC-EDTA (pH8,0)
auffüllen auf 1 l mit A. bidest.
steril filtrieren
lichtgeschützt lagern
Natriumjodid (Geneclean)
90 g Na2J auffüllen auf 100 ml mit A.bidest.
Ebersberg

Anhang 182
Prähybridisierungspuffer für Northern Blot
50 ml deionisiertes Formamid
25 ml 20x SSC
2 ml Natriumphosphat
250 µl Heringssperm
20 ml 50x Denhard´s
2,7 ml 20 % SDS
Natriumphosphat-Lösung 1 M
44,88 g NaH2PO4 · H2O
35,49 g Na2HPO4
auffüllen auf 250 ml A.bidest., portionieren, einfrieren bei –20 °C
GTC-Lösung
250 g Guanidinthiocyanat (GTC)
293 ml DEPC-H2O
17,6 ml 0,75M Natriumcitrat (pH 7,0)
246 ml 10 % Sarcosyl in DEPC-H2O, 65 °C
steril filtrieren
lagerbar 3 Monate bei RT
Zugabe 360 µl Mercaptoethanol/50 ml
lagerbar 1 Monat bei 4 °C
10 % Sarcosyl-Lösung
10 g N-Lauroylsarcosin auf 100 ml DEPC-H2O
autoklavieren
0,75 M Natriumcitrat-Lösung
44,1 g Tri-Natriumcitrat-Dihydrat
auf 200 ml auffüllen mit A.bidest.
pH 7,0 einstellen
autoklavieren
2 M Natriumacetat-Lösung
32,8 g Natriumacetat (wasserfrei)
auffüllen auf 200 ml A.bidest
pH 4,0 einstellen
autoklavieren
Stripp-Lösung zum Abkochen der Membranen vor Rehybridisierung
3,7 g EDTA auf 1 l A.bidest. autoklaviert
= 10 mM EDTA (pH 7,5)

Anhang 183
20x SSC
175,4 g Natriumchlorid
88,2 g Tri-Natriumcitrat-Dihydrat
auf 1 l auffüllen mit A.bidest.
pH 7,0 einstellen
filtrieren, autoklavieren
10x TBE für DNA-Gele
108,0 g Tris
55,0 g Borsäure
7,5 g EDTA
pH 8,0 einstellen
autoklavieren
TE-Puffer zum Äquilibrieren der G-50 Sephadex-Säulen bei der Markierung
1,21 g Tris (=10 mM)
0,4 g EDTA (=1 mM)
auffüllen auf 1 l mit A.bidest.
pH 7,5 einstellen
autoklavieren
Blue Juice ( Stop-Puffer als Farbmarkierung in Nukleinsäure-Gelen)
1,5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0 = 100 mM
2 ml Glycerin = 30 % (v/v)
0,4 ml Bromphenolblau ( 0,5 % in H2O w : v)
50x Denhard´s
1 g Ficoll 400 (=2 %)
1 g Polyvinylpyrrolidon (=2 %)
1 g bovines Serumalbumin (=2 %)
auffüllen auf 50 ml A.bidest.
steril filtrieren, portionieren, einfrieren bei –20 °C
50 mM EDTA
18,61 g EDTA auf 1 l A.bidest.
pH 8,0 einstellen
autoklavieren
0,5 M EDTA
93,06 g EDTA in 400 ml A.bidest. unter Erhitzen lösen
Zugabe 500 ml A.bidest.
pH 8,0 einstellen
auffüllen auf 1 l
autoklavieren

Anhang 184
Entwickler für Röntgenfilme
100 ml Konzentrat G150 + 500 ml H2O
Fixierer für Röntgenfilme
200 ml Fixierer G350 mit 200 ml H2O mischen,
dann Zugabe 200 ml H20
Lösung 1 für RNase H-Mapping
0,75 g KCl (=100 mM)
0,20 g MgCl2 · 6 H2O (=10 mM)
auffüllen auf 100 ml A.bidest.
autoklavieren
Lösung 2 für RNase H-Mapping
0,75 g KCl (=100 mM)
0,41 g MgCl2 x 6 H2O (=20 mM)
1,21 g Tris (=100 mM)
0,031 g DTT (=2 mM)
auffüllen auf 100 ml A.bidest.
pH 7,8 einstellen, steril filtrieren
Lösung 3 für RNase H-Mapping
4,92 g Natriumacetat
1,49 g EDTA
auffüllen auf 100 ml A.bidest.
pH 7,4 mit Essigsäure einstellen
autoklavieren
4 % Paraformaldehyd
7,2 g Paraformaldehyd mit 115 ml DEPC-H20 auf 60 °C erhitzen
abkühlen lassen
aufklaren mit NaOH
Zugabe 60 ml 3x PBS
pH 7,2 einstellen
20x Denhard´s für In-situ-Hybridisierung
0,4 g Ficoll 400
0,4 g Polyvinylpyrrolidin
0,4 g bovines Serumalbumin
auf 100 ml DEPC-H2O auffüllen

Anhang 185
0,5 M Dithiothrein-Lösung für In-situ-Hybridisierung
7,71 g DTT auf 100 ml A.bidest. auffüllen
in 2 ml portionieren, lagern bei –20 °C
im Endvolumen des Prähybridisierungspuffers (300 ml) werden 6 ml zugesetzt
= 10 mM
Heringssperm
375 mg Heringssperm
25 ml A.bidest.
über Nacht rühren, kurz aufkochen, abkühlen
mit steriler Spritze mischen und in 2 ml-Portionen portionieren
lagern bei –20 °C
3x PBS
1.Ansatz: 22,8 g NaCl (=390 mM)
4, 3 g Na2HPO4 (wasserfrei) (=30 mM)
auf 1 l A.bidest.
2.Ansatz: 22,8 g NaCl (=390 mM)
4,7 g NaH2PO4 · 2H2O (=30 mM)
auf 1 l A.bidest.
beide Ansätze mischen, autoklavieren
DEPC-H2O
2 ml DEPC auf 1 ml A.bidest. gut mischen
autoklavieren
20x Hybridisierungssalze für In-situ-Hybridisierung
5,84 g NaCl (=1 M)
3,46 g PIPES (=0,1 M)
3,72 g EDTA (=0,1 M)
auf 100 ml DEPC-H2O
pH 6,8 einstellen mit NaOH
autoklavieren
Formamid deionisiert
1g Resin / 10 ml Formamid 3-4 h rühren,
filtrieren, portionieren, lagern bei –20 °C
Prähybridisierungspuffer für In-situ-Hybridisierung
150 ml Formamid deionisiert
75 ml 20x Denhard´s
75 ml 20x Hybridisierungssalze
6 ml DTT
5 ml Heringssperm

Anhang 186
Hybridisierungspuffer für In-situ-Hybridisierung
0,5 g Dextransulfat
50 ml Prähybridisierungspuffer
0,1 M CaCl2
11 g CaCl2 in 100 ml A.bidest.
autoklavieren
Chloramphenicol-Stammlösung
34 mg/ml Ethanol
portionieren und bei –20 °C lagern
Ampicillin-Stammlösung
25 mg/ml A.bidest.
portionieren und bei –20 °C lagern
Acetat-Alkohol-Lösung zum Waschen von RNA-Pellets
25 % 0,1 M Natriumacetat, pH 5,2
75 % Ethanol
5 M Kaliumacetat-Lösung
49,1 g Kaliumacetat auf 100 ml A.bidest.
autoklavieren
Chloroform/Isoamylalkohol 49:1
1x SSC mit 0,2 %SDS
8,77 g NaCl (=0,15 M)
4,41 g Natriumcitrat-Dihydrat (= 0,015 M)
1 g SDS
auf 1 l mit A.bidest.
filtrieren, autoklavieren
0,2x SSC mit 0,2 % SDS
1,75 g NaCl
0,88 g Natriumcitrat-Dihydrat
1 g SDS
Neutralisationspuffer für Southern-Blot
87,6 g NaCl (=1,5 M)
60,57 g Tris (=0,5 M)
pH 7,5 mit HCl einstellen
autoklavieren

Anhang 187
Denaturierungspuffer für Southern-Blot
35,06 g NaCl (= 0,6 N)
16,00 g NaOH (= 0,4 N)
autoklavieren
STE-Puffer für DNA-Isolierung aus Hühnerblut
1,21 g Tris (10 mM)
5,84 g NaCl (100 mM)
0,37 g EDTA (1 mM)
pH 8,0 einstellen, auf 1 l mit A. bidest. auffüllen
autoklavieren
7,5 M Ammoniumacetat-Lösung für DNA- Isolierung aus Hühnerblut
11,69 g Ammoniumacetat
auf 100 ml auffüllen mit A. bidest.
autoklavieren
Ethidiumbromid-Lösung zum Anfärben von Nukleinsäuren
0,2 g Ethidiumbromid in 20 ml A. bidest
Lagerung bei 4 °C, dunkel
DNase-Puffer zum Verdau von DNA in Gesamt-RNA-Präparationen
10 ml Tris HCl pH 8,0 (40 mM)
58,4 g NaCl (10mM)
203,3 g MgCl2 (10 mM)
auf 100 ml auffüllen mit A. bidest.
autoklavieren
Tris HCl für DNase-Puffer (400 mM)
0,49 g Tris
pH 8,0 einstellen mit HCl
autoklavieren
Gelatine-Lösung zur Beschichtung von ICC-Objektträgern
5 g Gelatine
0,5 g Chrom(III)-kaliumsulfat-Dodecahydrat
auf 1 l mit A. bidest.
unter Erhitzen und Rühren zusammenmischen, bis vollständig gelöst
filtrieren und auf 20 °C abkühlen
Gefrierschutz-Lösung für Gewebe in der Immuncytochemie
25 % Sucrose in 0,02M PBS

Anhang 188
0,02M PBS für Immuncytochemie
Stock-Lösung A: 27,6 g NaH2PO4 x H2O
in 1 l A. bidest.
Stock-Lösung B: 35,6 g Na2HPO4 x 2 H2O
in 1 l A. bidest.
80 ml A + 420 ml B
45 g NaCl
4500 ml A. bidest.
pH 7,4
Glucoseoxidase-Diaminobenzidin-Nickel-Faärbe-Lösung für Immuncytochemie
Lösung A: 2,5 g Nickelammoniumsulfat
50 ml Natriumacetatpuffer 0,2M (pH 6,0)
Lösung B: 50 – 70 mg Diaminobenzidin
50 ml A. bidest.
A+B
200 mg ß-D(+)-Glucose
40 mg Ammoniumchlorid
0,5 – 1 mg Glucoseoxidase
0,2M Natriumacetat für Immuncytochemie
16,4 g Natriumacetat
800 ml A. bidest.
pH 6,0 mit Essigsäure
auf 1 l mit A. bidest.
Zamboni’s Fixativ für die Perfusion
60 g Paraformaldehyd
auf 600 ml mit 0,02M PBS
auf 60 °C
filtrieren
225 ml gesättigte Pikrinsäure
abkühlen lassen
pH 7,4 – 7,5
auf 1,5 l mit 0,02 M PBS

Anhang 189
11.7 Nährböden und Nährmedien
LB-Medium
10 g Bacto-Trypton
5 g Bacto-Hefeextrakt
10 g NaCl
auf 1 l mit A.bidest.
pH 7,5 mit NaOH einstellen (pH 7,0 für Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit)
autoklavieren
LB-Agarplatten
LB-Medium
15 g/l Bacto-Agar
autoklavieren
abkühlen auf 60 °C
Zugabe des Antibiotikums: 50 µg/ml Kanamycin (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit)
2 µl/ml Ampicillin-Stammlösung
Platten gießen und aushärten lassen, Lagerung bei 4 °C
2YT-Medium
5 g NaCl
16 g Bacto-Trypton
10 g Bacto-Hefeextrakt
auf 1 l mit A.bidest.
autoklavieren

Anhang 190
11.8 Plasmawerte der Tiere
Versuch Dehydrierung (Kap. 6.8)
Tiernr
.
Geschlecht Behandlung
Na +
[mmol/l]
K +
[mmol/l]
Ca 2+
[mmol/l]
Cl -
[mmol/l]
Osmolalität
[mmol/kg]
AVT
[pg/ml]
1 männlich ohne 156.0 5.91 1.17 117 325 15.781
2 männlich ohne 153.6 6.31 1.16 120 318 14.314
3 männlich ohne 150.0 6.48 1.09 118 313 20.768
4 männlich ohne 150.9 6.35 1.09 119 313 10.081
5 weiblich ohne 149.8 5.89 1.29 116 312 4.480
6 weiblich ohne 148.2 5.44 1.30 116 309 9.207
7 weiblich ohne 145.4 5.46 1.17 115 305 5.107
8 weiblich ohne 145.5 5.81 1.23 118 310 6.207
9 männlich
10 männlich
11 männlich
12 männlich
13 weiblich
14 weiblich
15 weiblich
16 weiblich
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
165.4 5.99 0.98 134 341 51.189
166.6 6.03 0.98 131 341 36.315
169.5 5.44 1.02 136 338 50.223
169.9 5.72 1.05 139 342 53.249
165.4 5.70 1.11 135 336 49.396
167.2 5.42 1.11 137 339 49.863
167.6 5.08 1.03 133 342 47.542
160.0 5.61 0.97 131 331 50.843

Anhang 191
Versuch Länge des Poly(A)-Schwanzes (Kap. 6.7)
Tiernr. Geschlecht Alter Behandlung
Na +
[mmol/l]
K +
[mmol/l]
Ca 2+
[mmol/l]
Cl -
[mmol/l]
Osmolalität
[mmol/kg]
AVT
[pg/ml]
9378 männlich adult ohne 148.2 6.28 1.01 120 298 3.767
9396 weiblich adult ohne 150.5 5.95 1.35 127 302 9.407
9398 männlich adult
9384 weiblich adult
48 h
dehydriert
48 h
dehydriert
158.6 7.36 1.07 132 320 27.341
176.1 6.09 1.19 146 346 62.490
321 männlich E14 ohne 121.4 4.75 n.g. 79 245 n.g.
322 weiblich E14 ohne 123.3 4.87 n.g. 82 253 n.g.
Versuch Ontogenese (Kap. 6.3)
Tiernr. Geschlecht Alter
[mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] [mmol/l]
Osmolalität
[mmol/kg]
AVT
[pg/ml]
300+301 männlich adult 147.7 6.63 1.00 120 313 18.065
302+303 männlich adult 147.9 n.g. 0.92 119 313 19.105
304+305 männlich adult 149.4 6.29 1.00 117 317 24.551
311+312 weiblich adult 151.5 4.32 1.04 118 307 13.169
313+314 weiblich adult 150.4 4.23 0.99 117 304 11.789
315+316 weiblich adult 151.5 3.61 0.87 118 317 12.413
321+323 männlich E14 121.4 4.75 n.g. 79 245 n.g.
325+326 männlich E14 n.g. n.g. n.g. n.g. 248 n.g.
328+329 männlich E14 120.5 4.01 0.25 84 253 n.g.
322+324 weiblich E14 123.3 4.87 n.g. 82 253 n.g.
327+330 weiblich E14 121.7 4.23 n.g. n.g. 252 n.g.
331+332 weiblich E14 120.4 4.16 0.26 84 261 n.g.
340+341 männlich D112 149.9 4.45 0.88 111 317 9.809
342+343 männlich D112 147.2 4.22 0.74 102 301 6.370
344+345 männlich D112 150.5 4.45 0.81 112 316 11.823
346+347 weiblich D112 145.6 4.32 0.90 110 309 7.050
348+349 weiblich D112 152.5 4.19 1.01 114 312 11.966
350+351 weiblich D112 152.1 4.77 1.07 114 317 5.473
360+363 weiblich E18 127.2 4.64 0.39 80 263 n.g.
361+362 männlich E18 n.g. n.g. n.g. n.g. 250 n.g.
364+365 männlich E18 126.4 4.52 0.24 79 264 n.g.
366+370 männlich E18 126.7 4.33 0.28 85 267 n.g.
367+368 weiblich E18 127.5 4.06 0.33 83 266 n.g.
369+372 weiblich E18 126.5 4.35 0.41 83 272 n.g.
380+384 weiblich D1 137.1 6.06 0.38 92 276 16.345
381+382 männlich D1 138.7 6.09 0.33 93 276 15.125
383+389 männlich D1 138.1 6.22 0.35 93 276 15.805
385+386 weiblich D1 139.0 5.67 0.32 92 279 12.119
387+388 weiblich D1 137.3 5.95 0.39 89 283 12.419
Na +
K +
Ca 2+
Cl -

Anhang 192
390+391 männlich D1 137.1 6.31 0.39 90 278 12.086
Tiernr. Geschlecht Alter
Na +
[mmol/l]
K +
[mmol/l]
Ca 2+
[mmol/l]
Cl -
[mmol/l]
Osmolalität
[mmol/kg]
AVT
[pg/ml]
400+401 weiblich D14 137.4 6.48 0.67 107 304 12.866
402+405 männlich D14 138.8 7.39 0.82 109 309 15.245
403+404 weiblich D14 138.1 7.55 0.63 106 302 17.425
406+407 männlich D14 138.3 7.14 0.76 111 307 17.375
408+412 weiblich D14 n.g. n.g. n.g. n.g. n.g. n.g.
409+410 männlich D14 136.6 7.28 0.64 108 299 11.633
420+421 männlich D35 142.2 7.51 1.04 111 n.g. 54.927
422+423 männlich D35 139.0 8.34 0.85 107 n.g. 6.370
424+425 männlich D35 140.1 7.33 0.75 106 n.g. 6.303
426+427 weiblich D35 143.4 7.05 0.70 107 n.g. 12.792
428+432 weiblich D35 144.6 10.9 1.02 116 n.g. 15.818
433+434 weiblich D35 140.8 7.83 0.94 113 n.g. 9.243
440+441 männlich D49 137.5 6.14 0.99 112 298 61.794
442+443 männlich D49 137.9 6.87 0.93 110 291 23.575
444+445 männlich D49 139.0 6.43 0-98 111 297 44.379
446+447 weiblich D49 140.1 6.71 1.04 109 298 61.734
448+449 weiblich D49 137.2 6.75 0.93 109 291 83.963
450+451 weiblich D49 140.3 6.58 1.05 110 298 n.g.
480+481 männlich D70 142.5 n.g. 0,94 112 303 9.769
482+483 männlich D70 142.7 n.g. 0.94 113 303 23.528
484+485 männlich D70 141.9 n.g. 0.97 112 302 15.629
486+487 weiblich D70 141.2 n.g. 0.98 113 302 12.066
488+489 weiblich D70 142.2 n.g. 1.02 114 304 21.828
490+491 weiblich D70 142.4 n.g. 1.05 115 305 9.612
n.g. = nicht gemessen

Publikationsliste 193
12 Publikationsliste
Teilergebnisse dieser Arbeit sind publiziert in:
GROSSMANN, R., A. JURKEVICH und A. KÖHLER (1999):
Role of estrogen in development of sexually dimorphic vasotocin system in the chicken bed
nucleus of stria terminalis.
Soc. Neurosci. Abstr., 25, Part 1, 229
JURKEVICH, A., S.W. BARTH, W.J. KUENZEL, A. KÖHLER und R. GROSSMANN
(1999a):
Development of sexually dimorphic vasotocinergic system in the bed nucleus of stria terminalis
in chickens.
J. Comp. Neurol., 408, 46 – 60
JURKEVICH, A., S.W. BARTH, W.J. KUENZEL, A. KÖHLER und R. GROSSMANN
(1999b):
Development of sex differences in the vasotocinergic system of chicken.
Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 107, Suppl. 1, S18
JURKEVICH, A., R. GROSSMANN, A. KÖHLER, S.W. BARTH und K. KUENZEL
(2000a):
Vasotocin expression in the bed nucleus of stria terminalis of chickens during ontogeny: an In
situ model to study sexual differentiation of neuroendocrine system.
In: VII International Symposium on Avian Endocrinology, Varanasi 2000, No. 5.04
JURKEVICH, A., R. GROSSMANN und A. KÖHLER (2000b):
Development of sex differences in the vasotocin system of chickens: organizational role of
estrogen.
Exp Clin. Endocrinol. Diabetes, 108, (Suppl. 1), S60
KÖHLER, A.I., S.W. BARTH, R.A.D. BATHGATE, R. IVELL, R. GROSSMANN
(1998a):
Pre- and posthatch development of the mesotocin gene expression in the hypothalamus of the
chicken.
Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 106, Suppl. 1, S8
KÖHLER, A.I., S. BARTH, R. BATHGATE, R. IVELL, R. GROSSMANN (1998b):
Mesotocin gene expression in the hypothalamus of pre- and posthatched chickens.
Eur. J. Neurosci., 10, Suppl. 10, 163
KÖHLER, A., S. BARTH, R. IVELL, R. GROSSMANN (1998c):
Genexpression des Mesotocin im Zwischenhirn des Huhnes.
DGfZ/GfZ-Fachtagung, Berlin, B05
KÖHLER, A., R. GROSSMANN (1999):
Gene expression of mesotocin in the hypothalamus and peripheral tissues of the chicken.
World Congress on Neurohypopyhsial Hormones, Edinburgh, WED23

Danksagungen
Mein besonderer Dank gilt Dr. Roland Großmann für die Überlassung des Themas und für die
ständige Bereitschaft zu hilfreichen und anregenden Diskussionen während der Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff danke ich für die Übernahme des Referates und die
Bereitstellung aller für die Durchführung dieser Arbeit notwendigen Möglichkeiten am Institut
für Tierzucht und Tierverhalten in Celle.
Herzlichen Dank auch an Prof. Dr. Richard Ivell und Prof. Dr. Edda Töpfer-Petersen für die
Übernahme der Betreuungsgruppe und die hilfreichen Anregungen.
Dr. Aleksandr Jurkevic, Institute of Ecology in Vilnius, Litauen, möchte ich danken für alle
Hilfestellungen, besonders für die geduldige Einführung in die Statistik.
Für viele nützliche Anregungen und Tips gilt mein Dank Dr. Eckhard Mühlbauer, Institut für
Neuropsychopharmakologie der FU Berlin.
Ebenso danke ich Dr. Stephan Barth, Bundesforschungsanstalt für Ernährung, Karlsruhe, Prof.
Wayne Kuenzel, University of Maryland, USA, und Lucy Zhao, Agricultural University of
Nanjing, China, für die Einführung in die anatomischen und methodischen Grundlagen.
Mein besonderer Dank gilt allen Mitarbeitern des Forschungsbereiches Nutztierphysiologie für
das tolle Arbeitsklima und die vielen Leckereien. Die Unterstützung nach Feierabend, nachts
und an Wochenenden kann ich gar nicht wieder gut machen.
Auch an Dr. Stephan Schwarz, Corinna Kehrenberg und Dr. Tanja Kampers vielen Dank für
alles.
Mein besonderer Dank schließlich gilt meiner Familie für ihr Vertrauen in mich und jede Form
der moralischen und materiellen Unterstützung. Ohne Euch wäre das alles nicht möglich
gewesen.