Tierärztliche Hochschule Hannover - Stiftung Tierärztliche ...

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung zur Verbesserung der Kryokonservierbarkeit
von Bullensperma durch den Zusatz von Liposomen
zum Verdünner
INAUGURAL − DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Torleif Röpke
Karlsruhe
Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein
Klinik für Rinder
Prof. Willem F. Wolkers, PhD
Institut für Mehrphasenprozesse
Leibniz Universität Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein
2. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. Dagmar Waberski
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2011
PhD Harriette Oldenhof
Reproduktionsmedizinische Einheit der
Kliniken
Gefördert durch den Förderverein Biotechnologieforschung e.V., Bonn, Deutschland
Eine Arbeit aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen

Meinen Eltern
in Liebe und Dankbarkeit
gewidmet

INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ............................................................................ 11
2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................ 12
2.1 Kryokonservierung ................................................................................... 12
2.2 Plasmamembran des Spermiums ............................................................ 14
2.3 Schäden durch Kryokonservierung .......................................................... 16
2.4 Kryoprotektiva und Äquilibrierungszeit ..................................................... 18
2.5 Liposomen als kryoprotektive Substanz ................................................... 19
3 MATERIAL UND METHODEN ................................................. 24
3.1 Bullen und Versuchssperma ..................................................................... 24
3.1.1 Versuchstiere ........................................................................................... 24
3.1.2 Spermagewinnung ................................................................................... 24
3.1.3 Spermabeurteilung ................................................................................... 25
3.2 Kryokonservierung ................................................................................... 25
3.2.1 Verdünnung mit einem auf TRIS basierenden Verdünner unter Zusatz
von Hühnereigelb oder Liposomen ........................................................... 25
3.2.2 Konfektionierung und Einfriervorgang ...................................................... 29
3.2.3 Herstellung von geklärtem Eigelb ............................................................. 30
3.2.4 Herstellung von Liposomen ...................................................................... 30
3.3 Untersuchungsmethoden zur Beurteilung der Spermaqualität ................. 35
3.3.1 Computergestützte Motilitätsanalyse ........................................................ 35
3.3.2 Durchflusszytometrische Beurteilung der Integrität der Plasmamembran
und des Akrosoms .................................................................................... 36
3.4 Versuchsansätze ...................................................................................... 37
3.4.1 Effekte von EPC Liposomen auf die Spermaqualität vor und nach dem
Tiefgefrieren ............................................................................................. 37
3.4.2 Effekte von Liposomen aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kopfgruppen auf die Spermaqualität ................................... 38

INHALTSVERZEICHNIS
3.4.3 Effekte synthetischer Liposomen aus gesättigten Fettsäuren auf die
Spermaqualität. ........................................................................................ 39
3.4.4 Statistische Auswertung ........................................................................... 40
4 ERGEBNISSE .......................................................................... 41
4.1 Effekte unterschiedlicher Konzentrationen von EPC Liposomen und
Äquilibrierungszeiten auf die Spermaqualität ........................................... 41
4.2 Effekte von Liposomen aus EPC und Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kopfgruppen auf die Spermaqualität ........................................................ 44
4.3 Effekte synthetischer Liposomen auf die Spermaqualität ......................... 46
4.3.1 Liposomen aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kopfgruppen ............................................................................................. 46
4.3.2 Liposomen aus gesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kohlenstoffkettenlängen ........................................................................... 48
5 DISKUSSION ........................................................................... 50
5.1 Schlussfolgerung ...................................................................................... 54
6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................... 55
7 SUMMARY ............................................................................... 57
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................. 59
9 TABELLENVERZEICHNIS ...................................................... 63
10 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................... 64
11 ANHANG .................................................................................. 79
11.1 Extrusions-Technik ................................................................................... 79
11.2 Zusammensetzung der Kontroll- und Liposomenansätze ......................... 81

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
a. d. an der
ADR Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter
AR Akrosomreaktion
BSA bovine serum albumin
BSP bovine seminal plasma
bzw. beziehungsweise
C Kohlenstoff
CASA computer assisted semen analysis
CMA cell motion analysis
°C Grad Celsius
DLPC 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin
DLS dynamic light scattering
DMPC 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin
DOPA 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphat
DOPC 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin
DOPE 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin
DOPG 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-(1’-rac-glycerol)
DOPS 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin
DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin
DSPC 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin
DX DL, DM, DP oder DS
e. V. eingetragener Verein
EY egg yolk
EPC Egg-Phosphatidylcholin
et al. et alii
Fa. Firma
FITC Fluoreszein-Isothiocyanat
FL Fluoreszenzkanal
g Gramm

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
× g Erdbeschleunigung
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GLY Glycerin
h Stunde
KV künstliche Vagina
LDF low density lipoprotein Fraktion
LMV large multilamellar vesicles
LUV large unilamellar vesicles
mg Milligramm
Min. Minute
Mio. Million
ml Milliliter
mM mmol/l
mol Mol
MW molecular weight
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
nm Nanometer
od. oder
p Signifikanzniveau
PC Phosphatidylcholin
PG Phosphatidylglycerol
PI Propidiumiodid
PMAI Plasmamembran und Akrosom intakt
PNA Peanut Agglutinin
PMOT Progressive Motilität
PS Phosphatidylserin
PX PC, PS, PG oder PE
ROS reactive oxygen species
RT Raumtemperatur

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
s Sekunde
SPF spezifisch pathogen frei
SUV small unilamellar vesicles
TG Tiefgefrierung
Tm
phase-transition-temperature
TRIS Tris-hydroxymethyl-aminomethan
USA United States of America
z.B. zum Beispiel
% Prozent

1 EINLEITUNG
EINLEITUNG
Seit der Entdeckung von Eigelb als schützenden Zusatz bei der Kryokonservierung
von Spermatozoen wird es bei zahlreichen Spezies angewendet [1,2,3]. Jedoch birgt
der bis heute erfolgreich eingesetzte Eigelbverdünner ein Kontaminationsrisiko [4] in
sich und variiert zudem in der Zusammensetzung [5]. Es besteht daher der Wunsch,
Eigelb im Tiefgefriermedium für Spermien durch definierte Komponenten zu
ersetzen. Untersuchungen des Lipid- und Lipoproteinanteils im Eigelb deuten darauf
hin, dass besonders der Phospholipidanteil diesen Schutz der Spermien während der
Abkühlung ermöglicht [6,7].
Membranen werden als der wichtigste Ort von Gefrierschädigungen angesehen [8].
Während des Kälteschocks entlassen Spermienmembranen Phospholipide in das
umgebende Medium. Darüber hinaus werden Membranschäden während des
Kälteschocks in Verbindung mit einer Phasenseparation von Lipiden gebracht, da
diese die Spermienmembran vorübergehend permeabel werden lässt [9,10,11]. Es
wird vermutet, dass Strategien zur Membranmodifikation, wie die Inkubation von
Spermien mit Eigelb oder Liposomen, entweder zum Anstieg oder Abfall der Kryostabilität
von Zellen führen können. Der stabilisierende Effekt von Liposomen beim
Tiefgefrieren und Auftauen von Zellen wurde zuerst bei Spermien entdeckt [7,12].
Seit wenigen Jahren werden Liposomen auch zur Konservierung von Erythrozyten
mittels Tiefgefrierung [13] und Gefriertrocknung [14] eingesetzt.
In dieser Studie wurde die Wirkung von verschiedenen Sorten unilamellarer Liposomen
auf die Qualität von bovinen Spermatozoen vor und nach der Kryokonservierung
untersucht und mit denen von Eigelb verglichen.
11

2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Kryokonservierung
LITERATURÜBERSICHT
Das Tiefgefrieren von Bullensperma ist ein in der Literatur umfangreich dargelegtes
Gebiet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll nur auf einige wichtige Aspekte zu
dieser Thematik hingewiesen werden.
Die Grundlage für die Langzeitkonservierung und deren weltweiter züchterischer
Einsatzmöglichkeit wurde mit der Entdeckung des Glycerins als potentiellem Kryoprotektivum
bereits 1949 durch Polge et al. [15] gelegt. An Geflügelsperma
beobachteten diese Autoren, dass die Zellen das Einfrieren durch Glycerinzugabe
bei sehr tiefen Temperaturen überstanden und ihre Motilität erhalten blieb. Im Jahre
1953 entwickelten Polge und Rowson [16,17] eine praxisreife Methode zum
Einfrieren von Bullensperma bei einer Temperatur von -79 °C. Diese Methode galt
viele Jahre als Standardverfahren. Die heute in Europa angewendeten Tiefgefrierverdünner
enthalten als wichtigste Substanzen meist TRIS-Puffer, Glycerin und
Eigelb oder Milch.
Obwohl Eigelb seit mehr als 60 Jahren als Kryoprotektivum angewendet wird, ist
dessen exakte Schutzwirkung noch nicht ganz geklärt. Die „low density lipoprotein“
Fraktion (LDF) im Eigelb scheint eine Schutzfunktion während des Kälteschocks und
der Tiefgefrierung auszuüben. Eine Hypothese ist, dass LDF den Verlust von Phospholipiden
aus der Zellmembran weitestgehend verhindert und somit die Toleranz
gegenüber dem Kälteschock zunimmt. Manjunath et al. [18] beschreiben die
Interaktion zwischen LDF und BSP (bovine seminal plasma) - Proteinen des Seminalplasmas
(BSP-A1/-A2, BSP-A3 und BSP-30-kDa) als eine schnelle, spezifische
und stabile Bindung, die auch während des Auftauprozesses beibehalten wird. Die
Interaktion von BSP-Proteinen mit der LDF des Eigelbs soll deren Bindung an die
Spermienoberfläche und so die Stimulation eines Cholesterin- und Phospholipideffluxes
verhindern [19]. BSP-Proteine würden sonst die Motilität und die Fertilität
negativ beeinflussen [19].
12

LITERATURÜBERSICHT
In der heutigen Zeit zwingen Zuchtfortschritt, weltweiter Handel und Konkurrenzdruck
auf nationaler und internationaler Ebene von Eigelb als Kryoprotektivum abzurücken,
hin zu einem neuen Verdünner mit definierter chemischer Zusammensetzung und
ohne Inhaltsstoffe tierischer Herkunft. Das Risiko einer Kontamination des Eidotters
mit Bakterien und Mykoplasmen oder anderen Pathogenen ist unbestreitbar [4,20].
Gerade die seuchenhygienischen Aspekte spielen im internationalen Geschäft der
Besamungsstationen - dem Im- und Export von Samenportionen - eine übergeordnete
Rolle. Aus diesem Grund sind sie ein wichtiges Argument für den Austausch
tierischer Eiweiße gegen Komponenten nicht tierischer Herkunft im Verdünnermedium
[20]. Bousseau et al. [20] konnten in einer Studie nachweisen, dass im
Eigelb immer eine gewisse bakterielle Kontamination vorhanden ist. Eigelb aus
spezifisch pathogen freien (SPF) Hühnereiern birgt ein geringeres Kontaminationsrisiko.
Die vollständige Beseitigung der Keimbelastung durch Zugabe von
Antibiotika ist bei praxisüblichen Konzentrationen an antibakteriellen Zusätzen
(Gentamycin 250 μg/ml, Tylosin 50 μg/ml, Lincomycin 150 μg/ml und Spectinomycin
300 μg/ml) im eigelbhaltigen Verdünner Triladyl (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland)
nicht möglich [20].
Vor einigen Jahren wurde begonnen, Eidotter durch steriles Soja-Lecithin zu ersetzen.
Die Gefahr einer mikrobiellen Kontamination des Verdünners wurde damit
gesenkt. Vergleichende Studien an aufgetauten Spermaproben von Split-Ejakulaten
zwischen Verdünner mit Soja-Lecithin bzw. Eigelb wiesen keine signifikanten
Unterschiede im Anteil lebender Zellen, im akrosomalen Status und in der Motilität
auf [21].
Ein weiteres Argument gegen die Anwendung von Eigelb ist die starke Variabilität in
dessen Zusammensetzung, was schließlich zu erheblichen Schwierigkeiten in der
Standardisierung der Tiefgefrierkonservierung führt [22].
13

2.2 Plasmamembran des Spermiums
LITERATURÜBERSICHT
Ein kurzer Überblick über Aufbau und Funktion der Plasmamembran von Spermien
soll zum besseren Verständnis der vorliegenden Studie beitragen. Die Plasmamembran
umhüllt die Samenzelle vollständig und hält Organellen und intrazelluläre
Bestandteile zusammen [23]. Der Membranaufbau zeigt das typische Bauprinzip von
Biomembranen (Abb. 2.1): eine Lipiddoppelschicht mit darin eingelagerten Cholesterinmolekülen,
Proteinen, Glykolipiden und anderen integralen und assoziierten
Makromolekülen [24].
Abb. 2.1: Schemazeichnung einer Lipidmembran. Proteine und Zucker bewegen
sich innerhalb der fluiden Lipiddoppelschicht.
(Bildquelle: www.unitus.it/scienze/corsonew/lezione11.html)
Unterschiede zu Plasmamembranen anderer somatischer Zellen bestehen in dem
höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren und dem höheren Cholesteringehalt,
durch den die Fluidität besonders im Kopfbereich herabgesetzt wird [25]. Der
Befruchtungserfolg hängt wesentlich von der Fluidität der Plasmamembran ab und
wird von dem Gehalt an verschiedenen Fettsäuren beeinflusst [26]. Die vorherrschenden
Phospholipide in bovinen Spermien sind Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin,
Cholinplasmalogen, Ethanolaminplasmalogen, Phosphatidylserin,
Sphingomyelin und Cardiolipin [27]. Der Lipidaufbau und die Fluidität der Membran
14

LITERATURÜBERSICHT
ändern sich während des Reifungsprozesses der Samenzelle. Durch die wenigen
verbleibenden Zellorganellen und den Abschluss der DNA Transkription im reifen
Spermium ist eine Neusynthese von Plasmamembranbausteinen unmöglich [28].
Plasmamembranschädigungen führen zu einem irreversiblen Verlust von Motilität
und Fertilität der Samenzelle [29].
Die physikalischen Eigenschaften biologischer Membranen werden durch Lipidzusammensetzung,
Temperatur und anderen Einflüssen von außen bestimmt. Bei
der Phasenübergangstemperatur wechseln die Membranlipide von der hochstrukturierten
Gelphase in die ungeordnete flüssigkristalline Phase und umgekehrt. Innerhalb
des physiologischen Temperaturbereichs befindet sich die Lipid-Doppelschicht
in der lamellar-flüssigkristallinen Struktur, dem Normalzustand der biologischen
Membran. Bei niedrigen Temperaturen wechselt dieser Zustand in die starre
Gelphase, in welcher die Fettsäureketten exakt geordnet vorliegen und so die
zytoplasmatischen Prozesse beeinflussen. Die Phasenübergangstemperatur (Tm) ist
für jede Lipidsorte charakteristisch. Die Lipidzusammensetzung der Membran ist
stark an Ausmaß und Art der durch Kryokonservierung bedingten Schädigung
beteiligt [30]. So wird z.B. die Phasenübergangstemperatur durch kurzkettige und
ungesättigte Lipide herabgesetzt und steigt bei längeren Kohlenstoffketten an. In der
Zellmembran, einem Gemisch aus Lipiden, Sterinen und Proteinen, bedeutet dies ein
sehr komplexes Phasenübergangsverhalten der Membran. Spermien verschiedener
Tierarten mit vergleichbarer Resistenz gegenüber dem Kälteschock besitzen
Membranen, die sich in der Lipidzusammensetzung, dem Cholesterin/Phospholipid-
Verhältnis, sowie Länge und Sättigungsgrad der Kohlenstoffketten ähneln [27]. So
sind es vor allem „rohe“, unbearbeitete Lipide im Eigelb die mit der Spermienmembran
interagieren [31].
15

LITERATURÜBERSICHT
2.3 Schäden durch Kryokonservierung
Der Prozess der Kryokonservierung stellt eine extreme Belastung der Plasmamembran
der Spermien dar [32,33]. Die Zellen werden dem Kälteschock, der Eiskristallbildung
und der zellulären Dehydratation ausgesetzt. Bereits bei einer Abkühlung auf
+15 °C finden an der Zelle Veränderungen statt, die sich bis zu einer Temperatur von
-4 °C intensivieren. Die Kälteschocksensibilität der Spermien ist tierartlich, aber auch
inter- und intraindividuell unterschiedlich. Membran- und Akrosomenschädigungen
sowie ein Abfall der Motilität sind charakteristische Phänomene [3].
Während des Abkühl- und Gefrierprozesses findet eine temperaturabhängige,
sogenannte thermotrope, und durch Dehydratation verursachte, sogenannte
lyotrope, Phasenverschiebung innerhalb der Plasmamembran statt. Dabei gehen
Phospholipide der Membran vom Flüssig- in den Gelzustand über. Art und Ausmaß
dieser Phasenübergänge werden von der molekularen Membranzusammensetzung
vorgegeben. Sie ist mitverantwortlich für die unterschiedliche Abkühlempfindlichkeit
bei den verschiedenen Tierarten [34]. Folgen dieses Geschehens sind eine laterale
Phasenseparation von Membrankomponenten und eine erhöhte Membranpermeabilität
[8,9]. Die Kühlung verändert somit den Phasenstatus und die strukturelle
Organisation von Membrankomponenten, was zu einer Verschmelzung von Lipid
Rafts in der Membran führt. Bei der Tiefgefrierung kommt es aufgrund der
Freisetzung gebundenen Wassers um die Kopfgruppe der Phospholipide zu hohen
kooperativen flüssig-zu-Gel-Phasenübergängen in Zellmembranen [35,36].
Sobald eine Lösung unter ihren Gefrierpunkt abgekühlt wird, entstehen Eiskristalle.
Nach Mazur [37] setzt die Eiskristallbildung im Außenmedium spontan oder induziert
zwischen -5 °C und -10 °C ein. Im Gegensatz dazu gefriert die intrazelluläre Flüssigkeit
bei diesen Temperaturen noch nicht. Die gelösten Elektrolyte verbleiben in den
ungefrorenen extrazellulären Bereichen, der osmotische Druck nimmt bei Abnahme
der Temperatur und Schrumpfung dieser Bereiche weiter zu und induziert einen
Zellstress [38]. Dies führt zu einem höheren chemischen Potential im verbleibenden
intrazellulären Wasser im Gegensatz zum extrazellulären Wasser. Es entsteht ein
Konzentrationsgefälle, das durch entsprechenden Wasseraustritt aus der Zelle
kompensiert werden muss, um das Gleichgewicht wieder herzustellen [39]. Die
16

LITERATURÜBERSICHT
Abkühlgeschwindigkeit spielt bei der Art der Schädigung eine wichtige Rolle [40]. Bei
der langsamen Abkühlung - hier herrscht die Dehydratisierung vor - kommt es durch
osmotischen Stress infolge von Lösungseffekten zur Schädigung [41], während bei
schnellen Abkühlraten die intrazelluläre Eiskristallbildung hauptverantwortlich für den
schädigenden Zellstress und schließlich den Tod der Zelle ist. Das Abkühlen der
Spermasuspension bis wenige Grade unter ihren Gefrierpunkt vor der Eiskristallbildung
wird als „Supercooling“ bezeichnet [42]. Bei der Entstehung von Eiskristallen
wird überschüssige Energie in Form von Wärme abgegeben. Diese ist
zellschädigend. Pribor [43] erkannte bei seiner Studie an Erythrozyten die zentrale
Bedeutung von Abkühl- und Auftaugeschwindigkeiten für das Überleben der Zellen.
Reaktive Sauerstoffradikale (reactive oxygen species = ROS) werden während des
Einfrier- und Auftauvorgangs bei der Kryokonservierung von den Spermien produziert
[44], wobei gleichzeitig der Gehalt an Antioxidantien in den Spermien
abnimmt [45]. Antioxidative Abwehrmechanismen arbeiten bei niedrigen Temperaturen
nicht, was eine Anreicherung der ROS während des Tiefgefrierens zur Folge
hat. ROS, die ein oder mehrere ungebundene Elektronen besitzen, führen in Zellmembranen
zur Lipidperoxidation und einer Esterspaltung bei Phospholipiden [46].
Diese Vorgänge bewirken ein Absinken der Membranintegrität. Superoxidanionen,
Hydrogenperoxide, Peroxylradikale und Hydroxylradikale gehören zu den ROS [47].
Um ihre Elektronenhüllen zu stabilisieren, reagieren sie mit den meisten organischen
Substanzen und führen bei diesen zu einer Oxidation oder Reduktion. Durch den
hohen Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren und nur geringen
Konzentrationen von antioxidativen Enzymen im Zytoplasma steigt die Sensibilität
der Plasmamembran für Lipidperoxidationen [46]. Intrazelluläre Antioxidantien
können die Zellmembran, welche das Akrosom und den Spermienschwanz umgibt,
nicht schützen. Hierfür sind nur die Antioxidantien im Seminalplasma geeignet [48].
Folgen der Lipidperoxidation sind die Beeinträchtigung der Motilität [49] und
Schädigung der DNA, sowie der Proteine des Spermiums, was sich negativ auf die
Fertilität auswirkt [50,51].
17

LITERATURÜBERSICHT
2.4 Kryoprotektiva und Äquilibrierungszeit
Die Zugabe von Kryoprotektiva ist für das Überleben der Zellen während der Kryokonservierung
essentiell. Dieser Zusatz zum Verdünner in beinahe molaren Dimensionen
bedeutet substantiellen, transienten Stress für die Samenzelle [52].
Propantriol (Trivialname Glycerin oder Glycerol) ist seit 1949 [15] das Kryoprotektivum
der Wahl für Spermatozoen. Die Schutzwirkung ist auf die Reduktion der
Salzkonzentration zurückzuführen, die beim Einfrierprozess eine intrazelluläre
Kristallisierung und irreversible Membrandenaturierung verhindert [53]. Jedoch sind
Kryoprotektiva vorsichtig einzusetzen, da bei zu geringen Konzentrationen die
Schutzwirkung während des Einfrierprozesses abnimmt und bei zu hohen
Konzentrationen die toxischen Eigenschaften die Fertilität senken. De Leeuw et al.
[54] haben in ihrer Studie unter anderem die Wirkung von Glycerin und membranstabilisierenden
Substanzen (Eigelb, DOPC-, DOPC/DOPA/Cholesterin-Vesikel und
BSA) anhand des prozentualen Anteils intakter Spermien nach dem Auftauen
untersucht. Im Verdünner mit Glycerin und ohne Zusatz von Eigelb wurden 18%
weniger plasmamembranintakte Spermien gemessen als im herkömmlichen
Verdünner mit 20% Eigelbanteil. Der Anteil plasmamembranintakter Zellen war im
glycerinfreien Verdünner mit 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DOPC, 18:1)
Liposomen allein um 16% höher als in Kombination mit 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-
Phosphat (DOPA, 18:1) und Cholesterin, jedoch um 20% niedriger als mit Eigelb.
Eigelb ist der maßgebende zusätzliche Schutz gegen Schäden bei der
Kryokonservierung, für den eine gleichwertige synthetische Alternative gefunden
werden soll.
Im Anschluss an die Verdünnung wird das Sperma vor der Tiefgefrierung einer
sogenannten Äquilibrierung bei 4 bis 5 °C unterzogen. In heute praxisüblichen
Gefrierkonservierungsprotokollen werden Äquilibrierungszeiten von drei bis vier
Stunden angegeben [55]. In der Literatur finden sich Empfehlungen für eine optimale
Äquilibrierungszeit von wenigen Minuten bis zu 18 Stunden [56,57]. In der Studie von
Griga [58] wurde die Spermaqualität nach Äquilibrierungsdauern von einer bis zu 48
Stunden bei 4 °C untersucht. Sie beobachteten signifikant höhere Anteile progressiv
motiler und plasmamembranintakter Spermien nach dem Auftauen bei zunehmender
18

LITERATURÜBERSICHT
Äquilibrierungsdauer. Durch die schnelle Aufnahme von Glycerin in das Spermium
scheint eine längere Lagerzeit bei 4 °C hierbei von untergeordneter Bedeutung zu
sein [54]. Eine längere Äquilibrierungszeit führt nicht in jedem Verdünnermedium zu
einem positiven Effekt auf Motilität, Zell- und Akrosomenmembranintegrität der
aufgetauten Spermien [59]. Die Autoren verglichen drei kommerziellen Verdünnern -
Andromed, Biociphos Plus und Biladyl – hinsichtlich ihrer Kryokonservierungseignung
von bovinen Spermien, wenn diese für 18 Stunden bei 4 °C vor dem
Tiefgefrieren gelagert wurden. Die Verwendung von eigelbbasiertem Biladyl
Verdünner führte zu einem signifikant höheren Anteil an akrosomintakten Spermien
sowie einer längeren Lebensdauer der Spermien im Vergleich zu den beiden
eigelbfreien Verdünnern Andromed und Biociphos Plus.
2.5 Liposomen als kryoprotektive Substanz
Untersuchungen der Lipid- und Lipoproteinanteile des Eigelbs lassen darauf
schließen, dass im Besonderen die Phospholipidfraktion für den Schutz der Spermien
während des Tiefgefrier- und Auftaupozesses sorgt [6,7]. Parks et al. [60]
konnten in ihrer Studie nachweisen, dass Liposomen, die aus Ei-Phosphatidylcholin
(EPC) bestehen, die Spermienzellen während der Kühlung und Lagerung bei 4 °C
und vor dem Kälteschock schützen. Die Zugabe von Cholesterin zum Liposomenverdünner
reduzierte die schützende Wirkung durch EPC. Parks et al. [60] geben für
diese Beobachtung die durch Cholesterin veränderte Fließeigenschaft der EPC
Liposomen und die damit einhergehende Veränderung in der Fusionskompatibilität
mit der Spermienmembran an. Der schützende Effekt von Liposomen beim Einfrieren
und Auftauen von Zellen wurde erstmals bei Spermien festgestellt [12,61]. Im Jahre
1988 wurde ein analoger Effekt bei pflanzlichen Protoplasten nachgewiesen, bei
denen die Fusion von Phosphatidylcholin-Liposomen mit diesen Organellen zu einer
besseren Toleranz gegenüber dem Tiefgefrieren geführt hat [62].
Zwei Hauptgruppen natürlicher Phospholipide erlauben eine industrielle Herstellung
und Anwendung: Glycerophospholipide mit einem Glycerolgerüst und Sphingophospholipide
mit einem Sphingosingerüst. Erstgenannte finden in dieser Arbeit Anwen-
19

LITERATURÜBERSICHT
dung. Ei-Phospholipide sind vermutlich die reichhaltigste Phospholipidquelle in der
Natur (Abb. 2.2). Flüssiger Hühnereidotter beinhaltet 30% Lipide (60% in der
Trockensubstanz), mit etwa 9% Phospholipiden (18% in der Trockensubstanz) [63].
Der Phopholipidanteil im Eidotter setzt sich wie folgt zusammen: 16:0 zu 30%, 18:0
zu 16%, 18:1 zu 29%, 18:2 zu 14%, 18:3 zu 1%, 20:4 zu 5% und andere zu 5% [64].
Aceton
Flüssiger Eidotter
Eigelbpulver
Aceton
20
Trocknung
Entfettetes Eigelbpulver Dotterlipide
Ethanol
Ei-Phospholipide
Ei-Phosphatidylcholin (Egg PC)
Ethanol
Aceton
Abb. 2.2: Prinzip der Herstellung von Phospholipiden aus Eidotter am Beispiel
des Phosphatidylcholins (Egg PC).
Für gewöhnlich hat natürliches Phosphatidylcholin (PC) aus Eidotter eine hydrophillipophile
Ausgewogenheit und eignet sich gut zur Herstellung von künstlichen
Biomembranen. 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC, 16:0) ist ein gut
untersuchtes synthetisches Phospholipid. DPPC liegt bei Temperaturen unter 35 °C
in der gelartigen Form und bei Temperaturen über 41 °C in der flüssigen Form vor.
Bei einer Reduzierung der Kohlenstoffkette auf 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phos-

LITERATURÜBERSICHT
phocholin (DMPC, 14:0) liegt eine Phasenübergangstemperatur (Tm) von 23 °C vor
(Abb. 2.3). 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DSPC, 18:0) hat eine Tm von
55 °C. Das Einfügen einer Doppelbindung in jede der beiden Kohlenstoffketten von
DSPC zur Formung von DOPC hat den gleichen Effekt wie die Kürzung der C-Ketten
um mehr als sechs C-Atome [65] (Abb. 2.3).
Egg-Phosphatidylcholine (EPC)
1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DLPC, 12:0)
1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DMPC, 14:0)
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC, 16:0)
1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DSPC, 18:0)
Abb. 2.3: Schematische Darstellung der Struktur der Lipide EPC, DLPC, DMPC,
DPPC und DSPC. (Bildquelle: www.avantilipids.com)
21

LITERATURÜBERSICHT
Die Lipide als integrale Bestandteile der Membran sind in der Regel ambiphile,
chirale Moleküle bestehend aus einer polaren Kopfgruppe und einer apolaren
Kohlenwasserstoffkette. Die Kopfgruppen sind meist stark hydrophil, während die
Kohlenwasserstoffe der Kette stark hydrophob sind, was so den ambiphilen
Charakter der Lipide begründet. Eine Exposition der Lipide gegenüber Wasser führt
daher, aufgrund des hydrophoben Effekts, zu einer Selbstordnung. Je nach Lipidkonzentration
und Methode der Bearbeitung formen sich unterschiedliche Strukturen.
Eine mögliche Darstellung von Lipid-Doppelschichten sind unilamellare Vesikel.
Zuerst bilden sich große Vesikel, die aus mehreren Lipidschichten (LMV = large
multilamellar vesicles) aufgebaut sind (Abb. 2.4). Kleine einschichtige Vesikel (SUV =
small unilamellar vesicles) lassen sich aus einer wässrigen Lipiddispersion durch
Behandlung mit Ultraschall bilden. Große einschichtige Vesikel (LUV = large
unilamellar vesicles) werden bei der Extrusion durch feinporige Filtermembranen
geformt (Abb. 2.4). Bei diesem Vorgang entstehen Vesikel von exakt definierter
Größe.
LMV
SUV
Abb. 2.4: Schematische Darstellung des Aufbaus unterschiedlicher Vesikel. LMV
= large multilamellar vesicles; LUV = large unilamellar vesicles; SUV =
small unilamellar vesicles. (Bildquelle: www.avantilipids.com)
Graham und Foote [12] untersuchten die Wirkung mittels Ultraschall hergestellter
Liposomen auf die Kryokonservierbarkeit von bovinen Spermien. Dabei setzten sie
22
LUV

LITERATURÜBERSICHT
PC Lipide mit variierenden Kohlenstoffkettenlängen (8, 12, 14, 16, 18 und 20 C-
Atome) und Doppelbindungen (0, 1, 2 oder 3), sowie Phosphatidylserin (PS) und
Cholesterin jeweils allein oder in Kombination ein. Die getrockneten Lipide wurden im
Verdünnermedium durch Wärmebehandlung in Lösung gebracht und im Ultraschallbad
für 5 Minuten mit einem Ultraschall-Desintegrator (Branson Sonifier,
Branson Instruments Co. Stamford, CT) behandelt. Dieser Arbeitsschritt wurde bei
permanenter Zufuhr von Stickstoffdampf durchgeführt. Nach der Ultraschallbehandlung
wurde die Lösung zentrifugiert, der Überstand in ein Reagenzglas
überführt und mit Stickstoff bedampft. Die Liposomen wurden in flüssigem Stickstoff
gelagert und kurz vor der Verwendung bei Raumtemperatur aufgetaut. Phospholipide
mit 8 C-Atomen wirkten bereits kurz nach der Verdünnung letal auf Spermien. Die
Zugabe von PC Liposomen mit unterschiedlichen C-Kettenlängen oder Sättigungsgraden
führte im Vergleich zur Inkubation mit PS Liposomen zu keiner Zunahme des
Anteils motiler Spermien. Im Vergleich zu PS Liposomen allein hatte die Kombination
aus PS und Cholesterin Liposomen einen um 13% höheren Anteil motiler Spermien
nach dem Auftauen zur Folge. Der Anteil motiler Spermien im Verdünner mit
Liposomen aus PS, PC 12 und Cholesterin war im Vergleich zu Eigelb bei der
Kühlung und während des Tiefgefrierens und Auftauens um 1% niedriger. Aus
diesen Ergebnissen folgerten Graham und Foote [12], dass Lipide, welche
theoretisch die Phasenübergangstemperatur der Membran herabsetzen, ein
Überleben der Zellen während der Tiefgefrierung auf -196 °C ermöglichen. Sie
postulierten, dass aufgrund dieser Ergebnisse und der schnellen Wirkung von PS
Liposomen, eine Fusion eher als ein Austausch für die Interaktion zwischen
Plasmamembranen und Liposomen in Frage kommt. Weitere Studien belegen den
schnellen Schutz von Spermien vor dem Kälteschock durch PC Lipide [66,67].
23

MATERIAL UND METHODEN
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Bullen und Versuchssperma
3.1.1 Versuchstiere
Zur Gewinnung des Spermas standen acht Bullen des Besamungsvereins Neustadt
a. d. Aisch e. V. (BVN) zur Verfügung, darunter sieben zuchtwertgeprüfte Bullen und
ein ungeprüfter Bulle der Rasse Deutsches Fleckvieh im Alter zwischen 1,5 und 11
Jahren. Von jedem Bullen wurden vier Ejakulate je Versuch untersucht. Darüber
hinaus wurden neun Ejakulate von fünf Bullen der Klinik für Rinder der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover verwendet. Vier von ihnen gehörten der Rasse
Holstein Frisian an und einer der Rasse Deutsches Fleckvieh. Alle Bullen wurden
zweimal pro Woche zur Spermagewinnung herangezogen.
Die Bullen wurden unter einheitlichen Bedingungen gehalten und gefüttert. Die Tiere
zeigten während der gesamten Versuchsdauer ein ungestörtes Allgemeinbefinden
und wiesen keine Sexualstörungen oder Erkrankungen der Geschlechtsorgane auf.
3.1.2 Spermagewinnung
Die Spermagewinnung wurde aus hygienischen und sicherheitstechnischen Gründen
im Sprungraum durchgeführt. Unterstellbullen und ein Phantom standen für den
Aufsprung zur Verfügung. Erst nach zwei bis drei „Blindsprüngen“ wurde die
Samennahme mithilfe einer künstlichen Vagina (KV), Modell „Neustadt/Aisch“
(Müller, Nürnberg, Deutschland) durchgeführt. Ein spezieller Vaginenraum diente der
Aufbewahrung, Reinigung und Sterilisation der KV. Vor Gebrauch wurden die KV in
einem Brutschrank auf 42 °C vorgewärmt. Die innere Wand der Vagina wurde zur
besseren Stimulation mittels Vaseline gleitfähig gemacht. Das Ejakulat wurde in
einem Einwegkunststoffröhrchen (Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) aufgefangen,
welches über einen Gummitrichter an der KV befestigt war und zur besseren
Wärmeisolation in einem Schutzmantel steckte. Nach dem Ablösen des Röhrchens
24

MATERIAL UND METHODEN
von der KV wurde es durch eine Schleuse in den Laborbereich verbracht und bis zur
weiteren Bearbeitung in ein auf 32 °C eingestelltes Temperiergerät (Kugelbad, Fa.
Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) gestellt.
3.1.3 Spermabeurteilung
Das Sperma wurde makroskopisch auf Farbe, Konsistenz und Beimengungen untersucht.
Zur Versuchsdurchführung wurden nur Ejakulate herangezogen, die frei von
Schmutz, Harn oder Blut waren. Das Ejakulatvolumen wurde bestimmt und der
prozentuale Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien im originären Sperma durch subjektive
Schätzung ermittelt. Dazu diente ein Mikroskop mit beheizbarem Objektträgertisch,
positivem Phasenkontrast und einem Okular sowie einem Objektiv mit
jeweils 10-facher Vergrößerung (Dialux 20, Leitz, Wetzlar, Deutschland). Für die
Beurteilung wurden mit Hilfe einer Pipette zwei kleine Tropfen des Ejakulates auf
einen vorgewärmten Objektträger (37 °C) aufgebracht und mit je einem Deckgläschen
(18 x 18 mm) belegt. Ejakulate mit weniger als 60% vorwärtsbeweglichen
Spermien wurden verworfen. Die Spermienkonzentration der Ejakulate wurde mit
Hilfe eines Photometers (SMD 5, Programm 4, Minitube, Tiefenbach, Deutschland)
oder mittels Zählkammer nach THOMA bestimmt und in Milliarden pro Milliliter angegeben.
Ejakulate mit einer Dichte von weniger als 400 Mio. Spermien je Milliliter
wurden verworfen. Anschließend wurde das Ejakulat mit Hilfe von Verdünnern auf
eine Konzentration von 60 Mio. Spermien je Milliliter eingestellt.
3.2 Kryokonservierung
3.2.1 Verdünnung mit einem auf TRIS basierenden Verdünner unter Zusatz
von Hühnereigelb oder Liposomen
Für die Kryokonservierung wurde jedes Ejakulat im Anschluss an die Beurteilung in
sechs Portionen aufgeteilt und mit je einem Kontrollverdünner mit und einem ohne
25

MATERIAL UND METHODEN
Zusatz von Eigelb und vier unterschiedlichen Liposomen-Verdünnern verdünnt. Für
die Kontrolle mit Eigelb wurde das Sperma mit vorgewärmtem TRIS-Tiefgefrier (TG)-
Verdünner I (198 mM TRIS, 64 mM Zitronensäure, 55 mM Fructose 0,4 g/l Penicillin,
1,0 g/l Streptomycin, pH 7,0, 280-300 mOsm/kg) mit einem Zusatz von 8% geklärtem
Eigelb auf 120 × 10 6 Spermien/ml verdünnt und für 15 Minuten bei 23 °C inkubiert.
Anschließend wurde langsam die gleiche Menge an TRIS-TG-Verdünner II mit Eigelb
sowie 12,8% Glycerin hinzugegeben. Somit befanden sich 60 × 10 6 Spermien/ml
Verdünner mit 6,4% Glycerin und 8% Eigelb im Endvolumen. Die Herstellung der
Kontrolle ohne Eigelb erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie mit Eigelb, jedoch
wurde das Eigelb durch Wasser ersetzt (Abb. 3.1).
Für die Kryokonservierung mittels TRIS-TG-Verdünner mit einem Liposomenzusatz
an Stelle von Eigelb wurde das Sperma mit TRIS-TG-Verdünner I mit 4 mg/ml Liposomen
(LUV) verdünnt und für 15 Minuten bei 23 °C inkubiert. Im Anschluss daran
wurde die gleiche Menge TRIS-TG-Verdünner II mit 12,8% Glycerin zugegeben. Im
Endvolumen waren 60 × 10 6 Spermien/ml, 6,4% Glycerin und 2 mg/ml Liposomen
(Abb. 3.1). Die Zusammensetzungen der Kontroll- und Liposomenansätze sind im
Anhang aufgeführt (Tabelle 11.1, 11.2 und 11.3).
Bei Experimenten mit unterschiedlichen Endkonzentrationen an Liposomen (0,2 bis
4 mg/ml) wurde der Samen zuerst im TRIS-TG-Verdünner I mit der jeweils zweifachen
Menge der im Endvolumen gewünschten Liposomenkonzentration verdünnt.
26

MATERIAL UND METHODEN
Spermien in TRIS - EY
(1,2×109 Spermien in TRIS - EY
(1,2×10 Spermien/ml)
je 0,5 ml
9 Spermien/ml)
je 0,5 ml
TG-Verdünner I TRIS + EY TRIS - EY TRIS - EY + LUV
4,5 ml mit 32°C Kontrolle 1 Kontrolle 2 Varianten
(120×106 TG-Verdünner I TRIS + EY TRIS - EY TRIS - EY + LUV
4,5 ml mit 32°C Kontrolle 1 Kontrolle 2 Varianten
(120×10 /ml) 6 /ml)
15 Min. Inkubation bei 23°C
TG-Verdünner II
5,0 ml mit 24°C TRIS + EY + GLY TRIS - EY + GLY TRIS - EY + GLY
(60×106 TG-Verdünner II
5,0 ml mit 24°C TRIS + EY + GLY TRIS - EY + GLY TRIS - EY + GLY
(60×10 /ml) 6 /ml)
24 h Aquilibrierung bei 4°C
27
Tiefgefrierung
Abb. 3.1: Übersicht über die Zusammensetzung der Kontrollansätze mit (TRIS +
EY) und ohne Eigelb (TRIS - EY) und der Liposomenansätze (TRIS –
EY + LUV). TG = Tiefgefrierung, EY = Eigelb, LUV = large unilamellar
vesicles (2 mg/ml), GLY = Glycerin.
Alle für den Verdünnungsprozess notwendigen Utensilien wurden im Vorfeld auf
32 °C erwärmt. Wie bei der Anwendung des Verdünners nach Steinbach [68]
beschrieben, wurde bei allen Experimenten der Samen in zwei Schritten verdünnt.
Die erforderliche Menge an Frischsperma wurde anhand dieser Vorgaben errechnet
und mit einer Pipette in ein Schraubglas (Schott AG, Mainz, Deutschland) vorgelegt.
Nun erfolgte der erste Verdünnungsschritt: 4,5 ml des auf 32 °C vorgewärmten
Tiefgefrierverdünners I (TG-Verdünner I, ohne Glycerin) wurden unter langsamen
Drehbewegungen des Schraubglases dem Sperma zupipettiert. Im Anschluss daran

MATERIAL UND METHODEN
wurden die Verdünnungsflaschen in ein auf 23 °C temperiertes Wasserbad umgesetzt
und verblieben dort für ca. 15 Minuten. Danach wurden die Verdünnungsflaschen
aus dem Wasserbad entnommen, abgetrocknet und auf den Labortisch
(Temperaturbereich 21 ± 3 °C) gestellt. Im folgenden zweiten Verdünnungsschritt
wurden 5 ml des entsprechenden, auf 24 °C vorgewärmten TG-Verdünners II unter
leichten Schwenk- und Drehbewegungen dem vorverdünnten Sperma zugesetzt. Die
verschlossenen Verdünnerflaschen (Schott AG, Mainz, Deutschland) wurden in eine
Schüttelvorrichtung (Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen, Deutschland),
die sich in einem 4 °C Kühlraum befand, gestellt. Die modifizierte, der Verdünnerflaschengröße
angepasste Schütteleinheit, sorgte für ein unablässiges Durchmischen
des Sperma-Verdünner-Gemisches. Auf diese Weise sollte der Kontakt der
Spermien mit den verschiedenen Verdünnerkomponenten, wie z.B. Liposomen,
verstärkt werden. Mit dem Verbringen in den Kühlraum begann die Äquilibrierung des
ausverdünnten Spermas. Die Äquilibrierungszeit betrug je nach Versuch 6 oder 24
Stunden. Dabei kühlte das verdünnte Sperma zunächst innerhalb von ca. 75 min von
24 °C auf 4 °C herunter, was einer Abkühlrate von 0,27 °C/min entspricht. Die
Temperaturen während der Abkühlphase wurden mit Temperaturfühlern (Fa.
Greisinger Electronic GmbH, Typ GTF 101 Pt 100, Regenstauf, Deutschland), einem
12 Kanal-Temperaturschreiber (Fa. Advantech Co., Ltd., Typ ADAM- 4015, ADAM-
4520 RS-232 to RS-422 / RS-485 Isolated Converter, Düsseldorf, Deutscland) und
einer Messwerterfassungssoftware (DASY Lab 9.0, measX GmbH & Co. KG,
Mönchengladbach, Deutschland) bestimmt. Die Temperaturfühler wurden in den
Verdünnerflaschen angebracht bevor sie in den Kühlraum gestellt wurden. Die
Temperaturerfassung erfolgte einmal pro Sekunde.
Die TRIS-TG-Verdünner I und II setzten sich aus 1,5-facher TRIS-Stammlösung,
40% geklärtem Eigelb in wässriger Lösung oder 40 mg/ml Liposomen in wässriger
Lösung und 12,8% Glycerin zusammen. Die chemische Zusammensetzung der
TRIS-Stammlösung zur Herstellung der TRIS-TG-Verünner I und II ist in Tabelle 3.1
aufgeführt.
28

MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 3.1: Chemische Zusammensetzung der TRIS-Stammlösung zur Herstellung
des TRIS-Tiefgefrierverünners I und II.
Tris-Hydroxy-Methyl-
Amino-Methan
MW
(g/mol)
für 1,5x TRIS
gebe in
1000 ml (g)
29
Konzentration
in 1,5x TRIS
Konzentration
in 1x TRIS
121,14 36,05 297,59 mM 198,39 mM
Citricacidmonohydrat 210,14 20,24 96,32 mM 64,21 mM
D-Fructose 180,16 14,88 82,59 mM 55,06 mM
Penicillin G 0,606 0,606 g/l 0,404 g/l
Streptomycin 1,50 1,50 g/l 1,0 g/l
3.2.2 Konfektionierung und Einfriervorgang
Unter Konfektionierung des Spermas ist das maschinelle oder manuelle Abfüllen der
Besamungsportionen zu verstehen. Nach der Äquilibrierung bei 4 °C wurde das in
10 ml Tiefgefrierverdünner verdünnte Sperma in Pailletten (Typ Mini Pailletten,
Einheit 0,25 ml, IMV, L`Aigle, Frankreich) abgefüllt und gekennzeichnet. Das maschinelle
Abfüllen in Besamungsportionen erfolgte mit einer auf 4 °C temperierten und im
Kühlkabinett stehenden Abfüllmaschine (MPP Quattro, Fa. Minitüb, Tiefenbach,
Deutschland) und die Beschriftung der Pailletten mit einem Drucker (JET 2 SE,
Leibinger, Tuttlingen, Deutschland). Anschließend wurden die Pailletten auf Rampen
aufgelegt und visuell auf eine korrekte Befüllung kontrolliert. Das Einfrieren der Besamungsportionen
erfolgte in Stickstoffdampf bei -95 °C für 9 Minuten (NIFA Technologies
BV, Leeuwarden, Niederlande). Bei jedem Einfriervorgang waren 4 Rampen, die
sich alle auf gleicher Höhe befanden, in der Einfriermaschine. Im Anschluss daran
wurden die Pailletten in flüssigen Stickstoff überführt und bei -196 °C in einem
Stickstoffcontainer gelagert.

3.2.3 Herstellung von geklärtem Eigelb
MATERIAL UND METHODEN
Das Eigelb für den modifizierten TRIS-Eigelb-TG-Verdünner nach Steinbach [68]
wurde aus Hühnereiern hergestellt, die aus kontrollierter Haltung und Fütterung des
Lehr- und Forschungsgutes Ruthe der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
bezogen wurden. Die Eier wurden im Labor bei Zimmertemperatur unter möglichst
sterilen Kautelen geöffnet, das Eiweiß verworfen und die Eigelbmembran durch
Abrollen auf Filterpapier gereinigt. Anschließend wurde die Membran mit einer
sterilen Kanüle perforiert, so dass das Eigelb in einen Messzylinder abtropfte. Mit
destilliertem Wasser wurde im Verhältnis 2:3 aufgefüllt. Auf einem Rührtisch
(IKAMAG RCT, IKA-Labortechnik Janke & Kunkel GmbH, Staufen, Deutschland)
wurde die 40%ige Eigelblösung für 15 Minuten mit einem Magnetrührfisch
homogenisiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation (Sorvall RC 5C Plus,
Newtown, CT , USA) bei einer Geschwindigkeit von 7800 × g und einer Innenraumtemperatur
von 4 °C für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in
Schraubgläser (Schott AG, Mainz, Deutschland) umgefüllt und der Niederschlag
verworfen. Das zentrifugierte Eigelb wurde maximal fünf Tage bei 4 °C gelagert.
3.2.4 Herstellung von Liposomen
Die in dieser Studie verwendeten Lipide wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster,
AL, USA) bezogen: Egg-Phosphatidylcholin (EPC), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-
Phosphocholin (DOPC, 18:1), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin (DOPS,
18:1), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-(1’-rac-glycerol) (DOPG, 18:1), 1,2-
Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DOPE, 18:1), 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-
3-Phosphocholin (DLPC, 12:0), 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DMPC,
14:0), 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC, 16:0), 1,2-Distearoyl-sn-
Glycero-3-Phosphocholin (DSPC, 18:0). Zusammensetzungen aus 45 mg EPC bzw.
DOPC und 5 mg DOPC, DOPS, DOPG oder DOPE wurden im Verhältnis 9:1 (w/w)
hergestellt. Eine Zusammenfassung der verwendeten synthetischen Phospholipide
zur Herstellung von Liposomen befindet sich in Tabelle 3.2.
30

MATERIAL UND METHODEN
Alle Lipide wurden in Chloroform gelöst geliefert und bei -20 °C gelagert. Im Labor
wurde der Chloroformlösung ein Volumen abpipettiert, welches die für die spätere
Lösung erforderliche Lipidmenge nach der Trocknungsphase enthielt. Zur weiteren
Verarbeitung wurde das Reagenzglas (Schott AG, Mainz, Deutschland) mit Lipidlösung
unter einem Abzug zur Trocknung, je nach Lipidsorte für ein bis drei Tage
aufgestellt und anschließend 10 Stunden lyophilisiert (Fa. Christ, Osterode,
Deutschland). Das Ergebnis der Trocknungsphase ließ sich optisch anhand eines
gelbkörnigen Lipidfilms für EPC und eines weißkörnigen Lipidfilms für synthetische
Lipide kontrollieren. In diesem Zustand war eine Lagerung bei -20 °C über mehrere
Wochen möglich. Zur Herstellung von großen multilamellaren Vesikeln (LMV) wurde
der Lipidfilm mit destilliertem Wasser versetzt und für wenige Minuten in ein 30 °C
warmes Wasserbad gestellt. Anschließend wurde der dünne Lipidfilm durch Schütteln
und häufiges Vortexen gelöst. Zur weiteren Lösung wurde das Reagenzglas in
flüssigen Stickstoff getaucht und anschließend in einem Wärmebad erwärmt. Die
Temperatur des Wärmebads musste oberhalb der Phasenübergangs-Temperatur
des jeweiligen Lipids, bis zu 63 °C warm gehalten werden, um die Lipidschichten zu
lösen und LMV zu bilden. Der Vorgang des Tiefgefrierens und schnellen Auftauens
wurde viermal wiederholt.
31

MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 3.2: Übersicht über die verwendeten synthetischen Phospholipide zur
Herstellung von Liposomen. R beschreibt die Fettsäureketten: An erster
Stelle steht die Anzahl der Kohlenstoffatome, an zweiter die Zahl der
Doppelbindungen. Tm ist die Phasenübergangstemperatur (phasetransition-temperature).
Der Durchmesser gibt die Porengröße der
Polycarbonatmembran bei der Liposomenherstellung an.
Phospholipid R Akronym
Phosphocholin:
32
Molekulargewicht
(g/mol)
Tm
(°C)
Ladung
Durchmesser
(nm)
1,2-Dilauroyl 12:0 DLPC 621,8 -1 neutral 200
1,2-Dimyristoyl 14:0 DMPC 677,9 23 neutral 100/200
1,2-Dipalmitoyl 16:0 DPPC 734,1 41 neutral 200
1,2-Distearoyl 18:0 DSPC 790,2 53 neutral 200
1,2-Dioleoyl 18:1 DOPC 786,1 -22 neutral 100
Phosphoethanolamin
1,2-Dioleoyl
Phosphatidylglycerol
1,2-Dioleoyl
Phosphatidylserin
1,2-Dioleoyl
18:1 DOPE 744,1 25 neutral 100
18:1 DOPG 775,1 -18 negativ 100
18:1 DOPS 810,0 -11 negativ 100
Zur Herstellung von Liposomen mit 100 und 200 nm im Durchmesser wurde der
Avanti® Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, USA) verwendet (Abb. 3.2
und 3.3). Der gewünschte Vesikeldurchmesser wurde während der Extrusion durch
definierte Porengrößen der Polycarbonatmembran (Whatman, New Jersey, USA)
erreicht. Die Fettsäureketten mussten für diese Behandlung oberhalb der Temperatur,
bei der die Fettsäuren vom gelartigen in den flüssigen Zustand übergehen,
gehalten werden. Hierzu wurde der Mini-Extruder auf einer Heizplatte auf den
notwendigen Temperaturbereich erwärmt, ebenso die LMV-Suspension. Die
weiterführenden Arbeitsschritte am Avanti® Mini-Extruder erfolgten nach Herstellerangaben.
Das Ergebnis war eine homogene, transparente bis weißlich-bläuliche
Lösung mit unilamellaren Vesikeln bzw. Liposomen. Im Anschluss an den Herstel-

MATERIAL UND METHODEN
lungsprozess wurde die Liposomenlösung für maximal 24 Stunden bei 4 °C gelagert.
Mit dem Verfahren des Dynamic Light Scattering (DLS; Dynamische Lichtstreuung)
(Viscotek, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK) wurde eine Größenmessung
der Liposomen vorgenommen. Bei dieser Methode wird das Streulicht
eines Lasers an Molekülen in Lösung oder Suspension gemessen. Die Intensität des
gestreuten Lichtes fluktuiert in Abhängigkeit von der Größe der Partikel. Mit dem DLS
Verfahren wurde die Liposomengröße nach Verwendung einer 100 nm Polycarbonatmembran
kontrolliert. Abbildung 3.1 zeigt die Größenverteilung der EPC Liposomen.
Die meisten dieser Liposomen hatten einen Radius von 64,8 nm, während ein
geringer Teil der Liposomen einen Radius von weniger als 50 nm aufwies.
Alle Materialien, die während der Herstellung mit Lipiden in Kontakt kamen, wurden
mit destilliertem Wasser gespült und mit 70% Ethanollösung gereinigt.
Abb. 3.2: Intensitätsverteilung von EPC Liposomen bei Verwendung einer
100 nm Polycarbonatmembran, gemessen mittels Dynamic Light
Scattering (DLS) (Viscotek, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire,
UK).
33

MATERIAL UND METHODEN
Abb. 3.3: Schematische Darstellung der Zusammensetzung des Avanti® Mini-
Extruder von Avanti Polar Lipids, welcher zur Extrusion der Liposomen
verwendet wurde. (Bildquelle: www.avantilipids.com)
Abb. 3.4: Avanti® Mini-Extruder von Avanti Polar Lipids in seine Einzelteile
zerlegt (A) bzw. zusammengebaut in Gebrauch (B).
(Bildquelle: www.avantilipids.com)
34
A
B

MATERIAL UND METHODEN
3.3 Untersuchungsmethoden zur Beurteilung der Spermaqualität
3.3.1 Computergestützte Motilitätsanalyse
Jede Spermaprobe wurde mittels computergestützter Motilitätsanalyse (CASA:
computer assisted sperm analysis) vor und nach der Kryokonservierung untersucht.
Auf der Besamungsstation Neustadt a.d. Aisch wurde hierfür das SpermVision®-
System (Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) verwendet. Dieses bestand aus
einem Mikroskop (Olympus C x 31, Olympus Europa Holding GmbH, Deutschland)
mit negativem Phasenkontrast, einer Digitalkamera (PT-41-04M60, Teledyne
DALSA, Ontario, Kanada) und einem PC, auf dem die SpermVision®-Software
Version 3.5 installiert war. Das Mikroskop war mit einem beheizbaren Kreuztisch und
einer separaten, beheizten Arbeitsplatte (HT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach,
Deutschland) ausgestattet.
Zwei Milliliter des verdünnten Spermas wurden in ein Eppendorfgefäß gefüllt und für
10 Minuten in einem Wärmeblock bei 37 °C inkubiert. Mit einer variablen 10 μm
Pipette (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) wurde ein Aliquot von 2,4 μl zum
Befüllen einer LEJA-Messkammer (LEJA Products B.V., Nieuw-Vennep, Niederlande)
entnommen. Diese besitzt eine standardisierte Kammerhöhe von 20 μm. Der
Tropfen wurde durch Kapillarkräfte in die Messkammer eingezogen. Der Vorgang
wurde bei unvollständiger Befüllung oder sichtbaren Luftblasen in der Kammer
wiederholt. Bei jeder Messung wurden 10 aufeinander folgende Messpositionen auf
der zentralen Längsachse einer LEJA-Messkammer ausgewertet. Sie wurden durch
den fahrbaren Kreuztisch von der Software automatisch angesteuert. Dabei wurden
1600 bis 2000 Spermien erfasst. Die verwendeten Kammern entstammten der
gleichen Charge. Es wurde die progressive Motilität (PMOT) der Spermien mittels
SpermVision®-Software 3.5 erfasst. Nur Spermien mit DSL (distance straight-line)-
Werten von mindestens 4,5 µm wurden als progressiv motil bezeichnet.
35

MATERIAL UND METHODEN
3.3.2 Durchflusszytometrische Beurteilung der Integrität der Plasmamembran
und des Akrosoms
Die Überprüfung der Integrität der Plasmamembran und des Akrosoms der Spermien
wurde durchflusszytometrisch unter Verwendung der FITC-PNA / PI-Färbung durchgeführt.
Die Spermaproben wurden mit dem Durchflusszytometer Epics XL (Fa. Beckman
Coulter, Krefeld, Deutschland) gemessen. Das Gerät arbeitet mit einem luftgekühlten
Argonionlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm. Für die Messungen wurden zwei
verschiedene Filter eingesetzt, ein Bandpassfilter mit einer Wellenlänge von
530 ± 30 nm für die grüne Fluoreszenz (FL1) und ein Langpassfilter mit einer Wellenlänge
von 650 nm für die rote Fluoreszenz (FL3). Die Bearbeitung und Auswertung
der Messdaten erfolgte mit den Software-Programmen EXPO 32 ADC XL 4 Color
und Expo 32 Analysis (Fa. Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland). Das Durchflusszytometer
wurde an den Messtagen zweimal mit einer Cleanse-Lösung (Coulter
Clenz, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) und zweimal mit bidestilliertem
Wasser gespült. Nach der Spülung wurde die Fluoreszenzintensität des Gerätes mit
Flow-Check-Flüssigkeit (Fa. Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) kalibriert. Bei
jeder Messung wurden 10.000 Spermien analysiert.
Der rotfluoreszierende Farbstoff PI (Propidiumiodid; Fa. Sigma-Aldrich, München,
Deutschland) kann nur geschädigte Plasmamembranen durchdringen. Er fügt sich in
die Doppelhelixstruktur der DNA ein. Der grünfluoreszierende Farbstoff Fluoreszein-
Isothiocyanat (FITC) ist an das Arachis hypogaea-Lektin (PNA: peanut agglutinin)
gekoppelt (Fa. Sigma-Aldrich, München, Deutschland), welches sich selektiv an die
geschädigte äußere Akrosomenmembran bindet. Liegt eine Akrosomenreaktion bzw.
eine akrosomale Schädigung vor, bindet sich das Lektin an das Akrosom.
Für die Analyse der kryokonservierten Spermaproben wurden jeweils 4 Pailletten
aufgetaut und in einem Eppendorfgefäß gepoolt. Mit einem TRIS-Medium (200 mM
TRIS, 65 mM Zitronensäure, 96 mM Fructose, 0,05 g/l Gentamicin-Sulfate, pH 7, 300
- 310 mOsm/kg) wurde das Sperma auf eine Endkonzentration von 5 × 10 6
Spermien/ml verdünnt. Für die Messung wurden 492 μl der verdünnten Spermiensuspension
mit 3 μl 3 mM PI und 5 μl 0,30 mM FITC-PNA versetzt und mit einem
36

MATERIAL UND METHODEN
Vortexer (Lab Dancer Orbital Shaker, Fa. IKA, Staufen, Deutschland) ca. 5 Sekunden
gemischt. Anschließend wurde die Probe für 15 Minuten in einem Wärmeblock bei
37 °C inkubiert und kurz vor der Messung ein zweites Mal kurz auf den Vortexer
gestellt.
3.4 Versuchsansätze
In den vorliegenden Studien wurden die Effekte
von Liposomen, die sich aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kopfgruppen zusammensetzen (EPC oder DOPC mit DOPX; PX: PC, PS, PG
oder PE)
von Liposomen, die sich aus gesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kohlenstoffkettenlängen (DLPC, DMPC, DPPC und DSPC) zusammensetzen
von DMPC Liposomen mit 100 nm und 200 nm Größe
auf die Motilität und die Integrität der Plasmamembran und des Akrosoms boviner
Spermien vor und nach der Kryokonservierung untersucht.
3.4.1 Effekte von EPC Liposomen auf die Spermaqualität vor und nach dem
Tiefgefrieren
Im Rahmen dieses Vorversuchs wurden die Effekte von EPC Liposomen mit einem
Durchmesser von 100 nm in den Konzentrationen 0,2 mg, 0,4 mg, 2,0 mg und
4,0 mg je Milliliter TRIS-GLY-Verdünner auf die Spermaqualität getestet.
Von fünf Bullen der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
wurden hierzu neun Ejakulate gewonnen, verdünnt und 6 bzw. 24 Stunden bei 4 °C
vor dem Tiefgefrieren inkubiert. Der prozentuale Anteil plasmamembran- und
akrosomintakter (PMAI) Spermien wurden nach dem Verdünnungsprozess sowie
nach 6 bzw. 24 Stunden Äquilibrierung und nach dem Auftauen bestimmt (Abb. 3.4).
37

MATERIAL UND METHODEN
4 °C Kühltemperatur Tiefgefrierung
PMAI- und PMOT-Messung: 1. 2. 3. 4.
Äquilibrierung in Stunden: 0 6 24 Nach dem Auftauen
Abb. 3.5: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Bestimmungen der
Plasmamembran und Akrosomintegrität (PMAI) und der progressiven
Motilität (PMOT) im Rahmen der Prüfung der Effekte verschiedener
Konzentrationen von EPC Liposomen auf die Spermaqualität.
3.4.2 Effekte von Liposomen aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kopfgruppen auf die Spermaqualität
Die Untersuchungen wurden an je vier Ejakulaten von sechs Bullen der Besamungsbullenstation
Neustadt a. d. Aisch e.V. (BVN) durchgeführt. Die Ejakulate wurden in
Kontrollverdünnern mit bzw. ohne Eigelb und Liposomenverdünnern mit EPC bzw.
DOPC und DOPC, DOPS, DOPG oder DOPE Lipiden verdünnt (Abb. 3.6 und 3.7).
Die Zusammensetzung der verwendeten Kontroll- und Liposomenverdünner ist im
Anhang aufgeführt (Tabelle 11.1 und 11.2).
38

Versuchsserie
1
2
3
TRIS-
Kontrollansätze
+ EY - EY
+ EY
+ EY
MATERIAL UND METHODEN
-EY
-EY
24 Ejakulate von 6 Bullen
je Versuchsserie
EPC:
DOPC
DOPC:
DOPC
DLPC
39
TRIS-Liposomenansätze
EPC:
DOPS
DOPC:
DOPS
DMPC
EPC:
DOPG
DOPC:
DOPG
DPPC
EPC:
DOPE
DOPC:
DOPE
DSPC
Abb. 3.6: Schematische Darstellung der Aufteilung der Ejakulate in Kontroll- (mit
(+ EY) und ohne Eigelb (- EY)) und Testverdünner mit Liposomen aus
gesättigten (DLPC, DMPC, DPPC oder DSPC) und ungesättigten
(EPC/DOPC:DOPX) Lipiden in einer Konzentration von 2 mg/ml
Verdünner. PX steht für PC, PS, PG oder PE. Dazu ist die zeitliche
Abfolge der Bestimmungen der Plasmamembran und Akrosomintegrität
(PMAI) und der progressiven Motilität (PMOT) dargestellt.
PMAI- und PMOT- Messung: 1. 4 °C Kühltemperatur 2. Tiefgefrierung 3.
Äquilibrierung in Stunden: 0 24 Nach dem Auftauen
Abb. 3.7: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Bestimmungen der
Plasmamembran- und Akrosomintegrität (PMAI) und der progressiven
Motilität (PMOT).
3.4.3 Effekte synthetischer Liposomen aus gesättigten Fettsäuren auf die
Spermaqualität.
Das Versuchsdesign entsprach grundsätzlich dem unter 3.4.2 beschriebenen Ansatz.
Die Ejakulate wurden in Kontrollverdünnern mit bzw. ohne Eigelb und

MATERIAL UND METHODEN
Liposomenverdünnern mit DLPC, DMPC, DPPC oder DSPC Lipiden verdünnt (Abb.
3.6 und 3.7). Die Zusammensetzung der verwendeten Kontroll- und Liposomenverdünner
ist im Anhang aufgeführt (Tabelle 11.1 und 11.3).
Bei der Herstellung von Liposomen aus DLPC, DPPC und DSPC Lipiden wurde die
LMV-Suspension durch eine 200 nm Membran gefiltert. Um Unterschiede in der
Wirkung verschiedener Liposomengrößen auf den Anteil plasmamembran- und
akrosomintakter (PMAI) sowie progressiv motiler (PMOT) Spermien festzustellen,
wurden DMPC Lipide durch eine 100 sowie 200 nm Polycarbonatmembran geformt.
3.4.4 Statistische Auswertung
Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms Microsoft®
Excel® 2003 (Microsoft Corporation, USA) und des Statistikprogramms Statview
Version 5.0 (SAS Institute Inc., Cary, MC, USA). Die graphische Darstellung der
Ergebnisse erfolgte mit dem Programm Microsoft® Excel 2003. Die PMOT- und
PMAI-Daten wurden durch den Mittelwert und die Standardabweichung beschrieben.
Alle Merkmale wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test auf eine Normalverteilung hin
überprüft. Die Untersuchung auf Unterschiede innerhalb der Verdünnergruppen und
der Messzeitpunkte geschah mittels ANOVA-Test. Zur Klärung der Frage, ob die
Verdünner einen Einfluss auf die Ausprägung der Parameter zu den einzelnen
Untersuchungszeitpunkten hatten, wurde der Fisher`s PLSD-Test durchgeführt. Die
Prüfung ob nach fortgeschrittener Lagerung eine Veränderung der prozentualen
Anteile von PMOT- und PMAI-Spermien vorlag, erfolgte ebenfalls mit dem Fisher`s
PLSD-Test. Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurden
als signifikant bezeichnet.
40

4 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE
4.1 Effekte unterschiedlicher Konzentrationen von EPC Liposomen und
Äquilibrierungszeiten auf die Spermaqualität
In Abbildung 4.1 ist der Effekt des TRIS-GLY-Verdünners mit unterschiedlichen
Konzentrationen von EPC Liposomen vor und nach dem Tiefgefrieren auf den Anteil
plasmamembran- und akrosomintakter Spermien (PMAI) dargestellt.
Die PMAI-Werte der Spermien waren unmittelbar nach der Verdünnung am höchsten
und nach dem Einfrieren und Auftauen der Spermien am niedrigsten. Es waren keine
Unterschiede in den PMAI-Werten zwischen den Spermien nach einer 6- bzw 24stündigen
Äquilibrierung festzustellen. Nach dem Auftauen bei vorhergehender 6stündiger
Lagerung vor dem Tiefgefrieren, wurden PMAI-Werte von 14,2 ± 4,2% im
Verdünner ohne Zusatz von Liposomen, 33,0 ± 8,2% bei einer Konzentration von
2,0 mg/ml und 39,0 ± 6,9% bei einer Konzentration von 4,0 mg/ml ermittelt. Bei einer
Äquilibrierungsdauer von 24 Stunden wurde ein PMAI-Wert von 16,3 ± 4,9% im
Verdünner ohne Zusatz von Liposomen ermittelt, im Vergleich zu PMAI-Werten von
40,5 ± 7,5% und 38,9 ± 8,4% bei EPC Konzentrationen von 2,0 bzw. 4,0 mg/ml. Dies
bedeutet, dass bei einer 24-stündigen Äquilibrierung in TRIS-GLY-Verdünner die
PMAI-Werte der Spermien nach dem Auftauen ab einer Liposomenkonzentration von
2,0 mg/ml Höchstwerte erreichten.
41

PMAI (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ERGEBNISSE
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
EPC Konzentration (mg/ml) in TRIS + GLY Verdünner
42
0h bei RT
6h bei 4°C
24h bei 4°C
6h bei 4°C,
aufgetaut
24h bei 4°C,
aufgetaut
Abb. 4.1: Prozentualer Anteil plasmamembran- und akrosomintakter Spermien
(PMAI) in TRIS-GLY-Verdünner in Abhängigkeit von der EPC-Konzentration.
Die PMAI-Werte wurden vor dem Einfrieren unmittelbar nach
dem Verdünnen bei Raumtemperatur (0 h bei RT), nach 6 Stunden (6 h
bei 4 °C) und 24 Stunden Äquilibrierung (24 h bei 4 °C) sowie nach dem
Einfrieren und Auftauen (6 h / 24 h bei 4 °C, aufgetaut) untersucht. Es
sind Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt (n = 9 Ejakulate
von 5 Bullen).

ERGEBNISSE
In Abbildung 4.2 sind die Effekte verschiedener Äquilibrierungszeiten bei 4 °C bei
Verwendung verschiedener TRIS-GLY-Verdünner (mit Eigelb, ohne Eingelb, mit
2,0 mg/ml EPC) auf die PMAI-Werte vor und nach dem Tiefgefrieren dargestellt.
Im TRIS-GLY-Verdünner ohne Zusätze von Eidotter bzw. Liposomen war der Anteil
an PMAI-Spermien bereits nach der Äquilibrierung deutlich abgefallen (p < 0,05). Vor
dem Einfrieren war bei keinem der Verdünner ein Effekt der unterschiedlichen
Äquilibrierungsdauer auf die PMAI-Werte festzustellen (p > 0,05). Dagegen hatte die
Veränderung der Äquilibrierungsdauer von 6 auf 24 Stunden bei allen Verdünnern
nach dem Einfrieren und Auftauen positive Auswirkungen auf die PMAI-Werte
(p < 0,05).
PMAI (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
TRIS + EY + GLY TRIS - EY + GLY TRIS + 2,0 mg/ml
EPC + GLY
43
*
0h bei RT
6h bei 4°C
24h bei 4°C
6h bei 4°C, aufgetaut (0h)
24h bei 4°C, aufgetaut (0h)
6h bei 4°C, aufgetaut (3h)
24h bei 4°C, aufgetaut (3h)
Abb. 4.2: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI) Spermien nach Verdünnung
in TRIS-GLY-Verdünner mit und ohne Zusatz von Eigelb (EY)
bzw. 2,0 mg/ml EPC Liposomen. Die Analysen erfolgten unmittelbar
nach dem Verdünnen (0 h bei RT), nach 6 Stunden Äquilibrierung (6 h
bei 4 °C), nach 24 Stunden Äquilibrierung (24 h bei 4 °C), unmittelbar
nach dem Auftauen (6 h / 24 h bei 4 °C, aufgetaut) und nach
dreistündiger Inkubation bei 37 °C (6 h / 24 h bei 4 °C, aufgetaut (3 h)).
Es sind Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. (n = 9
Ejakulate von 5 Bullen). Eine zwei Werte miteinander verbindende
Klammer mit einem * zeigt einen signifikanten Unterschied (p < 0,05).

ERGEBNISSE
4.2 Effekte von Liposomen aus EPC und Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kopfgruppen auf die Spermaqualität
Um zu untersuchen, ob der Zusatz von Lipiden mit anderen Kopfgruppen als EPC
die Überlebensfähigkeit der Spermien verbessert, wurden EPC Liposomen mit DOPX
Lipiden (PX steht für PC, PS, PG oder PE) hergestellt. In Abbildung 4.3 sind die
Anteile plasmamembran- und akrosomintakter (PMAI; A) sowie progressiv motiler
(PMOT; B) Spermien nach Verdünnung mit TRIS-GLY-Verdünnern mit bzw. ohne
Eigelb oder EPC:DOPX Liposomen dargestellt.
Zu allen Untersuchungszeitpunkte zeigten die Spermien, die mit dem herkömmlichen
TRIS-GLY-Verdünner mit Eigelb versetzt wurden, die höchsten (p < 0,05) und die
Spermien, die mit dem herkömmlichen TRIS-GLY-Verdünner konserviert worden
waren, die niedrigsten (p < 0,05) PMAI- und PMOT-Werte. Von den Spermien, denen
Liposomen-Verdünner zugegeben wurden, wiesen nach der Äquilibrierung und nach
dem Auftauen diejenigen die höchsten (p < 0,05) PMAI- und PMOT-Werte auf, bei
denen EPC:DOPG Liposomen zur Herstelllung des Verdünners verwendet worden
waren.
44

PMAI (%)
PMOT (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
c d d d a
b
b
ERGEBNISSE
d
c c
0h 24h bei 4°C Aufgetaut
bd bc ac
a
bd b bc cd
ac
a
b cd
a
b
c c c c
0h 24h bei 4°C Aufgetaut
d
e
e
45
a
a
b
b
A
c c
d cd
c c
d cd
d
cd cd
B
c
TRIS + EY + GLY
TRIS - EY + GLY
TRIS + EPC/PC + GLY
TRIS + EPC/PS + GLY
TRIS + EPC/PG + GLY
TRIS + EPC/PE + GLY
Abb. 4.3: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI; A) sowie progressiv
motile (PMOT; B) Spermien nach Verdünnung in TRIS-GLY-Verdünner
mit EPC:DOPX Liposomen (A und B). PX steht für PC, PS, PG oder
PE. Die Analysen erfolgten unmittelbar nach dem Verdünnen bei
Raumtemperatur (0 h), nach 24 Stunden Äquilibrierung bei 4 °C (24 h
bei 4 °C) und unmittelbar nach dem Auftauen (Aufgetaut). Es sind
Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt (n = 6 Bullen mit je 4
Ejakulaten). Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b, c, d, e)
unterscheiden sich signifikant zwischen den Verdünnern innerhalb
derselben Untersuchungszeitpunkte (p < 0,05).

ERGEBNISSE
4.3 Effekte synthetischer Liposomen auf die Spermaqualität
4.3.1 Liposomen aus ungesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kopfgruppen
Die Effekte verschiedener DOPC:DOPX Liposomen auf die Spermaqualität wurden
in gleicher Weise wie bei den EPC:DOPX Liposomen beschrieben, untersucht. PX
steht für PC, PS, PG oder PE. Abbildung 4.4 zeigt die Anteile plasmamembran- und
akrosomintakter (PMAI) sowie progressiv motiler (PMOT) Spermien in TRIS-GLY-
Verdünnern mit bzw. ohne Eigelb (EY) oder DOPC:DOPX Liposomen.
Nach der Äquilibrierung und nach dem Einfrieren und Auftauen waren die PMAI- und
PMOT-Werte bei den mit dem herkömmlichen TRIS-GLY-Eigelb-Verdünner konservierten
Spermien am höchsten (p < 0,05). Bei den Liposomen-Verdünnern zeigten
Spermien im Verdünner mit DOPC:PG Liposomen die höchsten (p < 0,05) PMAI- und
PMOT-Werte. Die Werte entsprechen denen, die nach der Inkubation mit
EPC:DOPG Liposomen erzielt wurden (p > 0,05).
46

PMAI (%)
PMOT (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a c c c c
b
a
b
ERGEBNISSE
c c d
c c d
0h 24h bei 4°C Aufgetaut
a
bc c c c bc
bc c c c bc
a
b
c c d
0h 24h bei 4°C Aufgetaut
e
e
47
a
a
b
b
c c
d
c c
d
c
c d
c d
A
c
B
c
TRIS + EY + GLY
TRIS - EY + GLY
TRIS + DOPC/PC + GLY
TRIS + DOPC/PS + GLY
TRIS + DOPC/PG + GLY
TRIS + DOPC/PE + GLY
Abb. 4.4: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI; A) sowie progressiv
motile (PMOT; B) Spermien nach Verdünnung in TRIS-GLY-Verdünner
mit und ohne Zusatz von Eigelb (EY) und mit synthetischen
DOPC:DOPX Liposomen. PX steht für PC, PS, PG oder PE. Die
Analysen erfolgten unmittelbar nach dem Verdünnen bei Raumtemperatur
(0 h), nach 24 Stunden Äquilibrierung bei 4 °C (24 h bei
4 °C) und unmittelbar nach dem Auftauen (Aufgetaut). Es sind
Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt (n = 6 Bullen mit je 4
Ejakulaten). Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b, c, d, e)
unterscheiden sich signifikant zwischen den Verdünnern innerhalb
derselben Untersuchungszeitpunkte (p < 0,05).

ERGEBNISSE
4.3.2 Liposomen aus gesättigten Fettsäuren mit unterschiedlichen
Kohlenstoffkettenlängen
Abbildung 4.5 zeigt den Effekt von Liposomen, bestehend aus gesättigten Lipiden mit
unterschiedlichen C-Kettenlängen, auf die Anteile plasmamembran- und akrosomintakter
(PMAI) und progressiv motiler (PMOT) Spermien.
Auch hier zeigten die Spermien, die mit dem herkömmlichen TRIS-GLY-Verdünner
mit Eigelb versetzt worden waren, nach 24-stündiger Äquilibrierung und nach dem
Einfrieren und Auftauen, die höchsten (p < 0,05) PMAI- und PMOT-Werte.
Von den mit Liposomen-Medien verdünnten Spermien zeigten in dieser
Versuchsreihe zu allen Untersuchungszeitpunkten diejenigen, die mit DMPC Lipiden
verdünnt wurden, die höchsten (p < 0,05) PMAI- und PMOT-Werte. Diese waren
vergleichbar mit denjenigen, die in TRIS-GLY-Verdünnern mit EPC oder DOPC
Liposomen inkubiert worden waren. Dagegen waren bei Spermien, die mit DLPC
Liposomen inkubiert worden waren, bereits unmittelbar nach dem Verdünnungsprozess
die PMAI- und PMOT-Werte auf 0,6% bzw. 0,8% abgefallen (p < 0,05).
In weiteren Versuchen wurde der Effekt der Größe der DMPC Liposomen auf die
Spermaqualität untersucht. Die PMAI- und PMOT-Werte von Spermien, die in TRIS-
GLY-Verdünnern mit 100 bzw. 200 nm DMPC Liposomen inkubiert worden waren,
unterschieden sich nicht (p > 0,05). Nach dem Auftauen wurden 44,6% PMAI- bzw.
45,4% PMOT- Spermien im Verdünner mit 100 nm DMPC Liposomen und 43,5%
bzw. 44,8% im Verdünner mit 200 nm DMPC gemessen (Ergebnisse nicht graphisch
dargestellt).
48

Prog. PMOT Mot. (%) (%)
PMAI PMI (%) (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a a
b b a
b
b
ERGEBNISSE
c c c
d
0h 24h bei 4°C Aufgetaut
a
b a b a
b b
b
c c c
d
0h 24h bei 4°C Aufgetaut
b
b
b
b
49
a
a
b
b
d
d
b
A
b
B
b
b
TRIS + EY + GLY
TRIS - EY + GLY
TRIS + DLPC + GLY
TRIS + DMPC + GLY
TRIS + DPPC + GLY
TRIS + DSPC + GLY
Abb. 4.5: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI; A) sowie progressiv
motile (PMOT; B) Spermien nach Verdünnung in TRIS-GLY-Verdünner
mit synthetischen DXPC Liposomen. DX steht für DL, DM, DP oder DS.
Die Analysen erfolgten unmittelbar nach dem Verdünnen bei
Raumtemperatur (0 h), nach 24 Stunden Äquilibrierung bei 4 °C (24 h
bei 4 °C) und unmittelbar nach dem Auftauen (Aufgetaut). Die
Kontrollen bestanden aus TRIS-GLY-Verdünner mit und ohne Eigelb
(EY). Es sind Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt (n = 6
Bullen mit je 4 Ejakulaten). Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a,
b, c, d) unterscheiden sich (p < 0,05) innerhalb derselben Untersuchungszeitpunkte.

5 DISKUSSION
DISKUSSION
In dieser Studie wurde die Wirkung verschiedener unilamellarer Liposomen mit
unterschiedlichen thermophysikalen Eigenschaften auf die Integrität der Plasmamembran
und des Akrosoms sowie die Motilität boviner Spermien vor und nach der
Kryokonservierung untersucht. Der EPC Konzentrationsversuch zeigte die schützende
Wirkung von Liposomen in Abhängigkeit vom Liposomen:Zell-Verhältnis. Das
Wirkungsoptimum wurde bei einer Konzentration von 2,0 mg EPC Liposomen/
60 × 10 6 Spermien erzielt. Auch in einer Studie von Anzar et al. [69] mit im
Ultraschallbad hergestellten Liposomen wurde das Liposomen:Zell-Verhältnis als ein
Kriterium für den Wirkungsgrad genannt. Außerdem hatten die Lipidzusammensetzung
der Liposomen und die Dauer der Inkubation Auswirkungen auf die
Interaktion zwischen den Spermien und den Liposomen.
Liposomen, bestehend aus ungesättigtem EPC oder DOPC (18:1), schützen Spermien
während der Tiefgefrierung und führen zu vergleichbaren PMAI- und PMOT-
Werten nach dem Auftauen der Spermien. Der Anteil PMAI- und PMOT-Spermien
war bei der Verwendung von Liposomen, bestehend aus EPC bzw. DOPC mit DOPG
(negativ geladene Kopfgruppe), im Vergleich zu den Kombinationen aus EPC bzw.
DOPC mit DOPS (negativ geladen) oder DOPE (neutral) erhöht. Die nach Inkubation
und Kryokonservierung in DOPC:DOPG Liposomen-Verdünner erhöhten PMAI- und
PMOT-Werte könnten auf Interaktionen zwischen dem negativ geladenen Kopf des
Phosphatidylglycerols und den geladenen Regionen der Spermienmembran zurückzuführen
sein. Ricker et al. [70] ersetzten in ihren Studien an equinen Spermien
Eigelb durch EPC und kamen zu ähnlichen Ergebnissen wie in der vorliegenden
Studie. Von den Liposomen, die aus gesättigten Lipiden (DLPC, DMPC, DPPC und
DSPC; mit 12, 14, 16 und 18 C-Atomen) bestanden, zeigte DMPC die besten
kryoprotektiven Eigenschaften. DLPC Liposomen verursachten unmittelbar nach der
Verdünnung einen Abfall der PMAI- und PMOT-Werte auf nahezu 0%. Die PMAIund
PMOT-Werte der Spermien waren nach der Kryokonservierung bei allen
50

DISKUSSION
Verdünnern mit Liposomenzusätzen geringer als bei der Verwendung des etablierten
Eigelbverdünners.
Graham und Foote [12] untersuchten die Wirkung mittels Ultraschall hergestellter
Liposomen auf die Kryokonservierbarkeit von bovinen Spermien. In ihrer Studie
verwendeten sie reine PS und PC Lipide mit variierenden Kohlenstoffkettenlängen
und Doppelbindungen sowie Cholesterin allein oder in Kombination mit den
genannten Lipiden. Sie berichteten, vergleichbar zu den vorliegenden Ergebnissen,
dass Lipide mit einer Kettenlänge von weniger als 12 Kohlenstoffatomen eine
hochgradig spermizide Wirkung haben. Ihre Untersuchungen zeigten ferner, dass PS
allein oder in Kombination mit PC oder Cholesterin, aber nicht PC oder Cholesterin
allein, Spermien während der Abkühlphase schützen. In der eigenen Studie
verbesserte die Zugabe von PS in Kombination mit PC die PMAI- und PMOT-Werte
im Vergleich zum Verdünner ohne Zusätze nach dem Auftauen. Die Spermaqualität
in Verdünnern mit Liposomenzusätzen war nach dem Auftauen im Vergleich zu
anderen Untersuchungen [12,54] besser. Dieses Phänomen könnte auf Unterschiede
in den Kryokonservierungsverfahren und in den verwendeten Verdünnern zurückzuführen
sein. So hat die Äquilibrierungszeit vor dem Tiefgefrieren Auswirkungen auf
den Erfolg der Kryokonservierung boviner Spermien [57,58]. In der vorliegenden
Arbeit konnten bessere Auftauergebnisse nach 24 Stunden Äquilibrierung bei 4 °C
mit Eigelb- als auch mit Liposomen-Verdünner im Vergleich zur sechsstündigen
Äquilibrierung festgestellt werden. De Leeuw et al. [54] hatten im Gegensatz dazu in
ihrer Studie bovine Spermien nur zwei Stunden bei 5 °C vor dem Tiefgefrieren
äquilibriert. Außerdem wurde in der eigenen Studie während der Äquilibrierung ein
Schüttler eingesetzt, der die Verdünnerflaschen über die gesamte Dauer gleichförmig
bewegte und somit ein Separieren von Spermien und Liposomen verhindern sollte.
Der positive Effekt einer längeren Äquilibrierungsdauer auf die Spermaqualität nach
dem Auftauen ist vermutlich auf eine zeitlich bedingte Verstärkung der Wechselwirkung
zwischen Verdünnerkomponenten und der Spermienmembran zurückzuführen
[59].
Auch die Art der Herstellung der Liposomen könnte eine Rolle gespielt haben,
weshalb die Spermaqualität in der eigenen Arbeit im Vergleich zu den in der Literatur
51

DISKUSSION
genannten Studien verbessert war. So wurden in den vorliegenden Untersuchungen
extrudierte Liposomen verwendet, während in anderen Arbeiten [12,54] die
Liposomen mittels Ultraschall hergestellt worden waren. In der Studie von Graham
und Foote [12] waren die Unterschiede in den PMOT-Werten nach dem Auftauen
zwischen den Kontrollverdünnern und den Liposomenverdünnern geringer als in der
vorliegenden Arbeit. Da die kryoprotektive Wirkung von Liposomen von deren Größe
abhängt [14], sind mittels Ultraschall hergestellte Liposomen weniger wirksam als
extrudierte Liposomen, welche größer und homogener sind. Kheiloromoon et al. [14]
stellten fest, dass Liposomen mit Durchmessern von 100 bis 400 nm eine höhere
Wirkung in der Stabilisierung von Erythrozyten während der Gefriertrocknung
besitzen als mit Ultraschall behandelte (30 nm) oder aggregierte (1500 nm)
Liposomen. Die Autoren vermuten, dass sterische Einschränkungen die Liposomen
mit großem Durchmesser an der Interaktion mit der Zellmembran hindern. In unseren
Versuchen mit 100 und 200 nm großen DMPC Liposomen waren jedoch keine
Unterschiede in der Spermaqualität festzustellen. Vermutlich lag das daran, dass die
Größenunterschiede geringer als bei der oben genannten Studie waren.
Es gibt verschiedene Hypothesen zu den protektiven Effekten von Lipiden bzw.
Liposomen auf Spermien. So wird angenommen, dass lockere Verbindungen
zwischen den Phospholipiden und der Plasmamembran zu einer Neuordnung von
Membrankomponenten führen [7]. Diese Vermutung basiert auf der Beobachtung,
dass die protektive Wirkung von Lipiden nach Waschung verloren geht [7]. Eine
weitere Hypothese ist, dass durch den Austausch von Lipiden und Cholesterin
zwischen Liposomen und der Spermienmembran, sich deren physikalische
Eigenschaften ändern und die Zellen damit mehr oder weniger stabil gegenüber
sinkenden Temperaturen werden [71,72,73]. In einer kürzlich veröffentlichten Studie
wurde nachgewiesen, dass es zwischen Liposomen aus gesättigten Lipiden, die den
in dieser Studie verwendeten glichen, und Erythrozytenmembranen zu einem
Austausch von Lipiden und Cholesterin kommt [74]. Ein ausgeprägter Lipid- und
Cholesterintransfer wurde in der genannten Arbeit vor allem zwischen Erythrozyten
und DLPC Liposomen beobachtet. DLPC (12:0) verursachte einen kompletten
Integritätsverlust der Erythrozytenmembran, wie auch bei den hier untersuchten
52

DISKUSSION
bovinen Spermien. Membranen, bestehend aus Lipiden mit langen Kohlenstoffkettenlängen,
neigen zu einem deutlich langsameren Austausch von Lipiden und
Cholesterin [75]. Graham et al. [76] behandelten Spermien mit PC (10:0) und
berichten über einen totalen Motilitätsverlust und eine hohe Akrosomenreaktion (AR)
nach 15 Minuten Inkubation. In mehreren Studien wird beschrieben, dass DLPC die
AR bei Spermien induziert [54,77,78]. Bei älteren Studien ohne Kapazitationseinleitung
und -messung muss mit dem Begriff der AR aus heutiger Sicht vorsichtig
verfahren werden. Graham und Foote [79] stellten in einer Studie, in der sie den
Effekt unterschiedlicher Konzentrationen von PC (12:0) auf Motilität und AR der
Spermien untersuchten, fest, dass Spermien von Bullen mit hoher Fertilität weniger
PC zur Akrosomreaktion benötigten als Spermien von Bullen mit geringer Fertilität.
Nach Anzar et al. [69] und Garret et al. [80] ist die Fusion von Liposomen mit
lebenden Zellen als weitere Möglichkeit der Interaktion zwischen Liposomen und
Membranen in Betracht zu ziehen. Die Fusion von PC und PE Liposomen mit der
Spermienmembran haben Anzar et al. [69] mittels Resonanzenergietransfer, R18
Fluoreszenz und Durchflusszytometrie sowohl qualitativ als auch quantitativ beurteilt.
Eine Studie an Eberspermien kam zu dem Ergebnis, dass das Ausmaß der Fusion
von der Spermienkonzentration, der Lipidsorte und der Inkubationszeit abhängt [81].
Bei der letztgenannten Arbeit wurden Liposomen aus fünf definierten Phospholipiden
(PC, PE, SPH, PS und PI) miteinander kombiniert und deren Effekte auf die AR,
Kapazitation und Motilität von Eberspermien während des langsamen Abkühlens
(0,1 °C/Minute) und nach dem Auftauen kryokonservierten Spermas untersucht.
Die Lipidzusammensetzung von bovinen Spermienmembranen ist seit langem
beschrieben [27] und das thermodynamische Phasenverhalten der hier verwendeten
Lipide ist ebenfalls gut charakterisiert [82,83,84]. Beim Übergang von der ungeordneten
Phase in die mehr geordnete Phase während der Abkühlung von Raumtemperatur
auf 4 °C kommt es an bovinen Spermienmembranen zu schwachen
Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Molekülen. Spermienmembranen verbleiben
bei 4 °C relativ flüssig im Vergleich zu reinen Lipiden, die bei dieser
Temperatur in Gelform vorliegen. Der Mangel an kooperativen Phasenübergängen
ist typisch für Spermien und andere Säugerzellen [27,70] und hat Auswirkungen auf
53

DISKUSSION
das Phasenverhalten der gesamten Membran. Die Tatsache, dass DMPC, welches
sich bei 4 °C in der Gelphase befindet, und DOPC, welches bei 4 °C in der flüssigen
Phase vorliegt, ähnliche kryoprotektive Eigenschaften besitzen, lässt aber darauf
schließen, dass der Phasenstatus der Lipide nicht der Schlüsselfaktor für die stabilisierende
Liposom-Spermium-Interaktion ist.
5.1 Schlussfolgerung
Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass sich Verdünner mit synthetisch
hergestellten Liposomen prinzipiell zur Kryokonservierung boviner Spermien eignen.
Die Motilitätsergebnisse der Spermien nach Inkubation und Kryokonservierung in
DOPC:DOPG Liposomen-Verdünner liegen oberhalb der Empfehlung der Arbeitsgemeinschaft
Deutscher Rinderzüchter (ADR). Eine Verlängerung der Äquilibrierungszeit
bei 4 °C von 6 auf 24 Stunden, die mehr Zeit für Liposomen-Spermien-
Interaktionen gibt, wirkt sich positiv auf die Plasmamembranintegrität und Motilität
der Spermien nach dem Auftauen aus. Da die Anteile plasmamembran- und
akrosomintakter bzw. progressiv motiler Spermien nach dem Einfrieren mittels
Liposomen-Verdünner im Vergleich zum Eidotter-Verdünner noch reduziert waren,
sind weitere Studien nötig, bevor synthetische Liposomen als Ersatz von Eidotter für
Tiefgefrierverdünner empfohlen werden können.
54

6 ZUSAMMENFASSUNG
Torleif Röpke (2011)
ZUSAMMENFASSUNG
Untersuchung zur Verbesserung der Kryokonservierbarkeit von Bullensperma
durch den Zusatz von Liposomen zum Verdünner
In dieser Studie wurde die Wirkung von verschiedenen Sorten unilamellarer Liposomen
auf die Qualität von bovinen Spermatozoen vor und nach der Kryokonservierung
im Vergleich zu Eidotter untersucht. Die angewendeten Lipide zur
Herstellung der Liposomen besitzen unterschiedliche thermophysikalische Eigenschaften,
welche die protektiven Effekte von Liposomen auf Zellmembranen bei der
Kryokonservierung beeinflussen können.
Zur Gewinnung des Spermas standen acht Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh
des Besamungsvereins Neustadt a. d. Aisch e.V. (BVN) und fünf Bullen der
Besamungsstation der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover zur Vefrügung. Die in der Studie verwendeten Liposomen wurden mit Hilfe
eines Mini-Extruders in einem Durchmesser von 100 und 200 nm geformt.
Ejakulatvolumen, Dichte und Motilität des Samens wurden bestimmt und danach mit
vorgewärmtem TRIS-Tiefgefrier (TG)-Verdünner I, ergänzt durch den Zusatz von 8%
geklärtem Eigelb oder 4 mg/ml Liposomen, auf 120 × 10 6 Zellen/ml verdünnt. Direkt
im Anschluss wurde die gleiche Menge TRIS-TG-Verdünner II mit und ohne Eigelb
sowie 12,8% Glycerin langsam hinzugegeben, so dass das Endvolumen aus 60 ×
10 6 Zellen/ml, 6,4% Glycerin und 8% Eigelb oder 2 mg/ml Liposomen bestand. Das
verdünnte Sperma wurde für 6 bzw. 24 Stunden im 4 °C Kühlraum äquilibriert bevor
es in 0,25 ml Pailletten abgefüllt wurde. Das Einfrieren der Besamungsportionen
erfolgte im Stickstoffdampf bei -95 °C für 9 Minuten. Die Pailletten wurden im
Wasserbad bei 37 °C für 30 s aufgetaut. Der prozentuale Anteil progressiv motiler
(PMOT) Spermien wurde vor und nach der Kryokonservierung mittels computergestützter
Motilitätsanalyse untersucht. Der Anteil plasmamembran- und akrosom-
55

ZUSAMMENFASSUNG
intakter (PMAI) Spermien wurde durchflusszytometrisch nach FITC-PNA / PI-
Färbung bestimmt.
Liposomen, bestehend aus ungesättigtem EPC oder DOPC (18:1), zeigten einen
ähnlich starken kryoprotektiven Effekt, beurteilt anhand der PMAI- und PMOT-Werte
nach dem Auftauen. Die Anteile PMAI- sowie PMOT-Spermien waren bei der
Verwendung von Liposomen, bestehend aus EPC bzw. DOPC mit DOPG (negativ
geladene Kopfgruppe) höher (p < 0,05) als in der Kombination mit DOPS (negativ
geladen) oder DOPE (neutral), jedoch niedriger (p < 0,05) als bei der Kryokonservierung
mit dem herkömmlichen Eigelbverdünner. Von den aus gesättigten
Lipiden (DLPC, DMPC, DPPC und DSPC; mit 12, 14, 16 und 18 C-Atomen)
bestehenden Liposomen zeigten nur diejenigen aus DMPC kryoprotektive Eigenschaften.
Die PMAI- und PMOT-Werte der Spermien im Verdünner mit DMPC
Liposomen waren vergleichbar mit denjenigen, die mit EPC oder DOPC Liposomen
inkubiert worden waren. DLPC Liposomen verursachten einen Abfall der PMAI- und
PMOT-Werte auf nahezu Null unmittelbar nach der Verdünnung. Die PMAI- und
PMOT-Werte waren aber auch bei Verwendung von DMPC Liposomen geringer
(p < 0,05) als bei dem herkömmlichen Eigelbverdünner. Es waren keine Unterschiede
(p > 0,05) in der kryoprotektiven Wirkung zwischen 100 und 200 nm großen
DMPC Liposomen zu beobachten.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass synthetische Liposomen als Verdünnerzusatz
zur Kryokonservierung boviner Spermien prinzipiell geeignet sind. Da jedoch
die Anteile plasmamembran- und akrosomintakter bzw. progressiv motiler Spermien
nach dem Einfrieren mittels Liposomen-Verdünner im Vergleich zum Eidotter-
Verdünner reduziert waren, sind weitere Studien nötig, bevor synthetische
Liposomen als Ersatz von Eidotter für Tiefgefrierverdünner empfohlen werden
können.
56

7 SUMMARY
Torleif Röpke (2011)
SUMMARY
Studies designed to improve the cryopreservation of bovine sperm by addition
of liposomes to the freezing extender
In this study, the effect of various large unilamellar liposomes on pre-freeze and postthaw
quality of bovine spermatozoa compared to standard egg yolk freezing extender
has been investigated. The lipids in the liposomes have different thermophysical
properties which are primarily responsible for the cryoprotective effect of liposomes
on cellular membranes.
Semen was collected from eight bulls, that were held at the ‘Besamungsverein
Neustadt a. d. Aisch eV’ in Neustadt/Aisch, and from five bulls, that were held at the
Clinic for Cattle at the University of Veterinary Medicine Hannover. The unilamellar
liposomes in this study were prepared in a diameter of 100 and 200 nm using a miniextruder.
Volume, cell concentration and motility of semen were evaluated. Subsequently
semen was diluted with pre-warmed freezing extender I supplemented with either 8%
clarified egg yolk or 4 mg mL -1 liposomes at 120 × 10 6 cells/mL. An equal amount of
freezing extender II supplemented with or without egg yolk as well as 12.8% glycerol
was added slowly, resulting in 60 × 10 6 cells/mL, 6.4% glycerol and either 8% egg
yolk or 2 mg/mL liposomes. This suspension was equilibrated at 4 o C during 6 or 24 h
with agitation, after which it was filled in 0.25 mL straws. Straws were frozen in liquid
nitrogen vapor at -95 o C for 9 min. Thawing of the straws was done in a water bath of
37 °C for 30 s. The percentage of progressively motile (PMOT) sperm was
determined for extended and freeze-thawed sperm samples using computer assisted
sperm analysis. A double staining with PI and FITC-PNA was performed and the
plasma and acrosome intact (PMAI) sperm was assessed using a flow cytometer.
57

SUMMARY
Liposomes composed of unsaturated EPC or DOPC (18:1) protected sperm during
cryopreservation assessed by PMAI- and PMOT-values after freeze-thaw. The
portion of PMAI- and PMOT-sperm was higher (p < 0.05) using liposomes which
consisted of EPC or DOPC and DOPG (negatively charged head group) compared to
addition of DOPS (negatively charged) or DOPE (neutral), but lower (p < 0.05)
compared to standard egg yolk freezing extender. Among the saturated lipids that
were tested (DLPC, DMPC, DPPC, and DSPC; with 12, 14, 16 and 18 C-atoms,
respectively) only DMPC showed cryoprotective properties. PMAI- and PMOT-values
in freezing extender with DMPC liposomes were similar to the rates obtained with
EPC and DOPC liposomes. However, the percentages of PMAI- and PMOT-sperm
incubated with DMPC liposomes were lower (p < 0.05) compared to standard egg
yolk freezing extender. No differences (p < 0.05) were observed in cryoprotective
effects between 100 nm and 200 nm DMPC liposomes.
The results of this study indicate that synthetic liposomes are in principle an
appropriate addition to extender for cryopreservation of bovine sperm. Because the
postthaw percentages of plasma and acrosome membrane intact and progressively
motile spermatozoa cryopreserved using liposome-extender were lower compared to
those using standard egg yolk extender, further studies are necessary before
synthetic liposomes can be recommended for substitution of egg yolk in freezing
extender.
58

ABBILDUNGSVERZEICHNIS
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 2.1: Schemazeichnung einer Lipidmembran. Proteine und Zucker
bewegen sich innerhalb der fluiden Lipiddoppelschicht.
(http://www.unitus.it/scienze/corsonew/lezione11.html)........................
Abb. 2.2: Prinzip der Herstellung von Phospholipiden aus Eidotter am Beispiel
des Phosphatidylcholins (Egg PC) .………………………...……………
Abb. 2.3: Schematische Darstellung der Struktur der Lipide EPC, DLPC,
DMPC, DPPC und DSPC. (Bildquelle: „www.avantilipids.com“) ……...
Abb. 2.4: Schematische Darstellung des Aufbaus unterschiedlicher Vesikel.
LMV = large multilamellar vesicles; LUV = large unilamellar vesicles;
SUV = small unilamellar vesicles. (Bildquelle: www.avantilipids.com)..
Abb. 3.1: Übersicht über die Zusammensetzung der Kontrollansätze mit (TRIS
+ EY) und ohne Eigelb (TRIS - EY) und der Liposomenansätze (TRIS
– EY + LUV). TG = Tiefgefrierung, EY = Eigelb, LUV = large
unilamellar vesicles (2 mg/ml), GLY = Glycerin. ……………………..…
Abb. 3.2: Intensitätsverteilung von EPC Liposomen bei Verwendung einer
100 nm Polycarbonatmembran, gemessen mittels Dynamic Light
Scattering (DLS) (Viscotek, Malvern Instruments Ltd, Worcestershire,
UK). ...…………………………………..……………………………………
Abb. 3.3: Schematische Darstellung der Zusammensetzung des Avanti® Mini-
Extruder von Avanti Polar Lipids, welcher zur Extrusion der
Liposomen verwendet wurde. (Bildquelle: „www.avantilipids.com“)…..
59
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21
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ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 3.4: Avanti® Mini-Extruder von Avanti Polar Lipids in seine Einzelteile
zerlegt (A) bzw. zusammengebaut in Gebrauch (B).
(Bildquelle: „www.avantilipids.com“)………………………………………
Abb. 3.5: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Bestimmungen
der Plasmamembran und Akrosomintegrität (PMAI) und der
progressiven Motilität (PMOT) im Rahmen der Prüfung der Effekte
verschiedener Konzentrationen von EPC Liposomen auf die
Spermaqualität. …………………………………………………………….
Abb. 3.6: Schematische Darstellung der Aufteilung der Ejakulate in Kontroll-
(mit (+ EY) und ohne Eigelb (- EY)) und Testverdünner mit
Liposomen aus gesättigten (DLPC, DMPC, DPPC oder DSPC) und
ungesättigten (EPC/DOPC:DOPX) Lipiden in einer Konzentration von
2 mg/ml Verdünner. PX steht für PC, PS, PG oder PE. Dazu ist die
zeitliche Abfolge der Bestimmungen der Plasmamembran und
Akrosomintegrität (PMAI) und der progressiven Motilität (PMOT)
dargestellt. ..…………………………………………………………………
Abb. 3.7: Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge der Bestimmungen
der Plasmamembran- und Akrosomintegrität (PMAI) und der
progressiven Motilität (PMOT). …………………………………………...
Abb. 4.1: Prozentualer Anteil plasmamembran- und akrosomintakter Spermien
(PMAI) in TRIS-GLY-Verdünner in Abhängigkeit von der EPC-
Konzentration. Die PMAI-Werte wurden vor dem Einfrieren
unmittelbar nach dem Verdünnen bei Raumtemperatur (0 h bei RT),
nach 6 Stunden (6 h bei 4 °C) und 24 Stunden Äquilibrierung (24 h
bei 4 °C) sowie nach dem Einfrieren und Auftauen (6 h / 24 h bei
4 °C, aufgetaut) untersucht. Es sind Mittelwerte ± Standardabweichungen
dargestellt (n = 9 Ejakulate von 5 Bullen). …………….
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34
38
39
39
42

ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 4.2: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI) Spermien nach
Verdünnung in TRIS-GLY-Verdünner mit und ohne Zusatz von Eigelb
(EY) bzw. 2,0 mg/ml EPC Liposomen. Die Analysen erfolgten
unmittelbar nach dem Verdünnen (0 h bei RT), nach 6 Stunden
Äquilibrierung (6 h bei 4 °C), nach 24 Stunden Äquilibrierung (24 h
bei 4 °C), unmittelbar nach dem Auftauen (6 h / 24 h bei 4 °C,
aufgetaut) und nach dreistündiger Inkubation bei 37 °C (6 h / 24 h bei
4 °C, aufgetaut (3 h)). Es sind Mittelwerte ± Standardabweichungen
dargestellt. (n = 9 Ejakulate von 5 Bullen). Eine zwei Werte miteinander
verbindende Klammer mit einem * zeigt einen signifikanten
Unterschied (p < 0,05) …………………………………………………….
Abb. 4.3: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI; A) sowie progressiv
motile (PMOT; B) Spermien nach Verdünnung in TRIS-GLY-
Verdünner mit EPC:DOPX Liposomen (A und B). PX steht für PC,
PS, PG oder PE. Die Analysen erfolgten unmittelbar nach dem
Verdünnen bei Raumtemperatur (0 h), nach 24 Stunden
Äquilibrierung bei 4 °C (24 h bei 4 °C) und unmittelbar nach dem
Auftauen (Aufgetaut). Es sind Mittelwerte ± Standardabweichungen
dargestellt (n = 6 Bullen mit je 4 Ejakulaten). Werte mit unterschiedlichen
Buchstaben (a, b, c, d, e) unterscheiden sich signifikant
zwischen den Verdünnern innerhalb derselben Untersuchungszeitpunkte
(p < 0,05). ……………….……………………………………..
Abb. 4.4: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI; A) sowie progressiv
motile (PMOT; B) Spermien nach Verdünnung in TRIS-GLY-
Verdünner mit und ohne Zusatz von Eigelb (EY) und mit
synthetischen DOPC:DOPX Liposomen. PX steht für PC, PS, PG
oder PE. Die Analysen erfolgten unmittelbar nach dem Verdünnen
bei Raumtemperatur (0 h), nach 24 Stunden Äquilibrierung bei 4 °C
(24 h bei 4 °C) und unmittelbar nach dem Auftauen (Aufgetaut). Es
61
43
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ABBILDUNGSVERZEICHNIS
sind Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt (n = 6 Bullen
mit je 4 Ejakulaten). Werte mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b, c,
d, e) unterscheiden sich signifikant zwischen den Verdünnern
innerhalb derselben Untersuchungszeitpunkte (p < 0,05). ……………
Abb. 4.5: Plasmamembran- und akrosomintakte (PMAI; A) sowie progressiv
motile (PMOT; B) Spermien nach Verdünnung in TRIS-GLY-
Verdünner mit synthetischen DXPC Liposomen. DX steht für DL, DM,
DP oder DS. Die Analysen erfolgten unmittelbar nach dem
Verdünnen bei Raumtemperatur (0 h), nach 24 Stunden Äquilibrierung
bei 4 °C (24 h bei 4 °C) und unmittelbar nach dem Auftauen
(Aufgetaut). Die Kontrollen bestanden aus TRIS-GLY-Verdünner mit
und ohne Eigelb (EY). Es sind Mittelwerte ± Standardabweichung
dargestellt (n = 6 Bullen mit je 4 Ejakulaten). Werte mit
unterschiedlichen Buchstaben (a, b, c, d) unterscheiden sich (p <
0,05) innerhalb derselben Untersuchungszeitpunkte. ………………….
62
47
49

9 TABELLENVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 3.1: Chemische Zusammensetzung der TRIS-Stammlösung zur Herstellung
des TRIS-Tiefgefrierverünners I und II. ..…………………..
Tabelle 3.2: Übersicht über die verwendeten synthetischen Phospholipide zur
Herstellung von Liposomen. R beschreibt die Fettsäureketten: An
erster Stelle steht die Anzahl der Kohlenstoffatome, an zweiter die
Zahl der Doppelbindungen. Tm ist die Phasenübergangstemperatur
(phase-transition-temperature). Der Durchmesser gibt
die Porengröße der Polycarbonatmembran bei der Liposomenherstellung
an. …………………………...…..…………………………
63
29
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78

11 ANHANG
11.1 Extrusions-Technik
Extrusion Technique
Quelle: http://www.avantilipids.com
ANHANG
1) Prepare dry lipid mixture by lyophilization or evaporation.
2) Place the extruder stand / heating block onto a hot plate. Insert a thermometer into
the well provided in the heating block. Switch the hot plate on, and allow to reach the
desired temperature. Allow the temperature of the heating block to reach the desired
value (approximately 15 minutes).
3) Hydrate lipid mixture using a suitable buffer for at at least 30 min. The lipid
suspension should be kept above the phase transition temperature of the lipid during
hydration and extrusion. To increase the efficiency of entrapment of water-soluble
compounds, one may subject the hydrated lipid suspension to 3-5 freeze/thaw cycles
by alternately placing the sample vial in a dry ice bath and warm water bath.
4) Once the sample is fully hydrated, load the sample into one of the gas-tight
syringes and carefully place into one end of the mini-extruder.
Note: To reduce the dead volume, pre-wet the extruder parts by passing a syringe
full of buffer through the extruder; discard the buffer. New syringes may have tight
fitting parts; to facilitate extrusion, pre-wet syringe barrel and plunger with buffer prior
to inserting plunger into barrel.
5) Place the empty gas-tight syringe into the other end of the mini-extruder. Make
sure the empty syringe plunger is set to zero; the syringe will fill automatically as the
lipid is extruded through the membrane.
6) Check the temperature of the heating block before placing the assembled extruder
apparatus into the heating block. The temperature must be below 80°C, or the
syringes will be damaged.
7) Insert the fully assembled extruder apparatus into the extruder stand. Insert the
hex nut so that the apex of the hex nut points down.
79

ANHANG
Use the swing-arm clips to hold the syringes in good thermal contact with the heating
block.
Note: The extruder apparatus must be fully assembled before inserting in the heating
block, otherwise it will be damaged. The Syringes should fit tight into the Extruder.
8) Allow the temperature of the lipid suspension to equilibrate with the temperature of
the heating block (approximately 5-10 minutes)
9) Gently push the plunger of the filled syringe until the lipid solution is completely
transferred to the alternate syringe.
10) Gently push the plunger of the alternate syringe to transfer the solution back to
the original syringe.
11) Repeat previous two steps. A minimum of 4 times (total of 10 passes through
membrane). In general, the more passes though the membrane, the more
homogenous the lipid solution becomes.
12) The final extrusion should fill the alternate syringe. This is to reduce the chances
of contamination with larger particles or foreign material.
13) After the final extrusion, remove the mini-extruder from the heating block.
14) Remove the filled syringe from the extruder and inject the lipid solution into a
clean sample vial. Important: When removing syringes, pull the syringe straight out of
the extruder; removing at an angle could result in cracking the syringe.
15) Store the vesicle preparation above the transition temperature of the lipid during
the experiment. When not in use, store the vesicle solution at 4 °C. Do not freeze.
Vesicle solutions are not stable in aqueous media for more than 3-4 days when
stored at 4°C. Storage of vesicle solutions at higher temperatures and pH 8
may reduce the lifetime of the vesicle suspension.
16) Clean apparatus thoroughly before using with a new lipid preparation.
80

ANHANG
11.2 Zusammensetzung der Kontroll- und Liposomenansätze
Tabelle 11.1: Zusammensetzung der Kontrollansätze. Die erste Kontrolle war TRIS-TG-Verdünner mit 8% geklärtem
Eigelb und Glycerin (TRIS + EY + GLY), die zweite ohne Zusatz von Eigelb oder Liposomen mit Glycerin
(TRIS + GLY). TG steht für Tiefgefrierung.
Kontrollansätze
1) TRIS + EY
+ GLY
1,5x TRIS
(ml)
4,5 ml TRIS +/- EY
Wasser
(ml)
5 ml Verdünner I 5 ml Verdünner II
EY
(ml)
0,5 ml Spermalösung
(für 120*10 6 / ml TG-I)
TRIS
(ml)
81
Sperma
(ml)
4 ml TRIS + GLY
1,5x TRIS
(ml)
99,5% GLY
(ml)
Wasser
(ml)
3 0,5 1,0 variabel variabel 3,36 0,64 - 1,0
2) TRIS + GLY 3 1,5 - variabel variabel 3,36 0,64 1,0 -
EY
(ml)

ANHANG
Tabelle 11.2: Zusammensetzung der vier TRIS-GLY-Verdünner mit Liposomen aus ungesättigten EPC/DOPC:DOPX-
Fettsäuren (PX steht für PC, PS, PG oder PE) mit unterschiedlichen Kopfgruppen.
Liposomenansätze
im Versuch 3.4.2
3) TRIS
+ 2,0 mg/ml EPC/
DOPC:DOPC + GLY
4) TRIS
+ 2,0 mg/ml EPC/
DOPC:DOPS + GLY
5) TRIS
+ 2,0 mg/ml EPC/
DOPC:DOPG + GLY
6) TRIS
+ 2,0 mg/ml EPC/
DOPC:DOPE + GLY
1,5x TRIS
(ml)
4,5 ml TRIS + LUV
Wasser
(ml)
5 ml Verdünner I 5 ml Verdünner II
40 mg/ml
LUV in
Wasser (ml)
82
0,5 ml Spermalösung
(für 120*10 6 / ml TG-I)
TRIS
(ml)
Sperma
(ml)
4 ml TRIS + GLY
1,5x TRIS
(ml)
99,5% GLY
(ml)
Wasser
(ml)
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0

ANHANG
Tabelle 11.3: Zusammensetzung der TRIS-GLY-Verdünner mit Liposomen aus gesättigten DLPC-, DMPC-, DPPC- oder
DSPC- Fettsäuren mit unterschiedlichen Kohlenstoffkettenlängen.
Liposomenansätze im
Versuch 3.4.3
3) TRIS
+ 2,0 mg/ml DLPC + GLY
4a) TRIS
+ 2,0 mg/ml DMPC
100 nm + GLY
4b) TRIS
+ 2,0 mg/ml DMPC
200 nm + GLY
5) TRIS
+ 2,0 mg/ml DPPC + GLY
6) TRIS
+ 2,0 mg/ml DSPC + GLY
1,5x TRIS
(ml)
4,5 ml TRIS + EPC
Wasser
(ml)
5 ml Verdünner I 5 ml Verdünner II
40 mg/ml
LUV in
Wasser (ml)
83
0.5 ml Spermalösung
(für 120*10 6 / ml TG-I)
TRIS
(ml)
Sperma
(ml)
4 ml TRIS + GLY
1,5x TRIS
(ml)
99,5% GLY
(ml)
Wasser
(ml)
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0
3,0 1,0 0,5 variabel variabel 3,36 0,64 1,0

Auszüge der vorliegenden Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt:
44. Jahrestagung „Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung“ gleichzeitig
36. Veterinär-Humanmedizinische Gemeinschaftstagung
vom 16. bis 18. Februar 2011 in Hannover
T. Röpke, H. Oldenhof, C. Leiding, H. Bollwein und W. F. Wolkers
„Verbesserung der Kryokonservierbarkeit von Bullensperma durch Zusatz von
Liposomen zum Verdünner“
Teile dieser Dissertation wurden in folgender Publikation veröffentlicht:
Röpke, T., Oldenhof, H., Leiding, C., Sieme, H., Bollwein, H.,Wolkers, W. F. (2011)
Liposomes for cryopreservation of bovine sperm
Theriogenology 76, 1465-72
84

Danksagung
Mein erster Dank gilt Prof. Dr. Heinrich Bollwein für die Überlassung des
interessanten Themas, die jederzeit gewährte Unterstützung und das Engagement
bei der Anfertigung dieser Dissertation.
Ich danke Dr. Harriëtte Oldenhof und Prof. Willem F. Wolkers für die motivierende
und tatkräftige Betreuung sowie für die vielen konstruktiven Hinweise, die zur
Fertigstellung dieses Projektes beigetragen haben.
Ein großes Dankeschön gebührt dem Förderverein Biotechnologieforschung e. V.
(FBF), Bonn, für die Bereitstellung von Forschungsmitteln.
Dr. Claus Leiding und dem Besamungsverein Neustadt a.d. Aisch e. V. danke ich für
die Möglichkeit der Versuchsdurchführung und die großzügige Bereitstellung
hervorragender Arbeitsbedingungen. Allen Mitarbeitern der Besamungsbullenstation
danke ich für die freundliche Aufnahme in das Team und die angenehme Zeit.
Besonders herzlich danke ich Frau Göbel für ihre unermüdliche Hilfe, das entgegengebrachte
Vertrauen und die menschliche und konstruktive Zusammenarbeit.
Christoph Stoll danke ich für die intensive Einarbeitung in die Herstellung von
Liposomen am Institut für Mehrphasenprozesse der Leibniz Universität Hannover
und seiner stetigen Hilfsbereitschaft.
Ein großer Dank gilt Christel Hettel und Anne-Kathrin Blässe für die Hilfe bei den
ersten Schritten im Labor und der dabei notwendigen moralischen Unterstützung.
Danken möchte ich auch Dr. Oguz Calisici und Mathias Siuda für die umfangreiche
Einführung in die Flowzytometrie und für ihre große Hilfsbereitschaft bei Problemlösungen.

Herzlich bedanken möchte ich mich auch bei meinen Mitdoktoranden, vor allem bei
denen der Besamungsstation der Klinik für Rinder, für das kollegiale Miteinander und
die schöne gemeinsame Zeit. Speziell danke ich Swenja Bijmholt und Kay Müller für
unvergessliche Erlebnisse in Neustadt a.d. Aisch.
Ich danke meinen Freunden für das Einfach-Da-Sein, für die mentalen Wegweisungen
beim Abbau von Blockaden und für die nötige Abwechslung in dieser
langen Zeit.
Mein größter Dank gebührt meiner Familie, besonders meinen Eltern Brigitte und
Hans Eckhard Röpke, für ihre Liebe und Unterstützung.