Biochemisches Praktikum 1 – Grundpraktikum

THEORETISCHE
GRUNDLAGEN
Biochemisches Praktikum 1
Grundpraktikum

Enzyme
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Biochemisches Praktikum 1 – Grundpraktikum
Enzym-Kinetik
Enzyme sind biologische Katalysatoren, die den Stoffwechsel in Zellen regulieren und organisieren.
Ihre Funktion ist die Beschleunigung chemischer Reaktionen, die ohne sie unter den Bedingungen
biologischer Systeme nicht in wahrnehmbarer Geschwindigkeit ablaufen würden. Manche
Reaktionen werden bis zu 10 17 -fach beschleunigt, aber selbst so einfache Reaktionen wie die
Hydratisierung von CO2 werden durch ein spezielles Enzym, die Carboanhydrase noch um das 10 6 -
fache schneller. Auf diese Weise stellt der Organismus den vollständigen Transport von CO2 aus
dem Gewebe ins Blut sicher.
Die meisten bekannten Enzyme sind Proteine. Die Entdeckung katalytisch aktiver RNA-Moleküle
zeigt aber, dass in der frühen Evolution auch andere Makromoleküle als Biokatalysatoren gewirkt
haben können.
Enzyme nehmen in der Zelle verschiedene Aufgaben war: Sie
- sind verantwortlich für die Katalyse chemischer Umwandlungen bei der Synthese von Metaboliten
- wandeln unterschiedliche Energieformen ineinander um (z.B. Lichtenergie in chemische
Bindungsenergie bei der Photosynthese)
- koppeln chemische Umsetzungen an den Energiehaushalt der Zelle
- und ermöglichen endergonische Reaktionen durch ihre Kopplung an exergonische Reaktionen.
Neben ihrer katalytischen Aktivität zeichnen sich Enzyme durch ihre Substratspezifität und durch
ihre gute Regulierbarkeit aus. Beides ist notwendig, um die komplexen Stoffwechselvorgänge einer
Zelle zu koordinieren.
Die Substratspezifität eines Enzyms wird durch seinen räumlichen Aufbau bestimmt. Polypeptidketten
falten sich abhängig von ihrer Primärstruktur und bilden komplexe dreidimensionale Strukturen
aus. Im aktiven Zentrum eines Enzyms wird das Substrat gebunden und in die richtige räumliche
Position zu den Aminosäureseitenketten gebracht, die für die Katalyse verantwortlich sind.
Das Substrat wird über viele schwache Wechselwirkungen (Wasserstoff- oder Salzbrücken) gebunden.
Nur wenn alle Wechselwirkungen im aktiven Zentrum aktiviert werden, ist das Substrat
fest gebunden und richtig positioniert. Auf diese Weise werden unspezifische Bindungen und damit
unnötige Nebenreaktionen bei der Enzymkatalyse vermieden.
Je nach biologischer Aufgabe können Enzyme eine mehr oder weniger strenge Substratspezifität
zeigen. Ein gutes Beispiel dafür sind proteolytische Enzyme, die Proteasen.

Proteasen katalysieren in der Zelle die Hydrolyse von Peptidbindungen
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Subtilisin, eine bakterielle Protease erkennt Polypeptidketten und spaltet sie spezifisch in der Peptidbindung.
Die katalytische Aktivität von Subtilisin wird dabei kaum durch die Seitenketten an der
Spaltstelle beeinflusst. Im Gegensatz dazu spaltet Trypsin, ein Verdauungsenzym, Polypeptidketten
nur auf der Carboxylseite von Lysin oder Argininresten. Die basischen Seitenketten dieser
Aminosäuren sind notwendig, um das Substrat richtig im aktiven Zentrum zu positionieren. Eine
Protease im Blutgerinnungsprozess, Thrombin, ist noch spezifischer in der Substratbindung.
Thrombin spaltet nur Arginin-Glycin Bindungen, die innerhalb einer spezifischen Peptidsequenz
liegen. Hier sind mehrere spezielle Seitenketten notwendig, um das Substrat im aktiven Zentrum zu
positionieren und zu binden.
Viele Enzyme benötigen so genannte Cofaktoren, kleine Moleküle, die für die Katalyse essentiell
sind. Diese Cofaktoren können Metalle oder kleine organische Moleküle sein. Die katalytische Aktivität
der alkalischen Phosphatase hängt z.B. von Zn 2+ Ionen ab. Das Chelatieren der Zn 2+ -Ionen
mit EDTA führt zur Inhibition des Enzyms, gibt man wieder Zn 2+ -Ionen zu, wird die alkalische
Phosphatase wieder aktiv. Organische Cofaktoren werden Coenzyme genannt. Sie leiten sich oft
von Vitaminen ab. Manche dieser Coenzyme sind kovalent an das Enzym gebunden und werden als
prosthetische Gruppe bezeichnet. Nicht kovalent gebundene Cofaktoren wie NADH oder FADH
werden oft als Cosubstrate bezeichnet. Ein Enzym ohne seinen Cofaktor ist ein Apoenzym, das
vollständig aktive Enzym nennt man Holoenzym.
Auch Enzym katalysierte Reaktionen laufen nur ab, wenn die Energiebilanz der Reaktion negativ
ist, die Reaktion also exergonisch verläuft und Energie frei wird (∆G < 0). Enzyme beschleunigen
chemische Reaktionen dramatisch, aber sie verändern nicht das Gleichgewicht der Reaktion. Die
Beschleunigung wird durch das Absenken der notwendigen Aktivierungsenergie erreicht.
Die Verringerung der Aktivierungsenergie führt zu einer größeren Reaktionsgeschwindigkeit, da
mehr Moleküle vorhanden sind, deren Energie zur Überschreitung der Barriere groß genug ist.
Das Absenken der Aktivierungsenergie erreichen Enzyme durch die Stabilisierung eines energiereichen
Übergangszustandes der Reaktion.

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Zur Stabilisierung des Übergangszustandes muss das Substrat vom Enzym im aktiven Zentrum
gebunden werden. Deshalb ist die Geschwindigkeit einer Enzym-katalysierten Reaktion direkt davon
abhängig, wie viele Substratmoleküle an Enzymmoleküle gebunden vorliegen. Bei einer gegebenen
Enzymkonzentration hängt die Substratbindung von der Substratkonzentration ab. Sind nur
wenige Substratmoleküle vorhanden, werden nur wenige aktive Zentren besetzt. Je höher die
Substratkonzentration, umso mehr aktive Zentren sind besetzt und umso schneller ist der Umsatz
des Substrats. Solange nicht alle aktiven Zentren der vorhandenen Enzymmoleküle ein Substrat gebunden
haben, steigt die Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Substratkonzentration.
Allerdings wird es mit steigendem Besetzungsgrad der vorhandenen Enzym-Moleküle für die neuen
Substratmoleküle immer schwieriger, ein freies Enzym zu finden. Deshalb steigt die Reaktionsgeschwindigkeit
nicht linear mit der Substratkonzentration. Es ergibt sich eine Sättigungskurve,
die sich der maximalen Geschwindigkeit annähert. Vmax ist erreicht, wenn alle Enzym-Moleküle
ein Substrat gebunden haben. Vmax/2 ist erreicht, wenn die Hälfte aller Enzym-Moleküle mit
Substrat besetzt ist.
Die Konzentration, bei der für ein bestimmtes Substrat Vmax erreicht wird, ist von der Affinität des
Enzyms zum Substrat abhängig. Substrate, die gut von einem Enzym gebunden werden, besetzen
bei geringer Konzentration die Enzym-Moleküle. Die Reaktionsgeschwindigkeit steigt wesentlich
schneller bezogen auf die Substratkonzentration, als mit einem gering affinen Substrat.
Die Entwicklung der Reaktionsgeschwindigkeit spiegelt damit die Affinität des Enzyms zu einem
Substrat wieder.

L. Michaelis und M. Menten haben Anfang des 20. Jahrhunderts aus ihren Beobachtungen bei der
Messung der Reaktionsgeschwindigkeiten von Enzym katalysierten Reaktionen als erste die
Existenz eines Zwischenschritts, die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes, postuliert und aus
der sich ergebenden Reaktionsgleichung
die Definition der Michaelis(-Menten)-Konstante KM und der Reaktionsgeschwindigkeit V
abgeleitet:
[S] = Substratkonzentration
[E] = Enzymkonzentration
[ES] = Enzym-Substrat-Komplexkonzentration
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Die Michaelis-Menten-Konstante KM (Einheit molL -1 ) ist die Substratkonzentration bei halbmaximaler
Reaktionsgeschwindigkeit. Sie ist für jedes Substrat spezifisch und gibt an, wie hoch die Affinität
von Enzym und Substrat ist. Ein kleiner KM-Wert bedeutet eine hohe Affinität, ein hoher KM
Wert zeigt eine schlechte Enzym-Substrat-Bindung an.
Die Bestimmung von Vmax, Vmax/2 und damit von KM ist aus einem Michaelis-Menten-Diagramm
sehr ungenau. Deshalb erfolgt die Darstellung der Abhängigkeit von Geschwindigkeit und Substratkonzentration
in einem so genannten Lineweaver-Burk-Diagramm. Hier werden die Kehrwerte
von V gegen [S] aufgetragen, also 1/V gegen 1/[S].
Es ergibt sich eine Gerade, deren Schnittpunkt mit der y-Achse 1/Vmax entspricht. Ihr Schnittpunkt
mit der x-Achse ergibt –1/KM. Das Lineweaver-Burk-Diagramm ist nur eine andere Darstellung der
Michaelis-Menten-Kinetik, die das Ablesen der wichtigen Werte erleichtert.
Befindet sich die Substratkonzentration im Sättigungsbereich(= alle Enzyme haben ein Substrat
gebunden) hängt die Reaktionsgeschwindigkeit von der Anzahl der Substratmoleküle ab, die vom
Enzym pro Zeiteinheit in Produkt umgesetzt werden. Diese wird durch die Wechselzahl eines
Enzyms ausgedrückt und entspricht der Geschwindigkeitskonstante k3 in obiger
Reaktionsgleichung. k3 wird auch als kcat bezeichnet.

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In vivo sind Enzym katalysierte Reaktionen hoch reguliert. Die Regulation der Enzyme erfolgt über
die Hemmung ihrer Aktivität. Dabei unterscheidet man drei verschiedene Formen der Enzymhemmung:
- kompetitive Hemmung
- nicht-kompetitive Hemmung und
- un-kompetitive Hemmung.
Die Kompetitive Hemmung
Bei der kompetitiven Hemmung ähnelt der Inhibitor dem
Substrat und wird vom Enzym im aktiven Zentrum gebunden.
Der Inhibitor kann nicht umgesetzt werden, verhindert aber die
Bindung des Substrats und dessen Reaktion. Eine kompetitive
Hemmung ist reversibel und kann durch eine Erhöhung der
Substratkonzentration überkommen werden.
Das Lineweaver-Burk-Diagramm einer kompetitiven Inhibition
zeigt den Einfluss des Inhibitors auf Vmax und KM. Vmax
verringert sich nicht, aber der KM -Wert der Reaktion steigt. Es
wird mehr Substrat benötigt im Vergleich zur Reaktion ohne
Inhibitor. Für die Effektivität eines Inhibitors ist seine Affinität
zum Enzym Ausschlag gebend. Da er wie das Substrat im aktiven Zentrum gebunden werden muss,
beeinflusst die Stärke der Bindung die Wirkung der Inhibition. Die Inhibitorkonstante KI lässt sich
wie KM aus dem Diagramm berechnen.
Die nicht-kompetitive Hemmung
Ein nicht-kompetitiver Inhibitor bindet nicht
im aktiven Zentrum eines Enzyms, verhindert
aber durch seine Bindung die
Substratumsetzung. Da ein nicht-kompetitiver
Inhibitor nicht mit dem Substrat konkurriert,
kann er durch Erhöhung der
Substratkonzentration nicht überkommen
werden.
Das Diagramm zeigt, dass sich der KM-Wert bei dieser Hemmung nicht verändert, aber Vmax sinkt.
Die un-kompetitive Hemmung
Bei der un-kompetitiven Inhibition bindet der Inhibitor nicht
das Enzym, sondern den Enzym-Substrat-Komplex.
Vmax wird kleiner, KM wir d größer und die Hemmung
kann durch Erhöhung der Substratkonzentration nicht
überkommen werden.

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Ein Sonderfall ist die irreversible nicht-kompetitive Hemmung von Enzymen. Die beteiligten
Substanzen sind keine Inhibitoren im klassischen Sinn, sondern Zellgifte. Sie können wie kompetitive
Inhibitoren im aktiven Zentrum binden und dieses blockieren oder wie nicht-kompetitive
Inhibitoren die Bindung des Substrats oder die Umsetzung des Substrats verhindern. Da die Bindung
dieser Inhibitoren irreversibel erfolgt, führen sie durch die Zerstörung der Enzymmoleküle zur
dauerhaften Hemmung und damit in vielen Fällen zum Zelltod.
Zyanide (Blausäure, HCN oder Zyankali, KCN) hemmen zum Beispiel eine Cytochromoxidase.
Schwermetallionen (z.B. Quecksilber) reagieren mit SH-Gruppen in Proteinen und zerstören Disulfidbrücken.
Auch die Wirkung mancher Antibiotika beruht auf der irreversiblen Hemmung bestimmter
Enzyme, Penicillin hemmt z.B. eine bakterielle Transpeptidase und verhindert damit die
Zellwandbildung.
In der Medizin spielen Enzyme und ihre Regulation heute eine bedeutende Rolle. Von den ca. 1000
genetischen Erkrankungen, bei denen das defekte Gen identifiziert wurde, ist in der Mehrheit eine
enzymatische Funktion betroffen. Die Phenylketonurie (PKU) ist ein klassisches Beispiel für einen
genetisch bedingten Enzymdefekt. Den Betroffenen fehlt ein Enzym bei der Umwandlung von
Phenylalanin in Tyrosin. Nicht behandelt führt die Krankheit zu schweren Schäden im Gehirn. PKU
hat eine Häufigkeit von 1 : 10000 und kann heute direkt nach der Geburt durch einen einfachen Test
diagnostiziert werden.
Auch in der Diagnostik vieler Krankheiten sind Enzyme häufig genutzte Marker. Leberschäden lassen
sich z.B. durch Messung der Blutgerinnungsenzyme erkennen, Veränderungen in der Aktivität
der Verdauungsenzyme weisen auf Pankreaserkrankungen hin und Herzinfarkte lassen sich schon
vier Stunden später durch die Erhöhung herzspezifischer Enzyme erkennen. Auch bei der Behandlung
vieler Krankheiten werden heute Enzymreaktionen beeinflusst. Hier spielen vor allem
kompetitive Hemmstoffe eine wichtige Rolle: Hemmstoffe der Thymidin-Synthase, wie z.B. 5–
Fluorouracil werden in der Krebstherapie eingesetzt, Gicht wird mit Allopurinol, einem Hemmstoff
der Xanthinoxidase behandelt und Sulfonamide, die in der Behandlung von Infektionskrankheiten
Verwendung finden, hemmen die bakterielle Folsäuresynthese.
Der Einsatz von Enzymen in Medizin und Technik und die Entwicklung wirksamer Enzym-Hemmstoffe
für die Krankheitsbehandlung setzt voraus, dass die Enzyme und ihre Reaktionskinetik genau
untersucht sind.
Im Praktikum werden Sie an zwei einfachen Beispielen sehen, wie Enzymkinetiken gemessen und
Inhibitorwirkungen untersucht werden können. Dazu werden Sie
o Vmax und KM der Alkohol-Dehydrogenase (ADH) für zwei Substrate bestimmen
o die Wirkung eines Inhibitors auf die Enzymaktivität der ADH testen
o mit Hilfe der ADH katalysierten Reaktion den Alkoholgehalt in einer Kirsch-Likör-Praline
bestimmen
o und den Einfluss äußerer Parameter (pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration) auf die
Aktivität der alkalischen Phosphatase untersuchen.

Alkohol-Dehydrogenase - ADH:
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Das Enzym Alkohol-Dehydrogenase katalysiert die reversible Oxidation von Alkohol zu Acetaldehyd.
CH3CH2OH + NAD + CH3CHO + NADH + H +
Es kommt in Mikroorganismen wie der Hefe und in Pflanzen und Tieren vor. ADH aus Hefe unterscheidet
sich in Aufbau und Funktion von ADH aus Leber. Das Hefeenzym ist 150 kDa groß, hat
vier aktive Zentren und überträgt bei der alkoholischen Gärung Wasserstoff auf Acetaldehyd. Das
Produkt ist Ethanol, der aus der Zelle entfernt wird. ADH in der menschlichen Leber ist 84 kDa
groß und hat zwei aktive Zentren. Seine Aufgabe ist es, aufgenommenen Alkohol durch Oxidation
in Acetaldehyd umzuwandeln. Acetaldehyd wird von einem weiteren Enzym dann zu Essigsäure
oxidiert. Im menschlichen Körper spielt die ADH damit eine wichtige Entgiftungsfunktion.
Für den Nachweis der ADH-Reaktion wird ein optischer Test verwendet. Bei der Oxidation von Alkohol
zum Aldehyd wird jeweils auch ein NAD + als Elektronenakzeptor reduziert und in NADH
überführt. Für jedes Molekül Aldehyd, das aus einem Molekül Alkohol entsteht wird also auch ein
Molekül NAD + in NADH umgewandelt. Während die Umsetzung von Alkohol in Aldehyd nicht
direkt nachweisbar ist, kann die Bildung von NADH optisch am Photometer verfolgt werden.
NAD + und NADH haben ein Absorptionsmaximum bei 255 nm. NADH hat aber noch ein
zusätzliches Maximum bei 345 nm. Die Zunahme der Absorption bei 345 nm ist ein direktes Maß
für die Umwandlung des Alkohols.
Wie oben beschrieben erhöhen Enzyme nur die Geschwindigkeit mit der eine Reaktion abläuft,
verändern aber nicht das Gleichgewicht der Reaktion. Um eine kontinuierliche Umsetzung des Alkohols
zu gewährleisten muss der gebildete Aldehyd aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt
werden. Dies wird durch die Zugabe von Semicarbazid zum Reaktionspuffer erreicht. Semicarbazid
reagiert mit dem Aldehyd zu einem Semicarbazon, das schwer löslich ist.
Während die menschliche ADH fast alle Alkohole oxidiert, zeigt die ADH aus Hefe eine deutliche
Substratspezifität. Verschiedene Alkohole werden mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt.
Dies wird im 1. Praktikumsversuch durch Messung der Enzymkinetik mit Ethanol und 1–Propanol
untersucht. Die Umsetzungsgeschwindigkeit der beiden Alkohole wird in Abhängigkeit von
ihrer Konzentration gemessen, daraus je ein Lineweaver-Burk-Diagramm erstellt und Vmax und KM
bestimmt.

Alkalische Phosphatase – AP
Phosphatasen sind Enzyme, die Monophosphorsäureester hydrolysieren. Ihre Substrate sind Alkohole,
Zucker, Phenole oder Nukleosidmonophosphate. Auch das Phosphat am 5`- Ende eines
DNA-Stranges oder phosphorylierte Aminosäuren in Proteinen werden hydrolysiert.
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Je nach Enzym zeigen Phosphatasen eine pH-Wert abhängige Aktivität. Es gibt saure Phosphatasen,
die bei niedrigen pH-Werten maximale Reaktionsgeschwindigkeit zeigen und alkalische
Phosphatasen, die im basischen Milieu optimal arbeiten.
Die alkalische Phosphatase des Menschen kommt hauptsächlich in Osteoblasten im Knochenmark
vor und ist wichtig für die Knochenneubildung. Das Enzym wird in der Medizin diagnostisch als
Marker für Knochen- und Lebererkrankungen und als Tumormarker bei Osteosarkomen verwendet.
Der Nachweis der alkalischen Phosphatase Aktivität erfolgt über die Spaltung von p-Nitrophenylphosphat.
Die Bildung des gelben Nitrophenolats kann direkt durch Messung der Absorption bei 405 nm verfolgt
werden.
An Hand dieser Reaktion soll der Einfluss äußerer Faktoren wie z.B. des pH-Werts, der Temperatur
oder der Salzkonzentration auf die Enzym-Aktivität untersucht werden.

Genomische DNA:
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Biochemisches Praktikum 1 – Grundpraktikum
DNA-Analytik
DNA ist DER Informationsspeicher in Lebewesen. Egal ob wir ein einfaches einzelliges Darmbakterium
oder einen komplexen, aus vielen verschiedenen Zelltypen aufgebauten Organismus wie
den Menschen betrachten – die Informationen, wie dieser Organismus aussieht, sich vermehrt,
Energie gewinnt, wie seine Zellen miteinander oder der Umwelt interagieren usw. ist in seinem genetischen
Material, der DNA, gespeichert. Dieser Informationsspeicher entscheidet darüber, wie,
wann und wo in einer Zelle Proteine synthetisiert werden.
Obwohl sich die „Menge“ und Komplexität dieses Informationsspeichers DNA je nach Organismus
stark unterscheiden, sind der grundlegende Aufbau und die Struktur von DNA in jedem Organismus
gleich.
DNA ist ein lineares Polymer, aufgebaut aus vier verschiedenen Monomeren, die sich auf zwei
Grundstrukturen, Purin und Pyrimidin, zurückführen lassen:
Das Rückgrat des DNA-Polymers wird durch sich wiederholende Zucker-Phosphat-Einheiten gebildet.
An jeder Zuckereinheit (Desoxyribose - Einheit) des DNA-Stranges hängt eine Base.
Die Reihenfolge der Basen ist für den strukturellen Aufbau des DNA-Moleküls unerheblich, sie
können entlang eines DNA-Stranges in jeder beliebigen Reihenfolge angeordnet werden.
Allerdings ist für die genetische Information, die in einem DNA Molekül gespeichert sein soll, die
Reihenfolge der Basen von entscheidender Bedeutung. Die Sequenz, in der die Basen innerhalb
eines DNA-Strangs aufeinander folgen, ist der Code, in dem die genetische Information gespeichert
wird.

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Ein DNA-Strang ist eine „direktionale“ Kette, d.h. innerhalb des linearen DNA-Moleküls gibt es eine
Orientierung.
Die Orientierung der DNA-Kette ergibt sich aus ihrem Synthese-Mechanismus: Das 3´-OH des
letzten Nukleotids in einem DNA-Molekül wird unter di-Phosphat - Abspaltung mit dem 5´-Phosphat
eines dNTP verknüpft.
DNA-Sequenzen werden (wenn nicht anders angegeben) in 5´- 3´-Richtung geschrieben:
5´ -ATGCTGGGCAAG....-3´
In der Regel bestehen DNA-Moleküle nicht aus einem, sondern aus zwei DNA Strängen, die umeinander
gewunden sind. Das Zucker-Phosphat-Rückgrat der Stränge liegt außen, die Basen weisen
nach innen. Die Basen bilden spezifische Basenpaare (bp), die durch Wasserstoffbrücken zusammengehalten
werden. Adenin paart mit Thymin (zwei Wasserstoffbrücken) und Guanin paart
mit Cytosin (drei Wasserstoffbrücken).
Es bildet sich die DNA - Doppelhelix, in der die Sequenz des einen DNA-Strangs auf Grund der
Basenpaarung die Sequenz des zweiten Strangs in der Doppelhelix festlegt. Die Stränge sind von
der Basensequenz komplementär, aber von ihrer Orientierung antiparallel angeordnet.

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Die Entschlüsselung des genetischen Codes und die Sequenzierung des Genoms von mittlerweile
Dutzender verschiedener Organismen haben uns theoretisch die Informationen gegeben, die letztendlich
zum Verstehen der Funktionsweise einer Zelle führen werden. Die reine Kenntnis der genomischen
Sequenzen ist aber nicht ausreichend für ein solches Verständnis. Es ist notwendig,
genomische DNA in kleine(re) Teilbereiche zu zerlegen und die Funktion dieser DNA-Abschnitte
bzw. die Funktion der dort codierten Proteine zu analysieren.
Für solche Analysen muss genomische DNA in möglichst homogener und reiner Form isoliert werden,
sie muss in kleinere Abschnitte aufgeteilt werden können und definierte Abschnitte müssen
isoliert und manipuliert werden können.
Die Praktikumswoche DNA-Analytik wird in die Grundlagen der zur Analyse, Manipulation und
Nutzung von DNA wichtigen Techniken einführen.
Es werden Experimente zu folgenden Methoden durchgeführt:
o Isolierung genomischer DNA aus verschiedenen eukaryotischen Zellen
(Gewebe, Hefezellen)
o Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
(Alkalische Lyse, Boiling Methode)
o Konzentrierung von DNA durch Fällung
o Auftrennung und Nachweis von DNA durch Agarosegel-Elektrophorese und SYBR Safe-
Färbung
o Spaltung von genomischer und Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen
o Restriktionskartierung von Plasmid-DNA
o Transformation von Plasmid-DNA in E. coli
o Amplifikation eines DNA-Fragments durch PCR (Polymerase chain reaction)

Isolierung genomischer DNA:
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Jede Zelle enthält ein bis zwei Moleküle der für den Organismus charakteristischen genomischen
DNA (eukaryotische Zellen haben in der Regel zwei Kopien). Diese genomische DNA in der Zelle
ist nicht „nackt“, sondern dicht be- und verpackt mit verschiedensten Proteinen (Stichwort „Chromatin“).
Außerdem befindet sich in der Zelle eine Vielzahl verschiedener organischer Makromoleküle
(Proteine, Lipide, Zucker usw.), die beim Aufschluss zusammen mit der DNA in den wässrigen
Puffer freigesetzt werden. Erschwerend kommt hinzu, dass einige der zellulären Proteine DNA
zerstören können (DNasen) und bestimmte zelluläre Bestandteile oder Komponenten des Aufschlusspuffers
inhibierend auf Enzyme wirken, die für die weitere Analyse und Manipulation der
DNA eingesetzt werden.
Methoden zur Isolierung von (genomischer) DNA umfassen drei grundlegende Schritte (die zum
Teil ineinander übergehen):
1. Aufschluss der Zellen
2. Abtrennen von Verunreinigungen
3. Konzentrierung der DNA
Bei der Wahl der Methode spielen der Ausgangsorganismus und der Verwendungszweck der DNA
eine entscheidende Rolle. Bakterienwände werden anders aufgeschlossen als die Zellwände von
Hefen oder die Zellmembranen von Säugetierzellen.
Da es sich bei genomischer DNA, egal aus welchem Organismus sie stammt, um ein sehr großes,
lineares Molekül handelt, ist sie sehr empfindlich gegenüber Scherkräften. Zu heftiges, schnelles
Mischen oder Pipettieren durch sehr enge Kanülen kann zum mechanischen „Zerbrechen“ (Scheren)
der genomischen DNA führen. Wird hochmolekulare DNA benötigt, müssen alle Mischschritte
vorsichtig durchgeführt, pipettieren durch Kanülen und auch das Präzipitieren der DNA vermieden
werden.
Im Praktikum soll genomische DNA aus zwei verschiedenen Quellen isoliert werden:
- Maus-DNA aus einem Stück Mäuseschwanz (die Mäuse wurden NICHT für diesen Praktikumsversuch
getötet!)
- Hefe-DNA aus Hefezellen
a) Isolierung genomischer DNA aus Gewebe:
Der Aufschluss von Säugetierzellen aus Zellkulturen für die Isolierung genomischer DNA ist in
der Regel einfach. Schon relativ geringe Konzentrationen an Detergenzien (TritonX100, 0,5 %,
SDS, 0,1 %), Ultraschall-Behandlung oder wiederholtes Einfrieren und Auftauen in einem
Hochsalz-Puffer („Freeze and Thaw“) reichen aus, um Säugetierzellen aufzubrechen und den
Zellinhalt in den Puffer zu eluieren. Dabei wird meist auch der Kern aufgeschlossen und die
genomische DNA liegt zusammen mit allen Zellbestandteilen im wässrigen Puffer gelöst vor.
Grobe Zelltrümmer können durch Zentrifugation entfernt werden. Wasserlösliche bzw. an die
genomische DNA gebundene Proteine können durch Behandlung der Lösung mit Phenol
(Phenolisierung) denaturiert und entfernt werden oder durch enzymatischen Abbau mit ProteinaseK
in kleine Peptide zerlegt werden. Die genomische DNA wird dann durch einen Fällungsschritt
(Präzipitation) von den Verunreinigungen abgetrennt und gleichzeitig konzentriert.
Bei der Isolierung von genomischer DNA aus Gewebe liegen die Zellen in einem dichten dreidimensionalen
Zellverband vor, der verhindert, dass das Aufschluss-Reagenz alle Zellen
schnell und gleichmäßig erreicht. Deshalb sollte der Zellverband zunächst aufgelöst werden,
z.B. indem man die Probe in flüssigem Stickstoff einfriert und im gefrorenen Zustand (unter N2-
Kühlung) pulverisiert. Auf diese Weise kann eine homogene Mischung der Zellen im Lysispuffer
erreicht werden.

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Eine technisch einfachere, aber zeitaufwendigere Methode zum Aufschluss von Gewebe wird
im Praktikum angewendet: Die Gewebeprobe wird in einem SDS-haltigen Lysispuffer zusammen
mit ProteinaseK solange inkubiert, bis das Enzym alle Zellen zerstört hat und die Proteine
abgebaut sind. Auf diese Weise werden Zellaufschluss und (teilweise) Abtrennung von Verunreinigungen
in einem Schritt erreicht.
Das für den Zellaufschluss und den Abbau der Proteine verwendete Enzym „ProteinaseK“ ist
eine Subtilisin verwandte Serinprotease. ProteinaseK spaltet peptidische Bindungen X—Y,
wobei X eine aliphatische, aromatische oder hydrophobe Aminosäure und Y jede beliebige
Aminosäure sein kann. Diese relativ unspezifische Substratwahl erlaubt es praktisch jedes beliebige
Protein mit ProteinaseK abzubauen und führt bei hohen Enzymkonzentrationen und
langen Inkubationszeiten zu einem Abbau der Proteine bis hin zu den freien Aminosäuren.
ProteinaseK wird weder durch zweiwertige Metallionen, noch durch Chelatoren (z.B. EDTA)
gehemmt und ist aktiv über einen weiten pH (4, 0 – 12,5) und Temperaturbereich (37 – 60 °C).
Seine optimale Aktivität erreicht das Enzym bei 55 °C mit 0,5 % SDS im Puffer.
Gewebebestandteile, die weder durch SDS noch durch ProteinaseK zerstört werden (Haare,
Knochen), können nach der enzymatischen Behandlung durch Zentrifugation abgetrennt werden.
Die genomische DNA wird dann durch Fällung aus der wässrigen Lösung abgetrennt.
In Gegenwart monovalenter Kationen bildet DNA in Ethanol oder Isopropanol einen unlöslichen
Niederschlag.
Da der Lysispuffer schon eine relativ hohe Konzentration an NaCl enthält, kann die DNA direkt
durch Zugabe von Ethanol (2,5 – 3 Volumen) oder Isopropanol (0,5 – 1 Volumen) gefällt werden.
Wird die DNA-Lösung vorsichtig mit dem Alkohol überschichtet, kann man die genomische
DNA an der Phasengrenze präzipitieren sehen. Vorsichtiges Mischen der Phasen lässt
die DNA als „Knäuel“ ausfallen. Um mit ausfallende Salze aus dem DNA-Präzipitat zu entfernen,
wird das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen. Dieser Schritt ist insbesondere bei Isopropanol
Fällungen wichtig, da auch Isopropanol Reste aus dem DNA Pellet entfernt werden
(Isopropanol ist schlechter flüchtig als Ethanol und wirkt selbst in geringsten Konzentrationen
stark inhibierend auf viele Enzyme). Nach dem Waschen wird der Überstand möglichst quantitativ
entfernt, das Pellet für kurze Zeit an der Luft getrocknet und anschließend in H2Obidest
(autoklaviert) oder Puffer gelöst. In der Regel wird für das Lösen von DNA TE 10/1-Puffer
verwendet. (TE 10/1 = 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA). Das enthaltene EDTA komplexiert
zweiwertige Kationen (z.B. Mg 2+ ), die für DNasen notwendige Kofaktoren sind.
b) Isolierung genomischer DNA aus Hefezellen:
Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein einzelliger Organismus, der sich sowohl als
haploide Zelle (ein Chromosomensatz) als auch als diploide Zelle (doppelter Chromosomensatz)
vermehren kann. Im Gegensatz zu höheren eukaryotischen Zellen oder Bakterien besitzt
die Hefe zusätzlich zur Zellmembran eine dicke, zweischichtige Zellwand, die unter anderem
die osmotische Stabilität der Zelle in verschiedenen wässrigen Umgebungen sicherstellt.
Zellwand
Diese Zellwand ist aus speziellen Proteinen, langkettigen Zuckern (β1,3–Glucan und β1,6–
Glucan) und Chitin aufgebaut. Die starke Vernetzung der Zucker untereinander und mit den
anderen Komponenten der Zellwand stabilisiert die Zelle zusätzlich und erschwert den
Aufschluss von Hefen. Die Struktur dieser Zellwand kann weder durch Behandlung mit ProteinaseK
noch durch Standard - Detergenzien wie SDS aufgelöst werden.

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Um Hefezellen effizient zu lysieren, muss zunächst die kovalente Verknüpfung der Zellwandkomponenten
aufgehoben werden. Dies geschieht mit speziellen Enzymen, z.B. Zymolyase,
die die β1,3-Bindung in Glucose-Polymeren hydrolysieren (Zymolyase= β1,3-glucan laminaripentaohydrolase).
Da hochreine Zymolyase sehr teuer ist, wird für die Isolierung von genomischer
Hefe-DNA in der Regel eine nur partiell gereinigte Enzympräparation, Lyticase, verwendet,
die neben der β1,3-Glucan-Hydrolase Aktivität auch noch Verunreinigungen mit anderen
Enzymen (z.B. Proteasen, RNasen, DNasen) enthält.
Die enzymatische Reaktion erfolgt in einem reduzierenden Milieu (β-Mercaptoethanol) und in
einem Puffer (1 M Sorbitol), der die zellwandlose Hefe osmotisch stabilisiert. Auf diese Weise
können die Hefe Spheroblasten (Hefezellen ohne Zellwand) nach der enzymatischen Reaktion
gewaschen und so von DNase Verunreinigungen und Resten des Reduktionsmittels abgetrennt
werden. Anschließend werden die Spheroblasten durch Suspension in TE 50/100 (50
mM Tris, 100 mM EDTA) und Zugabe von SDS lysiert. Zur vollständigen Denaturierung vor
allem der DNA gebundenen Proteine wird bei 70 °C inkubiert. Die Abtrennung der Zelltrümmer
und denaturierten Proteine erfolgt durch Zugabe von Kaliumacetat. Kaliumionen bilden mit
Dodecylsulfat (Anion aus SDS = Natriumdodecylsulfat) ein unlösliches Salz. Da die Dodecylsulfatmoleküle
mit ihrem hydrophoben Teil an die Proteine in der Lösung binden, werden die
Proteine mit dem unlöslichen Kaliumdodecylsulfat ausgefällt und lassen sich durch einfache
Zentrifugation aus der DNA-Lösung abtrennen. Abschließend wird die genomische Hefe-DNA
mit Isopropanol gefällt und nach Waschen mit Ethanol und Trocknen an der Luft in TE 10/1
gelöst.
c) Analyse genomischer DNA – Restriktionsspaltung und Auftrennung im Agarosegel
Die Qualität der isolierten genomischen DNA kann grob durch Auftrennung im Agarosegel und
Färbung der DNA mit SYBR Safe oder einem ähnlichen Farbstoff abgeschätzt werden.
Nukleinsäuren sind innerhalb eines großen pH Bereichs negativ geladen. Ladungsträger sind
die Phosphatgruppen des Zucker-Phosphat-Rückgrats der Nukleinsäure-Kette. Nukleinsäuren
besitzen eine gleich bleibende Ladungsdichte, d.h. das Verhältnis von Molekulargewicht zur
Ladung ist konstant. Die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld ist für alle Nukleinsäuren
in freier Lösung, unabhängig von ihrem Molekulargewicht, gleich groß. Um unterschiedlich
große Nukleinsäuren auftrennen zu können, muss die Elektrophorese in einer festen
Gelmatrix erfolgen. Die Unterschiede in der Wanderungsgeschwindigkeit werden in der festen
Matrix nur durch die Molekülgrößen hervorgerufen. Zwei Theorien versuchen die Wanderung
von Nukleinsäuren im elektrischen Feld innerhalb einer Matrix zu erklären: Der Ogston - Sieb-
Effekt geht von einer globulären Form der Nukleinsäuren in Lösung aus und erklärt die Auftrennung
durch Kollisionen der hypothetischen Kugeln mit der Gelmatrix. Kleine DNA-Fragmente
nehmen nach dieser Theorie nur einen geringen Raum ein (kleine Kugeln). Sie stoßen
nur selten an die Gelmatrix und wandern fast ungebremst durch die Gelporen. Größere DNA-
Fragmente (größere Kugeln) stoßen häufig(er) mit der Gelmatrix zusammen und werden langsamer.
Die Reptationstheorie geht davon aus, dass sich die Nukleinsäure-Ketten im elektrischen
Feld ausrichten und sich durch die Poren der Matrix “durchschlängeln“. Große DNA-Fragmente
brauchen dazu deutlich mehr Zeit als kleinere.
Die gebräuchlichste Gelmatrix zur Auftrennung von Nukleinsäuren ist Agarose. Lineare, doppelsträngige
DNA-Fragmente können in einem Agarosegel relativ genau und reproduzierbar
aufgetrennt werden. Dabei gibt es über einen weiten Größenbereich eine lineare Abhängigkeit
zwischen dem Logarithmus der Fragmentlänge (in bp) und der Laufstrecke (in cm) im Agarosegel.
Außer von der Fragmentgröße hängt die Wanderungsgeschwindigkeit von DNA hauptsächlich
von der Agarose Konzentration im Gel ab. Je nach erwarteter Fragmentgröße können Agarose
Konzentrationen zwischen 0,3 und 4 % verwendet werden. Da Gele mit < 0,7 % Agarose sehr
schwierig zu bearbeiten sind (sehr weich und instabil) und DNA sich bei > 1,5 % Agarose nur
sehr langsam in der Matrix bewegt, werden im Labor üblicherweise Gele zwischen 0,8 und
1,2 % Agarose gegossen. Geringere oder höhere Konzentrationen werden nur für spezielle

15
Anwendungen genutzt.
Für die Auftrennung sehr kleiner DNA-Fragmente (10 – 250 bp) finden häufig Polyacrylamidgele
Anwendung.
Um die Größe eines unbekannten DNA-Fragments zu bestimmen, wird es gemeinsam mit einem
DNA-Standard, der Fragmente von bekannter Größe enthält, auf einem Agarosegel aufgetrennt.
Der Vergleich der Laufstrecken ermöglicht dann die Längenbestimmung. Mittlerweile
werden verschiedene DNA-Längenstandards kommerziell angeboten, die auch für eine semiquantitative
Mengenabschätzung verwendet werden können. In diesen Standards sind verschiedene
DNA-Fragmente in einer definierten Konzentration enthalten. Der Vergleich der Färbungsintensität
dieser Markerbanden mit der Proben-DNA erlaubt eine ungefähre Mengenbestimmung.
Zur DNA-Färbung im Gel wird in der Regel Ethidiumbromid verwendet:
Ethidiumbromid ist ein organischer Farbstoff, der auf Grund seiner planaren Struktur in DNA
interkalieren kann. Seine aromatischen Ringe interagieren mit den heteroaromatischen Ringen
der Basen. Ethidiumbromid kann durch UV-Licht (254 – 366 nm) zur Fluoreszenz angeregt
werden. Der Farbstoff emittiert oranges Licht (590 nm). Die Bindung an die DNA bewirkt eine
Verstärkung der Fluoreszenz. Deshalb kann Ethidiumbromid gefärbte DNA auch in Gegenwart
von freiem Ethidiumbromid im Gel gut detektiert werden. Das fluoreszierende Ethidium-Kation
wandert während der Elektrophorese entgegen der Wanderungsrichtung der DNA zur Kathode.
Seine Fähigkeit in DNA zu interkalieren macht Ethidiumbromid zu einem starken Mutagen. Der
Farbstoff wird schnell über die Haut aufgenommen und wirkt genotoxisch (kanzerogen, mutagen).
Deshalb sind beim Arbeiten mit Ethidiumbromid besondere Sicherheitsvorschriften einzuhalten.
Seit einigen Jahren sind Farbstoffe verfügbar, die in Zellkultur und im Tierversuch schwächer
mutagen sind als Ethidiumbromid. Das in unserem Praktikum verwendete SYBR Safe gehört
zu dieser Generation neuer DNA-Farbstoffe. SYBR Safe ist ein asymetrischer, DNA
interagierender Cyanin-Farbstoff, der eine DNA Detektion im ng Bereich erlaubt. Der DNA-
Fluoreszenzfarbstoff-Komplex absorbiert blaugrünes Licht bei einer Wellenlänge λmax = 502 nm
und emittiert grünes Licht bei λmax = 530 nm. Ein weiteres, wenn auch deutlich schwächeres,
Absorptionsmaximum liegt im UV-Bereich bei 280 nm. Da es sich auch hierbei um einen Stoff
handelt, der an DNA bindet, ist bei der Handhabung, vergleichbar zum Ethidiumbromid,
besondere Vorsicht geboten.
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die doppelsträngige DNA sequenzspezifisch binden
und spalten (siehe unten). Die Restriktionsstellen sind zwischen 4 und 8 Basenpaare lang und
meist palindromisch. Die Häufigkeit einer Restriktionsstelle in einem Genom hängt von ihrer
Länge ab. In einer statistisch zusammengesetzten DNA-Sequenz kommt eine 4 bp lange Erkennungsstelle
ca. alle 4 4 bp (256 bp) vor, eine 6 bp lange Erkennungssequenz kommt ca. alle
4 6 bp (4096 bp) vor. Das Restriktionsenzym HaeIII mit der Erkennungssequenz 5´-GGCC-3´
schneidet daher deutlich häufiger in genomischer DNA als das Enzym EcoRI mit der Erkennungssequenz
5´-GAATTC-3´. Die Berechnung der Anzahl der Schnittstellen pro Genom an
Hand der Länge der Erkennungssequenz ist eine rein theoretische. Das Restriktionsenzym
HaeIII spaltet natürlich nicht genau alle 256 bp und die Spaltung mit EcoRI ergibt nicht nur
Fragmente der Größe 4096 bp. Wird genomische DNA mit einem Restriktionsenzym gespalten
erhält man eine Mischung aus allen möglichen Fragmentgrößen, die bei der Auftrennung im
Agarosegel keine diskreten Banden bilden, sondern einen so genannten DNA-“Schmier“. Allerdings
gibt die Länge der Erkennungssequenz einen Hinweis, ob mehr große oder mehr kleine
Fragmente zu erwarten sind.

Plasmide:
Plasmide sind kleine, extra-chromosomale, meist zirkuläre DNA-Moleküle, die in einigen Mikroorganismen
(Bakterien, Hefen) natürlich vorkommen.
16
Sie können zwischen 2 und 200 kb groß sein und üben in ihren Wirtszellen verschiedene genetische
Funktionen aus. Für die Analyse und Manipulation von DNA sind insbesondere bakterielle
Plasmide das entscheidende Werkzeug geworden, das es ermöglicht, spezifische DNA-Fragmente
in großen Mengen zu isolieren und gezielt zu untersuchen.
Um in Bakterien stabil erhalten zu bleiben und sich dort zu vermehren, benötigen Plasmide lediglich
zwei genetische Grundelemente:
Origin
Markergen
- einen Origin of replication (origin) = Replikationsursprung, der vom bakteriellen Replikationsapparat
erkannt wird und sicherstellt, dass das Plasmid vervielfältigt wird und
- ein Gen, das dem Wirtsbakterium unter den gegebenen Lebensumständen einen Vorteil gegenüber
plasmid-losen Bakterien sichert und somit den Erhalt des Plasmids in der Zellpopulation
und seine Weitergabe an die Tochterzellen garantiert (Selektionsmarker).
Der origin eines Plasmids ermöglicht und garantiert nicht nur die autonome Replikation des Plasmids,
sondern entscheidet auch über die Kopienzahl, in der ein Plasmid in einer Bakterienzelle
vorliegen kann. Je nach origin kommt das Plasmid in weniger als 20 (low-copy Plasmide) oder in
weit über 100 Kopien (high-copy Plasmide) pro Bakterienzelle vor. Abhängig auch von der Gesamtgröße
des Plasmids können mit bestimmten origins nahezu 1000 Kopien eines Plasmids pro
Bakterium vorliegen.

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Als Selektionsmarker werden im Labor häufig Gene verwendet, die eine Antibiotikums-Resistenz
vermitteln (Ampizillin-, Kanamyzin- oder Tetracyclin-Resistenz). Sie erlauben es den Plasmid tragenden
Bakterien in Medien, die das entsprechende Antibiotikum enthalten, zu wachsen. Bakterien
ohne das Plasmid stellen das Wachstum ein oder sterben.
Eine weitere Klasse von Genen, die zur Selektion von Plasmiden eingesetzt werden können, sind
so genannte Auxotrophie-Markergene. Die Wirtszelle weist bei diesem Selektionssystem einen
Defekt in einem Stoffwechselgen auf, der durch das Plasmid komplementiert (geheilt) wird. Z.B.
gibt es Bakterienstämme, die einen Defekt in einem Gen der Tryptophan Biosynthese aufweisen.
Diese Bakterien können in Selektionsmedien, die kein Tryptophan enthalten, nicht wachsen. Wird
das im Bakteriengenom defekte Gen als intakte Variante auf einem Plasmid in das Bakterium eingebracht,
können alle Zellen, die das Plasmid enthalten in Trp - –Selektionsmedium wachsen.
Die Möglichkeit, Fremd-DNA in ein Plasmid einzubringen und diese mit dem Plasmid in Bakterien
zu vermehren, hat Plasmide zu einem wichtigen Werkzeug für die Analyse und Nutzung von DNA
gemacht.
So genannte Klonierungsvektoren sind Plasmide, die neben den essentiellen genetischen Elementen
origin und Markergen noch eine „Multiple cloning site“ = MCS enthalten. Eine MCS enthält
DNA-Sequenzen, die nur einmal im Plasmid vorkommen und von bestimmten Restriktionsenzymen
(siehe unten) erkannt werden. An dieser Stelle kann das Plasmid mit dem entsprechenden
Restriktionsenzym geöffnet = linearisiert werden. Dann kann an diese Stelle ein fremdes DNA-
Fragment eingefügt und das Plasmid wieder geschlossen = zirkularisiert werden.
Die hier beschriebene Methodik wird allgemein als DNA-Klonierung bezeichnet. Die Klonierung
(das Klonen = Herstellen von identischen Kopien) ist aber erst abgeschlossen, wenn das neu zusammengesetzte
Plasmid in ein Bakterium transformiert (eingeschleust) und dort vermehrt wurde.
Die heutigen Verwendungsmöglichkeiten von Plasmiden gehen über das „simple“ Klonieren von
spezifischen DNA-Fragmenten weit hinaus. So können Plasmide durch Einbau weiterer genetischer
Elemente (Promotoren, Terminatoren, Operons, usw.) als Expressionsvektoren verwendet
werden (siehe Praktikums-Teil Proteinanalytik). Diese Expressionsvektoren können dazu verwendet
werden, um gezielt bestimmte Gene in verschiedenen Organismen zu exprimieren.
Ein großer Vorteil der bakteriellen Plasmide ist ihre einfache Aufreinigung. Im Praktikumsversuch
soll Plasmid-DNA aus Bakterien nach zwei verschiedenen Standardprotokollen isoliert werden:
- Plasmidisolierung durch „alkalische Lyse“ und
- Plasmidisolierung nach der „Boiling Methode“.

Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli:
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Zur Vermehrung und Aufreinigung von Plasmiden werden im Labor Derivate des Escherichia coli
Stammes K12 verwendet. E. coli K12 ist ein sogenannter Sicherheitsstamm, dem die für die Pathogenität
verantwortlichen Gene fehlen. In den letzten Jahrzehnten sind für unterschiedliche Anwendungen
verschiedene Derivate dieses K12 Stammes entwickelt worden. Der hier im Praktikum
für die Plasmidisolierung verwendete Stamm Top10F´ (Invitrogen) ist effizient und einfach zu
transformieren und wächst schnell zu hohen Dichten. Zusätzlich ist der Stamm in einem wichtigen
DNA-Reparatur Protein mutiert, was zu einer erhöhten Stabilität der transformierten Fremd-DNA
führt.
Die Anzucht der Bakterien für die Plasmidisolierung erfolgt in Flüssig-Medium. In der Regel wird
LB-Medium (Luria-Bertani), das Hefeextrakt (0,5 %), BactoTrypton (1 %) und Natriumchlorid (0,5
%) enthält, verwendet. Dem Medium wird das entsprechende Antibiotikum zugesetzt (abhängig
vom verwendeten Plasmid), um das Wachstum von Bakterien ohne Plasmid zu verhindern. Angeimpft
wird das Medium mit einer “Einzelkolonie“, die aus einer einzelnen Bakterienzelle gewachsen
ist, um sicherzustellen, dass nur Bakterien mit identischem Plasmid in der Kultur wachsen. Je
nach gewünschter Ausbeute werden 5 – 500 ml Medium pro Plasmidisolierung angeimpft und 10 –
18 h unter Schütteln bei 37 °C inkubiert.
Nachdem die Bakterienkultur die gewünschte Dichte erreicht hat, wird sie abzentrifugiert und der
Überstand abgegossen.
a) Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse:
Das Bakterienpellet wird in einem Puffer (Resuspensionspuffer), der EDTA enthält, resuspendiert.
EDTA komplexiert zweiwertige Kationen (Mg 2+, Ca 2+ ), die für die Stabilität der Bakterienzellwände
wichtig sind. Dadurch wird die bakterielle Zellwand destabilisiert. Dem Puffer kann RNase zugesetzt
werden, die in die Bakterien eindiffundiert und die bakterielle RNA degradiert. Nach kurzer
Inkubationszeit wird der Suspension ein Puffer (Lysis-Puffer) zugesetzt, der SDS und NaOH enthält.
SDS löst die Proteine und Phospholipide aus der Zellwand und denaturiert die Proteine. Dies
führt zur Lyse der Bakterienzellen. Die im Vergleich zur genomischen DNA kleinen Plasmide
gehen im wässrigen Puffer gut in Lösung. Im Gegensatz dazu ist das Bakterienchromosom von
verschiedenen Proteinen gebunden und zusätzlich kovalent mit der bakteriellen Zellmembran verbunden.
NaOH im Puffer denaturiert ebenfalls die Proteine und zusätzlich die Plasmid- und
chromosomale DNA. Das Bakterienlysat wird durch Zugabe von saurem Kaliumacetat (Neutralisationspuffer),
neutralisiert. Die kleinen Plasmide können auf Grund der räumlichen Nähe der DNA-
Stränge schnell renaturieren und bleiben in Lösung. Die große chromosomale DNA renaturiert
deutlich langsamer und ist außerdem mit denaturierten Proteinen assoziiert. Die Neutralisierung
mit Kaliumacetat führt zur Bildung von unlöslichem Kaliumdodecylsulfat, das beim Ausfallen assoziierte
Proteine und die chromosomale DNA mit präzipitiert. Auf diese Weise können mit einem
Zentrifugationsschritt sowohl die genomische Bakterien-DNA als auch die meisten Proteine und
die Zelltrümmer von dem im Puffer gelösten Plasmid abgetrennt werden.
Die Qualität und Ausbeute der Plasmid-DNA hängt bei dieser Methode im Wesentlichen vom Lysis-Schritt
ab. Für eine vollständige Freisetzung der Plasmide müssen die Bakterien vollständig
lysiert werden. Dazu ist eine vollständige Durchmischung der Bakteriensuspension mit dem SDS
und NaOH haltigen Puffer erforderlich. Zu heftiges Mischen durch kräftiges Schütteln oder Vortexen
kann aber zum Scheren der genomischen DNA und damit zu ihrer Freisetzung in den Puffer
führen. Die Fragmente genomischer DNA werden bei der Fällung mit Kaliumacetat nur unvollständig
abgetrennt und führen zu einer Verunreinigung der Plasmid-Präparation mit chromosomaler
DNA. Deshalb darf die Bakteriensuspension nach Zugabe von Lysis-Puffer nur vorsichtig durch
wiederholtes „auf den Kopf drehen“ gemischt werden. Dieses vorsichtige Mischen wird solange
wiederholt, bis die Lösung deutlich klar und zähflüssig geworden ist.
Auch die Inkubationsdauer vor der Neutralisierung spielt für die Qualität der Plasmid-DNA eine
wichtige Rolle. SDS und NaOH müssen eine gewisse Zeit einwirken, um Proteine und DNA zu
denaturieren. Zu lange Inkubation kann aber zur Freisetzung der chromosomalen DNA und/oder
zur irreversiblen Denaturierung der Plasmid-DNA führen. Die Inkubationsdauer in Lysis-Puffer
sollte fünf Minuten nicht überschreiten.

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Auch nach Zugabe des Kaliumacetat-Puffers ist eine vollständige, aber vorsichtige Mischung der
Komponenten notwendig. Die unlöslichen Kaliumdodecylsulfat/Protein/DNA-Komplexe fallen als
dicke weiße Flocken aus. Die Mischung ist vollständig, wenn sich der Niederschlag abzusetzen
beginnt und die überstehende Lösung klar wird.
Das Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt, im klaren Überstand ist die Plasmid-DNA gelöst.
Für viele Anwendungen, wie z.B. Restriktionsspaltungen ist die Reinheit der Plasmid-DNA
ausreichend. Sie muss lediglich zur Konzentrierung mit Ethanol oder Isopropanol gefällt werden.
Wird hochreine Plasmid-DNA benötigt, kann der Überstand direkt zur weiteren Aufreinigung auf
spezielle Säulensysteme aufgetragen werden.
b) Isolierung von Plasmid-DNA nach der Boiling Methode:
Diese Methode nutzt ein Enzym zusammen mit einem milden Detergenz, um die bakteriellen Zellwände
aufzuschließen. Das Bakterienpellet wird in einem Puffer (STET), der 5 % Triton X-100 enthält,
resuspendiert. Dann wird eine Lysozym Lösung zugegeben. Lysozym baut die Bakterienzellwände
ab und führt zur Lyse der Zellen. Nach einer kurzen Einwirkzeit wird die Suspension in ein
kochendes Wasserbad gegeben. Die Hitze führt zu einer schnellen Denaturierung der Proteine
und zu einer teilweisen Denaturierung der DNA. Während die kleine Plasmid-DNA in Lösung geht,
wird die genomische Bakterien-DNA von den gebundenen und teilweise entfalteten Proteinen ausgefällt.
Außerdem ist die genomische Bakterien-DNA kovalent an die Zellwand gebunden und fällt
mit den Zelltrümmern aus. Auch hier kann in einem einzigen Zentrifugationsschritt genomische
DNA, Zelltrümmer und ein großer Teil der Proteine von der gelösten Plasmid-DNA abgetrennt werden.
Wichtig ist bei dieser Methode der pH-Wert des Puffers. Lysozym arbeitet erst bei einem pH-Wert
von 8,0 effizient. Bei einem geringeren pH-Wert ist das Enzym deutlich inhibiert. Auch die Inkubationszeiten
der einzelnen Schritte sind für eine effiziente Trennung von genomischer- und Plasmid-
DNA und für eine gute Ausbeute an Plasmid-DNA von großer Bedeutung:
Der enzymatische Abbau der bakteriellen Zellwände muss zu einer Lyse der Zellen führen, darf
aber die Zellwände nicht völlig zerstören, da sonst die genomische DNA mit freigesetzt würde.
Auch der Hitzeschritt (boiling = kochen) muss lang genug sein, um einen Großteil der Proteine zu
denaturieren und die Zellen endgültig zu lysieren. Dauert die Hitzebehandlung aber zu lange, kann
die genomische DNA frei gesetzt oder die Plasmid-DNA irreversibel denaturiert werden.
Nach der Abtrennung der Zelltrümmer und der genomischen DNA kann die Plasmid-DNA durch
Fällung mit Ethanol oder Isopropanol konzentriert werden.
c) Kontrolle und Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA
Während für lineare DNA-Fragmente in Agarosegel eine lineare Abhängigkeit zwischen Fragment-
Länge und Laufstrecke gilt, (siehe oben) ist das Laufverhalten von zirkulären DNA-Molekülen stark
abhängig von ihrer Form. Plasmid-DNA liegt in Bakterien nicht als einfaches zirkuläres Molekül
vor, sondern ist zusätzlich verdrillt. Es wird zu einer Art Superhelix gewunden. Diese Form des
Plasmids wird als “supercoiled“ bezeichnet. Das Molekül wird durch das zusätzliche Aufwinden
kompakter, es nimmt deutlich weniger Raum ein, als ein lineares DNA Molekül mit der gleichen
Länge in bp. Im Agarosegel zeigt diese dichte Form des Plasmids ein schnelleres Laufverhalten,
als ausgehend von seiner Größe in bp erwartet.
supercoiled Plasmid-DNA (Form 1) relaxed Plasmid-DNA (Form II)

20
Um die superhelikale Verdrillung des supercoiled Plasmids aufzuheben bzw. zu entspannen, ist es
ausreichend, an einer Stelle des DNA-Strangs einen Bruch in einem der beiden Phosphatrückgrate
der Doppelhelix einzuführen. Das Plasmid ist immer noch ein geschlossener Zirkel, die Verdrillung
wird aber über den Einzelstrangbruch aufgehoben. Das entspannte Plasmid, auch relaxed Plasmid
oder offene Form II genannt, nimmt einen größeren Raum ein, als das supercoiled Plasmid, und es
verhält sich in der Gelelektrophorese auch “sperriger“, als ein gleich großes lineares Fragment.
Einzelstrangbrüche, so genannte “nicks“, sind bei Plasmid-Präparationen nicht zu 100 % zu
vermeiden. Geringste Mengen an DNase Aktivität reichen aus, um einen signifikanten Prozentsatz
einer Plasmid-Präparation von der supercoiled in die relaxed Form zu überführen.
Einzelstrangbrüche können aber auch mechanisch eingeführt werden, z.B. durch Scherkräfte. Eine
optimale Plasmid-Präparation nach einer der oben beschriebenen Methoden enthält < 10 % der
relaxed Form des Plasmids und > 90 % der supercoiled Form.
Trennt man eine solche Plasmid-DNA auf einem Agarosegel auf und vergleicht sie mit durch Restriktionsspaltung
linearisierter Plasmid-DNA, ist das unterschiedliche Laufverhalten deutlich zu
sehen.
In der Abbildung oben ist ein solcher Vergleich gezeigt. In der mit M bezeichneten Spur ist ein linearer
DNA-Längenstandard aufgetragen. In Spur 1 ist eine unbehandelte Plasmid-DNA aufgetragen,
während in Spur 2 das gleiche Plasmid nach Spaltung mit einer Restriktionsendonuklease
(eine Erkennungsstelle) aufgetragen wurde. Die mit * gekennzeichnete Bande entspricht der supercoiled
Plasmid-DNA. Sie läuft deutlich schneller, als die in Spur 2 aufgetragene, gleich lange
lineare DNA (+). Die sehr schwache mit # gekennzeichnete Bande enthält die relaxed Plasmid-
DNA, die deutlich langsamer läuft, als die supercoiled oder lineare Form.
Die Auftrennung einer nicht mit einem Restriktionsenzym behandelten Plasmid-DNA im Agarosegel
lässt daher zwar Rückschlüsse über die Qualität der Plasmid-Präparation zu (je weniger
relaxed Form, umso besser), aber sie erlaubt keinerlei Rückschlüsse auf die Größe des isolierten
Plasmids. Für eine Größenbestimmung im Vergleich mit einem Längenstandard muss ein
zirkuläres Plasmid erst linearisiert werden.
Die Auftrennung Ihrer isolierten Plasmid-DNAs im Agarosegel dient der Abschätzung der DNA-
Qualität und zusätzlich soll im Vergleich mit dem mit aufgetragenen Längenstandard und der
Kontroll-DNA eine Konzentrationsabschätzung der Plasmid-Präparationen durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen:
Die Entdeckung von Enzymen, die DNA an sequenz-spezifischen Stellen erkennen, binden und
spalten, hat der Wissenschaft ein wichtiges Werkzeug zur Analyse und Manipulation von (genomischer)
DNA in die Hand gegeben.
Aus Zellen isolierte DNA besteht aus sehr großen Molekülen, auf denen die einzelnen Informationseinheiten
(Gene) nur äußerst schwierig gezielt untersucht, verändert oder genutzt werden
können. Um funktionelle Bereiche der genomischen DNA analysieren zu können, muss sie zunächst
gezielt zerkleinert werden. Große DNA-Moleküle können zwar mechanisch zerbrochen
werden, die Bruchstellen liegen aber zufällig über das Ursprungsmolekül verteilt und es entsteht
eine heterogene Mischung an DNA-Fragmenten, von denen jedes unterschiedliche Enden hat.
Restriktionsenzyme spalten DNA-Stränge an (durch die Sequenz) definierten Stellen unter Ausbildung
genau definierter Enden. Damit ist es möglich, aus einem großen DNA-Molekül spezifische
Fragmente herzustellen, die dann nach Größe aufgetrennt und isoliert werden können. Die Restriktionsanalyse
von DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen ermöglicht eine erste Feincha-

21
rakterisierung einer DNA und ist die Grundlage für die Isolierung und Vermehrung von DNA-Fragmenten
durch Klonierung.
Ursprünglich kommen Restriktionsenzyme in Bakterien vor. Sie schützen das Bakterium vor eindringender
Fremd-DNA (z.B. Phagen), indem sie die Fremd-DNA zerkleinern und inaktivieren. Die
eigene DNA wird durch eine Modifikation, in der Regel Methylierung einer bestimmten Base, vor
der Erkennung durch Restriktionsenzyme geschützt. Die DNA-spaltende Endonuklease- und die
DNA schützende Methylase-Aktivität sind in natürlich vorkommenden Restriktionsenzymen in einem
Protein(-Komplex) vereinigt.
Bakterielle Restriktionsenzyme haben also zwei enzymatische Aktivitäten:
- sie spalten die Phosphodiesterbindung beider Stränge eines DNA-Moleküls hydrolytisch
(Endonuklease-Aktivität)
- und sie modifizieren DNA durch Methylierung bestimmter Basen (Methylase-Aktivität)
Restriktionsenzyme lassen sich nach ihren Eigenschaften in drei verschiedene Klassen (Typ I, II
und III) einordnen.
Typ I Restriktionsenzyme sind komplexe Enzymsysteme, die zugleich Endonuklease und Methylase
sind. Sie haben eine definierte, zweiteilige Erkennungssequenz, spalten den DNA Strang aber
unspezifisch 1000 oder mehr bp von der Erkennungsstelle entfernt. Für Ihre Endonuklease-Aktivität
benötigen sie ATP. Auf Grund der unspezifischen Spaltung weit von der Erkennungssequenz
entfernt haben sie für die DNA-Klonierung keine Bedeutung.
Typ II Restriktionsenzyme sind binäre Systeme, in denen Endonuklease-Aktivität und Methylase-
Aktivität voneinander trennbar sind (befinden sich auf zwei verschiedenen Polypeptiden, die
unabhängig aktiv sind). Typ II Restriktionsendonukleasen sind sehr stabile Systeme, die ATP
unabhängig den DNA-Strang spalten. Ihre Erkennungsstelle ist meist 4 – 8 bp lang und in der
Regel palindromisch. Die Spaltung erfolgt innerhalb oder sehr nahe der Erkennungsstelle. Dadurch
entstehen DNA-Fragmente definierter Länge mit definierten Enden (siehe unten). Diese Eigenschaften
machen Typ II Restriktionsenzyme zu einem wichtigen Werkzeug bei der DNA-
Klonierung.
Typ III Restriktionsenzyme sind wie Typ I Restriktionsenzyme sowohl Endonuklease als auch
Methylase. Sie benötigen für die Spaltung ATP. Ihre Erkennungssequenzen sind 5 – 7 bp lang und
asymmetrisch. Die Spaltungsstelle liegt 5 – 20 bp von der Erkennungssequenz entfernt. Der Abstand
der Spaltung von der Erkennungssequenz ist für jedes Typ III Enzym eindeutig festgelegt.
Es entstehen DNA-Fragmente mit definierter Länge, aber unterschiedlichen Enden. Sie spielen für
die DNA-Klonierung nur eine untergeordnete Rolle.
Einteilung der Restriktionsenzyme:
Funktion
Erkennungsstelle
Spaltstelle
Typ I Typ II Typ III
Endonuklease und
Methylase
zweiteilig,
asymmetrisch
unspezifisch, mehr als
1000 bp von Erkennungsstelle
entfernt
Endonuklease unabhängig
von Methylase
4 – 8 bp, meist palindromisch
innerhalb oder nahe
Erkennungsstelle,
Spaltung erfolgt symmetrisch
ATP-Bedarf ja nein ja
Endonuklease und
Methylase
5 – 7 bp, asymmetrisch
ca. 5 – 20 bp von der
Erkennungsstelle
entfernt

22
Die im Labor üblicherweise für DNA-Klonierung verwendeten Restriktionsenzyme Typ II spalten
den DNA-Strang innerhalb der Erkennungssequenz symmetrisch. Nach der Form der gebildeten
Enden lassen sich Typ II Restriktionsenzyme in drei Untergruppen einteilen.
“Blunt end“ (glatte Enden) erzeugende Enzyme:
Diese Enzyme spalten beide DNA-Stränge an der Symmetrieachse der Erkennungssequenz.
Hae III:
DNA-Fragmente mit glatten Enden können unabhängig von ihrer Sequenz miteinander verknüpft
werden.
“Compatible, cohesive ends“ (überhängende Enden) erzeugende Enzyme:
Diese Enzyme spalten die beiden DNA-Stränge an den gleichen Orten der Symmetrieachse der
Erkennungssequenz und erzeugen überhängende, einzelsträngige Enden. Schneiden die Enzyme
am 5´-Ende der Erkennungssequenz entstehen 5´- überhängende ssDNA-Enden.
Eco RI: 5´-NNNN- GAATTC -NNNN-3´
3´-NNNN- CTTAAG -NNNN-5 ´
Überhängende Enden erzeugende Restriktionsenzyme können aber auch am 3´-Ende der Erkennungssequenz
spalten. Dann entstehen 3´-überhängende ssDNA-Enden.
Pst I: 5´-NNNN- CTGCAG -NNNN-3´
3´-NNNN- GACGTC -NNNN-5 ´
DNA-Fragmente, die mit dem gleichen Restriktionsenzym erzeugt wurden, weisen alle die gleichen
Enden auf, die zueinander kompatibel sind. Deshalb können diese DNA-Enden unabhängig von
ihrem Ursprung miteinander verknüpft werden.
Restriktionskartierung der Plasmid-DNA
5´-NNNN- GGCC -NNNN-3´
3´-NNNN- CCGG -NNNN-5 ´
5´-NNNN- GG pCC -NNNN-3´
3´-NNNN- CCp GG -NNNN-5´
5´-NNNN- G pAATTC -NNNN-3´
3´-NNNN- CTTAAp G -NNNN-5´
5´-NNNN- CTGCA pG -NNNN-3´
3´-NNNN- Gp ACGTC -NNNN-5´
Die Verteilung der Restriktionsschnittstellen ist für jedes DNA-Fragment charakteristisch. Restriktionsanalysen
bzw. Restriktionskartierungen können zur Charakterisierung und Identifizierung von
DNA-Fragmenten verwendet werden. Dazu wird die zu untersuchende DNA mit verschiedenen
Restriktionsenzymen und Kombinationen dieser Enzyme gespalten und die entstehenden DNA-
Fragmente auf einem Agarosegel der Größe nach aufgetrennt. Für jede DNA wird ein spezifisches
Gemisch an verschiedenen Fragmentgrößen erzeugt, die zur Erstellung einer Restriktionskarte
und zur Identifizierung der DNA verwendet werden können.
Im Praktikum soll die Restriktionskarte eines (Ihnen) unbekannten Plasmids für verschiedene Restriktionsenzyme
erstellt werden. Dazu wird die von Ihnen im Versuch Plasmidisolierung gereinigte
DNA mit drei verschiedenen Restriktionsenzymen und Kombinationen aus jeweils zwei dieser Enzyme
gespalten. Je nach Anzahl der vorhandenen Erkennungsstellen wird das zirkuläre Plasmid
vom Restriktionsenzym linearisiert (eine Erkennungsstelle) oder in zwei oder mehr Fragmente
(zwei oder mehr Erkennungsstellen) gespalten. Die Kombination verschiedener Restriktionsenzyme
wird je nach Anzahl und Lage der Schnittstellen zueinander verschiedene Fragmente er-

zeugen. Aus der Fragmentzahl und –größe in den verschiedenen Spaltungen kann die Lage der
Schnittstellen zueinander bestimmt und eine Restriktionskarte erstellt werden.
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Ein sehr einfaches Beispiel ist in der Grafik unten zu sehen:
ungespaltenes
Plasmid
Eco RI
Pst I
4650 bp
Pst I
Die Spaltung des zirkulären Plasmids mit EcoRI ergibt ein lineares 4560 bp langes Fragment.
Nach PstI Spaltung erhält man zwei Fragmente von 2400 bp und 2160 bp. Spaltet man gleichzeitig
mit EcoRI und PstI werden drei Fragmente von 2160, 1900 und 500 bp gebildet. Aus diesen
Spaltmustern lassen sich die Schnittstellen eindeutig zueinander lokalisieren:
- EcoRI Spaltung → 1 Fragment ⇒ 1 Schnittstelle
- PstI Spaltung → 2 Fragmente ⇒ 2 Schnittstellen
Fragmentgröße 2400 bp und 2160 bp ⇒ Abstand der PstI
Schnittstellen
- EcoRI/PstI Spaltung→ das 2400 bp PstI Fragment verschwindet, aber es werden ein 1900
und ein 500 bp Fragment gebildet (1900 + 500 = 2400). Das 2160 bp
PstI-Fragment bleibt erhalten. Also muss sich die EcoRI Schnittstelle
innerhalb des 2400 bp PstI Fragments befinden und zwar 500 bp von
einer der PstI Erkennungsstellen entfernt.
PstI
4650 bp
EcoRI PstI
Eco RI Spaltung
1 Fragmen t
4560 bp
PstI
PstI
4650 bp
EcoRI
Mögliche Lokalisierung der Schnittstellen
Die Verwendung weiterer Restriktionsenzyme würde eine eindeutige Lokalisierung erlauben.
PstI
Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA:
Pst I Spaltung
2 Fragmente
2400 bp
2160 bp
Unter Transformation versteht man in der Molekularbiologie/Biochemie das Einbringen von
(Fremd-) DNA in eine Zelle. Unbehandelt nehmen die meisten Bakterienstämme DNA aus dem
Medium gar nicht oder nur sehr schlecht auf. Um Plasmid-DNA effizient in Bakterien einbringen zu
können, muss ihre Zellmembran permeabel gemacht werden. Die Bakterien sind dann “kompetent“
für die Aufnahme von DNA.
Im Wesentlichen werden heute zwei Methoden verwendet, um Bakterien zu transformieren:
- Elektroporation und
- Transformation chemisch kompetenter Zellen durch Hitze-Schock
Bei der Elektroporation von Zellen wird durch die Pulse eines sich entladenden Kondensators für
kurze Zeit ein elektrisches Feld erzeugt, durch das sich in der Zellmembran Löcher bilden, die sich
schnell wieder schließen. DNA aus dem Medium kann durch diese Löcher in verschiedene Zellen
(Pflanzen-, Säugetier- und Bakterienzellen) eingebracht werden.
PstI
4650 bp
EcoRI
EcoRI
Pst I/ Eco RI Spaltung
3 Fragmente
2160 bp
1900 bp
500 bp
PstI
4650 bp
PstI

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Im Praktikum werden wir chemisch kompetente Bakterienzellen durch Hitze-Schock transformieren.
Um Bakterien chemisch kompetent für die DNA-Aufnahme zu machen, werden sie in der logarithmischen
Wachstumsphase geerntet, schnell auf 0 °C abgekühlt und auf Eis in einem CaCl2 haltigem
Puffer inkubiert. Der Mechanismus nach dem Bakterien durch Behandlung mit Ca2+ Ionen
kompetent werden, ist bis heute nicht vollständig verstanden. Es gibt zwei Theorien über die Wirkung
der Ca2+ Ionen. Zum einen wird vermutet, dass die Behandlung mit CaCl2 zu einer Destabilisierung
der Zellmembran führt, eventuell sogar die Bildung von kleinen Poren oder Löchern in der
Zellmembran verursacht. Eine andere Erklärung wäre, dass die positiv geladenen Ca 2+ Ionen die
negative Ladung des DNA-Rückgrats (Phosphat-Anteil) und die negative Ladung der Lipide in der
Zellmembran neutralisiert und dadurch eine Interaktion von Plasmid-DNA und Zellmembran überhaupt
erst möglich wird.
CaCl2 kompetente Bakterien können für längere Zeit gelagert werden, ohne ihre Kompetenz für die
Plasmidaufnahme zu verlieren. Dafür müssen sie direkt nach der Behandlung mit Ca 2+ Ionen auf
Eis aliquotiert (in kleine Arbeitsportionen aufgeteilt) und auf -80 °C eingefroren und gelagert werden.
Für die Transformation werden die kompetenten Bakterien aufgetaut (auf Eis), mit der DNA-Probe
gemischt (vorsichtig, da die Zellen sehr fragil sind) und für 20 – 40 min auf Eis inkubiert. Während
dieser Inkubationsphase bindet die DNA an die Zellmembran. Die niedrige Temperatur verringert
die Bewegungen innerhalb der semi-flüssigen Membran und verstärkt die Interaktion mit der DNA.
Der folgende Hitze-Schock erfolgt durch kurze (1 – 2 min) Inkubation in einem 42 °C Wasserbad.
Warum dieser Hitzeschock die Aufnahme der Plasmid-DNA ermöglicht oder verstärkt ist ebenfalls
nicht wirklich bekannt. Möglicherweise führt die plötzliche Erhöhung der Temperatur zu einer Vergrößerung
der Löcher in der Zellmembran, so dass die DNA in die Zelle eindringen kann. Es wird
aber auch diskutiert, dass die Temperaturerhöhung zu einer verstärkten Bewegung der Membranbausteine
führt und die DNA dadurch von der Membran aufgenommen und ins Zellinnere geschleust
wird. Die abschließende Inkubation auf Eis soll zu einem Schließen der Löcher bzw. zu
einer Stabilisierung der Membran führen und schließt den Transformationsprozess ab.
Die optimalen Inkubationszeiten auf Eis, die Dauer des Hitzeschocks und die abschließende Inkubation
auf Eis müssen für jeden Bakterienstamm optimiert werden, wenn hohe Transformationseffizienzen
gebraucht werden.
Chemisch kompetente Bakterienzellen sind sehr fragil. Der Transformationsprozess führt zu einer
zusätzlichen Belastung der Zellen. Deshalb ist es notwendig die Zellen während der Transformation
sehr vorsichtig zu behandeln (NICHT vortexen, NICHT kräftig schütteln, nur sehr vorsichtig pipettieren)
und nach der Transformation für einige Zeit in einem Medium zu inkubieren das es ihnen
erlaubt ihre Zellmembranen wieder zu stabilisieren bzw. zu reparieren. Bei einigen Antibiotika-Resistenzmarkern
ist es außerdem notwendig, erst die Expression des Resistenzgens zu erlauben,
bevor die Behandlung mit dem Antibiotikum beginnt, da seine Wirkung irreversibel ist.
Polymerase Chain Reaction – PCR:
Die Entwicklung der Polymerase Kettenreaktion und der Einsatz einer temperaturstabilen DNA-
Polymerase bei dieser Methode haben die Arbeiten mit DNA innerhalb weniger Jahre revolutioniert.
Die Möglichkeit selbst geringste Mengen DNA (theoretisch ein einzelnes Molekül) mit technisch
geringem Aufwand und innerhalb kurzer Zeit spezifisch so zu amplifizieren, dass sie für Nachweis-
und Analysemethoden einsetzbar ist, hat das Anwendungs-Spektrum von DNA basierten Methoden
in der Analytik, Medizin und Forschung unüberschaubar gemacht.
Das Prinzip der PCR kopiert auf simple Weise in vitro die Art und Weise in der in vivo DNA repliziert,
d.h. vermehrt wird.
Für die Verdopplung der genomischen DNA benötigt eine Zelle eigentlich nur ein einzelsträngiges
DNA-Template, einen Primer, der an dieses Template hybridisiert, eine DNA-Polymerase, die von
diesem Primer ausgehend den neuen Strang synthetisiert und dNTPs für den Aufbau der neuen
DNA. Diese Komponenten werden bei einer PCR-Reaktion zusammenpipettiert und dann Be-

25
dingungen geschaffen, die es der Polymerase ermöglichen, die Polymerisationsreaktion immer
wieder durchzuführen.
Als Template kann DNA aus einer beliebigen Quelle verwendet werden. Die Primer müssen komplementär
zu den Enden des gewünschten DNA Fragments sein und ein freies 3´-OH haben, an
das die Polymerase Nukleotide anhängen kann. Primer 1 muss an das 3´-Ende des sense-Stranges
und Primer 2 an das 3´-Ende des antisense-Stranges binden. Unter den richtigen Pufferbedingungen
und bei Anwesenheit von Nukleotiden kann die Polymerase von den Primern ausgehend
einen neuen DNA-Strang synthetisieren.
Da die Template DNA in der Regel doppelsträngig vorliegt, beginnt die Reaktion mit einem Denaturierungsschritt.
Dazu wird die Template-DNA für einige Minuten auf 94 – 98 °C erhitzt. Um den
Primern, 17 – 30 bp lange einzelsträngige Oligonukleotide, die Möglichkeit des Hybridisierens mit
dem Template zu geben, muss der Ansatz anschließend entsprechend der Primer Zusammensetzung
auf 50 – 72 °C abgekühlt werden. Da die Primer in wesentlich höherer Konzentration vorliegen
als die Template-DNA, erfolgt das „Annealen“ des Primers mit dem Template schneller als
die Renaturierung der einzelsträngigen DNA-Stränge. Nun kann eine DNA-Polymerase an den
kurzen Doppelstrangbereich aus Template und Primer binden und die im Reaktionsansatz vorhandenen
dNTPs zur Elongation des Primers verwenden. Der Einsatz einer temperaturstabilen DNA-
Polymerase aus Thermus aquaticus, Taq-Polymerase, erlaubt es, den gesamten Reaktionsansatz
zusammen zu pipettieren und dann nur durch Veränderung der Temperatur die einzelnen Reaktionsschritte
ablaufen zu lassen.
Auf Grund ihrer Herkunft aus einem thermophilen Organismus liegt die optimale Polymerisationstemperatur
der Taq bei 72 °C. Das Enzym ist so temperaturstabil, dass es mehrmals in dem oben
beschriebenen Temperaturzyklus aufgeheizt und wieder abgekühlt werden kann, ohne an enzymatischer
Aktivität zu verlieren. Gerade diese Stabilität erlaubt es, die DNA-Synthese oftmals hin-

26
tereinander in einem Reaktionsansatz ablaufen zu lassen und so eine exponentielle Amplifikation
des DNA-Fragments zu erreichen.
Zyklus 2 der obigen PCR-Reaktion veranschaulicht die rasche Vermehrung der Ziel-DNA.
Nach dem Denaturieren liegen im 3. Zyklus vier Kopien beider Template Stränge vor und am Ende
des 3. Zyklus haben sie 2 Kopien des doppelsträngigen Ziel-Fragments im Ansatz. Nach 4 Zyklen
sind es 4 Moleküle, nach 5 Zyklen 8 und nach 30 Zyklen haben sie 268.435.456 Moleküle ihres
Fragments.

28
Im Praktikum werden wir die von Ihnen isolierte genomische Hefe-DNA als Template verwenden
und ein spezifisches Gen aus der Hefe amplifizieren. Abhängig von den ausgegebenen Primern
wird ein 500 – 800 bp langes Fragment aus der codierenden Sequenz dieses Gens amplifiziert.
Die eingesetzte Taq-Polymerase haben entweder Sie selbst oder Ihr Parallel-Kurs während der
Protein-Analytik Woche aus E. coli aufgereinigt.
Optimierung von PCR-Bedingungen
Die Spezifität und Effizienz einer PCR-Reaktion wird von vielen Parametern beeinflusst. Die eingesetzte
Kopienzahl der Template-DNA spielt ebenso eine Rolle, wie die Länge und Basenzusammensetzung
der Primer, die Konzentration der dNTPs, die Pufferzusammensetzung und die Zyklenzahl.
Ausgehend von bestimmten Basisbedingungen muss eine PCR-Reaktion deshalb für verschiedene
Anwendungen optimiert werden.
In der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden hauptsächlich zwei Parameter optimiert:
A) Hybridisierungs-Temperatur der Primer
Entsprechend des G/C und A/T – Gehalts der Primersequenzen kann ein ungefährer
Schmelzpunkt (d.h. die Temperatur, bei der 50% der Primer mit der Zielsequenz einen
Doppelstrang ausbilden) berechnet werden. Dies ist ein guter Anhaltspunkt, in der Praxis muss
jedoch oft die optimale Temperatur experimentell bestimmt werden. Je niedriger die
Hybridisierungs-Temperatur gewählt wird, umso größer ist i.d.R. die Ausbeute. Allerdings nehmen
auch die unspezifischen Amplifikationen zu, so dass in der Praxis der beste Kompromiss zwischen
Ausbeute und Spezifität gesucht wird.
B) Konzentration von Mg 2+ -Ionen im PCR-Reaktionsmix
Magnesium-Ionen sind besonders effizient, um die negativen Ladungen der Phosphate durch
Komplexierung voneinander abzuschirmen. Eine hohe Magnesium-Konzentration fördert daher die
Ausbildung von doppelsträngiger DNA zwischen dem Primer und der Zielsequenz, und erhöht so
die Ausbeute. Wie schon bei der Hybridisierungs-Temperatur steigen aber auch die nichtspezifischen
Amplifikationen bei einer höheren Mg 2+ -Konzentration, so dass ebenfalls ein
Kompromiss aus Ausbeute und Spezifität gefunden werden muss. In der Praxis werden meist
Mg 2+ -Konzentrationen zwischen 1 mM und 4 mM gewählt.
Des Weiteren ist Mg 2+ auch ein essentieller Ko-Faktor im aktiven Zentrum aller DNA-Polymerasen.
Experiment:
Der im Praktikum verwendete Thermocycler kann einen Temperaturgradienten entlang des
Heizblocks während der Reaktion einstellen. Dadurch können unterschiedliche
Hybridisierungstemperaturen im gleichen Lauf getestet werden. Zusätzlich werden wir zwei
verschiedene Mg 2+ -Konzentrationen austesten (1 mM und 3 mM).

Biochemisches Praktikum 1 – Grundpraktikum
Proteine:
29
Protein-Analytik
Wenn DNA der Speicher ist, in dem alle Informationen über den Aufbau und die Funktion einer
Zelle enthalten sind, dann sind Proteine die Maschinen, die diese Informationen lesen und umsetzen.
Proteine sind an nahezu allen zellulären Vorgängen beteiligt und üben dabei die verschiedensten
Funktionen aus. Sie können als Katalysatoren bei Synthesen wirken, sie sind Transportvehikel
zwischen Zellkompartimenten oder Zellen, sie dienen als Speicher für andere Moleküle
oder leiten Signale weiter.
Trotz dieser funktionellen Vielfalt ist der chemische Grundaufbau aller Proteine gleich. Sie sind lineare
Polymere, die aus 20 verschiedenen Grundbausteinen, den Aminosäuren, aufgebaut werden.
Die grundlegende Struktur der verschiedenen Aminosäuren ist identisch:
An ein zentrales Kohlenstoffatom (α-C) sind eine Aminogruppe (-NH2), eine Carboxylgruppe
(-COOH), ein Wasserstoffatom (-H) und ein für die Aminosäure charakteristischer „Rest“ (-R) gebunden.
Von diesem Aufbau um ein zentrales α-C-Atom leitet sich auch der Begriff α-Aminosäure
ab. Die beiden reaktiven Gruppen an den α-C-Atomen zweier Aminosäuren können miteinander
reagieren und in einer Kondensationsreaktion unter Abspaltung eines Moleküls Wasser miteinander
verknüpft werden. Obwohl die Ausbildung dieser Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren eine
endogene Reaktion ist, die Energie verbraucht, sind Peptidbindungen kinetisch stabil. Die
Verknüpfung vieler Aminosäuren führt zur Ausbildung einer unverzweigten Polypeptidkette. Die
einzelnen Aminosäuren innerhalb einer solchen Polypeptidkette werden als Reste bezeichnet. Die
beiden Enden des Polypeptidrückrats unterscheiden sich, das eine trägt eine freie Aminogruppe, das
andere eine freie Carboxylgruppe. Per Definition wird das Aminoende als der Beginn der Kette
betrachtet und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids wird mit dem aminoendständigen Rest als
Anfang geschrieben.
Der räumliche Aufbau und damit die Funktion eines Proteins ergeben sich aus seiner Aminosäuresequenz,
d.h. aus der Reihenfolge in der die einzelnen Aminosäuren in einer Polypeptidkette aufeinanderfolgen.
Es können viele verschiedene funktionelle Gruppen (Alkohole, Thiole, Thioether,
n

30
Carbonsäuren, Carboxamide, verschiedene alkalische Gruppen) aneinander gereiht oder räumlich in
unterschiedliche Kontexte gebracht werden. Die daraus resultierende Reaktivität der verschiedenen
Gruppen ist von entscheidender Bedeutung für die Funktion der aktiven Zentren der Enzyme, die
spezifische chemische Reaktionen katalysieren.
Die Vielfalt der Proteinfunktionen wird durch ihre Fähigkeit spezifisch miteinander oder mit
anderen Makromolekülen zu interagieren noch erhöht. Es können sich große Komplexe aus vielen
Polypeptidketten bilden, die nur gemeinsam komplizierte Vorgänge, wie z.B. Replikation oder
Transkription ausführen können. Die Kontrolle der Proteinfunktionen wird unter anderem durch die
Modifikation verschiedener Aminosäurereste in einem Protein erreicht (Phosphorylierung, Acetylierung,
Methylierung). Diese Modifikationen können die Reaktivität, den räumlichen Aufbau oder
die Interaktion mit anderen Makromolekülen beeinflussen.
Jedes Protein hat eine eigene, exakt definierte Reihenfolge, in der die Aminosäuren aneinander
geknüpft sind. Diese spezifische Aminosäuresequenz eines Proteins wird als seine Primärstruktur
bezeichnet und legt letztendlich die räumliche Struktur des Proteins fest. Teilbereiche innerhalb
einer Polypeptidkette bilden, vorgegeben durch die Primärsequenz, klar strukturierte Elemente – α-
Helix und β-Faltblatt – aus, die über Wasserstoffbrücken innerhalb der Kette oder zwischen zwei
Ketten (-abschnitten) stabilisiert werden.
Die α-Helices und β-Faltblatt Strukturen werden von Aminosäureresten gebildet, die in der linearen
Sequenz, der Primärstruktur, nahe beieinander liegen. Sie sind über loop Bereiche (Schleifen) oder
β-turns (Haarnadelkurven) miteinander verbunden und bilden die Sekundärstruktur eines
Proteins. Die Interaktion der α-helikalen und β-Faltblatt Bereiche einer Polypeptidkette miteinander
(vermittelt und stabilisiert über Wasserstoffbrücken, ionische Wechselwirkungen, Schwefelbrücken)
resultiert in der Ausbildung der endgültigen dreidimensionalen Struktur des Polypeptids,
die als seine Tertiärstruktur bezeichnet wird.

31
Viele Proteine sind nicht aus einer einzelnen Polypeptidkette aufgebaut. Oft müssen zwei oder
mehrere identische oder unterschiedliche Polypeptide miteinander wechselwirken, um ein
funktionelles Protein zu bilden. Die Anordnung dieser Untereinheiten zueinander und ihre
Wechselwirkungen innerhalb eines Proteins heißt Quartärstruktur.
Proteine findet man in der Natur nie in reiner Form. Sie befinden sich in Zellen zusammen mit tausenden
unterschiedlichen Proteinen und sind gemischt mit verschiedensten biologischen
Makromolekülen und weiteren organischen und anorganischen Stoffen. Um die Funktion oder
Struktur eines bestimmten Proteins untersuchen zu können, benötigt man es in reiner, aber aktiver
Form und in relativ großen Mengen.
Ein wichtiger Punkt bei der Reinigung eines Proteins ist das Ausgangsmaterial, aus dem es gewonnen
werden kann und die Menge, in der es darin vorkommt. Manche Proteine liegen nur in
wenigen Kopien pro Zelle vor, andere findet man nur in bestimmten Geweben oder nur zu bestimmten
Zellzyklusstadien einer Zelle. Auch die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials hat einen
großen Einfluss auf die Entwicklung einer Reinigungsstrategie. Muss das Protein aus seltenen Organismen,
schwer kultivierbaren oder teuren Zellen isoliert werden, ist das Etablieren einer Reinigung
deutlich schwieriger, als mit leicht und billig verfügbaren Quellen.
Die Methoden der DNA Manipulation und die Informationen über die kodierende DNA-Sequenzen
haben in den letzten Jahrzehnten die Möglichkeit geschaffen Proteine in “großen Mengen” durch
heterologe Expression aus leicht und billig verfügbaren Quellen (z.B. Bakterien, Hefen) zu gewinnen.
Dazu werden bestimmte Plasmide, sogenannte Expressionsvektoren, verwendet.
Aber auch wenn das gewünschte Protein in großen Mengen in einem billigen Ausgangsmaterial zur
Verfügung steht, muss es immer noch von einer Vielzahl anderer organischer und anorganischer
Moleküle abgetrennt und ankonzentriert werden.
Die Praktikumswoche Protein-Analytik wird Sie in die Grundlagen der heterologen Expression von
Proteinen einführen und Sie mit einigen grundlegenden Methoden der Aufreinigung und des
Nachweises von Proteinen bekannt machen.
Es werden Experimente zu folgenden Methoden durchgeführt:
o induzierte Expression in Bakterien
o Aufschluss von Bakterien zur Proteingewinnung
o partielle Reinigung von Proteinen durch Hitzedenaturierung
o fraktionierte Fällung von Proteinen mit Ammoniumsulfat
o Dialyse von Proteinlösungen
o Affinitätsreinigung eines His-getaggten Proteins durch Bindung an Ni 2+ -NTA
o Partielle Reinigung eines Proteins durch An- und Kationenaustauschchromatographie
o Auftrennung von Proteingemischen durch SDS-Gelelektrophorese und Nachweis der Proteine
durch Färbung
o Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen

Heterologe Expression:
32
Die Sequenzabfolge der Aminosäuren in einem Polypeptid ist durch die kodierende Sequenz seines
Genes festgelegt. Da DNA deutlich leichter zu manipulieren und zu sequenzieren ist als Polypeptidketten,
war eine der großen Aufgaben der vergangenen Jahrzehnte die Zuordnung bestimmter
DNA-Sequenzabschnitte eines Genoms zu den daraus resultierenden Proteinen. Mit der Information
über die kodierende DNA-Sequenz eines bestimmten Proteins war gleichzeitig auch die
Aminosäureabfolge im Polypeptid bekannt. Heute ist die Zuordnung von Genen zu bestimmten
Proteinen auf Grund der vielen abgeschlossenen Genom-Sequenzierungsprojekte deutlich einfacher
und schneller. Ist die kodierende Sequenz eines Proteins bekannt, kann man sie klonieren und mit
Hilfe von Plasmiden in verschiedene Zellen einbringen.
Das detaillierte Wissen über wichtige, basale zelluläre Prozesse erlaubt es uns heute Gene nicht nur
auf DNA Level zu untersuchen, sondern sie auch gezielt in verschiedenen Organismen zu exprimieren.
Unter Expression eines Genes (= Genexpression) versteht man die Summe der Prozesse,
die in einer Zelle von der DNA-Sequenzinformation zum fertigen, funktionellen Protein führen. Im
Wesentlichen sind dazu zwei basale zelluläre Prozesse notwendig:
- die Transkription der DNA-Sequenz in mRNA
- und die Translation der mRNA in eine Polypeptidkette.
Beide Prozesse sind vor allem in Prokaryonten und niedrigen Eukaryonten sehr genau untersucht.
Um eine kodierende DNA-Sequenz in mRNA zu transkribieren, müssen vor dem Startkodon und
nach dem Stoppkodon bestimmte DNA Sequenzen vorhanden sein:
- Der Promotor befindet sich vor dem Startkodon und ist der DNA-Abschnitt, den die RNA-
Polymerase erkennt und bindet. Von ihm aus beginnt die Transkription der RNA.
Promotoren sind Organismus-spezifisch. Der natürliche Promotor eines Hefegens wird in
der Regel nicht vom Transkriptionsapparat eines Bakteriums oder einer humanen Zelle
erkannt (und umgekehrt). Je nach Funktion des Gens sind Promotoren unterschiedlich stark
(führen zur Bildung von mehr oder weniger RNA) und unterschiedlich reguliert (führen
immer = konstitutiv – zur Bildung von RNA oder sind nur unter bestimmten Bedingungen
aktiv = induzierbar).
- Der Terminator ist nach dem Stoppkodon lokalisiert und garantiert den Stopp der
Transkription am Ende des Gens.
- Abhängig vom Organismus und der Genfunktion können noch verschiedene Regulationselemente,
die die Induktion oder Repression des Promotors erlauben, vorhanden sein.
Für eine effiziente Translation sind auf der DNA bzw. der transkribierten RNA nur wenige spezifische
Elemente notwendig:
- In Bakterien stellt eine purinreiche Sequenz kurz vor dem ATG-Startkodon die Erkennung
der Translations-Startstelle durch die Ribosomen sicher. Diese Sequenz wird als Shine-
Dalgarno-Sequenz bezeichnet.
- In Eukaryonten wird in der Regel das erste ATG am 5´-Ende der mRNA als Translationsstart
verwendet.
- Neben der Menge an gebildeter mRNA spielen noch andere Faktoren eine Rolle für die
Menge an exprimierten Protein. So ist z.B. die Stabilität der mRNA ein nicht unwichtiger
Regulationsfaktor für die Expressionskontrolle.
Die gezielte Expression eines Proteins erlaubt nicht nur die Analyse seiner Wirkung in einem bestimmten
zellulären Kontext, sie kann auch dazu benutzt werden, um große Mengen eines Proteins
herzustellen. Dazu muss die Transkription des Genes durch starke Promotoren erfolgen, die in

kurzer Zeit zur Bildung großer Mengen an mRNA führen. Diese wird dann vom Translationsapparat
der Zelle in Protein “übersetzt”.
33
Für die Expressionsstärke eines Gens ist primär nur der Promotor verantwortlich, die transkribierte
Sequenz spielt keine Rolle. Deshalb ist es möglich schwach exprimierte Gene unter die Kontrolle
starker Promotoren zu stellen und sie zu überexprimieren oder z.B. humane Gene unter die Kontrolle
eines bakteriellen Promoters zu klonieren und sie von Bakterien synthetisieren zu lassen.
Diese heterologe Expression (Synthese eines wirtsfremden Proteins) wird häufig für die Gewinnung
großer Mengen an Proteinen genutzt, die in der Herkunftsquelle nur in geringer Menge vorhanden
sind, oder deren Ausgangsmaterial teuer oder schwierig zu bekommen ist.
Es gibt verschiedene Expressionssysteme für die heterologe Expression (Bakterien, Hefe, Insektenzellen
usw.), die am häufigsten verwendeten sind aber bakterielle Expressionssysteme.
Bakterien sind für die Expression von Fremdproteinen ein beliebter Wirtsorganismus. Sie sind
- einfach und billig zu kultivieren
- Fremd-DNA lässt sich leicht und effizient einbringen
- es existieren verschiedene, hoch effiziente bakterielle Expressionssysteme
- die Zellen sind leicht aufzuschließen
Wie oben beschrieben werden für die Expression neben der kodierenden DNA-Sequenz verschiedene
DNA-Elemente benötigt. Diese Expressionselemente werden in Plasmide kloniert und die
kodierende Gen-Sequenz wird zwischen sie eingefügt. Neben dem Replikationsstart (origin),
Selektionsmarker und MCS (Mutiple Cloning Site) müssen Expressionsvektoren also noch einen
Promotor und eine Terminatorsequenz enthalten. Der Promotor liegt sinnvollerweise direkt 5´ vor
der MCS, der Terminator 3´ danach.
Wie der obige Expressionsvektor zeigt, kann die heterologe Expression in Bakterien mit äußerst
simplen Vektoren durchgeführt werden. Es können damit Proteinausbeuten im % Anteil an der Gesamtzellmasse
erreicht werden.
Die heterologe Expression ist aber nicht immer so einfach durchzuführen. Probleme, die auftauchen
können, sind z.B.:
- Toxizität des Fremd-Proteins für die Bakterien
- Instabilität des Fremdproteins (Abbau durch bakterielle Proteasen)
- Bildung von “Inclusion bodies”, bei zu stark exprimierten Proteinen
(Inclusion bodies = Einschlusskörperchen: bestehen hauptsächlich aus falsch gefalteten,
aggregierten Proteinen; entstehen, wenn das überexprimierte Protein nicht oder nur unvollständig
gefaltet werden kann)
In vielen Fällen können diese Schwierigkeiten durch die Verwendung induzierbarer Expressionssysteme
vermieden werden. Ein induzierbares Expressionssystem erlaubt es, die Expression zu
einem exakt definierten Zeitpunkt zu starten. Die Expression des Fremdproteins erfolgt dann z.B.
nicht während der Wachstumsphase der Bakterien, sondern wird erst angeschaltet, wenn genügend

34
Zellen vorhanden sind, um selbst bei kurzer Expressionsdauer genügend Protein zu erhalten. Bei
toxischen Proteinen sterben die Zellen zwar bald nach der Induktion, bzw. stellen die Teilung ein,
da aber eine große Anzahl an Zellen das Protein synthetisiert, kann man trotzdem relevante
Ausbeuten erreichen. Analog kann durch eine kurzzeitige Expression der Abbau eines Proteins
zumindest zum Teil vermieden werden.
In der Biochemie werden heute hauptsächlich zwei induzierbare bakterielle Expressionssysteme
verwendet, das Lac-Operon System und das T7 Expressionssystem.
Das Lac-Operon:
Die auf dem Lac-Operon basierenden Expressionsplasmide nutzen ein bakterielles Regulationssystem
der Genexpression.
Bakterien nutzen bevorzugt Glucose als Kohlenstoffquelle. Sie sind aber auch in der Lage andere
Zucker, z.B. Laktose (Milchzucker) zu verwerten. Ohne Laktose, bei Anwesenheit von Glucose im
Medium, sind die Enzyme, die für die Aufnahme und Umsetzung von Laktose gebraucht werden,
nicht oder kaum exprimiert. Das Schlüsselenzym der Laktose Verwertung, β-Galactosidase (spaltet
Laktose in Galactose und Glucose), ist kaum nachweisbar. Entzieht man den Bakterien die Glucose
und gibt Laktose als einzige Zuckerquelle zu, steigt die Menge der β-Galactosidase Moleküle in
wenigen Minuten von ~60 auf bis zu 60.000 Moleküle pro Zelle. Die Zugabe von Laktose führt also
zu einer extremen Induktion der Genexpression.
Diese Induktion kann theoretisch auf zwei verschiedenen Wegen erreicht werden:
- Der Promotor ist ohne Laktose blockiert. Diese Repression des Promotors wird bei Laktose-
Zugabe aufgehoben.
- Der Promotor ist ohne Laktose schwach aktiv. In Anwesenheit von Laktose wird die Rekrutierung
der bakteriellen RNA-Polymerase und damit die Expression verstärkt.
Beide Formen der Genregulation sind in der Natur bekannt.
Im Fall des Lac-Operons ist der Promotor in Abwesendheit von Laktose aktiv reprimiert:
(Achtung: Die hier beschriebene Regulation des Lac-Operon ist eine Vereinfachung. In Wirklichkeit
ist die Regulation deutlich komplexer und zum Teil noch nicht endgültig geklärt.)
5’
Die obige Abbildung zeigt den Aufbau des Lac-Operons. Der Lac-Promotor kontrolliert die
Transkription der drei wichtigen Laktose-Stoffwechselgene LacY (Permease - aktive Aufnahme der
Laktose durch die Zellmembran), LacZ (β-Galactosidase - spaltet Laktose in Galactose und Glucose)
und LacA (Transacetylase – acetyliert Laktose). Sie werden als polycistronische mRNA
transkribiert (eine mRNA kodiert für mehrere Polypeptidketten). Direkt nach dem 3´-Ende der
3’

35
kodierenden Sequenz für das LacA Gen befindet sich der Terminator, der für den Stopp der
Transkription sorgt.
3´ vom Promotorbereich und 5´ der kodierenden Sequenz liegt ein DNA-Abschnitt, der Operator
genannt wird. An diese Operator-Sequenz kann das LacI Protein binden. Auf diese Weise blockiert
es die am Promotor gebundene RNA-Polymerase, die Gene des Laktose-Stoffwechsels werden
nicht transkribiert. Der Lac-Promotor ist mit gebundenem LacI Protein reprimiert, LacI ist das Repressor-Protein
des Lac-Operons.
Das LacI-Gen ist nicht Bestandteil des Lac-Operons, es liegt auf einem weit entfernten Bereich des
bakteriellen Chromosoms.
Gibt man Laktose ins Medium, gelangen einige Moleküle ins Bakterieninnere und binden an das
LacI Protein. Diese Bindung führt zu einer Konformationsänderung, das LacI Protein kann nicht
mehr an die Operator-Sequenz binden bzw. löst sich vom Operator.
Jetzt kann die RNA-Polymerase mit der Transkription starten, die Laktose-Stoffwechselgene werden
exprimiert, es gelangt mehr Laktose aus dem Medium in die Zellen (durch die Permease) und
die Inhibition des LacI Repressors wird verstärkt. Gleichzeitig wird die Laktose abgebaut und ihre
Konzentration im Medium und in den Zellen sinkt. Dadurch steht wieder verstärkt freier LacI Repressor
zur Verfügung, bindet an den Operator und das Lac-Operon wird wieder reprimiert.
Dieses Regulationssystem aus Promotor, Operator und Repressor des Lac-Operons wird in vielen
Expressionsvektoren verwendet. Anstelle der Laktose Stoffwechselgene wird eine MCS eingefügt,
in die ein beliebiges Gen kloniert werden kann.
Da die natürliche Konzentration des LacI Repressors in der Bakterienzelle gering ist, die meisten
Bakterienvektoren aber origins für hohe Plasmid-Kopienzahlen enthalten, tragen viele dieser Lac-
Operon Expressionsvektoren zusätzlich eine Kopie des LacI Gens, um so die Repression des Lac-
Promotors zu verstärken.

36
Der hier gezeigte Vektor pGEX ist ein Beispiel für diese Expressionsvektoren. Ptac steht für den
Promotor-Operator Bereich aus dem Lac-Operon. Direkt 3´ von diesem Bereich ist die kodierende
Sequenz der Glutathion S-Transferase (GST) kloniert. Der Lac-Terminator ist nicht extra eingezeichnet,
befindet sich aber 3´ der GST-Sequenz. lacI q ist das Gen für den LacI Repressor. Amp r
steht für das Ampizillin Resistenzgen und pBR322 ori ist ein bakterieller origin, der hohe Kopienzahlen
sicherstellt. Für das Induktionsexperiment im Praktikum wird unter anderen dieses Plasmid
verwendet.
Da Laktose vom Bakterium abgebaut wird, kann damit nur eine zeitweilige Induktion aufrecht erhalten
werden (es sei denn, man gibt alle paar Stunden neue Laktose zu). Deshalb wird in der Praxis
für die Induktion das Laktose-Strukturanalogon IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
verwendet.
Laktose IPTG
Es bindet wie Laktose an den LacI Repressor und verhindert seine Bindung an den Lac-Operator,
kann aber vom Bakterium nicht abgebaut werden. Dadurch kann durch eine einmalige Zugabe von
IPTG eine dauerhafte Induktion des Lac-Promotors erreicht werden.
Das T7-RNA-Polymerase System:
Die bakterielle RNA-Polymerase ist ein äußerst aktives Enzym, wie die hohen Induktionsraten des
Lac-Operons (bis zu 1000-fach) zeigen. Allerdings ist sie im Bakterium nicht nur für die Expression
des Lac-Promotors zuständig, sondern transkribiert alle vom Bakterium benötigten Gene. Deshalb
ist die Expressionsstärke des Lac-Promotors letztendlich limitiert und abhängig vom Zellzyklus
bzw. dem Expressionsbedarf der Bakterienzellen.
Phagen RNA-Polymerasen werden durch solche Limitierungen nicht beeinflusst.
Phagen (Viren, die spezifisch Bakterien als Wirtszellen befallen) infizieren Bakterienzellen, nutzen
den Replikationsapparat der Bakterienzellen, um neue Kopien ihrer DNA herzustellen und den
Translationsapparat der Bakterien, um ihre Hüllproteine zu synthetisieren. Die Transkription der

37
Phagengene erfolgt aber häufig durch Phagen-eigene RNA-Polymerasen. Diese RNA-Polymerasen
erkennen in der Regel sehr spezifisch nur den Phagenpromotor, sind äußerst aktiv und durch den
Zellzyklus des Bakteriums nicht beeinflusst.
Der Bakteriophage T7 besitzt eine hoch aktive RNA-Polymerase, deren Promotor Erkennungssequenz
eine kurze (< 20 bp) DNA-Sequenz ist, die im Bakteriengenom nicht vorkommt.
Bakteriophage T7
Die Transkription durch die T7 RNA-Polymerase ist daher absolut spezifisch nur für die Proteine,
die unter der Kontrolle des T7 Promotors stehen. In einem Bakterium, in dem keine T7 RNA-
Polymerase vorhanden ist, werden diese Gene nicht transkribiert, sie sind (nahezu) 100 %
reprimiert. Dies bietet die Möglichkeit auch Proteine, die für Bakterienzellen stark toxisch sind, in
bakterielle Vektoren zu klonieren und die Plasmide in Bakterien zu amplifizieren.
Um Gene unter Kontrolle des T7 Promotors exprimieren zu können, muss die T7-RNA-Polymerase
im Bakterium zur Verfügung gestellt werden. Dies ist z.B. möglich, indem man das T7-RNA-
Polymerase Gen auf einem induzierbaren Expressionsplasmid separat zur Verfügung stellt.
Eine elegantere Methode wird heute in den biochemischen Labors genutzt. Es werden Bakterienstämme
(z.B. BL21DE3) verwendet, die in ihrem Genom eine Kopie des T7-RNA-Polymerase
Gens unter Kontrolle des Lac-Promotors/Operators tragen. Die Expression der T7-RNA-Polymerase
ist durch den LacI Repressor unterdrückt und kann durch Zugabe von IPTG induziert werden.
Dadurch wird die Expression des Zielproteins ermöglicht.
Obige Abbildung (aus einem Novagen Katalog) zeigt den Aufbau dieses Expressionssystems. Da
die Repression des Lac-Promotors durch den LacI Repressor nicht 100 %ig ist, tragen die Expressionsplasmide
in der Regel zusätzlich die Lac-Operator-Sequenz direkt 3´ nach der T7-RNA-Polymerase
Bindungssequenz. Dadurch ist ohne IPTG Zugabe auch eine basale Expression durch die
wenigen, gebildeten T7-RNA-Polymerase Moleküle weitgehend unterdrückt.

Der unten gezeigte pET28 Vektor zeigt den Aufbau eines solchen T7-Expressionsplasmids:
38
Während das Lac-Operon basierte Expressionssystem im Prinzip in jedem Bakterienstamm verwendbar
ist, erfolgt die Expression von Proteinen unter Kontrolle des T7 Promotors nur in Bakterien,
die das Gen der T7-RNA-Polymerase tragen.
Im Praktikum werden wir die Funktionalität der beiden oben beschriebenen
Expressionssysteme untersuchen.
Sie werden die Expression eines Proteins in zwei verschiedenen Bakterienstämmen durch
IPTG Zugabe induzieren, nach unterschiedlichen Induktionszeiten Proben entnehmen und
die Induzierbarkeit der Expression durch SDS-Gelelektrophorese analysieren.
Der Vergleich der Induzierbarkeit im Bakterienstamm Top10F´ (trägt keine Kopie der T7-
RNA-Polymerase) und im Stamm BL21DE3 (trägt eine Kopie der T7-RNA-Polymerase)
ermöglicht die Identifizierung der beiden Expressionssysteme, ohne Informationen über das
verwendete Expressionsplasmid.
Elektrophoretische Trennung von Proteinen durch SDS-Gelelektrophorese
Nukleinsäuren besitzen eine gleich bleibende Ladungsdichte und, mit Ausnahmen, eine einheitliche
räumliche Struktur. Deshalb ist es möglich, sie in einer Matrix (Agarose, Polyacrylamid) auf Grund
ihrer Beweglichkeit in einem elektrischen Feld, der Größe nach aufzutrennen.
Bei Proteinen ist eine solche Auftrennung nach Größe nicht so einfach möglich. Die Ladung nativer
Proteine ist zum einen abhängig von ihrer Primärsequenz (Aminosäurezusammensetzung) und zum
zweiten abhängig vom pH-Wert ihrer Umgebung. Hinzu kommt, dass native Proteine keine
einheitliche räumliche Struktur besitzen. Große Proteine können eine sehr kompakte, globuläre
Struktur einnehmen, während kleinere Proteine auf Grund einer mehr linearen Struktur deutlich
mehr Raum einnehmen können. Es ist deshalb nicht möglich, native Proteine nach ihrer Größe im
elektrischen Feld zu trennen. Zwar kann man auf Grund der unterschiedlichen Ladung und der
unterschiedlichen räumlichen Struktur eine Auftrennung eines nativen Proteingemisches in einem
Polyacrylamidgel erreichen, aber die Laufstrecke der einzelnen Proteine erlaubt keine Aussage über
ihre Größe. Da die Ladung eines Proteins Sequenz- und pH-Wert- abhängig ist, kann es passieren,

39
dass einzelne Komponenten eines Proteingemisches nicht in Richtung Anode und durch die Matrix
wandern, sondern Richtung Kathode.
Die SDS-Gelelektrophorese löst diese beiden Probleme bei der Auftrennung von Proteinen nach
Größe. SDS (Sodium dodecylsulfat, Sodium = Natrium) ist ein anionisches Detergenz.
Mit seinem langen, hydrophoben Kohlenstoffkettenanteil kann das SDS-Molekül ideal mit den
Seitenketten der Aminosäuren interagieren. Der geladene Sulfatanteil ist dem Lösungsmittel, Wasser,
zugewandt und solubilisiert so die Polypeptidkette. Die Interaktion von SDS mit Proteinen erfolgt
im Verhältnis 1,4 zu 1 (1,4 g SDS auf 1 g Protein). Die negative Ladung der Dodecylsulfationen
überdeckt die Eigenladung der Proteine. Sie spielt praktisch keine Rolle mehr für die Gesamtladung
des Teilchens.
Vor der Elektrophorese wird das Proteingemisch in SDS-Puffer mit einem Reduktionsmittel (in der
Regel β-Mercaptoethanol) erhitzt.
Die Wasserstoffbrücken, die die Sekundär- und Tertiärstruktur der Proteine stabilisieren, werden
aufgespalten und es entstehen weitgehend lineare Polypeptidketten, die mit Dodecylsulfat bedeckt
sind. Das Reduktionsmittel dient zur Aufspaltung von Schwefelbrücken zwischen Cysteinen.
Diese denaturierten Dodecylsulfat/Polypeptid-Komplexe weisen eine konstante Ladungsdichte auf
(Verhältnis Ladung pro Masseeinheit ist konstant) und haben eine annähernd lineare Form. Auf
diese Weise können sie in einer Matrix im elektrischen Feld nach ihrer Größe aufgetrennt werden.
Die am häufigsten verwendete Gelmatrix für die Auftrennung von Proteinen ist Polyacrylamid
(PAA). Je nach Anwendung werden PAA-Konzentrationen zwischen 8 und 20 % verwendet. Es
können auch Gradientengele gegossen werden, die in Laufrichtung der Proteine eine steigende
Konzentration aufweisen. Abhängig von der PAA-Konzentration gibt es über einen bestimmten
Größenbereich eine lineare Abhängigkeit zwischen dem Logarithmus des Molekulargewichts des
Proteins (in kDa) und der Laufstrecke (in cm) im PAA-Gel.
Neben der Konzentration beeinflusst auch der Vernetzungsgrad des Acrylamids die Porengröße des
Gels und damit die Auftrennung der Proteine. Polyacrylamid entsteht durch die radikalische
Polymerisation einer wässrigen Acrylamid-Lösung in Gegenwart von Methylenbisacrylamid. Das
Verhältnis von Acrylamid zu Bisacrylamid entscheidet über den Vernetzungsgrad der Acrylamidketten
und damit auch mit über die Porengröße des Gels.

40
Als Radikalstarter der Polymerisation wird Ammoniumperoxidisulfat eingesetzt, TEMED dient als
Moderator der Reaktion:
Der Zerfall des Peroxidisulfats initiiert die Radikalreaktion und das Kettenwachstum:
Durch das Bisacrylamid wird eine Verknüpfung der Acrylamidpolymere erreicht. Es entsteht eine
Art Netz:
In SDS-Gelen können Proteine von 5 bis 800 kDa aufgetrennt werden. Da Polyacrylamid klar und
farblos ist, können die Proteine direkt im Gel mit den verschiedensten Chemikalien gefärbt werden.
Eine Standardmethode, um Proteine im PAA-Gel nachzuweisen, ist die Färbung mit Coomassie-
Brilliant-Blau. Dieser Triphenylmethanfarbstoff wurde ursprünglich für die Färbung von Seide und
Wolle verwendet (Achtung! Färbt sehr effizient und dauerhaft verschiedene Kleidungsstoffe, aber
auch die Proteine der Haut!)
Coomassie-Brilliant-Blau

41
Im sauren Milieu bildet die unprotonierte, anionische Sulfonatform des Farbstoffs unspezifische
Komplexe mit Proteinen. Der Farbstoff interagiert dabei mit kationischen und nichtpolaren, hydrophoben
Seitenketten. Am stärksten ist seine Interaktion mit Arginin, weniger stark interagiert er mit
Lysin>Histidin>Tryptophan>Tyrosin>Phenylalanin.
Je nach Aminosäurezusammensetzung können damit 100 ng – 1 µg Protein noch deutlich nachgewiesen
werden. Für die Färbung wird das PAA-Gel in einer Coomassie-Lösung in Essigsäure
geschwenkt und nach ca. einer Stunde das überschüssige Coomassie mit reiner 10 % Essigsäure
wieder ausgewaschen. Die PAA-Matrix wird klar und nur die Proteinbanden bleiben gefärbt.
Die diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese:
In einem einfachen SDS-Gel hängt die Trennschärfe stark von der Konzentration und Zusammensetzung
der Probe und zum Teil auch vom Probenvolumen ab. In hoch konzentrierten Proben kann
es zur Aggregation von Polypeptidketten und dadurch zu einer Unschärfe der Banden kommen.
Zudem wird die Bandenbreite auch vom Probenvolumen mit beeinflusst, je höher das Volumen,
umso breiter die Bande. Diese beiden negativen Einflüsse können durch die Verwendung einer
diskontinuierlichen SDS-Gelelektrophorese vermieden werden.
Das SDS-Gel ist hier aus zwei Schichten, einem Sammel- und einem Trenngel, aufgebaut. Das
Sammelgel ist niedrigprozentig und damit weitporig, die Proteine werden durch die Gelmatrix
kaum beeinflusst. Das Trenngel ist höherprozentig und damit engmaschig und trennt die Proteine
nach der Größe.
Außerdem werden zwei verschiedene Puffer kombiniert:
Das Sammelgel ist mit einem Tris HCl-Puffer auf pH 6,8 eingestellt. Der auf das Gel aufgebrachte
Kathodenpuffer besteht aus Tris/Glycin. Beim Start der Elektrophorese wandern die im Gel
vorhandenen Chlorid-Ionen und die Proteine zur Anode. Durch die vom pH-Wert unabhängige Ladung
und die geringe Größe hat Chlorid eine sehr hohe Mobilität und wandert vor den Proteinen.
Als Ersatz für die abgewanderten Chlorid-Ionen folgt Glycin aus dem Kathodenpuffer, das bei pH
6,8 größtenteils protoniert als Zwitterion vorliegt. Dadurch sinkt im Bereich ohne Chlorid-Ionen die
Leitfähigkeit des Sammelgels und die elektrische Feldstärke nimmt zu. Das starke elektrische Feld
beschleunigt die Proteine bis an die von den Chlorid-Ionen vorgegebene Grenze. An dieser Stelle
des Sammelgels fällt die Feldstärke durch die hohe Leitfähigkeit des Chlorids ab. Die
Proteine werden wieder abgebremst und sammeln sich in schmalen Banden entsprechend ihrer
elektrophoretischen Mobilität, die zwischen der des Cl - und der des Glycin liegt. Die Proteine
werden also entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität vorsortiert (vermindert Aggregation)

und in eine schmale Bande fokussiert (verringert Einfluss des Probenvolumens).
42
Das Trenngel ist engporig und mit einem Tris HCl-Puffersystem auf pH 8,8 eingestellt. Die
Proteine treten, in einem engen Bereich fokussiert, nach den Chlorid- und vor den Glycin-Ionen in
das Trenngel ein. Bei pH 8,8 liegt Glycin stärker deprotoniert vor, erreicht eine höhere Mobilität als
die Proteine und wandert vorbei. Der „schiebende" Effekt, den Glycin im Sammelgel durch die
schlechte Leitfähigkeit und die dadurch hervorgerufene hohe Feldstärke hatte, fällt weg. Das elektrische
Feld, das die Proteine umgibt, ist durch den homogenen Puffer konstant. Die Geschwindigkeit
wird jetzt von der Größe der Proteine bestimmt. Durch die geringere Porenweite des Trenngels
erhöht sich der Einfluss des Reibungswiderstands auf die Geschwindigkeit. Je größer ein Protein ist,
desto geringer ist die Strecke, die es pro Zeiteinheit zurücklegt.
Diese Form der diskontinuierlichen SDS-Gelelektrophorese werden Sie im Praktikum für die Analyse
der induzierten Expression und für die Kontrolle der Proteinreinigung einsetzen.
Proteinreinigung
Unabhängig davon, ob ein Protein aus einer natürlichen Quelle oder nach Überexpression aus einem
geeigneten Expressionssystem gewonnen wird, befindet es sich in der Regel in Zellen zusammen
mit tausenden anderen Makromolekülen. In den seltensten Fällen kann ein Protein direkt aus solch
einem Gemisch analysiert werden, es muss erst von den anderen Zellbestandteilen abgetrennt
werden.
Die wichtigste Frage, die vor Beginn einer Reinigung geklärt sein muss, ist die Detektion des Zielproteins.
In einem Überexpressionssystem wird das Protein oft so stark exprimiert, dass eine
Färbung im PAA-Gel das Zielprotein als prominenteste Bande einer bestimmten Größe detektierbar

43
macht. Ist das Protein nicht einfach auf Grund seiner Menge erkennbar, wird ein Assay benötigt,
mit dem die Fraktionen, die das Zielprotein enthalten, bestimmt werden können. Für die Detektion
können z.B. enzymatische Aktivitäten des Proteins, DNA- oder RNA-Bindung, Interaktion mit
bestimmten Reagenzien oder Antikörper genützt werden.
Da es heute relativ einfach ist DNA zu manipulieren, kann ein Protein auch durch spezifische Tags
modifiziert werden, die eine Detektion (z.B. mit Antikörpern gegen den Tag) möglich machen.
Solche Tags können auch zur spezifischen Reinigung eines Proteins verwendet werden (siehe
unten).
Eine Reinigungsstrategie für ein bestimmtes Protein rein theoretisch, ohne Vorversuche zu entwickeln,
ist praktisch nicht möglich. Zu viele verschiedene Parameter können einzelne Schritte beeinflussen.
Deshalb müssen Reinigungsprotokolle für jedes Protein neu etabliert werden. Man kann
aber ausgehend vom Ausgangsmaterial, gewünschter Menge, erforderlichem Reinheitsgrad,
Stabilität und spezifischen Eigenschaften des Proteins eine gewisse Vorauswahl der möglichen
Methoden treffen, die dann getestet werden müssen.
Reinigung der Taq-Polymerase:
Das im Praktikum zu reinigende Protein, die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, ist in verschiedener
Hinsicht ein Sonderfall. Thermus aquaticus gehört zu den thermophilen (Wärme
liebenden) Bakterien und lebt in heißen Quellen und Geysiren beispielsweise im Yellowstone-
Nationalpark. Die Umgebungstemperatur in diesen Quellen liegt bei etwa 50-80 °C. Die Taq
Polymerase ist daher sehr unempfindlich gegen höhere Temperaturen (die maximale enzymatische
Aktivität der Taq liegt bei 72 °C) und es muss während der Reinigung nicht permanent auf Kühlung
geachtet werden. Wie sie sehen werden, kann man sogar “Hitzedenaturierung“ bei einem
temperatur-stabilen Protein zur Abtrennung anderer Proteine einsetzen.
Die Taq-Polymerase wurde mit dem T7-Expressionssystem im Bakterienstamm BL21DE3 (E. coli)
überexprimiert. Außerdem wurde die Taq Polymerase mit einem His-Tag versehen, der eine
Affinitätsreinigung durch Bindung an Ni 2+ -Agarose erlaubt (siehe unten).
Zellaufschluss:
Der erste Schritt der Proteinreinigung ist der Zellaufschluss. Bakterien können enzymatisch mit Lysozym
oder durch mechanische Methoden (Ultraschall, Frenchpress, Glasmühle usw.) aufgeschlossen
werden.
Für die Taq Reinigung werden die Bakterienzellen mit Lysozym und einem anschließenden Hitzeschritt
aufgeschlossen. Lysozym baut die Bakterienzellwände ab und führt zur Lyse der Zellen. Da
Enzympräparationen oft Protease-Verunreinigungen enthalten oder aber, wenn sie hochrein sind,
sehr teuer sind, werden enzymatische Methoden beim Zellaufschluss eher selten eingesetzt. Für die
Taq-Reinigung wird der enzymatische Aufschluss bei 4 °C durchgeführt und die Zellen anschließend
durch einen Hitzeschritt bei 75 °C vollständig zur Lyse gebracht. Die Inkubation bei
75 °C führt nicht nur zu einer vollständigen Lyse der Zellen, sondern denaturiert auch den größten
Teil der E. coli Proteine, das Lysozym und alle möglicherweise in der Enzympräparation enthaltenen
Verunreinigungen. In einem anschließenden Zentrifugationsschritt werden die Zelltrümmer
und die denaturierten, ausgefallenen Proteine pelletiert und abgetrennt. Die Taq-Polymerase
befindet sich im klarem Überstand. Durch diesen Hitzeschritt werden mindestens 90 % der verunreinigenden
Proteine aus dem Rohextrakt entfernt.
Ammoniumsulfatfällung:
Wie DNA können auch Proteine zur Aufkonzentrierung gefällt werden. Agenzien, die die Hydratisierung
der Proteine herabsetzen, führen zur Aggregation und zur Präzipitation. So können Proteine

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mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln (Ethanol, Methanol, Aceton) gefällt werden. Auch
Trichloressigsäure (TCA) eignet sich gut für die Proteinfällung. Je nach Bedingungen kann das
Gesamtprotein aus der Lösung gefällt, oder aber eine fraktionierte Fällung durchgeführt werden.
Durch die Fällung mit organischen Lösungsmitteln werden Proteine meist irreversibel denaturiert.
Deshalb eignet sich diese Fällungsmethode nicht für die Reinigung eines nativen Proteins.
Auch Salze beeinflussen die Löslichkeit von Proteinen. Je nach Salz können die Ladungen der
Proteine durch Gegenionen abgeschirmt und die Proteine dadurch in Lösung gebracht werden.
Manche Salze konkurrieren aber mit den Proteinen bei der Solvatisierung um das Wasser und entziehen
den Proteinen zunehmend die Hydrathülle. Hydrophobe Wechselwirkungen in den Proteinen
werden dabei stabilisiert und die Proteinaggregation wird gefördert, bis die Proteine ausfallen. Die
Hofmeister-Serie beschreibt die Wirkung verschiedener Salze auf die Löslichkeit von Proteinen.
Die rechts stehenden Salze sind chaotrop, vermindern hydrophobe Effekte und halten Proteine in
Lösung (= Einsalzen). Die links stehenden Salze sind antichaotrop oder kosmotrop, vergrößern
hydrophobe Effekte und führen zum Ausfallen der Proteine (= Aussalzen).
Ammoniumsulfat ist für die Fällung nativer Proteine besonders gut geeignet. Es schützt die biologische
Aktivität der ausgefällten Proteine und stabilisiert sogar Proteinkomplexe bei der Fällung. Da
es nach der Fällung leicht wieder zu entfernen ist (Dialyse, siehe unten) und außerdem sehr
preiswert ist, wird es häufig für die Konzentrierung von Proteinen während einer Reinigung verwendet.
Mit Ammoniumsulfat können auch fraktionierte Fällungen durchgeführt werden. Dazu
wird die Proteinlösung zunächst auf eine niedrige AS-Konzentration eingestellt und zentrifugiert.
Besonders hydrophobe Proteine werden bei der niedrigen AS-Konzentration ausfallen, während die
besser Löslichen noch im Überstand bleiben. Die AS-Konzentration kann schrittweise erhöht
werden, wodurch auch gut lösliche Proteine zunehmend aussalzen.
Bei der Taq-Reinigung dient die Ammoniumsulfatfällung vor allem der Konzentrierung, da unter
den gewählten Bedingungen die meisten Proteine aussalzen. Der Überstand nach der Hitzedenaturierung
wird mit einer gesättigten AS-Lösung auf 45% Ammoniumsulfat-Sättigung
eingestellt und auf Eis inkubiert, bis die Proteine ausgefallen sind. Das Präzipitat wird durch
Zentrifugation in einer Kühlzentrifuge abgetrennt und dann in einem geringeren Volumen Puffer
wieder gelöst.
Taq-Reinigung über Ni 2+ -Affinitätschromatographie:
Konventionelle Chromatographieverfahren nutzen die Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften
von Proteinen – Löslichkeit, Ladung, Größe, Hydrophobizität – für die Reinigung. Je nach
Protein können mit diesen Verfahren sehr effiziente Reinigungen durchgeführt werden. Oft sind
aber mehrere verschiedene Reinigungsschritte notwendig, um ein bestimmtes Protein von allen
anderen abzutrennen.
Deutlich effizienter und schneller sind Reinigungsverfahren, die hoch spezifische Eigenschaften
eines Proteins nutzen. Ein DNA-bindendes Protein kann z.B. an immobilisierte DNA gebunden und

45
so in einem Schritt von allen anderen nicht DNA-bindenden Proteinen abgetrennt werden. Solche
Reinigungsverfahren beruhen auf der hohen Affinität des Zielproteins zu einem bestimmten Liganden,
der an eine Matrix immobilisiert werden kann und heißen Affinitätschromatographie. Da viele
Proteine keine spezifische Bindung an einen speziellen Liganden zeigen, können sie nicht über
diese schnelle und hoch effiziente Methode gereinigt werden. Man kann aber Proteine mit Affinitäts-Tags
versehen, die für die Reinigung verwendet werden und - falls störend - anschließend
durch spezifische Proteasen wieder abgetrennt werden können. So kann man z.B. Proteine mit dem
Enzym Glutathion-S-Transferase (GST) fusionieren und die hoch spezifische Bindung der GST an
Glutathion für die Reinigung verwenden.
Auch Metallionen können von verschiedenen Proteinen gebunden werden, viele Enzyme benötigen
Metallionen als Co-Faktoren bei der Katalyse. An der Komplexierung von Metallionen sind
verschiedene Aminosäuren beteiligt, die räumlich (aber nicht unbedingt in der Sequenz) nahe
zueinander orientiert sind. Die Aminosäure Histidin ist besonders gut geeignet, um Ni 2+ -Ionen zu
binden. Fusioniert man an ein Protein N- oder C-Terminal eine Reihe von 6 Histidinen, so bindet
dieser Bereich spezifisch Ni 2+ -Ionen. Um diese Bindung an Ni 2+ zur Reinigung zu verwenden,
müssen die Ni 2+ -Ionen an einer Matrix immobilisiert werden. Dies gelingt mit Chelatoren, die nur
einen Teil der Koordinationsstellen des Nickels besetzen und selbst kovalent an eine Matrix wie
z.B. Agarose gekoppelt werden.
Im Praktikum wird die Ni 2+ -NTA-Agarose von Quiagen benutzt um die His6-getaggte Taq-Polymerase
zu reinigen. Die Ni 2+ -NTA-Agarose verwendet an Agarose gekoppelte Nitrilotriacetic acid
(NTA) als Chelator für die Nickel-Ionen. NTA besetzt vier der sechs Liganden-Bindungsstellen des
Nickels. Dadurch sind zwei der Bindungsstellen frei, um mit dem His6-Tag zu interagieren.
Die durch den His6-Tag erreichte Bindung an die Ni 2+ -NTA-Agarose ist hochspezifisch für das getaggte
Protein. Alle anderen Proteine interagieren nicht oder nur unspezifisch mit der Agarose und
können durch Waschen mit Puffer entfernt werden.
Zur Elution wird Imidazol verwendet. Der Imidazolring ist der Bestandteil des Histidin, der mit
dem Ni 2+ -Ion interagiert.

46
Die Bindung des Imidazol an Ni 2+ -NTA-Agarose ist deutlich schwächer als die Bindung des His6-
Tags. Deshalb werden relativ hohe Konzentrationen an Imidazol (200 mM) für die kompetitive
Elution benötigt.
Dialyse von Proteinlösungen:
Bei der Reinigung oder Charakterisierung von
Proteinen kann es notwendig sein, die
Proteinlösung umzupuffern. So ist zum
Beispiel ein Hochsalzpuffer inkompatibel mit
der Reinigung mittels Ionenaustauscherchromatographie.
Die einfachste Methode den
Puffer einer Proteinlösung auszutauschen, ist
die Dialyse. Dazu wird die
Proteinlösung in einen Dialyseschlauch
gegeben, der in ein großes Volumen des angestrebten Puffers gegeben wird. Die semipermeable
Membran des meist aus regenerierter Cellulose bestehenden Dialyseschlauchs ist für kleine
Moleküle (z.B. Salzionen) nicht aber für Proteine durchlässig. Die kleinen Moleküle diffundieren
durch die Dialysemembran in den umgebenden Puffer und es stellt sich ein Gleichgewicht ein.
Das Volumen der Taq-Lösung nach der AS-Fällung ist zu gering, um in einem Dialyseschlauch dialysiert
zu werden. Deshalb wird die Dialyse in einem mit einer Dialysemembran verschlossenen
Eppendorfgefäß durchgeführt.
Analyse der Taq-Reinigung:
Zur Auswertung der Taq-Reinigung stehen prinzipiell drei Methoden zur Auswahl:
- Bestimmung der enzymatischen Aktivität pro Volumeneinheit (quantitativ oder qualitativ)
- SDS-Gelelektrophorese und Nachweis der Proteine durch Färbung
- Proteinbestimmung der einzelnen Reinigungsfraktionen
Im Praktikum werden wir die Reinigung durch SDS-Gelelektrophorese und Färbung der Proteine
mit Coomasie überprüfen. Die Auftrennung der Reinigungsfraktionen im SDS-Gel zeigt qualitativ
das Abtrennen verunreinigender Proteine in den Taq-Fraktionen und erlaubt eine Abschätzung der
Reinheit und des Molekulargewichts des isolierten Enzyms.
Darüber hinaus soll eine PCR-Reaktion mit der selbst gereinigten Taq-Polymerase bestätigen, dass
tatsächlich das richtige Protein in aktiver Form gereinigt wurde.

47
Proteinreinigung durch Ionenaustauschchromatographie
Abhängig von ihrer Aminosäurezusammensetzung weisen Proteine eine spezifische Eigenladung
auf. Je nach Eigenladung kann ein Protein an negativ geladenen Materialen (wenn es selber positiv
geladen ist) oder an positiv geladenen Materialien (wenn es selber negativ geladen ist) binden.
Diese Eigenschaft kann man nutzen, um Proteine durch Ionenaustauschchromatographie zu
reinigen.
Für die Ionenaustauschchromatographie werden inerte, ungeladene Gelmatrices (Sepharose,
Superose…) verwendet, an die geladene Gruppen kovalent gebunden sind.
Kationenaustauscher haben negativ geladene Gruppen (z.B. Carboxylgruppen) an die Matrix
gekoppelt und binden positiv geladene Teilchen. Anionenaustauscher haben positiv geladene
Gruppen (z.B. Ammoniumgruppen) an die Matrix gekoppelt und binden negativ geladene
Teilchen.
Die Gelmatrix mit den geladenen Gruppen wird in
einem Puffer mit geringer Ionenstärke resuspendiert und
mit diesem Puffer equilibriert. Im Beispiel rechts ist ein
Anionenaustauscher gezeigt. An die Matrix sind positiv
geladene Gruppen gebunden, die Gegenionen stammen
aus dem Laufpuffer. Der Laufpuffer enthält eine
Pufferkomponente zur Einstellung des pH Werts und
eine niedrige Konzentration an Salz, in der Regel NaCl
oder KCl. Die Cl - Ionen aus dem Laufpuffer binden als
Gegenionen an die positiv geladenen Gruppen der
Matrix.
Das zu trennende Proteingemisch wird im Laufpuffer
auf das Säulenmaterial aufgetragen. Die negativ
geladenen Proteine verdrängen die Cl - Ionen von den
positiven Gruppen an der Matrix, binden an diese und
werden so auf dem Säulenmaterial festgehalten.
Neutrale oder positiv geladene Proteine binden nicht an
das Säulenmaterial und werden mit dem Puffer durch
die Säule gespült.
Nachdem alle nicht bindenden Proteine durch das
Säulenmaterial gewaschen wurden, können die
gebundenen Proteine durch Erhöhung der Ionenstärke
im Puffer wieder vom Säulenmaterial gelöst werden.
Die Erhöhung der Ionenstärke im Puffer erreicht man in
der Regel durch Erhöhung der Salzkonzentration. Durch
stufenweise Erhöhung der Salzkonzentration können
erst schwach an die Säulen gebundene, mit steigender
Salzkonzentration im Puffer, stark an die Säule
gebundene Proteine schrittweise von der Säule eluiert
werden.
Auf diese Weise werden Proteine nach ihrer Ladung
voneinander getrennt.
>>steigende Salzkonzentration>>

Protokoll zum Grundpraktikum - Enzymkinetik
Protokoll von:
Name:
Vorname:
Matrikelnummer:
und
Name:
Vorname:
Matrikelnummer:
Thema: Enzymkinetik
Zeitraum:
Betreuer/in:
48

Protokoll zum Grundpraktikum Biochemie – Woche Enzymkinetik
Achtung: Bitte schreiben Sie zu folgenden Themen jeweils maximal 1 ½ Seiten „Einleitung“.
Diese Einleitung soll kurz zusammenfassen, was sie mit welcher Zielsetzung gemacht haben.
Maximal 1 ½ Seiten ist wörtlich gemeint, wir werden nicht mehr korrigieren – bzw. nach 1 ½
Seiten aufhören zu lesen.
49
Bitte schreiben sie 1 ½ zeilig mit Schriftgröße 11 – 12 Punkt!
Themen:
1. ADH – Analyse der Substratspezifität, Inhibitorwirkung und Alkoholbestimmung
2. AP – Einfluss äußerer Faktoren auf die Enzymaktivität (pH-Wert, Temperatur,
Salze)
Achtung: Alle (abgezeichneten) Original -Messdaten als Anhang zum Protokoll
beilegen!
Alkoholdehydrogenase – Substratspezifität
Berechnung der eingesetzten Konzentrationen:
Endkonzentration eingesetzt: ml Stocklösung / g Feststoff:
300 mM Ethanol, 25 ml (MW: 46,07; D: 0,79)
600 mM 1-Propanol, 20 ml (MW: 60,1; D: 0,8)
50 mM Fluorethanol, 5 ml (MW: 82,1; D: 0,99)
Substratspezifität der ADH:
1. Erstellen Sie eine Tabelle mit folgenden Punkten:
- Originalmessdaten
- Berechnung ∆Ε/min in M
- Mittelwerte (soweit sinnvoll); wenn Sie für einzelne Messpunkte keine Mittelwerte
berechnen begründen Sie das bitte; wenn es nicht sinnvoll ist aus zwei kompletten
Messreihen Mittelwerte zu berechnen, begründen Sie dies bitte, berechnen den KM
Wert separat für beide Messreihen und diskutieren welches der wahrscheinlichere ist.
- Reaktionsgeschwindigkeit v in Mol L -1 min -1 für jede Substratkonzentration
(εNADH = 3427 L mol -1 cm -1 )
- 1/v
- 1/[S]
Achtung: Geben Sie bitte alle Konzentrationen in M (Mol L -1 ) an. Reaktionsgeschwindigkeit
in Mol L -1 min -1 !!!
Bei der Formatierung der Tabelle sollten Sie darauf achten, dass die Daten übersichtlich
und leicht zu zuordnen dargestellt werden. Ziehen Sie die Verwendung von Querformat für
die Tabellen in Betracht.

50
2. Erstellen Sie ein Lineweaver-Burk-Diagramm für Ethanol und Propanol, indem Sie 1/v
gegen 1/[S] auftragen (Millimeterpapier oder Exceltabelle und –Grafik).
3. Bestimmen Sie aus dem Diagramm Vmax und KM für Ethanol und Propanol und berechnen
Sie die Wechselzahl k3 (sec -1 ) für das Enzymmolekül und die einzelne katalytische
Untereinheit.
KM in Mol L -1 min -1 angeben!!! Wechselzahl k3 in min -1
MW ADH: 148 kDa (= 148000)
Stocklösung ADH: wird in der Abschlussbesprechung bekannt gegeben
Verdünnung ADH: wird in der Abschlussbesprechung bekannt gegeben
ADH aus Hefe enthält 4 katalytische Untereinheiten
Alkoholdehydrogenase – Hemmung der ADH
1. Erstellen Sie eine Tabelle mit folgenden Punkten:
- Originalmessdaten
- Berechnung ∆Ε/min
- Mittelwerte
- Reaktionsgeschwindigkeit v in Mol L -1 min -1 für jede Substratkonzentration
(εNADH = 3427 L mol -1 cm -1 )
- 1/v
- 1/[S]
2. Erstellen Sie ein Lineweaver-Burk-Diagramm für jede Inhibitorkonzentration. Tragen Sie die
Geraden in EINE Grafik ein und bestimmen Sie aus der Lage der (annähernd) gemeinsamen
Schnittpunkte den Hemmtyp.
3. Berechnen Sie für jede Inhibitorkonzentration die Inhibitorkonstante KI
Bilden Sie einen (sinnvollen) Mittelwert.
Berechnung Inhibitorkonstante siehe Seminar
4. Ist die Inhibitorkonstante von Fluorethanol größer oder kleiner als die Michaelis-Menten
Konstante von Ethanol? Ist Fluorethanol damit ein guter (affiner) Inhibitor?
4. Alkoholdehydrogenase – Alkoholgehalt einer Kirschlikörpraline
1. Erstellen Sie für Ihre Eichmessungen und Likörmessungen eine Tabelle mit den
Originaldaten.
2. Erstellen Sie mit den Werten der Ethanolstandards eine Eichgerade (Extinktion gegen Konzentration
auftragen). Falls Sie Excel verwenden: Achten Sie auf die Erstellung einer
SINNVOLLEN Ausgleichsgeraden.
3. Bilden Sie aus den Messwerten der Pralinenprobe einen Mittelwert (Verdünnung einberechnen)
und lesen Sie die Alkoholkonzentration der Probe aus der Eichgerade ab.
Der Alkoholgehalt eines Likörs beträgt zwischen 15 und 20 %. Stimmt dies mit Ihrer
Messung überein? Wenn nein, diskutieren Sie mögliche Fehlerquellen

Alkalische Phosphatase – Ermittlung von Vmax und Substratsättigungskonzentration,
pH-Wert Abhängigkeit der Enzymaktivität
Berechnung der Pufferherstellung:
Endkonzentration
200 ml AP-Puffer
eingesetzt: ml Stocklösung / g Feststoff:
250 mM Natriumacetat (MW: 82,03)
250 mM Imidazol (MW: 68,08)
250 mM Borsäure (MW: 61,8)
Versuchsauswertung:
51
1. Erstellen Sie eine Tabelle der Extinktionswerte zu Reaktionszeit bei den unterschiedlichen
pH-Werten (es kann die Originaltabelle aus dem Script verwendet/eingeklebt werden).
2. Tragen Sie für die verschiedenen pH-Werte die Extinktion gegen die Zeit in ein Diagramm
ein und bestimmen Sie die Reaktionsgeschwindigkeit (Extinktion pro min) als Geradensteigung.
Berücksichtigen Sie dabei nur den linearen Bereich der Messung.
3. Tragen Sie die Reaktionsgeschwindigkeiten gegen den pH-Wert auf. Wo liegt das Optimum
der alkalischen Phosphatase?
4. Erstellen sie eine Tabelle mit Ihren Messwerten bei den unterschiedlichen Temperaturen.
Bei welcher Temperatur ist die AP Aktivität am höchsten? Würden Sie dieses
Temperaturoptimum für ein Enzym erwarten.
5. Erstellen Sie eine Tabelle mit Ihren Messwerten bei verschiedenen Salzkonzentrationen.
Welchen Einfluss hat welches Salz auf die AP Aktivität? Warum?
Falls Ihre Ergebnisse nicht mit den erwarteten übereinstimmen, diskutieren Sie bitte jeweils
kurz mögliche Ursachen/Erklärungen.

Protokoll zum Grundpraktikum – DNA-Analytik
Protokoll von:
Name:
Vorname:
Matrikelnummer:
und
Name:
Vorname:
Matrikelnummer:
Thema: DNA-Analytik
Zeitraum:
Betreuer/in:
52

Protokoll zum Grundpraktikum Biochemie – Woche DNA-Analytik
Protokoll bitte 1 1/2 Zeilig schreiben, Zeichengröße 11 – 12 Punkt!
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Achtung: Schreiben Sie zu folgenden Themen jeweils maximal eine Seite „Einleitung“.
Diese Einleitung soll kurz zusammenfassen, was sie mit welcher Zielsetzung gemacht
haben.
Maximal eine Seite ist wörtlich gemeint, wir werden nicht mehr korrigieren – bzw. nach
einer Seite aufhören zu lesen.
Themen:
1. Isolierung genomischer DNA
2. Isolierung von Plasmid-DNA und Restriktionskartierung
3. Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien
4. PCR
1. Isolierung genomischer DNA aus Gewebe und Hefezellen und Analyse der
genomischen DNA – Restriktionsspaltung und Auftrennung im Agarosegel
Berechnung der Pufferherstellung:
Endkonzentration
50 ml Gewebe-Lysispuffer:
eingesetzt: ml Stocklösung / g Feststoff:
100 mM Tris HCl, pH 8,5
5 mM EDTA, pH 8,0
0,2 % SDS
200 mM NaCl
100 ml TE 10/1:
10 mM Tris HCl, pH 7,5
1 mM EDTA, pH 8,0
200 ml Spheroblasten Waschpuffer:
1 M Sorbitol
100 mM EDTA, pH 8,0
1 ml Lyticase-Puffer:
1 M Sorbitol
100 mM EDTA, pH 8,0
14,3 mM β-Mercaptoethanol
100 ml TE 50/100:
50 mM Tris HCl, pH 7,5
100 mM EDTA, pH 8,0

100 ml 50 x TAE:
2 M Tris
2 M Essigsäure
50 mM EDTA
Gel-Dokumentation:
Kleben Sie das Bild Ihres Agarosegels ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!
Wenn sie sich unsicher sind, fragen Sie was unter exakter Beschriftung zu verstehen ist!
Versuchsauswertung:
54
1. Schätzen Sie an Hand des Markers im Agarosegel die Größe Ihrer genomischen DNA.
Erwarten Sie für genomische DNA diese Größe? Wenn ja, Begründung, wenn nein, woran
kann es liegen, dass Ihre genomische DNA nicht das erwartete Laufverhalten zeigt?
2. Schätzen Sie jeweils die Menge der RNaseA behandelten DNA im Agarosegel im Vergleich
zu den (Mengen-) definierten Markerbanden und berechnen Sie die Konzentration Ihrer
DNAs pro µl und Ihre Gesamtausbeute.
3. Vergleichen Sie die DNA-Präparation aus Gewebe und Hefe. Sehen Sie Unterschiede?
Erwarten Sie Unterschiede?
4. Vergleichen Sie die EcoRI und HaeIII Spaltungen der genomischen DNAs. Sehen Sie
Unterschiede zwischen den Spaltungen? Wenn ja, warum?
Beantworten Sie die Fragen mit wenigen kurzen Sätzen. Zu Frage 1 und 2 werden auch Zahlen
erwartet. Ja und Nein wird nicht als (einzige) Antwort akzeptiert (auch nicht zu Frage 3)
Sollte Ihr Agarosegel, Ihre DNA-Präparation oder Ihre Spaltung nicht auswertbar sein, verwenden
Sie die Musterlösung (online und Anhang) zur Beantwortung der Fragen.
Dokumentieren Sie aber in jedem Fall Ihr Gel (Bild einkleben) und begründen Sie kurz, warum Sie
die Musterlösung für die Auswertung benutzen.

2. Isolierung von Plasmid-DNA, Kontrolle und Mengenabschätzung der
isolierten Plasmid-DNA
Berechnung der Pufferherstellung:
Endkonzentration
100 ml Resuspensionspuffer:
eingesetzt: ml Stocklösung/ g Feststoff:
50 mM Tris HCl, pH 8,0
10 mM EDTA, pH 8,0
100 ml Lysispuffer:
200 mM NaOH
1 % SDS
100 ml Puffer STET
10 mM Tris HCl, pH 8,0
1 mM EDTA, pH 8,0
100 mM NaCl
5 % Triton X-100
Gel-Dokumentation:
Kleben Sie das Bild Ihres Agarosegels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!
Versuchsauswertung
55
1. Schätzen Sie für beide Methoden die Plasmid-DNA Ausbeute durch Vergleich mit bekannten
DNA-Mengen im Gel, berechnen Sie die Konzentration der Plasmid-DNA pro µl und
Ihre Gesamtausbeute (für beide Präparationsmethoden durchführen). Geben Sie eindeutig an
welche Kontroll-DNA und welche Plasmid-DNA Sie für die Abschätzung verwenden.
2. Vergleichen Sie die Ausbeute und Qualität der Plasmid-DNA aus den zwei verschiedenen
Isolierungsmethoden. Welche Methode liefert mehr DNA? Welche Methode liefert die
bessere Qualität an Plasmid-DNA? (Qualitätsmerkmale: Verhältnis supercoiled zu nicked
DNA; Laufverhalten der DNA – scharfe Banden?)
3. Diskutieren Sie die beiden Methoden hinsichtlich Schnelligkeit, Einfachheit, Ausbeute und
Qualität der Plasmid-DNA. Welche Methode würden Sie bevorzugen? Warum?

56
3. Restriktionskartierung von Plasmid-DNA
Gel-Dokumentation:
Kleben Sie das Bild Ihres Agarosegels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!
Versuchsauswertung:
1. Messen Sie die Laufstrecke der einzelnen Markerbanden aus und tragen Sie sie in eine
Tabelle mit den Größen in Basenpaaren ein. Berechnen Sie den dekadischen Logarithmus
der Größe in Basenpaaren und tragen diese Werte ebenfalls in die Tabelle ein.
2. Tragen Sie die Laufstrecke gegen den dekadischen Logarithmus der Größe in Basenpaaren
in ein Diagramm auf Millimeterpapier ein (alternativ Erstellen einer Excel Tabelle und
Excel Grafik); erstellen Sie eine Eichkurve.
Falls Sie Excel verwenden: Achten Sie darauf, dass die vom Programm erstellte
Ausgleichsgrade „sinnvoll“ ist!
3. Messen Sie die Laufstrecke der einzelnen Banden in Ihren verschiedenen Restriktionsansätzen
aus und bestimmen Sie mit Hilfe der Eichgerade ihre Größe. (Tabelle erstellen)
Achten Sie darauf, dass die aus der Eichgerade abgelesenen Werte in etwa mit den per
Augenschein abgeschätzten Werten übereinstimmen. (Vergleich mit Markerbanden)
4. Wie groß ist Ihr Plasmid in bp?
5. Welche(r) Ansätze (supercoiled Plasmid, linearisiertes Plasmid, in mehrere Fragmente
gespaltenes Plasmid) eignen sich am besten für die Größenbestimmung und welche(r)
eignen sich nicht? Begründung
6. Erstellen Sie eine ungefähre Restriktionskarte Ihres Plasmids, indem Sie die Schnittstellen
der verwendeten Restriktionsenzyme und ihren ungefähren Abstand (in bp) zueinander in
einen Plasmid-Zirkel eintragen. Erklären/begründen Sie Ihre Restriktionskarte an Hand der
Restriktionsspaltungen. Ein Plasmid-Zirkel mit den Resriktionsschnittstellen alleine genügt
nicht. Sie müssen begründen, warum Sie die Schnittstellen so angeordnet haben.
Sollte Ihr Agarosegel, Ihre DNA-Präparation oder Ihre Spaltung nicht auswertbar sein, verwenden
Sie die Musterlösung (online) zur Beantwortung der Fragen.
Dokumentieren Sie aber in jedem Fall Ihr Gel (Bild einkleben) und begründen Sie kurz, warum Sie
die Musterlösung für die Auswertung benutzen.

4. Transformation von Bakterien
Versuchsauswertung:
57
1. Zählen Sie die Kolonien pro Platte und notieren Sie die Werte. Bilden Sie den Mittelwert für
die einzelnen Verdünnungen und für alle Platten.
2. Berechnen Sie die Transformationseffizienz (Transformanden pro µg DNA) und tragen Sie
den Wert in die Tabelle ein.
3. Notieren Sie die Plasmid-Daten und Transformationseffizienzen aller Gruppen und erfassen
Sie die Werte in der Tabelle. Berechnen Sie den Mittelwert aller Transformationseffizienzen
für die beiden Plasmide.
4. Gibt es signifikante Unterschiede in den Transformationseffizienzen bezogen auf die Gruppen
(Vergleich verschiedener Gruppen mit identischem Plasmid).
5. Gibt es signifikante Unterschiede in den Transformationseffizienzen bezogen auf die Plasmide
(Vergleich der Mittelwerte der Transformationseffizienz für die verschiedenen Plasmide)?
6. Wenn ja, diskutieren Sie mögliche Ursachen.
Auswertungstabelle Bakterien-Transformation:
Gruppe
Mittel-
wert
Plasmid pGEX Plasmid pET-ACID
Transformationseffizienz =
Kolonien pro µg DNA
Gruppe
Mittel-
wert
Transformationseffizienz =
Kolonien pro µg DNA

5. Polymerase Chain Reaction – PCR
58
5a) Optimierung von PCR Reaktionen:
Gel-Dokumentation:
Kleben Sie das Bild Ihres Agarosegels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!
1. Wie groß ist das amplifizierte Fragment?
2. Vergleichen Sie die Amplifkation mit 1 mM MgCl2 und 3 mM MgCl2 über den
Temperaturgradienten.
Wo ist jeweils das Temperaturoptimum?
Gibt es Unterschiede in der Effizienz und Ausbeute?
5b) Amplifikation eines DNA Fragment von Hefe-DNA
Gel-Dokumentation:
Kleben Sie das Bild Ihres Agarosegels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!
Versuchsauswertung:
1. Bestimmen Sie die Größe des amplifizierten DNA-Fragments
2. Vergleichen Sie die Ergebnisse der verschiedenen Gruppen
Sind die PCR Ansätze identisch/ähnlich?
3. Was sehen Sie in den verschiedenen Kontrollansätzen?
Falls in den Kontrollansätzen Banden zu sehen sind: Worauf sind diese Amplifikate
zurückzuführen?

Musterlösungen – nur verwenden wenn wirklich notwendig!
59
Genomische DNA aus Hefe: Das Bild entspricht nicht dem Auftrag im Script, siehe Beschriftung
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1. Marker
2. leer
3. genomische DNA Hefe ohne RNase
4. genomische DNA Hefe ohne RNase
5. genomische DNA Hefe mit RNase
6. genomische DNA Hefe mit RNase
7. genomische DNA Hefe HaeIII Spaltung
8. genomische DNA Hefe EcoRI Spaltung
9. genomische DNA Hefe HaeIII Spaltung
10. genomische DNA Hefe EcoRI Spaltung
11. Marker

Genomische DNA aus Gewebe: Das Bild entspricht nicht dem Auftrag im Script, siehe
Beschriftung
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
60
1. Marker
2. genomische DNA Gewebe ohne RNase
3. genomische DNA Gewebe mit RNase
4. genomische DNA Gewebe HaeIII Spaltung
5. genomische DNA Gewebe EcoRI Spaltung
6. genomische DNA Gewebe ohne RNase
7. genomische DNA Gewebe mit RNase
8. genomische DNA Gewebe HaeIII Spaltung
9. genomische DNA Gewebe EcoRI Spaltung
10. Marker

Plasmidisolierung:
Restriktionskartierung:
61
Spur 1: Marker
Spur 2: Plasmid 9, alkalische Lyse
Spur 3: Plasmid 12, alkalische Lyse
Spur 4: Plasmid 16, alkalische Lyse
Spur 5: Plasmid 26, alkalische Lyse
Spur 6: Plasmid 9, Boiling
Spur 7: Plasmid 12, Boiling
Spur 8: Plasmid 16, Boiling
Spur 9: Plasmid 26, Boiling
Spur 10: Kontroll-DNA, 500 ng
Spur 11: Kontroll-DNA, 1000 ng
Spur 12: Marker
Plasmid 9, ca. 4.300 bp Plasmid 12, ca. 4.500 bp
Plasmid 16, ca. 4.500 bp Plasmid 26, ca. 5.000 bp
Auftrag entsprechend der Vorschrift im Script

PCR mit genomischer Hefe-DNA
1 2 3 4 5 6 7
1. Marker
2. Vollständiger PCR Ansatz
3. Vollständiger PCR Ansatz
4. Vollständiger PCR Ansatz
5. PCR Ansatz ohne genomische DNA
6. PCR Ansatz ohne forward Primer
7. PCR Ansatz ohne reverse Primer
62

Protokoll von:
Name:
Vorname:
Matrikelnummer:
und
Name:
Vorname:
Matrikelnummer:
Thema: Protein-Analytik
Zeitraum:
Betreuer:
63
Protokoll zum Grundpraktikum

Protokoll zum Grundpraktikum Biochemie – Woche Protein -Analytik
64
Bitte schreiben sie 1 1/2 zeilig mit Schriftgröße 11 – 12 Punkt!
Achtung: Bitte schreiben Sie zu folgenden Themen jeweils maximal 1 1/2 Seiten „Einleitung“.
Diese Einleitung soll zum Versuch hinführen und gegebenenfalls kurz zusammenfassen,
was sie mit welcher Zielsetzung gemacht haben.
Maximal 1 1/2 Seiten ist wörtlich gemeint, wir werden nicht mehr korrigieren – bzw.
nach 1 1/2 Seiten aufhören zu lesen.
1. Berechnungen
Themen:
5. Induzierte Genexpression
6. Reinigung der Taq-Polymerase
7. Ionenaustauschchromatographie
Berechnung der Pufferherstellung:
Endkonzentration eingesetzt: ml Stocklösung / g Feststoff:
10 ml 10 % APS:
10 % (w/v) APS
500 ml 10 % Essigsäure:
10 % (v/v) Essigsäure
200 ml Coomassie-Färbelösung:
0,1% (w/v) Coomassie Brillant BlauR
45 % (v/v) Ethanol
10 % (v/v) Essigsäure
200 ml 10 x SDS-Laufpuffer:
1,92 M Glycin
250 mM Tris
1 % (w/v) SDS
10 ml Lysozym-Aufschluss-Puffer:
50 mM Tris, pH 8,0
150 mM NaCl
20 ml Bindungspuffer Ni 2+ -NTA:
50 mM Tris pH 8,0
500 mM NaCl
5 mM β-Mercaptoethanol

0,01% (v/v) Triton
10 ml Waschpuffer Ni 2+ -NTA:
50 mM Tris pH 8,0
100 mM NaCl
5 mM β-Mercaptoethanol
1 % (v/v) Triton
10 ml Elutionspuffer Ni 2+ -NTA:
50 mM Tris pH 8,0
500 mM NaCl
5 mM β-Mercaptoethanol
0,01% (v/v) Triton
200 mM Imidazol, pH 8,0
3 L Lagerungspuffer Ni 2+ -NTA:
50 mM Tris pH 8,0
100 mM NaCl
5 mM β-Mercaptoethanol
50 % (v/v) Glycerin
65

Berechnung der Gelherstellung:
Trenngel 10 %:
Trenngel 15 %:
Sammelgel:
Substanz
Acrylamid-Lösung
30+0,8
66
Konzentration im
Gel
10 % 30 %
Tris HCl pH 8,8 0,38 mol/l 1 mol/l
dd H2O - -
APS 0,1 % 10 %
SDS 0,1 % 10 %
TEMED 0,1 % 100 %
Substanz
Acrylamid-Lösung
30+0,8
Konzentration im
Gel
15 % 30 %
Tris HCl pH 8,8 0,38 mol/l 1 mol/l
dd H2O - -
APS 0,1 % 10 %
SDS 0,1 % 10 %
TEMED 0,1 % 100 %
Substanz
Acrylamid-Lösung
30 + 0,8
Konzentration im
Gel
5 % 30 %
Tris HCl pH 6,8 0,15 mol/l 1 mol/l
dd H2O - -
APS 0,13 % 10 %
SDS 0,1 % 10 %
TEMED 0,1 % 100 %
Stammlösung Pro 10 ml
Stammlösung Pro 10 ml
Stammlösung Pro 5 ml

2. Reinigung der Taq-Polymerase
Gel-Dokumentation:
Kleben Sie das Bild Ihres PAA-Gels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!
Wenn sie sich unsicher sind, fragen Sie was unter exakter Beschriftung zu verstehen ist!
Versuchsauswertung
67
1. Messen Sie die Laufstrecke der einzelnen Markerbanden aus und tragen Sie sie in eine
Tabelle mit den Größen in kDa ein. Berechnen Sie den dekadischen Logarithmus der Größe
in kDa und tragen diese Werte ebenfalls in die Tabelle ein.
2. Tragen Sie die Laufstrecke gegen den dekadischen Logarithmus der Größe in kDa in ein
Diagramm auf Millimeterpapier ein (alternativ Erstellen einer Exel Tabelle und Exel
Grafik); erstellen Sie eine Eichkurve.
Falls Sie Exel verwenden: Achten Sie darauf, dass die vom Programm erstellte
Ausgleichsgrade „sinnvoll“ ist!
3. Identifizieren Sie die gereinigte Taq-Polymerase, messen Sie die Laufstrecke des Proteins
aus und bestimmen seine Größe aus der Eichkurve;
4. Das Molekulargewicht der Taq beträgt 94 kDa. Stimmt Ihre Größenbestimmung damit
überein? Wenn nein, woran könnte das liegen?
5. Schätzen Sie durch Vergleich mit der BSA-Bande die Menge an gereinigter Taq. Führen Sie
die Abschätzung für alle drei Fraktionen einzeln durch, Berechnen Sie die Menge an
gereinigter Taq in den einzelnen Fraktionen (µg/µl) und geben Sie die Gesamtausbeute an
Taq an.
6. Beurteilen Sie qualitativ aus dem SDS-Gel den Verlauf der Reinigung. Auf welcher Stufe
wird der größte Reinigungseffekt erreicht?

3. Induzierte Genexpression
Gel-Dokumentation:
Kleben Sie das Bild Ihres PAA-Gels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!
Versuchsauswertung
68
1. Messen Sie die Laufstrecke der einzelnen Markerbanden aus und tragen Sie sie in eine
Tabelle mit den Größen in kDa ein. Berechnen Sie den dekadischen Logarithmus der Größe
in kDa und tragen diese Werte ebenfalls in die Tabelle ein.
2. Tragen Sie die Laufstrecke gegen den dekadischen Logarithmus der Größe in kDa in ein
Diagramm auf Millimeterpapier ein (alternativ Erstellen einer Exel Tabelle und Exel
Grafik); erstellen Sie eine Eichkurve.
Falls Sie Exel verwenden: Achten Sie darauf, dass die vom Programm erstellte
Ausgleichsgrade „sinnvoll“ ist
3. Identifizieren Sie das induzierten Protein, messen Sie seine Laufstrecke aus und bestimmen
aus der Eichkurve seine Größe
4. In welchem Bakterienstamm ist Ihr Protein induzierbar? Wird Ihr Protein durch die
bakterielle oder die T7-RNA Polymerase exprimiert?
5. Wie gut ist die Regulation/Induzierbarkeit des Expressionssystems in den beiden
verschiedenen Bakterienstämmen?

4. Ionenaustauschchromatographie
1. Welche Bedingungen haben Sie zum Testen der SP-Sepharose bzw. der Q-Sepharose
gewählt? Fassen Sie Ihre Planung kurz zusammen.
69
2. Welche Reinigungsergebnisse haben Sie mit diesen Bedingungen jeweils erreicht?
(Messungen der Absorption und/oder Beobachtungen unter der UV-Lampe) Beschreiben Sie
kurz die Ergebnisse anhand der Tabellen / Aufzeichnungen (Original Daten anhängen).
3. Welche Bedingungen haben sie für die Quantitative Reinigung verwendet?
4. Erstellen Sie eine Eichgerade für die Proteinbestimmung (µg Protein gegen Extinktion auftragen,
Tabelle der Messwerte und BSA Konzentrationen);
5. Erstellen Sie eine Tabelle mit den Messwerten der Absorption, Bradford-Messung und
Proteinkonzentration der einzelnen Fraktionen Ihrer quantitativen Reinigung.
6. Berechnen Sie die spezifische und gesamt GFP Menge in Ihrem Auftrag (Rohextrakt nach
Verdünnung) und Ihren Elutionsfraktionen. Wie effizient war die Reinigung über den
gewählten Ionenaustauscher?
7. Falls Sie Ihre Elutionsfraktionen über die Ni 2+ -NTA Säule weiter gereinigt haben:
Erstellen Sie eine Tabelle mit den Messwerten der Absorption, Bradford-Messung und
Proteinkonzentration der einzelnen Fraktionen Ihrer quantitativen Reinigung.
Berechnen Sie die spezifische und gesamt GFP Menge in Ihrem Auftrag (Rohextrakt nach
Verdünnung) und Ihren Elutionsfraktionen.
Wie effizient war die Ni 2+ -NTA Reinigung im Vergleich zum Ionenaustauscher?

70
Ionenaustauschchromatographie – Reinigung GFP „Testläufe“:
Geben Sie in den Tabellen an welches Säulenmaterial Sie testen, welchen pH-Wert und welche Salzkonzentration Sie für den Testlauf gewählt
haben, wie stark Sie Ihren Rohextrakt verdünnt haben um diese Bedingungen einzustellen und welche pH-Werte und Salzkonzentrationen Sie für
die Elutionen gewählt haben. Fangen Sie die einzelnen Fraktionen getrennt in Eppis auf und testen Sie die Fluoreszenz entweder an der UV-
Lampe (keine, schwach, stark, sehr stark) oder messen Sie die Absorption am Photometer. Führen Sie mindestens zwei Testläufe durch, ob mit
demselben Säulenmaterial bei unterschiedlichen Bedingungen oder mit beiden Säulenmaterialien je einen können Sie selber entscheiden.
Tabellen als Rohdaten vom Betreuer/in abzeichnen lassen!
Testlauf 1:
Säulenmaterial: pH-Wert: Salzkonzentration: Verdünnung Rohextrakt:
Fluoreszenz im Durchlauf: Fluoreszenz in W1 W2 W3 W4 W5
Konzentration Elutionen: pH E1:
Salz
E2:
E3:
E4:
E5:
Fluoreszenz in E1: E2: E3: E4: E5:
Testlauf 2:
Säulenmaterial: pH-Wert: Salzkonzentration: Verdünnung Rohextrakt:
Fluoreszenz im Durchlauf: Fluoreszenz in W1 W2 W3 W4 W5
Konzentration Elutionen: pH E1:
Salz
E2:
E3:
E4:
E5:
Fluoreszenz in E1: E2: E3: E4: E5:
Ionenaustauschchromatographie – Reinigung GFP „Quantitative Reinigung“:

Auftrag
Säulenmaterial: pH-Wert: Salzkonzentration:
Verdünnung Rohextrakt: Aufgetragenes Volumen: OD395 Säulenauftrag:
Absorption 395 nm
Proteinkonzentration
pH-Wert:
Salzkonzentration:
Absorption 395 nm
Proteinkonzentration
Durchlauf Wasch 1 Wasch 2 Wasch3 Wasch4 Wasch 5
Elution1 Elution2 Elution3 Elution4 Elution5 Elution6
71

Musterlösung Induzierte Genexpression:
72
Induktion pET-ACID – Auftrag entsprechend Script
Induktion pGEX – Auftrag entsprechend Script

Reinigung Taq-Polymerase:
Auftrag entsprechend Skript;
Spur 3 und 4 enthalten zu wenig Protein um sinnvoll ausgewertet werden zu können.
73