Einleitung - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen
und der Klinik für Pferde
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
__________________________________________________________________________
Untersuchungen zur Pathogenese
der Typhlocolitis des Pferdes
INAUGURAL–DISSERTATION
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Christoph Baums
aus Düsseldorf
Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. G. Amtsberg
Prof. Dr. E. Deegen
1. Gutachter: Prof. Dr. G. Amtsberg
2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. E. M. Liebler-Tenorio
Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2003

Meinen Eltern
und
Cordula

Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert:
BAUMS, C., C. P. BARTMANN, M. PETERS, G. AMTSBERG u. E. DEEGEN (2002):
Untersuchungen zur Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes.
In: E. DEEGEN u. M. RÖCKEN (Leitung): 17. Arbeitstagung der Fachgruppe
Pferdekrankheiten der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e. V..
25.4.–26.4.2002, Hannover, 192–195
BAUMS, C., J. VERSPOHL, J. ROHDE, G. AMTSBERG u. R. GOETHE (2002):
P23 Multiplex-PCR zur Genotypisierung von Clostridium perfringens-Isolaten in der
Diagnostik.
Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 115, 321–400

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ......................................................................................................................... 13
2 Schrifttum ........................................................................................................................ 14
2.1 Die Typhlocolitis des Pferdes.................................................................................... 14
2.1.1 Klinik .....................................................................................................................14
2.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde....................................................................... 16
2.1.3 Pathologisch-histologische Befunde...................................................................... 17
2.1.4 Immunpathologie................................................................................................... 18
2.1.5 Risikofaktoren........................................................................................................ 19
2.1.6 Differentialdiagnosen ............................................................................................ 25
2.1.7 Experimentelle Induktion der Typhlocolitis des Pferdes....................................... 32
2.2 Clostridium difficile .................................................................................................... 33
2.2.1 Allgemeine Eigenschaften und Nachweismöglichkeiten ...................................... 33
2.2.2 Virulenzfaktoren von Cl. difficile.......................................................................... 34
2.2.3 Biochemische Merkmale der Toxine A und B ...................................................... 35
2.2.4 Biologische Wirkungen der Toxine A und B (Zytotoxizität und
Enterotoxizität) ...................................................................................................... 36
2.2.5 Nachweis der Toxine A und B in der Diagnostik.................................................. 36
2.2.6 Toxin A und B als Glukosyltransferasen der kleinen GTPasen ............................ 37
2.2.7 Störung der Epithelzellbarrierefunktion durch die Toxine A und B ..................... 38
2.2.8 Immunpathologische Wirkung von Toxin A......................................................... 39
2.2.9 Aufnahme der Toxine A und B in die Zelle .......................................................... 40
2.2.10 Genetik der Toxingene tcdA und tcdB .................................................................. 40
2.2.11 Genregulation der Toxingene tcdA und tcdB........................................................ 41
2.2.12 TcdE....................................................................................................................... 42
2.2.13 Das binäre ADP-ribosylierende Enzym (CDT)..................................................... 42
2.2.14 Die Adhäsine Cwp66 und SlpA............................................................................. 42
2.2.15 Typisierung von Cl. difficile.................................................................................. 43
2.2.16 Die Pseudomembranöse Colitis des Menschen ..................................................... 44
2.2.17 Antibiotika als Risikofaktor für Cl. difficile-assoziierte Erkrankungen ................ 45

2.2.18 Untersuchungen zur Mikroökologie von Cl. difficile im Tiermodell.................... 46
2.2.19 Antagonismus von toxinogenen Cl. difficile- durch atoxinogene Cl. difficile-
Stämme .................................................................................................................. 48
2.3 Clostridium perfringens.............................................................................................. 48
2.3.1 Allgemeine Eigenschaften und Nachweismöglichkeiten ...................................... 48
2.3.2 Typisierung von Cl. perfringens............................................................................ 49
2.3.3 Virulenzfaktoren von Cl. perfringens und deren Genetik ..................................... 50
2.3.4 Das α-Toxin........................................................................................................... 51
2.3.5 Das Enterotoxin (CPE) .......................................................................................... 51
2.3.6 Das β2-Toxin......................................................................................................... 52
2.3.7 Toxingenregulation von Cl. perfringens................................................................ 53
2.3.8 Cl. perfringens als Enterotoxämie- und Enteritiserreger....................................... 54
2.4 Antibiotikaresistenzen von Cl. difficile und Cl. perfringens................................... 55
2.4.1 Resistenzprüfung ................................................................................................... 55
2.4.2 Resistenzspektren von Cl. difficile und Cl. perfringens ........................................ 56
2.4.3 Antibiotikaresistenzmechanismus von Cl. difficile und Cl. perfringens
gegenüber Makroliden........................................................................................... 57
3 Material und Methoden .................................................................................................. 59
3.1 Herkunft, Gewinnung und Aufbewahrung des Untersuchungsmaterials............ 59
3.2 Klinische Allgemeinuntersuchung............................................................................ 60
3.3 Hämatologische Untersuchung der Blutproben der Versuchspferde................... 60
3.4 Parasitologische Untersuchung der Versuchspferde.............................................. 61
3.5 Kennzeichen der Versuchspferde............................................................................. 61
3.6 Experimentelle Behandlungsmaßnahmen der Versuchspferde ............................ 61
3.7 Durchführung der Laparotomie............................................................................... 68
3.8 Fütterung und Durchführung der Nahrungskarenz .............................................. 69
3.9 Gaschromatographie ................................................................................................. 70
3.9.1 Aufarbeitung der Proben für die gaschromatographische Analytik der
Fettsäuren (Wasserextraktion)............................................................................... 70

3.9.2 Gaschromatographie der Wasserextrakte des Probenmaterials............................. 70
3.10 Kulturelle bakteriologische Diagnostik ................................................................... 70
3.10.1 Quantitativer Anaerobiernachweis ........................................................................ 70
3.10.2 Qualitativer Anaerobiernachweis .......................................................................... 71
3.10.3 Untersuchung auf Salmonellen.............................................................................. 72
3.10.4 Diagnostisches Vorgehen zur Identifizierung von Cl. difficile und
Cl. perfringens ....................................................................................................... 72
3.10.5 Salmonellendiagnostik........................................................................................... 75
3.10.6 Untersuchung des Probenmaterials auf die Cl. difficile-Toxine A und B ............. 76
3.10.7 Resistenzprüfung ................................................................................................... 77
3.11 Molekularbiologische Methoden .............................................................................. 78
3.11.1 DNA-Extraktion aus Cl. perfringens und Cl. difficile........................................... 79
3.11.2 PCR der Toxingene tcdA und tcdB sowie des Erythromycinresistenzgens
erm von Cl. difficile-Isolaten ................................................................................. 80
3.11.3 Multiplex-PCR zum Nachweis der Toxingene cpa, cpb, etxD, iap, cpb2 und
cpe von Cl. perfringens.......................................................................................... 81
3.11.4 Ribotypisierung von Cl. perfringens-Isolaten ....................................................... 86
3.11.5 PCR-Ribotypisierung von Cl. difficile................................................................... 90
4 Ergebnisse ........................................................................................................................ 91
4.1 Ergebnisse der Verlaufsuntersuchungen an vier Versuchspferden...................... 91
4.1.1 Versuchspferd „Ede“ ............................................................................................. 91
4.1.2 Versuchspferd „Agu“............................................................................................. 99
1.1.2 Versuchspferd „Resinale“.................................................................................... 105
1.1.3 Versuchspferd „Speranza“................................................................................... 114
1.1.4 Resistenzprüfung ................................................................................................. 119
1.1.5 Untersuchung der Cl. difficile-Isolate auf das Erythromycin-Resistenzgen
erm ....................................................................................................................... 121
1.1.6 Vergleichende Darstellung der Ergebnisse.......................................................... 122
1.1.7 Ergebnisse der gaschromatographischen Fettsäureanalytik im
Probenmaterial..................................................................................................... 128

1.2 Ergebnis der Genotypisierung von equinen Cl. perfringens-Isolaten aus
dem Probenmaterial des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der
Tierärztlichen Hochschule Hannover .................................................................... 130
2 Diskussion....................................................................................................................... 132
2.1 Verlaufsuntersuchung von vier Versuchspferden ................................................ 132
2.1.1 Hospitalisierung................................................................................................... 133
2.1.2 Nahrungskarenz ................................................................................................... 134
2.1.3 Gentamicin........................................................................................................... 136
2.1.4 Operation ............................................................................................................. 138
2.1.5 Erythromycin ....................................................................................................... 140
2.1.6 Kombination der Faktoren Nahrungskarenz und Erythromycin ......................... 143
2.2 Metronidazol-Resistenz der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Isolate ................. 147
2.3 Genotypisierung von equinen Cl. perfringens-Isolaten aus dem
Probenmaterial des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der
Tierärztlichen Hochschule Hannover .................................................................... 147
2.4 Schlussfolgerungen .................................................................................................. 150
3 Zusammenfassung ......................................................................................................... 151
4 Summary ........................................................................................................................ 154
5 Literatur ......................................................................................................................... 156
6 Anhang............................................................................................................................ 199
6.1 Nährmedien .............................................................................................................. 199
6.2 Abbildungen ............................................................................................................. 202
6.3 Tabellenverzeichnis ................................................................................................. 207
6.4 Abbildungsverzeichnis............................................................................................. 209

Abkürzungsverzeichnis
ATCC American Type Culture Collection, USA
b Basen
bp Basenpaare
BPLS Brillantgrün-Phenolrot-Laktose-Saccharose
bwt engl.: body weight
CCFA Cycloserin-Cefoxitin-Fructose-Agar
CDAD Clostridium difficile-assoziierte Diarrhoe
CDT Clostridium difficile-Toxin
(Aktin-spezifisches, ADP-ribosylierendes Enzym)
Cl. Clostridium
CPE Clostridium perfringens-Enterotoxin
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
Da Dalton
dATP 2`-Desoxy-Adenosin-5`-Triphosphat
dCTP 2`-Desoxy-Cytosin-5`-Triphosphat
dest. destilliert
dGTP 2`-Desoxy-Guanosin-5`-Triphosphat
DIN Deutsche Industrienorm
DNA engl.: desoxyribonucleic acid
dNTP 2`-Desoxy-Nukleotid-5`-Triphosphat
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Braunschweig, Deutschland
dTTP 2`-Desoxy-Thymidin-5`-Triphosphat
E. Escherichia
EDTA engl.: ethylendiamine-tetraaceticacid
ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assay
EME engl.: equine monocytic ehrlichiosis
engl. englisch
GE Gesamteiweiß
GTP Guanosin-Triphosphat

h Stunde
Htk. Hämatokrit
IBD engl.: inflammatory bowel disease
Ig Immunoglobulin
IL Interleukin
i. m. intramuskulär
insg. insgesamt
i. v. intravenös
KBE koloniebildende Einheit
kDa Kilodalton
KG Körpergewicht
LPS Lipopolysaccharide
M Molarität (mol/l)
MF Mac Farland
MHK minimale Hemmstoffkonzentration
min Minuten
MLS Makrolid-Lincosamid-Streptogramin
mM millimolar (mmol/l)
MP-PCR Multiplex-PCR
mRNA engl.: messenger RNA
NCCLS engl.: National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCTC National Collection of Type Cultures, London, England
NF-κB engl.: nuclear factor-κB
n. n. nicht nachgewiesen
n. u. nicht untersucht
OP Operation
PCR engl.: polymerase chain reaction
p. op. post operationem
PMC Pseudomembranöse Colitis
R resistent
rDNA engl.: ribosomal DNA
rRNA engl.: ribosomal ribonucleic acid

S sensibel
s. c. subkutan
SDS Sodiumdodecylsulfat
sec Sekunden
SSC engl.: standard saline citrate
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris Borsäure EDTA
TBG Tetrathionat-Brillantgrün-Galle
TE Tris EDTA
TEN Tris EDTA NaCl
Tm Schmelztemperatur
Tn Transposon
TNF Tumornekrosefaktor
U engl.: units
UDP Uridindiphosphat
UV ultraviolett

Einleitung 13
1 Einleitung
Das klinische Bild der Typhlocolitis des Pferdes ist gekennzeichnet durch einen akuten bis
perakuten Verlauf mit Diarrhoe, Kolik, Schocksymptomatik, Hämokonzentration und
Neutropenie (COHEN u. DIVERS 1998). Die Mortalität liegt bei 50–70 % (DEEGEN 2000).
Im Caecum und Colon ascendens dieser Patienten manifestiert sich eine fibrinösnekrotisierende
oder in einigen Fällen auch eine hämorrhagische Typhlocolitis (POHLENZ et
al. 1992). Diese Erkrankung tritt vor allem als Komplikation bei hospitalisierten
Kolikpatienten auf. Verschiedene Faktoren wirken auf diese Patientengruppe ein, die mit der
Pathogenese der Typhlocolitis kausal in Zusammenhang stehen können. Neben den durch
eine Grunderkrankung hervorgerufenen, prädisponierenden Veränderungen sind tierärztliche
Behandlungsmaßnahmen als Risikofaktoren der Typhlocolitis zu berücksichtigen. Antibiose,
Operationen, Nahrungskarenz und Futterumstellungen könnten unter Klinikbedingungen die
Ansiedlung von nosokomialen Infektionserregern ermöglichen. In diesem Zusammenhang
wird Clostridium (Cl.) difficile und Cl. perfringens eine enteropathogene Bedeutung für die
Typhlocolitis des Pferdes beigemessen (GREIß et al. 1996; BÅVERUD et al. 1997; JONES
2000). Bestimmte Stämme dieser beiden Arten bilden Toxine, die es diesen Keimen
ermöglichen, die charakteristischen pathologischen Veränderungen der Typhlocolitis
hervorzurufen. Das Toxin A und B von Cl. difficile sowie das Entero- und β2-Toxin von
Cl. perfringens könnten die entscheidenden Virulenzfaktoren für die Pathogenese der
Clostridien-assoziierten Typhlocolitis des Pferdes darstellen (GIBERT et al. 1997;
HERHOLZ et al. 1999; JONES 2000; WEESE et al. 2001 a).
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die genannten tierärztlichen Behandlungs-
maßnahmen bei hospitalisierten Versuchspferden die intestinale Ansiedlung und Vermehrung
von Cl. difficile und Cl. perfringens begünstigen. Am Ende der Versuchsreihe sollte bei
diesen Pferden die Typhlocolitis experimentell induziert und auf eine ätiologische Beteiligung
von Cl. difficile und Cl. perfringens hin untersucht werden. Durch die genotypische und
phänotypische Charakterisierung der Cl. difficile- und Cl. perfringens-Isolate wurde der
Fragestellung nachgegangen, inwieweit tierärztliche Behandlungsmaßnahmen eine Selektion
von toxinogenen und Antibiotika-resistenten Stämmen dieser beiden Erreger hervorrufen.

Schrifttum 14
2 Schrifttum
2.1 Die Typhlocolitis des Pferdes
2.1.1 Klinik
ROONEY et al. beschrieben 1963 erstmalig die Typhlocolitis des Pferdes unter der
Bezeichnung Colitis X als eigenständige Erkrankung. Die Autoren stellten den perakuten
Verlauf, die schlechte Prognose und als Leitsymptom die exzessive wässrige Diarrhoe heraus.
Infolge der meist plötzlich einsetzenden Diarrhoe kommt es vor allem bei unzureichender
Therapie zu einer hochgradigen Dehydratation. Nach STAEMPFLI et al. (1991) bestimmt bei
einem Typhlocolitispatienten das Ausmaß der Dehydratation die Prognose. Zahlreiche
Autoren berichten allerdings auch von Fällen, bei denen nach perakutem tödlichem Verlauf
ohne Diarrhoe die charakteristischen Läsionen im Caecum und Colon vorlagen (ROONEY et
al. 1963; BRYANS 1963; DIXIT u. KARA 1973; KRAFT 1985).
Das Verhalten eines Typhlocolitispatienten kann von der Depression bis zur hochgradigen
Koliksymptomatik in unterschiedlicher Weise gestört sein. Da die Kolik vor dem Ausbruch
der Diarrhoe auftreten kann, muss die Typhlocolitis als Differentialdiagnose beim
Kolikpatienten grundsätzlich immer berücksichtigt werden (COHEN u. DIVERS 1998;
LLOYD 1988).
Weiterhin zeichnet sich die Typhlocolitis klinisch durch Inappetenz, Apathie, Darmatonie und
einen hypovolämischen Schock aus (LARSEN et al. 1996; DEEGEN 2000). Dunkelrote oder
cyanotische verwaschene Schleimhäute mit einer verlängerten kapillären Füllungszeit
(> 3 sec) sind wie die kalten Akren Ausdruck des Schockgeschehens. Der Anstieg der Pulsund
Atemfrequenz tritt bei Typhlocolitispatienten bereits vor Diarrhoebeginn auf und erreicht
Maximalwerte (Puls 80–110/min und Atemfrequenz 28–40/min), die über denen der Patienten
mit Salmonellose und anderen Durchfallerkrankungen liegen (ODENKIRCHEN u.
HUSKAMP 1995). DEEGEN (2000) stellt heraus, dass im Gegensatz zur Salmonellose
Fieber üblicherweise nicht oder nur am ersten Tag auftritt. Eine geringgradig erhöhte rektale
Körpertemperatur von durchschnittlich 38,6 °C wird aufgrund der Auswertung von 47 Fällen
von Pferden mit einer akuten idiopathischen Colitis von STAEMPFLI et al. (1991) als
häufiges Symptom dieser Erkrankung aufgeführt. STEWART et al. (1995) beschreiben das
gehäufte Auftreten einer febrilen Diarrhoe mit einer durchschnittlichen

Schrifttum 15
Körperinnentemperatur von 39,6 °C bei Rennpferden, die nicht auf eine Infektion mit
Salmonellen und Ehrlichia risticii zurückgeführt werden konnte. Das von den Autoren
beschriebene klinische Bild weist ansonsten zahlreiche Gemeinsamkeiten mit der hier
dargestellten Klinik der Typhlocolitis auf.
Nach COHEN und DIVERS (1998) liegen bei der Clostridien-assoziierten Typhlocolitis
besonders häufig Anzeichen einer Tympanie des Colon vor. Einige Patienten zeigen eine
zyklische oder progressive Auftreibung des Abdomens, die meistens begleitet wird von
hochgradiger Koliksymptomatik.
Für eine frühzeitige Verdachtsdiagnose ist die initiale Leukozytendepression von großer
Bedeutung, die schon bis zu zwei Tage vor dem Einsetzen der Symptome auftreten kann
(ODENKIRCHEN u. HUSKAMP 1995; DEEGEN 2001). Die Leukopenie erreicht oft Werte
von weniger als 3 x 10 9 Leukozyten/l und geht einher mit einer hochgradigen degenerativen
Neutropenie. Ein besonders wichtiger Laborwert für die Diagnose, Therapie und Prognose
eines Typhlocolitispatienten ist auch der Hämatokrit. Oft kommt es schon vor Diarrhoebeginn
zu einer Hämokonzentration (ODENKIRCHEN u. HUSKAMP 1995). SAVILLE et al. (1996)
konnten bei 14 von 16 Pferden mit einer postmortal histologisch abgesicherten Diagnose einer
nekrotisierenden Enterocolitis eine Hämokonzentration mit Hämatokritwerten größer als 45 %
feststellen. In der von GREIß (1995) untersuchten Gruppe 1 von Pferden mit Diarrhoe bzw.
Typhlocolitis zeigten sieben von zehn Pferden zumindest zu einem Zeitpunkt
Hämatokritwerte von mindestens 45 %. Die Hämokonzentration kann trotz
Flüssigkeitstherapie Werte über 60 % und sogar 70 % erreichen (LAUK et al. 1987; GREIß
1995; SAVILLE et al. 1996; COHEN u. DIVERS 1998). ODENKIRCHEN und HUSKAMP
(1995) stellten heraus, dass die Maximalhämatokritwerte von Pferden mit Typhlocolitis
deutlich über denen von Pferden mit Salmonellose liegen. Im frühen Stadium der
Typhlocolitis steigt der Plasmaproteingehalt zunächst an, fällt aber im weiteren Verlauf stark
ab (DEEGEN et al. 1994; SAVILLE 1996; LARSEN et al. 1996). Die Auswirkungen der
Hämokonzentration und der exsudativen Enteropathie auf den Plasmaproteingehalt können
sich aber auch überlagern, so dass ein normaler Plasmaproteingehalt vorgetäuscht wird
(KRAFT 1994). Die starke Beeinträchtigung des Säure-Basen-Haushalts führt im Serum
meist zu einer Azidose, kann sich aber auch in einer Alkalose niederschlagen (STAEMPFLI
et al. 1991; LARSEN et al. 1996; DEEGEN 2000). Der Basenexzess fällt bei
Typhlocolitispatienten früher ab als bei Patienten mit Salmonellose (ODENKIRCHEN u.

Schrifttum 16
HUSKAMP 1995). Aufgrund einer statistischen Auswertung von zahlreichen klinischen und
labordiagnostischen Parametern von 47 Typhlocolitispatienten stellen STAEMPFLI et al.
(1991) den Basenexzess als den besten prognostischen Indikator der Typhlocolitis heraus.
Patienten mit einem tödlichen Verlauf der Typhlocolitis hatten im Mittel einen Basenexzess
von –7,6 im Gegensatz zu dem Mittelwert der Überlebenden von -2,7.
Auch die chemische Zusammensetzung des Serums verändert sich bei Typhlocolitispatienten
deutlich (COHEN u. DIVERS 1998). Typisch sind eine Hyponatriämie und Hypochlorämie.
Die Kaliumkonzentration kann im Referenzbereich liegen bzw. Veränderungen in beide
Richtungen aufweisen (KRAFT 1994; SAVILLE et al. 1996; LARSEN et al. 1996). Die
Harnstoff- und Kreatininkonzentration steigt im fortgeschrittenen Stadium der Typhlocolitis
an. Diese Urämie steht mit einer renalen Ischämie in Zusammenhang und spricht für eine
schlechte Prognose des Patienten (STAEMPFLI et al. 1991; COHEN u. DIVERS 1998).
SAVILLE et al. (1996) beobachteten bei 15 von 16 Pferden mit einer nekrotisierenden
Enterocolitis eine erhöhte Serumkreatininkonzentration ( > 1,4 mg/dl).
Eine mögliche Spätfolge der Typhlocolitis ist die Hufrehe (DEEGEN 2000). Bei der von
STEWART et al. (1995) beschriebenen febrilen Diarrhoe bei Rennpferden trat in 30 % von 86
Fällen eine Hufrehe als Komplikation auf.
2.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde
Für die Diagnose der Typhlocolitis des Pferdes sind die Befunde im Caecum und Colon
ascendens von entscheidender Bedeutung. Die pathologischen Veränderungen können in
seltenen Fällen auf das ventrale Colon beschränkt sein und liegen selten aboral der Flexura
pelvis vor. Die erwähnten Dickdarmabschnitte sind dilatiert und mit übel riechendem,
wässrigem Inhalt gefüllt. Die Lymphonodi caecales und colici sind vergrößert, ödematisiert
und hämorrhagisch verändert. Die Wand des Caecum und Colon ascendens ist häufig
verdickt, rot oder bläulich verfärbt und ödematisiert (POHLENZ et al. 1992; VAN
KRUININGEN 1995). In fortgeschrittenen typischen Fällen ist die Schleimhaut
landkartenähnlich mit fibrinösem Material bedeckt (Pseudomembranen), so dass die Diagnose
einer fibrinös-nekrotisierenden Entzündung schon aufgrund der makroskopischen Befunde
sicher gestellt werden kann (BRYANS 1963; DIXIT u. KARA 1973; SCHIEFER 1981;
KOHN 1982; POHLENZ et al. 1992). Teilweise können auch ulzerative
Schleimhautveränderungen vorliegen (VAN KRUININGEN 1995). Pseudomembranen sind

Schrifttum 17
aber nicht in allen Fällen nachweisbar und in einigen Fällen, die der Typhlocolitis zugeordnet
wurden, bestimmen Hämorrhagien der Dickdarmschleimhaut das pathologische Bild
(WIERUP 1977; UNEMURA et al. 1982; HERMANN 1985; KRAFT 1985). UNEMURA et
al. (1982) konnten beispielsweise nur in drei von 16 Fällen mit dem typischen klinischen Bild
der Typhlocolitis Pseudomembranen feststellen. In allen 16 Fällen waren aber diffuse
Hämorrhagien und Petechien mit einer deutlichen Kongestion der Mukosa erkennbar.
Die von STEWART et al. (1995) beschriebene febrile Diarrhoe bei Rennpferden zeichnete
sich pathologisch durch eine ödematisierte Dickdarmwand mit einer diffusen Kongestion aus.
Die Peritonealflüssigkeit war vermehrt, teilweise blutig und getrübt. Anzeichen einer fibrinösnekrotisierenden
Typhlocolitis lagen in den 28 sezierten Fällen weder pathologischanatomisch
noch pathologisch-histologisch vor.
Nicht nur im Dickdarm, sondern auch in anderen Organen können bei der Typhlocolitis
pathologische Veränderungen festgestellt werden, die vor allem mit der Kreislaufstörung in
Zusammenhang stehen (POHLENZ et al. 1992):
• Petechien an zahlreichen Stellen, insbesondere am Peritoneum, an der Pleura und am
Epicardium
• Rechtsherzdilatation
• Lungenödem
Eine Hyperämie und Schwellung der Milz sowie der Leber kann bei der Typhlocolitis
gleichfalls auftreten. Die Nebennierenrinde ist häufig hämorrhagisch infarziert (UNEMURA
et al. 1982; POHLENZ et al. 1992; VAN KRUININGEN 1995; LARSEN et al. 1996).
2.1.3 Pathologisch-histologische Befunde
Das histologische Bild der fibrinös-nekrotisierenden Typhlocolitis ist gekennzeichnet durch
(POHLENZ et al. 1992; VAN KRUININGEN 1995):
• eine hochgradige Epithelzellnekrose mit Auflagerung von Fibrin und Zelldetritus in den
Krypten der entsprechenden Dickdarmabschnitte;
• eine hochgradige Infiltration der Tela submucosa und Lamina propria mit neutrophilen
und eosinophilen Granulozyten, deren Bestandteile auch in den Auflagerungen
nachweisbar sind;

Schrifttum 18
• zahlreiche degranulierte Mastzellen in der Tela submucosa und Lamina propria;
• eine hochgradige Dilatation der Blut- und Lymphgefäße der Tela submucosa;
• eine Kontraktion der Arteriolen;
• hyaline Thromben in den Kapillargefäßen der Tela submucosa.
Die Veränderungen sind abhängig vom Stadium der Typhlocolitis (POHLENZ et al. 1992). In
einem frühen Stadium dominieren Epithelzellabschilferungen sowie die Infiltration der
Submukosa mit Neutrophilen und Eosinophilen das histologische Bild. Die Dilatation der
Lymph- und Blutgefäße ist bereits erkennbar. Mit dem Fortschreiten der Erkrankung kommt
es zu der umfangreichen Nekrose der Epithelzellen, der Ausbildung der diphtheroiden Colitis
und einer extremen Form der Lymphangiektasie.
2.1.4 Immunpathologie
Die Aktivierung von Mastzellen in der Tela submucosa und in der Lamina propria des
Dickdarmes spielt nach Untersuchungen von POHLENZ und KEMPER (1994) für die
Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes eine Schlüsselrolle. Durch die Degranulation der
Mastzellen werden eine Reihe von hochwirksamen Mediatoren, insbesondere Histamin und
Zytokine, freigesetzt. Diese Mediatoren modulieren die Aktivität zahlreicher Zellen im
Darmgewebe. Die Aktivierung der Mastzellen führt schließlich zu zahlreichen Veränderungen
(RUDAT 1993), u. a.:
• Erhöhung der Darmpermeabilität und der Mukussekretion,
• Modulation des Tonus der glatten Gefäßmuskulatur,
• Propria- und Submukosaödemen aufgrund der Modulation der Aktivität der
Lymphgefäße,
• Chemotaxis und Aktivierung von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten.
Welche Zytokine im Einzelnen eine Bedeutung für die Pathogenese der Typhlocolitis des
Pferdes besitzen, ist bis zu diesem Zeitpunkt noch unzureichend geklärt. Der
Tumornekrosefaktor (TNF) konnte bei Pferden mit unterschiedlichen Kolikerkrankungen, vor
allem bei Patienten mit einem Strangulationsileus, aber auch bei einzelnen
Typhlocolitisfällen, im Blut, in der Peritonealflüssigkeit und im Darmgewebe nachgewiesen

Schrifttum 19
werden (MORRIS et al. 1991; MAY et al. 1992; DAVIDSON et al. 2002). Da Endotoxine
bedeutungsvolle Induktoren der TNF-Biosynthese von Makrophagen sind, wird der
nachweisbare Gehalt von TNF im Serum (≥ 10 U/ml) mit einer Endotoxämie in
Zusammenhang gebracht (MORRIS et al. 1991; MORRIS 1992).
2.1.5 Risikofaktoren
Die Typhlocolitis tritt fast ausschließlich bei hospitalisierten Patienten auf. Auf diese Pferde
wirken oft gleichzeitig eine Reihe von Faktoren ein, die im Verdacht stehen, die Entstehung
der Typhlocolitis zu begünstigen (LAUK et al. 1987). Dieses Erscheinungsbild der
Typhlocolitis als Faktorenerkrankung legt eine synergistische Wirkung unterschiedlicher
Faktoren nahe (LARSEN et al. 1996; DEEGEN 2000).
Verschiedene Autoren messen folgenden Risikofaktoren, die im Anschluss näher diskutiert
werden, eine kausale Bedeutung für die Entstehung der Typhlocolitis des Pferdes bei:
• gastrointestinale Grunderkrankung
• Antibiose
• nichtsteroidale Antiphlogistika
• Hospitalisierung
• Operation
• Laxantien und gastrointestinale Stimulantien
• Nahrungskarenz
• Fütterungsfehler und Futterumstellung
• andere Stressoren (z. B. Transport)
2.1.5.1 Gastrointestinale Grunderkrankung
Die Typhlocolitis des Pferdes manifestiert sich oft als Komplikation bei Kolikpatienten
(DEEGEN et al. 1994). Anhand der Kasuistik von 23 Typhlocolitisfällen im Jahr 1992
konnten DEEGEN et al. (1994) zeigen, dass die Typhlocolitis bei Kolikpatienten auch
unabhängig von einer Antibiotikatherapie auftreten kann. Im Rahmen einer gastrointestinalen
Erkrankung kann die Darmflora in ihrer Funktion wesentlich beeinträchtigt werden. Dies
begünstigt die Entwicklung einer Dysbiose und in Folge die Ansiedlung enteropathogener

Schrifttum 20
Bakterien, wie zum Beispiel von Cl. difficile, im Rahmen der Pathogenese der Clostridienassoziierten
Typhlocolitis des Pferdes (2.1.6.5). Ferner führt die Ischämie und Reperfusion
von Darmabschnitten im Rahmen der Pathogenese und Therapie gastrointestinaler
Erkrankungen zur Beeinträchtigung der Barrierefunktion der Darmmukosa gegenüber
Endotoxinen (OLOFSSON et al. 1985). Da ein hoher Gehalt an gramnegativen Bakterien zur
physiologischen Dickdarmflora des Pferdes zählt und der Gastrointestinaltrakt physiologisch
ein Endotoxinreservoir darstellt (BURROWS 1981), kann bei Kolikpatienten somit leicht eine
Endotoxämie auftreten. Der Endotoxämie wird auch eine ätiologische Bedeutung für die
Typhlocolitis des Pferdes beigemessen (2.1.6.4).
2.1.5.2 Antibiose
Ein bedeutungsvoller Risikofaktor für die Typhlocolitis des Pferdes ist die systemische
Antibiotikatherapie (DEEGEN et al. 1994; BÅVERUD et al. 1997; SAVILLE et al. 1996;
LARSEN 1997; MADIGAN et al. 1998). Vor allem Breitspektrumantibiotika mit einem
enterohepatischen Kreislauf müssen als besonders gefährlich eingestuft werden. Die
Applikation von Tetracyclinen, Erythromycin, Lincomycin und Clindamycin ist beim
erwachsenen Pferd aufgrund der Assoziation mit der Typhlocolitis kontraindiziert (COOK
1973; BURROWS 1980; OWEN 1980; WALKER 1992). Mit diesen Antibiotika kann die
Typhlocolitis des Pferdes auch experimentell induziert werden (2.1.7). Ampicillin wird
ebenfalls über die Galle ausgeschieden und besitzt auch das Potential, die
Kolonisationsresistenz der Darmflora zu beeinträchtigen (OWEN 1980; PUYT u. MALET
1985).
Die Arbeiten von GUSTAFSSON et al. (1997) und von BÅVERUD et al. (1998)
verdeutlichen, dass das Antibiotikum Erythromycin sogar in subtherapeutischer Dosierung
beim erwachsenen Pferd eine Typhlocolitis hervorrufen kann. BÅVERUD et al. (1998)
beschreiben das gehäufte Auftreten von Typhlocolitisfällen bei Stuten, deren Fohlen zur
Therapie einer Rhodococcus equi-Infektion mit Erythromycin und Rifampicin behandelt
wurden. In der Gruppe der Stuten mit Typhlocolitis hatten die zugehörigen Fohlen eine
höhere Erythromycinkonzentration im Kot als solche Fohlen, deren Stuten keine
Typhlocolitis entwickelten. Die Koprophagie und die Aufnahme von Erythromycinkontaminiertem
Stroh hatte bei den Stuten der ersten Gruppe offensichtlich ausgereicht, die
Typhlocolitis hervorzurufen.

Schrifttum 21
Eine retrospektive Studie von STRATTON-PHELPS et al. (2000) zeigt, dass Fohlen, die mit
Erythromycin therapiert wurden, ein achtfach erhöhtes Risiko für eine Diarrhoe haben. Die
Autoren führen die Assoziation von Erythromycin mit der Fohlendiarrhoe nicht nur auf die
antibiotische, sondern auch auf die prokinetische Wirkung von Erythromycin zurück.
Erythromycin hat eine Motilin ähnliche Wirkung auf die glatte Muskulatur des Darmtraktes,
so dass die Passage der Ingesta beschleunigt wird (OTTERSON u. SARNA 1990; HASLER
et al. 1992; PEETERS et al. 1993).
Bei anderen als den oben genannten Antibiotika ist die Bedeutung für die Pathogenese der
Typhlocolitis des Pferdes noch unzureichend geklärt. In zahlreichen Studien fällt auf, dass der
Mehrzahl der Typhlocolitispatienten vor dem Ausbruch der Erkrankung Antibiotika appliziert
wurden, allerdings in fast allen Fällen in Zusammenhang mit anderen Risikofaktoren wie der
Hospitalisierung, chirurgischen Eingriffen oder einer schweren Grunderkrankung (DEEGEN
et al. 1994; GREIß et al. 1996; LARSEN et al. 1996; SAVILLE et al. 1996; BÅVERUD et al.
1997; MCGORUM et al. 1998). In der retrospektiven Studie von MCGORUM et al. (1998)
wurden beispielsweise 15 von 16 Pferden mit Typhlocolitis zuvor mit mindestens einem der
Antibiotika Penicillin, Streptomycin, Gentamicin oder potentierten Sulfonamiden behandelt.
STRAUB und FREY (2000) konnten einen deutlichen Rückgang der Prävalenz- und
Letalitätsrate der Typhlocolitis bei laparotomierten Patienten verzeichnen, nachdem die
postoperative Antibiose mit Gentamicin und Neomycin-Sulfathiazol eingestellt wurde.
WHITE und PRIOR (1982) verglichen die Auswirkungen der oralen
Oxytetracyclinapplikation auf die Darmflora mit denen der oralen Applikation von
Trimethoprim-Sulfadiazin. Nur bei Oxytetracyclinen beobachteten die Autoren eine deutliche
Veränderung der Keimflora, insbesondere eine Zunahme von Coliformen, Bacteroides spec.,
Streptococcus spec. und Cl. perfringens Typ A. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen konnte
KROPP (1991) nach der experimentellen Applikation von Sulfadimethoxin-Trimethoprim an
zwei Versuchspferde eine deutliche Keimzahlerniedrigung von Bazillen und Laktobazillen
feststellen und Cl. perfringens bei einem der untersuchten Pferde nachweisen. Da die
Ergebnisse von BÅVERUD et al. (1997) und MADIGAN et al. (1998) für eine kausale
Bedeutung der Antibiotika für die Cl. difficile-assoziierte Typhlocolitis des Pferdes sprechen
und umfassende Untersuchungen über die Bedeutung der Antibiotika für die Pathogenese von
Cl. difficile-assoziierten intestinalen Erkrankungen im Tiermodell vorliegen, werden diese

Schrifttum 22
Zusammenhänge bei der Charakterisierung von Cl. difficile ausführlich erläutert (2.2.17 und
2.2.18).
2.1.5.3 Nichtsteroidale Antiphlogistika
Das nichtsteroidale Antiphlogistikum Phenylbutazon kam früher in der Pferdepraxis häufig
bei akuten und chronischen Entzündungen zum Einsatz. Nach der Applikation von
Phenylbutazon wurde von verschiedenen Autoren das Auftreten einer meistens chronisch
verlaufenden Colitis teilweise auch in Zusammenhang mit einer Duodenitis beobachtet
(COLLINS u. TYLER 1984; KARCHER et al. 1990; MESCHTER et al. 1990; SIMMONS et
al. 1990; GERBER 1994; COHEN et al. 1995). Pathologisches Kennzeichen dieser
Phenylbutazon-induzierten Colitis ist das Auftreten von Ulcera, vor allem in dem Colon
dorsale dextrum (KARCHER et al. 1990). Pseudomembranen treten bei dieser eigenständigen
Form der Colitis meistens nicht auf.
Für das nichtsteroidale Antiphlogistikum Flunixin, das heute in der Pferdemedizin eine große
Rolle spielt, konnte ein großer therapeutischer Sicherheitsbereich festgestellt werden
(UNGEMACH 1993). In einzelnen Fällen ist das Auftreten einer Colitis aber auch auf die
Applikation von Flunixin zurückgeführt worden (TRILLO et al. 1984; TRAUB-DARGATZ
et al. 1988).
Nichtsteroidale Antiphlogistika hemmen die Prostaglandinbiosynthese. Prostaglandine sind
Mediatoren in einer Vielzahl physiologischer Prozesse wie der Blutgerinnung, Ovulation und
Wundheilung. Grundsätzlich haben sie bei akuten und chronischen Entzündungen als
Mediatoren eine Schlüsselfunktion. Es liegen aber eine Reihe von Ergebnissen aus
Tierversuchen mit Mäusen und Studien zur Pathogenese der „inflammatory bowel disease“
(IBD) des Menschen vor, die zeigen, dass Prostaglandine eine protektive Rolle bezüglich der
Entstehung einer Colitis spielen (KAUFMANN u. TAUBIN 1987; BERG et al. 2002). Der
Pathomechanismus für diese protektive Funktion ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Eine
mögliche Erklärung ist, dass das Prostaglandin PGE2 die Bildung des Interleukin 10 (IL-10)
induziert. IL-10 ist ein antiinflammatorisches Zytokin mit einer zentralen Bedeutung im
Immungeschehen der Mukosa (FIORENTINO et al. 1991; STRASSMANN et al. 1994).
Die Hemmung der Prostaglandinsynthese führt ferner im Magen-Darm-Trakt zu lokalen
Ischämien, einer reduzierten Mucusbildung, einer Anreicherung von Säuren in den

Schrifttum 23
Mukosazellen und einer gesenkten Thromboxansynthese und begünstigt auch über diese
Wirkungsmechanismen die Entwicklung von Ulcera (POHLENZ u. KEMPER 1994).
2.1.5.4 Hospitalisierung
Verschiedene Autoren heben hervor, dass die Typhlocolitis des Pferdes eine große Gefahr für
hospitalisierte Patienten darstellt (LAUK et al. 1987; DEEGEN 2000). Welche Bedeutung der
Hospitalisierung in dem Zusammenspiel verschiedener Risikofaktoren bzw. Stressoren, die
auf diese Patientengruppe einwirken, zukommt, ist aber in vielen Fällen unklar. Für die
Pathogenese der Clostridien-assoziierten Typhlocolitis des Pferdes ist die Hospitalisierung
wahrscheinlich eine wichtige Voraussetzung, da insbesondere Cl. difficile als nosokomialer
Erreger eingestuft werden muss (MCFARLAND et al. 1989; JOHNSON et al. 1990; WEESE
et al. 2000; JOBST et al. 2002).
2.1.5.5 Operation
In zahlreichen Arbeiten werden Typhlocolitisfälle beschrieben, die in der ersten Woche post
operationem auftraten (LAUK et al. 1987; GREIß 1995; LARSEN et al. 1996; MCGORUM
et al. 1998; JOBST 2001). Einige Autoren sehen den chirurgischen Eingriff als
bedeutungsvollen Risikofaktor für die Typhlocolitis des Pferdes (HUSKAMP 1994; KRAFT
1994). Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass im Zusammenhang mit operativen Eingriffen die
meisten der anderen aufgeführten Risikofaktoren auch auf den Patienten einwirken.
2.1.5.6 Laxantien und gastrointestinale Stimulantien
Wie eine umfassende humanmedizinische prospektive Studie mit einer Multivarianzanalyse
zeigt, ist die Applikation von Laxantien ein bedeutungsvoller Risikofaktor für eine
Cl. difficile-assoziierte Diarrhoe (MCFARLAND et al. 1990). In der Diskussion über die
Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes bleiben Laxantien aber meist unberücksichtigt. Bei
konservativ behandelten Kolikpatienten, die eine Risikogruppe in Bezug auf die Typhlocolitis
darstellen (DEEGEN et al. 1994; JOBST 2001), ist die Applikation von Laxantien und
gastrointestinalen Stimulantien aber eine bedeutungsvolle therapeutische Maßnahme.
Aufgrund einer umfassenden Kasuistik stellen ODENKIRCHEN und HUSKAMP (1995) fest,

Schrifttum 24
dass Arzneimittel, die den Magen-Darmtrakt beeinflussen, insbesondere Glaubersalz,
Paraffinöl, Metamizol, Butylscopolamin und Neostigmin häufiger vor Durchfallbeginn bei
Patienten mit Salmonellose oder Typhlocolitis als bei Patienten mit Durchfall anderer Genese
eingesetzt werden.
2.1.5.7 Nahrungskarenz
Eine längere Nahrungskarenz, insbesondere im Rahmen einer Operation, wurde wiederholt in
ätiologischen Zusammenhang mit der Typhlocolitis des Pferdes gestellt (LAUK et al. 1987;
DEEGEN et al. 1995). Nach einer experimentell durchgeführten 100 h Nahrungskarenz
konnten DEEGEN et al. (1995) bei drei Versuchspferden im Dickdarm eine Verflüssigung
des Chymus, eine Blinddarmalkalose, eine Zunahme an Valeriansäure und vor allem im
Caecum einen deutlich erniedrigten Gehalt an Buttersäure feststellen. ROEDIGER (1982)
zeigte für Colonozyten der Ratten, dass diese Zellen bevorzugt Buttersäure als Energiequelle
nutzen. Nach MEYER (1994) ist demnach auch beim Pferd zu erwarten, dass der Abfall der
Buttersäurekonzentration im Caecumchymus infolge einer Nahrungskarenz zu einem
Energiemangel der Dickdarmzellen führt. Ein Energiemangel dieser Zellen führt durch die
fortschreitende Hemmung der Absorption von Natrium und Wasser schließlich zu einer
Diarrhoe. Aufgrund dieser Zusammenhänge postuliert MEYER (1994), dass längere
Hungerphasen bei Pferden die Induktion der Typhlocolitis begünstigen können. Dies steht im
Einklang mit dem von LARSEN et al. (1996) beschriebenen deutlichen Rückgang von
Typhlocolitisfällen, nachdem unter anderem die präoperative Nahrungskarenz stark
eingeschränkt wurde. Die Autoren empfehlen eine Fütterung der Patienten mit Heu, aber nicht
mit Kraftfutter am Tag vor einer Operation. Nach der Operation soll das Anfüttern so früh wie
möglich begonnen werden.
2.1.5.8 Fütterungsfehler und Futterumstellung
Bei der Verfütterung von praecaecal schlecht verdaulichen Kohlenhydraten, wie der
Maisstärke, kommt es im Caecum zu einem pH-Abfall auf Werte kleiner als 5 (GOODSON et
al. 1988). Dies kann direkt zu einer Schädigung des Darmepithels führen (ARGENZIO 1990).
Für die Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes könnte ferner das Absterben gramnegativer
Bakterien im Rahmen eines pH-Abfalls von Bedeutung sein (POHLENZ u. KEMPER 1994).

Schrifttum 25
Durch die Lyse gramnegativer Bakterien werden Endotoxine freigesetzt, denen eine
ätiologische Bedeutung für die Typhlocolitis zugesprochen wird (2.1.6.4).
2.1.5.9 Andere Stresssoren (zum Beispiel Transport)
Bei Rennpferden kommt es häufiger zum Auftreten einer Typhlocolitis, ohne dass ein
Zusammenhang mit einer gastrointestinalen Erkrankung, einer Behandlung mit Antibiotika
oder Antiphlogistika hergestellt werden kann (STEWART et al. 1995). Auf diese Pferde
wirken eine Reihe von anderen Stressoren, wie Transport, Wettkämpfe, hartes Training und
eine restringierte kohlenhydratreichen Fütterung, ein, denen eine Bedeutung für die
Pathogenese dieser Typhlocolitisfälle zukommen könnte.
2.1.6 Differentialdiagnosen
Obwohl eine Reihe von verschiedenen Pathomechanismen für die Typhlocolitis des Pferdes
in der Literatur ausführlich diskutiert werden, ist deren Differenzierung und die Aufklärung
der Ätiologie von Typhlocolitisfällen in der Praxis nach wie vor problematisch (LARSEN
1997; COHEN u. DIVERS 1998; WEESE et al. 2001 a). Differentialdiagnostisch bzw. als
Ursachen der Typhlocolitis des Pferdes sind zu berücksichtigen:
• Salmonellen
• Cl. difficile
• Cl. perfringens
• Ehrlichia risticii
• larvale Cyathostominose
• Endotoxämie
• Pharmaka (insbesondere Phenylbutazon)
• toxische Substanzen (Arsen, Cantharidin, Rizinusöl)
Die genannten Ursachen treten in einigen Typhlocolitisfällen auch zusammen auf. GREIß et
al. (1996) beschreiben beispielsweise einen Fall mit einer akuten ulzerativ-nekrotisierenden
Typhlitis, bei dem sowohl toxinogene Cl. difficile, Cl. perfringens als auch Salmonella
Typhimurium var. Copenhagen in hochgradigem Keimgehalt vorlagen. Synergistische
Wirkungen sind zwischen den verschiedenen Pathomechanismen gut vorstellbar. Die

Schrifttum 26
Beeinträchtigung der Darmbarriere durch die Applikation nichtsteroidaler Antiphlogistika
oder durch eine larvale Cyathostominose könnte beispielweise die Resorption der
Clostridientoxine und der Endotoxine begünstigen. Zu dieser Fragestellung gibt es aber noch
keine wissenschaftlichen Untersuchungen. Im Folgenden wird auf die Salmonellose, „equine
monocytic ehrlichiosis“, larvale Cyathostominose und Endotoxämie im Zusammenhang mit
der Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes bzw. als Differentialdiagnose zur Clostridienassoziierten
Typhlocolitis kurz eingegangen. Im Hinblick auf die eigenen Untersuchungen
werden die Erreger der Clostridien-assoziierten Typhlocolitis des Pferdes, Cl. difficile und
Cl. perfringens, und deren Pathomechanismen im Anschluß ausführlich vorgestellt.
2.1.6.1 Salmonellen
Die Differenzierung zwischen der akuten Salmonellose und der Clostridien-assoziierten
Typhlocolitis aufgrund des klinischen Bildes ist schwierig (WHITLOCK 1986). Ein wichtiger
Anhaltspunkt ist der Verlauf der Körperinnentemperatur. Bei der Salmonellose tritt
persistierendes Fieber von Krankheitsbeginn an auf (ODENKIRCHEN u. HUSKAMP 1995;
DEEGEN et al. 2000). Die Salmonellose muss aber in jedem Fall differentialdiagnostisch
abgeklärt werden. Pathologisch unterscheidet sich die Salmonellose von der Typhlocolitis
durch das zusätzliche Auftreten von Entzündungsanzeichen im Dünndarm (POHLENZ et al.
1992).
Salmonella enterica ist beim Pferd ein nosokomialer Infektionserreger, der zu Ausbrüchen
von Durchfallerkrankungen in Pferdekliniken führen kann (BAUERFEIND et al. 1992). Unter
den hospitalisierten Patienten haben Pferde mit gastrointestinalen Erkrankungen ein erhöhtes
Risiko, mit Salmonellen infiziert zu werden (HIRD et al. 1986). Durch Transportstress, die
Applikation von Antibiotika und eine Operation kann eine klinisch inapperente
Salmonelleninfektion aktiviert werden (OWEN et al. 1983). Weiterhin können
Futterumstellungen die Ausscheidung von Salmonellen begünstigen (TRAUB-DARGATZ et
al. 1990).
Salmonellen besitzen eine Vielzahl von Virulenzfaktoren, zu denen u. a. Flagellen,
Zytotoxine, Enterotoxine und Endotoxine zählen. Im Gegensatz zur Pathogenese der
Clostridien-assoziierten Typhlocolitis zeichnet sich die Salmonellose durch eine hohe
Invasivität aus (SPIER 1993; GROISMAN u. OCHMAN 1997).

Schrifttum 27
2.1.6.2 Ehrlichia risticii
Das klinische und pathomorphologische Bild der „equine monocytic ehrlichiosis“ (EME,
„potomac horse fever“) ist nahezu identisch mit dem im ersten Kapitel beschriebenen Bild der
Typhlocolitis des Pferdes. Ein klinischer Unterschied ist die Persistenz des Fiebers mit einem
biphasischen Verlauf. Bis jetzt kommt die Erkrankung nur in Amerika vor und fällt dort durch
Saisonalität und wiederholtes Auftreten in bestimmten Regionen auf. EME kann durch
Blutübertragungen von erkrankten auf gesunde Pferde experimentell ausgelöst werden. Die
Erkrankung wird hervorgerufen durch Ehrlichia risticii, einen pleomorphen, gramnegativen
Keim. Die Kultivierung von Ehrlichia risticii gelang in Monozyten und Makrophagen-
Zellkulturen. In diesen Zellen konnte der Erreger auch elektronenmikroskopisch in der
Dickdarmschleimhaut nachgewiesen werden. Es besteht der Verdacht auf eine Vektorabhängige
Übertragung von Ehrlichia risticii, insbesondere durch Arthropoden. Die
Bestätigung der Verdachtsdiagnose auf EME erfolgt serologisch (MULVILLE 1991).
2.1.6.3 Larvale Cyathostominose
Ein hoher Anteil von Durchfallerkrankungen beim erwachsenen Pferd ist mit der larvalen
Cyathostominose assoziiert. Der Durchfall setzt oft plötzlich ein und nimmt dann aber
meistens einen chronischen Verlauf, der mit einem markanten progressiven Gewichtsverlust
einhergeht (LOVE 1992). Die Erkrankung kann aber auch nach einem kurzen akuten Verlauf
letal enden (REILLY et al. 1993). Kolik und subkutane Ödeme können das klinische Bild
ergänzen. In akuten Fällen lässt sich labordiagnostisch häufig eine Neutrophilie und
Hypoalbuminämie feststellen (LOVE 1992; MAIR 1993).
Die larvale Cyathostominose tritt vor allem im Spätwinter und Frühjahr auf. Diese
Saisonalität ist bedingt durch die synchrone Aktivierung der hypobiotischen Larven in der
intestinalen Mukosa (LOVE 1992). Die aktivierten Larven ruptieren die Zysten; in
Zusammenhang mit der Freisetzung von Inhaltsstoffen aus den Zysten und durch sekundäre
bakterielle Infektionen kommt es schließlich zu einer Typhlitis und Colitis (REINEMEYER
1992).

Schrifttum 28
2.1.6.4 Endotoxämie
Endotoxine (Lipopolysaccharide) sind mit einer Reihe von Erkrankungen des Pferdes in
ätiologischen Zusammenhang gebracht worden. Zu diesen Erkrankungen zählen die Hufrehe,
der septische Schock sowie verschiedene intestinale Erkrankungen, einschließlich der
Typhlocolitis, die mit Koliksymptomatik verbunden sind. Eine Reihe von
Untersuchungsergebnissen sprechen für die Bedeutung von Endotoxinen im Rahmen der
Pathogenese von Kolikerkrankungen. Durch die intravenöse Applikation von Endotoxinen
kann ein klinisches Bild hervorgerufen werden, das durch das Auftreten von Fieber,
Tachycardie, Dyspnoe, einer verlängerten kapillären Füllungszeit, Ataxie, Kolik, Diarrhoe,
Hämokonzentration, Neutropenie, Laktatazidose, einer systemischen vaskulären Hypotension
und einer arteriellen Hypoxämie einige Gemeinsamkeiten mit intestinalen Erkrankungen des
Pferdes, unter anderem auch der Typhlocolitis des Pferdes, aufweist (MOORE et al. 1981;
GERBER 1994). Die für die Typhlocolitis typischen pathologischen Veränderungen stellen
Pathologen vor allem mit der Resorption von Endotoxinen und einer Endotoxämie in
ätiologischen Zusammenhang (UNEMURA et al. 1982; POHLENZ et al. 1992). In zwei
Untersuchungen wurden das Plasma und teilweise auch die Peritonealflüssigkeiten von
unterschiedlichen Kolikpatienten mit dem Limulus-Amoebozyten-Lysat auf Endotoxine
untersucht (MEYERS et al. 1982; KING u. GERRING 1988). Nur in der Arbeit von
MEYERS et al. (1982) waren auch Proben von zehn Enteritisfällen in dem Probenmaterial,
die in sieben Fällen auf Salmonellen zurückgeführt werden konnten und zum Teil im
Limulus-Amoebozyten-Lysat positiv reagierten. Untersuchungen von Typhlocolitisfällen, die
sowohl die Clostridien- als auch die Endotoxindiagnostik einschließen, sind bis jetzt nicht
publiziert worden. Es ist somit zur Zeit immer noch unklar, ob es sich bei der Endotoxämie
um eine ätiologische Differentialdiagnose zur Clostridien-assoziierten Typhlocolitis handelt
oder ob die Endotoxämie als Folge der Störung der Darmbarriere, die durch die
Clostridientoxine hervorgerufen wird (2.2.7), auftritt.
Die Plasmaendotoxinkonzentration der zehn Kolikpatienten in der Arbeit von KING und
GERRING (1988) lag zwischen 0,1 und 2 ng/ml und korrelierte hoch signifikant mit der
Herzfrequenz und dem Hämatokrit. Das Pferd ist im Vergleich zu anderen Spezies besonders
empfänglich für die Wirkung von Lipopolysacchariden. Die intraperitoneale letale Dosis von
LPS für Ponys beträgt nur 200–400 µg/kg KG, während bei Kaninchen erst eine Dosis von 3–
10 mg/kg letal wirkt (BERCZI et al. 1966; BURROWS 1981). Equine neutrophile

Schrifttum 29
Granulozyten werden in vitro durch LPS aktiviert. Ausdruck dieser Aktivierung ist die
verstärkte Expression von Integrin-Adhäsionsmolekülen, eine herabgesetzte Verformbarkeit
und die Degranulation (WEISS u. EVANSON 2002). Die intravasale Aktivierung von
Neutrophilen führt durch die Freisetzung von Sauerstoffradikalen und Proteasen zur
Schädigung des Endothels. In schweren Fällen kommt es zu Hämorrhagien,
Parenchymschädigungen und einem Multiorganversagen.
2.1.6.5 Die Clostridien-assoziierte Typhlocolitis des Pferdes
Cl. difficile bzw. Cl. perfringens Typ A wird von verschiedenen Autoren eine ätiologische
Bedeutung für die Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes beigemessen (zusammenfassend
dargestellt von JONES 2000). In zahlreichen Typhlocolitisfällen kann jedoch weder einer
dieser beiden Clostridienarten noch ein anderer enteropathogener Erreger nachgewiesen
werden. WEESE et al. (2001) konnten beispielsweise nur in 7,7 % von 156
Typhlocolitisfällen einen Erreger identifizieren. Aufgrund der relativ geringen Nachweisrate
muss davon ausgegangen werden, dass nur ein Teil der Typhlocolitisfälle auf diese beiden
Clostridienarten zurückgeführt werden kann. Unter diesem Gesichtspunkt erscheint es
sinnvoll den Terminus „Clostridien-assoziierte Typhlocolitis“ zu verwenden, der wie der
englische Ausdruck „clostridial enterocolitis“ den Bezug zu dieser Gruppe von
Typhlocolitisfällen zum Ausdruck bringt (JONES 2000).
Obwohl die Nachweisrate von Cl. difficile bzw. der Toxine A und B von Cl. difficile in
Kotproben von Typhlocolitispferden in einigen Untersuchungen relativ niedrig ist, sprechen
eine Reihe von wissenschaftlichen Ergebnissen für eine ätiologische Bedeutung dieses
Erregers für die Typhlocolitis des Pferdes:
• Cl. difficile und die Toxine von Cl. difficile können wesentlich häufiger bei
Typhlocolitispatienten als bei anderen Patienten bzw. bei gesunden Pferden nachgewiesen
werden (VERSPOHL 1995; GREIß et al. 1996; BÅVERUD et al. 1997; BÅVERUD et al.
1998; DONALDSON u. PALMER 1999; WEESE et al. 2001 a).
• In den Untersuchungen von GREIß (1995) erreicht Cl. difficile bei sechs von zehn Pferden
mit Typhlocolitis im Dickdarminhalt einen Keimgehalt von ≥ 10 5 KBE/g Chymus. Dieser
Wert liegt in der Größenordnung des spezifischen Keimgehaltes, der bei Menschen mit
einer durch Cl. difficile hervorgerufenen Pseudomembranösen Colitis auftritt. Bei

Schrifttum 30
gesunden Pferden oder anderen Kolikpatienten (Kontrollgruppe) kann Cl. difficile nicht
oder nur in einem geringgradigem Keimgehalt nachgewiesen werden (GREIß 1995;
GREIß et al. 1996).
• Cl. difficile tritt bei Pferden, die einer Operation unterzogen werden, vor allem am 2. bis
4. Tag post operationem auf (JOBST 2001). In dieser Zeitspanne manifestiert sich häufig
die Typhlocolitis des Pferdes.
• Bei Fohlen lässt sich durch die Applikation von Cl. difficile eine Enteritis hervorrufen, die
sich allerdings vorwiegend im Dünndarm manifestiert (JONES et al. 1988). Dieser
Infektionsversuch zeigt, dass Cl. difficile beim Pferd potentiell enteropathogen ist.
• Sogar nach Desinfektionsmaßnahmen kann Cl. difficile in verschiedenen Umgebungs-
proben von Pferdekliniken mit Typhlocolitisproblemen nachgewiesen werden (WEESE et
al. 2000; JOBST 2001). Diese Befunde sprechen dafür, dass Cl. difficile in Analogie zur
Humanmedizin als nosokomialer Infektionserreger auch in Pferdekliniken auftritt (2.2.15).
• Beim Menschen und Syrischen Hamster ruft Cl. difficile eine Colitis hervor, die
zahlreiche pathologisch-anatomische und pathologisch-histologische Gemeinsamkeiten
mit der Typhlocolitis des Pferdes aufweist (2.2.16 und 2.2.18).
• Wie die Cl. difficile-assoziierte Caecitis des Hamsters kann die Typhlocolitis des Pferdes
durch die Applikation von Antibiotika, insbesondere von Makroliden, induziert werden
(2.1.7 und 2.2.18).
• Typische pathologisch-histologische Befunde der Typhlocolitis, wie z. B. die
Degranulation der Mastzellen, können durch die immunmodulatorische Wirkung des
Enterotoxins (Toxin A) von Cl. difficile erklärt werden, die bei anderen Enterotoxinen
nicht auftritt (2.2.8).
Cl. perfringens kann wesentlich häufiger als Cl. difficile bei gesunden Pferden nachgewiesen
werden. WIERUP und DIPIETRO (1981) stellen heraus, dass erst ab einem spezifischen
Keimgehalt von 10 2 KBE/g Kot Cl. perfringens eine enteropathogene Bedeutung besitzt.
Unter den Cl. perfringens Typ A-Stämmen wird vor allem den enterotoxinogenen und
β2-toxinogenen eine Bedeutung für die Typhlocolitis des Pferdes beigemessen. Die
Bedeutung von enterotoxinogenen Cl. perfringens-Stämmen für die Typhlocolitis des Pferdes
ist aufgrund folgender Ergebnisse jedoch unklar:

Schrifttum 31
• WEESE et al. (2001) konnten das Enterotoxin (CPE) von Cl. perfringens in 19 % der
Proben von Pferden mit Durchfall nachweisen, während alle normalen Kotproben CPE–
negativ waren.
• DONALDSON und PALMER (1999) beschreiben eine ähnliche Assoziation von CPE mit
der Diarrhoe beim Pferd. Bei 12 % der Kolikpatienten lag offensichtlich CPE vor. Es war
aber keine signifikante Assoziation zwischen dem Nachweis von CPE und der
Entwicklung einer Diarrhoe als Komplikation der Kolik feststellbar.
• GAUTSCH et al. (1993) konnten nur in einer von 36 Kotproben von Pferden mit Diarrhoe
CPE nachweisen. Alle 54 Cl. perfringens-Isolate bildeteten in der Kultur kein CPE.
• An vier Ponys durchgeführte Infektionsversuche mit enterotoxinbildenden
Cl. perfringens-Stämmen erbrachten keine Hinweise auf eine Ansiedlung und
enteropathogene Bedeutung beim Pferd (GAUTSCH et al. 1993).
• KANOE et al. (1990) konnten durch die Applikation des Enterotoxins bei Ponys eine
hämorrhagische Gastroenteritis mit Koliksymptomatik hervorrufen.
• Die intravenöse Applikation eines CPE enthaltenden Extraktes rief bei drei Ponys
klinische und pathologische Veränderungen hervor, wie sie in ähnlicher Form auch bei der
Typhlocolitis auftreten, z. B. Kolik, Leukopenie und eine Gastroenterocolitis (OCHOA u.
KERN 1980).
• Bis zu 15 % der Antibiotika-assoziierten Diarrhoen des Menschen werden auf
enterotoxinogene Cl. perfringens-Stämme zurückgeführt (BORRIELLO et al. 1984;
HANCOCK 1997; MODI u. WILCOX 2001; ASHA u. WILCOX 2002). Im Gegensatz zu
Cl. difficile-Infektionen beim Menschen kommt es bei diesen durch Cl. perfringens
verursachten Antibiotika-assoziierten Diarrhoen aber nicht zur Ausbildung von
Pseudomembranen (BORRIELLO et al. 1984).
Der derzeitige Kenntnisstand über das 1997 von GIBERT et al. erstmalig beschriebene β2-
Toxin ist im Vergleich zu dem oben genanntem Enterotoxin von Cl. perfringens und dem
Toxin A bzw. B von Cl. difficile noch sehr gering (2.3.6). Nach den ersten
Untersuchungsergebnissen könnten β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme eine wichtige
Rolle für die Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes spielen:
• Pferde mit intestinalen Erkrankungen haben eine erhöhte Prävalenz von β2-toxinogenen
Cl. perfringens-Stämmen (HERHOLZ et al. 1999; THIEDE et al. 2000).

Schrifttum 32
• β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme treten bei einer Reihe von anderen Tierarten im
Zusammenhang mit intestinalen Erkrankungen auf (GARMORY et al. 2000; KLAASEN
et al. 1999; GKIOURTZIDIS et al. 2001; THIEDE et al. 2001; MANTECA et al. 2002).
• STRAUB und FREY (2000) berichten von dem immunohistologischen Nachweis des β2-
Toxins in pathologisch verändertem Darmgewebe von Pferden mit einer Typhlocolitis.
• Untersuchungen von VAN DEN BULCK et al. (2002) zeigen eine erhöhte Prävalenz von
β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen bei hospitalisierten Pferden und vor allem bei
solchen mit Diarrhoe auf.
2.1.7 Experimentelle Induktion der Typhlocolitis des Pferdes
Im Rahmen wissenschaftlicher Untersuchungen wurde bei einzelnen Pferden die
Typhlocolitis des Pferdes experimentell induziert. Mit Ausnahme der Rizinusöl- (ROBERTS
et al. 1989) und Phenylbutazonapplikation (KARCHER et al. 1990) wurden für diese
Induktionen Antibiotika eingesetzt (Tabelle 1). Die kausale Bedeutung von Cl. perfringens
und Cl. difficile für die Pathogenese der induzierten Typhlocolitisfälle konnte in keiner der
Arbeiten eindeutig belegt werden. ANDERSSON et al. (1971) stellten bei zwei näher
untersuchten Pferden einen Anstieg des spezifischen Keimgehaltes von Cl. perfringens auf
≥10 4 KBE/g Kot fest. Zu dieser Zeit erfolgte aber noch keine differenziertere Bestimmung des
Toxintyps von Cl. perfringens. Nur in der Untersuchung von GUSTAFSSON et al. (1997)
konnten in einem Fall durch den direkten Nachweis des Cl. difficile-Toxins Hinweise für eine
ursächliche Beteiligung von Cl. difficile gewonnen werden.

Schrifttum 33
Tabelle 1: Experimentelle Induktionen der Typhlocolitis des Pferdes durch die
Applikation von Antibiotika
Methodik
Oxytetracyclin 1 x 27–
40 mg/kg KG i. v.
Clindamycin
10 mg/kg KG und
Lincomycin
25 mg/kg KG per os
alle 12 h zusammen mit
Dickdarminhalt von
Typhlocolitispferden
Lincomycin 4–8 x
25 mg/kg KG alle 12 h
per os
Lincomycin 1 x
10 mg/kg KG zusammen
mit Dickdarminhalt eines
Typhlocolitispferdes
Erythromycin
1,25 mg/kg KG alle 8 h
per os
2.2 Clostridium difficile
Anzahl der
induzierten
Typhlocolitisfälle
4
2
3
3
2
Ergebnis der bakteriologischen
Untersuchung auf
Cl. perfringens und Cl. difficile
Cl. perfringens ≥ 10 4 KBE/g
Kot bei zwei Pferden, keine
Untersuchung auf Cl. difficile
bei einem Pferd Cl. perfringens
mit 10 4 KBE/g Kot, keine
Untersuchung auf Cl. difficile
Cl. perfringens nicht
nachweisbar, keine
Untersuchung auf Cl. difficile
Cl. difficile Toxin A und
Cl. perfringens Enterotoxin
nicht nachweisbar
Nachweis von Cl. difficile und
Zytotoxin B bei einem Pferd
2.2.1 Allgemeine Eigenschaften und Nachweismöglichkeiten
Referenz
ANDERSSON
et al. (1971)
PRESCOTT
et al. (1988)
PRESCOTT
et al. (1988)
STAEMPFLI
et al. (1992)
GUSTAFSSON
et al. (1997)
Cl. difficile ist ein 2,5–5,9 µm x 0,3–1,5 µm großes grampositives Stäbchen, das subterminal
Sporen ausbildet (HAFIZ u. OAKLEY 1976). Dieser Keim gehört zu den obligaten
Anaerobiern, der auf verschiedenen bluthaltigen Nährmedien angezüchtet werden kann. Die
Aminosäuren Cystein, Isoleucin, Leucin, Tryptophan und Valin sowie Biotin, Pantothensäure
und Pyridoxin sind essentiell für das Wachstum von Cl. difficile (KARASAWA et al. 1995).
Als Selektivnährboden wurde lange Zeit der von GEORGE et al. (1979) beschriebene

Schrifttum 34
Cycloserin-Cefoxitin-Fructose-Agar (CCFA), gegebenfalls unter Zusatz von 0,1 %
Taurocholat (WILSON et al. 1982), eingesetzt. Eine weitere Verbesserung der Selektivität
ermöglicht der von ASPINAL und HUTCHINSON (1992) eingeführte „Cl. difficile“-
Nährboden mit den Supplementen Cysteinhydrochlorid, Norfloxacin und Moxalactam. Auf
den genannten Selektivnährböden bildet Cl. difficile nach 48 h Inkubation bei 37 °C
anhämolysierende, hellgraue, matte und unregelmäßig begrenzte Kolonien, die unter
ultraviolettem Licht mit λ = 360 nm fluoreszieren. Große Bedeutung für die Verdachts-
diagnose „Cl. difficile“ hat der typische Geruch nach p-Kreosol („horsey smell“, JONES
1989).
Für die Bestätigung der Verdachtsdiagnose kann der Nachweis der charakteristischen
L-Prolin-Aminopeptidase-Reaktion durchgeführt werden (FEDORKO u. WILLIAMS 1997,
GARCIA et al. 1997). Diese Enzymreaktion wird in verschiedenen kommerziellen
Anaerobierdifferenzierungssystemen berücksichtigt, kann aber auch im Plättchentest
nachgewiesen werden. Nach FEDORKO und WILLIAMS (1997) reicht der Einsatz von
L-Prolin-Aminopeptidase-Plättchen zur Bestätigung von Cl. difficile-verdächtigen Kolonien,
die auf Taurocholat-haltigem CCFA wachsen, aus.
ANDERSON et al. (1995) stellen eine hohe Zuverlässigkeit der gaschromatographischen
Fettsäureanalytik für die Identifizierung von Cl. difficile fest. In Pepton-Hefe-Glukose-
Bouillon bildet Cl. difficile Essigsäure, Isobuttersäure, Buttersäure, Isovaleriansäure,
Valeriansäure und Isocapronsäure, die sich gaschromatographisch nachweisen lassen (CATO
et al. 1986; JONES 1989).
2.2.2 Virulenzfaktoren von Cl. difficile
Nur ein Teil der Stämme von Cl. difficile kann als pathogen eingestuft werden. Diese
toxinogenen Cl. difficile-Stämme zeichnen sich durch die Bildung von zumindest einem der
beiden Exotoxine, Toxin A und B, aus. Diese beiden Toxine sind die entscheidenden
Virulenzfaktoren für die Antibiotika-assoziierte Diarrhoe und pseudomembranöse Colitis des
Menschen (LYERLY et al. 1988; BARTLETT 1990). Tabelle 2 gibt eine Übersicht über
einige bedeutungsvolle Virulenzfaktoren von Cl. difficile, deren Funktion und Genetik.

Schrifttum 35
Tabelle 2: Einige Virulenzfaktoren von Cl. difficile
Virulenzfaktor
(Synonyme)
Toxin A (TcdA,
Enterotoxin)
Toxin B (TcdB,
Zytotoxin)
Gen
tcdA
TcdC tcdC
TcdD
(TxeR)
genetische
Lokalisation
Funktion Referenz
proinflammatorisches
Enterotoxin
POTHOULAKIS und
LAMONT (2001)
tcdB potentes Zytotoxin BETTE et al. (1991)
tcdD
(txeR)
TcdE tcdE
binäres ADPribosylierendes
Enzym (CDT)
Cwp66
SlpA (P36 und
P47)
cdtA,
cdtB
slpA
chromosomal
(PaLoc)
chromosomal
(außerhalb von
PaLoc)
chromosomal
(außerhalb von
PaLoc)
chromosomal
(außerhalb von
PaLoc)
2.2.3 Biochemische Merkmale der Toxine A und B
wahrscheinlich
negativer Regulator
von tcdA, B, D, E
wahrscheinlich
Aktivator von tcdA, B,
D, E
HUNDSBERGER et al.
(1997)
HUNDSBERGER et al.
(1997)
zytolytische Wirkung TAN et al. (2001)
Zytotoxin
PERELLE et al. (1997);
BRAUN et al. (2000);
GÜLKE et al. (2001)
Adhäsin WALIGORA et al. (2001)
Adhäsin
KARJALAINEN et al.
(2001)
Anfang der 80er-Jahre wurde erkannt, dass Cl. difficile unterschiedliche Toxine bildet.
TAYLOR et al. (1981) konnten erstmalig durch eine Ionenaustauscherchromatographie eine
enterotoxische (Toxin A) von einer zytotoxischen (Toxin B) Aktivität trennen. KRIVAN und
WILKINS (1987) führten später die Reinigung von Toxin A über eine temperaturabhängige
Affinitätschromatographie ein. Diese Methode basiert auf der Bindung von Toxin A an
bestimmte Trisaccharidsequenzen, der auch eine Bedeutung in der Wechselwirkung mit dem
zellulären Rezeptor beigemessen wird (LYERLY et al. 1988). Beide Toxine gehören zu den
größten bekannten bakteriellen Toxinen. Für Toxin A wird aufgrund der Gensequenz ein
Molekulargewicht von 308 kDA und für Toxin B eines von 270 kDa bestimmt (VON
EICHEL-STREIBER et al. 1990). Beide Toxine sind Monomere mit einer sehr ähnlichen
Struktur (2.2.9) und Aminosäuresequenz. 63 % ihrer Aminosäuren sind homolog (VON

Schrifttum 36
EICHEL-STREIBER et al. 1992). Im Gegensatz zu Toxin B ist Toxin A stabil bei einem pH-
Wert von 4 und 10 sowie weniger empfänglich für proteolytischen Abbau (TAYLOR et al.
1981; SULLIVAN et al. 1982).
2.2.4 Biologische Wirkungen der Toxine A und B (Zytotoxizität und Enterotoxizität)
Die Toxine A und B zeigen in verschiedenen getesteten Spezies eine letale Wirkung
(SULLIVAN et al. 1982; ARNON et al. 1984; BETTE et al. 1991). Toxin B ist ein sehr
potentes Zytotoxin, das auf eine Vielzahl von Zelllinien in einer Größenordnung von 1 pg
(50 pg/ml) einen zytopathischen Effekt ausübt (LYERLY et al. 1988). Kennzeichen dieser
Zytotoxizität ist die Depolymerisation des Aktinzytoskeletts, die sich in morphologischen
Veränderungen der Zellen manifestiert. Typisch ist eine Abrundung der Zellen mit zum Teil
dünnen, baumartigen Ausläufern (D-Typ). Einzelne Varianten des Toxins B zeichnen sich
aber durch einen zytotoxischen Effekt aus, bei dem die Zellen eine Spindelform (S-Typ)
annehmen (TORRES 1991; VON EICHEL-STREIBER et al. 1995; MEHLIG et al. 2001).
Diese Formveränderung ist ansonsten typisch für die Wirkung des letalen Toxins (LT) von
Cl. sordellii (BETTE et al. 1991). Im Zytotoxizitätstest treten bei Toxin A die gleichen
morphologischen Veränderungen wie bei Toxin B auf, allerdings erst in der Größenordnung
von 10 ng (SULLIVAN et al. 1982; FIORENTINI u. THELESTAM 1991).
Ein deutlicher Unterschied in der Wirkung zwischen Toxin A und B wird bei Untersuchungen
mit ligierten Darmschlingen im Kaninchen deutlich. Nur Toxin A führt zur
Flüssigkeitsakkumulation im Lumen des Darmes (LYERLY et al. 1982; MITCHELL et al.
1986). Toxin A verursacht in diesem Modell sowohl im Ileum als auch im Colon
Hämorrhagien, die bei den Enterotoxinen von Vibrio cholerae und Escherichia coli nicht
auftreten. Aufgrund dieser Befunde charakterisierten MITCHELL et al. (1987 b) Toxin A als
ein „histotoxisches“ Enterotoxin.
2.2.5 Nachweis der Toxine A und B in der Diagnostik
Der Goldstandard für den direkten Nachweis der Cl. difficile-Toxine im
Untersuchungsmaterial ist der Zytotoxizitätstest. Bei dieser Methode wird in einem
Zellkultursystem die Abrundung der Zellen nach Zugabe eines Probenfiltrates beurteilt. Der
Zytotoxizitätstest zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus (DOERN et al.

Schrifttum 37
1992; KELLY et al. 1994). Nachteile dieser Methode sind jedoch der hohe Arbeitsaufwand,
die Subjektivität in Bezug auf die Beurteilung der morphologischen Veränderungen und eine
eingeschränkte Vergleichbarkeit durch den Einsatz unterschiedlicher Zelllinien. Aus diesen
Gründen haben sich in der Diagnostik „enzyme-linked immunosorbent assays“ (ELISA) zum
direkten Nachweis der Toxine A und B durchgesetzt. LYERLY et al. (1998) empfehlen als
ELISA den „TOX A/B-II-TEST“ (TechLab), bei dem affinitätsgereinigte, monoklonale
Maus-Antikörper gegen das Toxin A und affinitätsgereinigte, polyklonale Ziegen-Antikörper
gegen das Toxin A und B zum Einsatz kommen. Die Autoren plädieren für dieses Testsystem
aus folgenden Gründen: Zum einen liegt die Nachweisgrenze für die Toxine mit 2–5 ng/ml
unter der des ELISA „Cytoclone A+B“ (Cambridge Biotech). Zum anderen wird in anderen
kommerziellen Testsystemen nur das Toxin A von Cl. difficile nachgewiesen, so dass
Toxin A-negative aber Toxin B-positive Cl. difficile-assoziierte Diarrhoen unerkannt bleiben
können (KATO et al. 1997; LYERLY et al. 1992). LYERLY et al. (1998) führen für den
„TOX A/B-II-TEST“ im Vergleich zu dem Zytotoxizitätstest eine Sensitivität von 92,2 % und
eine Spezifität von 100 % auf.
2.2.6 Toxin A und B als Glukosyltransferasen der kleinen GTPasen
Toxin A und Toxin B zählen zu der Familie der großen Clostridien-Zytotoxine, die sich durch
einen sehr ähnlichen molekularen Wirkungsmechanismus auszeichnen (VON EICHEL-
STREIBER et al. 1996; AKTORIES 1997). Weiterhin gehören zu dieser Toxingruppe das
hämorrhagische (HT) und letale (LT) Toxin von Cl. sordellii und das α-Toxin von Cl. novyi.
Die großen Clostridien-Zytotoxine sind Glycosyltransferasen von kleinen GTPasen (auch als
kleine GTP-bindende Proteine bezeichnet). Unterschiede bestehen in der Substrat- und
Cosubstratspezifität. Die Toxine A und B von Cl. difficile monoglukosylieren Proteine der
Rho-Unterfamilie (RhoA, Rac1 und Cdc42Hs) an der Aminosäure Threonin 35 bzw. 37
(JUST et al. 1995 a; JUST et al. 1995 b). Kleine GTPasen der Ras-Unterfamilie werden in der
Regel nicht modifiziert. UDP-Glukose ist das Cosubstrat für die von Toxin A und B
katalysierte Glykosylierung. Die modifizierte Aminosäure Threonin 35 bzw. 37 ist in der
Effektorregion der GTPasen lokalisiert (SELF et al. 1993) und partizipiert an der GTP-
Bindung (PAI et al. 1989). Die durch die Toxine A und B hervorgerufene Glukosylierung der
Rho-Proteine führt zu einer Inhibition dieser Regulatoren. Rho-Proteine sind an der
Regulation des Aktinzytoskeletts beteiligt (PATERSON et al. 1990, HALL 1998). JUST et al.

Schrifttum 38
(1995 a) zeigen mit Mikroinjektionen von glukosyliertem RhoA-Protein bzw. von Toxin B in
Nierenepithelzellen, dass die von Toxin B verursachte Störung der Aktinfilamente sowie die
damit einhergehenden morphologischen Veränderungen durch eine Glykosylierung von RhoA
erklärt werden können. Proteine der Rho-Unterfamilie sind ferner mit einer Reihe von
Signaltransduktionsmechanismen der Zelle assoziiert, insbesondere der Integrin-abhängigen
Signaltransduktion, der Phosphatidylinositol-3-Kinase, der Phosphatidylinositol-4-Phosphat-
5-Kinase und der Phospholipase D. In einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie der
Zellmigration, der Endozytose, der Sekretion, der Regulation der Transkription, des
Zellzyklus, der Apoptosis und der Zelltransformation sind Rho-Proteine involviert
(AKTORIES 1997; HALL 1998).
Varianten des Toxins B von Cl. difficile-Stämmen, bei denen oft gleichzeitig eine Deletion
oder Leserastermutation im Gen tcdA vorliegt, rufen einen zytopathischen Effekt vom S-Typ
hervor, der mit der Inaktivierung von R-Ras und nicht mit der von Rho-Proteinen in
Verbindung gebracht wird (TORRES 1991; VON EICHEL-STREIBER et al. 1995; MEHLIG
et al. 2001).
2.2.7 Störung der Epithelzellbarrierefunktion durch die Toxine A und B
MITCHELL et al. (1987 b) konnten anhand von Versuchen mit einer isolierten Ileummukosa
in der Ussing-Kammer zeigen, dass Toxin A zu einem Strom von Natriumionen und in der
Folge auch von Chloridionen von der Serosa- zur Mukosaseite führt. Da dieser Ausstrom
immer mit dem Abfall der transmuralen Potentialdifferenz und histologischen Veränderungen
einherging, diskutierten die Autoren bereits eine Beeinträchtigung der Zonula occludens
(„tight junctions“) durch das Toxin A und einen dadurch hervorgerufenen parazellulären
Ionenstrom. Diese Hypothese konnte durch nachfolgende Untersuchungen von verschiedenen
Autoren an isolierter Mukosa und Epithelzelllinien bestätigt werden (HECHT et al. 1988;
MOORE et al. 1990). Die Störung der Epithelbarrierefunktion wird ebenso von Toxin B
hervorgerufen (HECHT et al. 1992). Sie geht einher mit der Disorganisation von F-Aktin und
der diffusen Verteilung von verschiedenen Zonula occludens-Proteinen, die als
Folgereaktionen der von Toxin A bzw. B vermittelten Inaktivierung der Rho-Proteine
interpretiert werden (NUSRAT et al. 2001).

Schrifttum 39
2.2.8 Immunpathologische Wirkung von Toxin A
Ein gemeinsames histologisches Kennzeichen der Typhlocolitis des Pferdes und der
Pseudomembranösen Colitis des Menschen ist die hochgradige Infiltration der Lamina propria
der betroffenen Darmabschnitte mit neutrophilen Granulozyten und anderen akuten
Entzündungszellen. Toxin A setzt eine Kaskade von immunologischen Reaktionen in Gang,
die zu einer verstärkten Expression von Leukozyten-Adhäsionsmolekülen auf der
Endotheloberfläche und in Folge zu einer lokalen Infiltration der Lamina propria mit akuten
Entzündungszellen, insbesondere neutrophilen Granulozyten, führt (POTHOULAKIS u.
LAMONT 2001). Aus klinischer Sicht ist hervorzuheben, dass die Hemmung der durch Toxin
A hervorgerufenen Aktivierung von Neutrophilen zu einer deutlich geringeren Enteritis und
Flüssigkeitssekretion im Tiermodell beiträgt (QIU et al. 1999).
Ein bedeutungsvoller Schritt der Immunmodulation durch Toxin A betrifft die
Kommunikation zwischen Enterozyten und sensorischen Nerven, Makrophagen sowie
Mastzellen der Lamina propria. Verschiedene Experimente zeigen, dass der Aktivierung von
primären sensorischen Neuronen und der Freisetzung von Neuropeptiden eine Schlüsselrolle
in der durch Toxin A hervorgerufenen Enteritis zukommt (CASTAGLIUOLO et al. 1994;
POTHOULAKIS u. LAMONT 2001). Die Freisetzung von Neuropeptiden, insbesondere
Neurotensin und Substanz P, führt zur Degranulation der Mastzellen, die für die Chemotaxis
der neutrophilen Granulozyten eine wichtige Rolle spielt (POTHOULAKIS et al. 1998;
CASTAGLIUOLO et al. 1999).
Ein sehr früher Schritt der durch Toxin A hervorgerufenen immunologischen Reaktionen ist
die Freisetzung von Interleukin 8 (IL-8) und anderen proinflammatorischen Zytokinen durch
Enterozyten und Monozyten (LINEVSKY et al. 1997; MAHIDA et al. 1996). Reaktive
Sauerstoffintermediate aus den Mitochondrien spielen für die von Toxin A hervorgerufene
IL-8-Freisetzung der humanen Colonozyten eine zentrale Rolle (HE et al. 2002). Die Bildung
dieser reaktiven Sauerstoffintermediate ist unabhängig von der Inaktivierung von Proteinen
der Rho-Unterfamilie und führt zur Aktivierung von NF-κB, einem wichtigen
Transkriptionsfaktor von zahlreichen, immunologisch bedeutsamen Genen (CAAMAŃO u.
HUNTER 2002). In Monozyten und neutrophilen Granulozyten geht der durch Toxin A
hervorgerufenen NF-κB-Aktivierung die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären
Calciumspeichern voraus (POTHOULAKIS et al. 1988; JEFFERSON et al. 1999). Ob und

Schrifttum 40
wie der Anstieg von Calcium im Zytosol mit den Sauerstoffintermediaten aus den
Mitochondrien in Zusammenhang steht, ist zurzeit noch offen.
Aufgrund der in den letzten Jahren gewonnenen Erkenntnisse über die durch Toxin A
hervorgerufene Immunmodulation, die bei anderen Enterotoxinen wie dem Choleratoxin nicht
auftritt, bezeichnen POTHOULAKIS und LAMONT (2001) Toxin A als ein
proinflammatorisches Enterotoxin.
2.2.9 Aufnahme der Toxine A und B in die Zelle
Die großen Clostridien-Zytotoxine zeigen bezüglich der Aufnahme in die Zelle und ihrer
Struktur Ähnlichkeit zu den AB-Toxinen, wie dem Diphtherietoxin, bzw. den AB5-Toxinen,
wie dem Choleratoxin. Das Toxin A von Cl. difficile besitzt am C-Terminus eine multivalente
Rezeptorbindungsdomäne mit repetitiven Sequenzelementen, die die Funktion der B-
Untereinheit der AB-Toxine wahrnehmen soll. Über eine hydrophobe Region im zentralen
Bereich des Toxins A ist die Rezeptorbindungsdomäne mit der katalytischen Domäne am N-
Terminus, die der A-Untereinheit der AB-Toxine entspricht und keine repetitiven
Sequenzelemente aufweist, verbunden (VON EICHEL-STREIBER et al. 1996). Die
Rezeptoren der Toxine A und B von Cl. difficile sind bis jetzt schlecht charakterisiert. Für das
Toxin A wurde ein 163 kDa Glykoprotein als möglicher Rezeptor identifiziert (ROLFE u.
SONG 1993). Die Aufnahme von Toxin A und B erfolgt über Endozytose via „clathrin-coated
pits“ (HENRIQUES et al. 1987; VON EICHEL-STREIBER et al. 1991).
2.2.10 Genetik der Toxingene tcdA und tcdB
Die für das Toxin A und B kodierenden Gene tcdA und tcdB bilden zusammen mit drei
weiteren Genen tcdC, tcdD und tcdE eine genetische Einheit mit einer Größe von 19,6 kb, die
als Pathogenitätslocus PaLoc bezeichnet wird (BRAUN et al. 1996). Nur Cl. difficile-
Stämme, bei denen PaLoc im Genom vorliegt, sind pathogen bzw. toxinogen (COHEN et al.
2000). Bei atoxinogenen Cl. difficile-Stämmen wird der PaLoc durch ein 115 bp DNA-
Fragment ersetzt, das zwischen den beiden Insertionssequenzen des PaLoc lokalisiert ist
(BRAUN et al. 1996; HAMMOND et al. 1995). Die Insertionsstelle von PaLoc liegt nur
einmal im Genom von Cl. difficile vor (BRAUN et al. 1996).

Schrifttum 41
Einige Cl. difficile-Stämme bilden kein Toxin A, aber Toxin B (TORRES 1991). Ein Teil
dieser Stämme trägt Deletionen im Gen tcdA (LYERLY et al. 1992; DEPITRE et al. 1993).
2.2.11 Genregulation der Toxingene tcdA und tcdB
Die Mengen an gebildetem Toxin A und B variieren stark zwischen verschiedenen
Cl. difficile-Stämmen und werden durch Umwelteinflüsse bestimmt (HUNDSBERGER et al.
1997; DUPUY u. SONENSHEIN 1998). Untersuchungen zur Genregulation der Toxingene
tcdA und tcdB können durch die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen einen
entscheidenden Beitrag zur Prophylaxe der Cl. difficile-assoziierten Erkrankungen leisten.
HUNDSBERGER et al. (1997) zeigen, dass während der frühen exponentiellen
Wachstumsphase tcdC im Gegensatz zu allen anderen Genen des PaLoc transkribiert wird.
Mit dem Übergang von der exponentiellen Wachstumsphase in die stationäre Phase nimmt die
tcdC mRNA stark ab, während gleichzeitig tcdA, B, D, E vermehrt transkribiert werden.
Diese Daten stehen im Einklang mit der Vorstellung, dass TcdC ein negativer Regulator der
Toxinbildung ist, der in der frühen exponentiellen Phase die Toxinbildung von Cl. difficile
unterbindet. SPIGAGLIA und MASTRANTONIO (2002) beschreiben Varianten von TcdC in
verschiedenen humanmedizinischen Isolaten. Der Cl. difficile-Stamm 8864 exprimiert eine
verkürzte, wahrscheinlich inaktive Form des TcdC-Proteins, die zu der extremen Zytotoxizität
dieses Stammes beitragen könnte (SOEHN et al. 1998).
Im Gegensatz zu TcdC sprechen Sequenzvergleiche und Regulationsuntersuchungen dafür,
dass TcdD (TxeR) ein Transkriptionsaktivator (HUNDSBERGER et al. 1997) bzw. ein
alternativer σ-Faktor (MANI u. DUPUY 2001) ist, der die Toxingene tcdA, tcdB und tcdE
positiv reguliert. TcdD ist ein basisches Protein mit einem C-terminalen Helix-turn-Helix-
Motiv (HUNDSBERGER et al. 1997). Aufgrund von Ähnlichkeiten im Promotorbereich von
tcdD zu Toxingenen anderer Bakterien diskutieren die Autoren eine auf Umwelteinflüsse
abgestimmte Genregulation von tcdD.
Die Promotoren der Toxingene tcdA und tcdB weisen Ähnlichkeiten zu dem Promotor des
Bacteriocinlocus von Cl. perfringens auf, der im Rahmen einer SOS-Antwort aktiviert wird.
Die Bildung der Toxine A und B von Cl. difficile könnte somit auch SOS-abhängig sein
(HUNDSBERGER et al. 1997). Die SOS-Antwort ist ein komplexes Regulationssystem, das
bei verschiedenen Umweltstressoren, wie UV-Strahlen, Hunger und Antibiotika-Exposition,
angeschaltet wird. Bei Clostridien führt die Aktivierung des SOS schließlich zur Sporulation.

Schrifttum 42
Der Zusammenhang mit dem SOS-Regulationssystem könnte erklären, warum bei Cl. difficile
eine Verbindung zwischen Toxinbildung und Sporenausbildung festgestellt werden konnte
(KAMIYA et al. 1992).
2.2.12 TcdE
Die Funktion von TcdE, dessen Gen zwischen tcdA und tcdB lokalisiert ist, ist noch
weitgehend ungeklärt. TAN et al. (2001) postulieren aufgrund von Sequenzanalysen und
Expressionsstudien in Escherichia coli eine zytolytische Funktion in der bakteriellen
Zellmembran, die denen der „holins“ der Bakteriophagen gleicht. Da Toxin A und B nicht
Signalsequenz-abhängig sezerniert werden, könnte das in der Bakterienzellmembran
lokalisierte TcdE die Freisetzung von Toxin A und Toxin B ermöglichen.
2.2.13 Das binäre ADP-ribosylierende Enzym (CDT)
POPOFF et al. (1988) konnten erstmalig ein Aktin-spezifisches ADP-ribosylierendes Enzym
(CDT) von Cl. difficile identifizieren, das eine große Homologie zu dem ι-Toxin von
Cl. perfringens aufweist. CDT besteht aus einer enzymatischen (CDTa) und einer bindenden
Komponente (CDTb). CDT wirkt zytotoxisch auf Verozellen (PERELLE et al. 1997; GÜLKE
et al. 2001). Die pathogene Bedeutung von CDT ist noch weitgehend ungeklärt. Nur ein
geringer Teil der toxinogenen Cl. difficile-Isolate bildet das binäre ADP-ribosylierende
Enzym, so dass CDT offensichtlich für die Virulenz von Cl. difficile nicht notwendig ist
(PERELLE et al. 1997). BRAUN et al. (2000) untersuchten 17 Cl. difficile-Isolate von
Pferden in Bezug auf die Toxingene tcdA, tcdB und cdtA. Vier der elf tcdA/B-positiven
Cl. difficile-Isolate waren auch positiv für das Toxingen cdtA. Bis jetzt sind weder in der
Tiermedizin noch in der Humanmedizin Cl. difficile-Stämme beschrieben worden, die nur das
binäre ADP-ribosylierende Enzym CDT, aber nicht das Toxin A und/oder B bilden.
2.2.14 Die Adhäsine Cwp66 und SlpA
Aufgrund von Sequenzanalysen und in Analogie zu anderen Bakterien postulieren
KARJALAINEN et al. (2001), dass Cl. difficile eine Reihe von Proteinen mit
Adhäsinfunktion auf der Oberfläche exprimiert. Für Cwp66 und SlpA konnten experimentelle

Schrifttum 43
Indizien einer Adhäsinfunktion gewonnen werden (KARJALAINEN et al. 2001;
WALIGORA et al. 2001). In der Zellkultur konnten die Autoren durch spezifische Antikörper
gegen SlpA bzw. Cwp66 die Adhäsion des entsprechenden Cl. difficile-Stammes stark
reduzieren. SlpA und auch Cwp66 besitzen zwei Domänen. Am N-Terminus befindet sich
eine „S-layer-homologous“-Domäne, die die Proteine in der Zellwand verankert. Während
diese Domäne zwischen verschiedenen Cl. difficile-Stämmen konserviert ist, zeigt die Cterminale
Domäne große Variabilität. Die weitere Charakterisierung dieser und weiterer
Adhäsine verspricht Erkenntnisse zum Verständnis des Kolonisationsmechanismus von
Cl. difficile. In diesem Zusammenhang sind auch die Ergebnisse von WALIGORA et al.
(1999) hervorzuheben, die zeigen, dass bestimmte Stressfaktoren die Adhäsion von
Cl. difficile in vitro erhöhen und die Expression von Oberflächenproteinen bestimmen.
Eisenmangel, ein saurer pH-Wert und eine hohe Salzkonzentration gehören zu den
untersuchten Streßfaktoren, die die Adhäsion von Cl. difficile verstärken. In diesem in vitro-
Testsystem konnte kein Unterschied in Bezug auf die Adhäsion von toxinogenen und
atoxinogenen Cl. difficile-Stämmen festgestellt werden.
2.2.15 Typisierung von Cl. difficile
Cl. difficile ist ein nosokomialer Infektionserreger (MCFARLAND et al. 1989; JOHNSON et
al. 1990). In zahlreichen Umgebungsproben aus Tier- bzw. Pferdekliniken konnte Cl. difficile
nachgewiesen werden (WEESE et al. 2000; JOBST et al. 2002). Die Übertragung und
Verschleppung dieses Erregers in Kliniken schafft die Voraussetzungen für Ausbrüche von
Cl. difficile-assozierten Erkrankungen in Krankenhäusern und Tierkliniken. MADEWELL et
al. (1995) dokumentieren den Ausbruch von Durchfallerkrankungen bei zehn hospitalisierten
Pferden, bei denen in neun Fällen toxinogene Cl. difficile-Stämme nachgewiesen werden
konnten. In der Humanmedizin werden seit Anfang der 90er-Jahre unterschiedliche Phänound
Genotypisierungsverfahren für Cl. difficile-Isolate eingesetzt, um solche nosokomialen
Ausbrüche epidemiologisch zu untersuchen (Tabelle 3).

Schrifttum 44
Tabelle 3: Typisierung von Cl. difficile
Phänotypisierung
Genotypisierung
Typisierungsmethode Referenz
Bacteriophagen und Bacteriocin SELL et al. (1983)
Polyacrylamidgelelektrophorese
Muster von 35 S-Methioninmarkierten
Proteinen
TABAQCHALL et al. (1983)
Serotypisierung DELMÉE (1985)
Immunoblotting HEARD et al. (1986)
Restriktionsenzymanalyse DELVIN et al. (1987)
Ribotypisierung BOWMAN et al. (1991)
Pulsfeldgelelektrophorese
KATO et al. (1994);
KRISTJANSSON et al. (1994)
AP-PCR („arbitrarily primed“) SILVA et al. (1994)
PCR des 16S-23S rDNA-Spacer
2.2.16 Die Pseudomembranöse Colitis des Menschen
GÜRTLER (1993);
CARTWRIGHT et al. (1995)
STUBBS et al. (1999)
Cl. difficile ist der Erreger der Pseudomembranösen Colitis (PMC) des Menschen. Weiterhin
können bis zu 20 % der Antibiotika-assoziierten Diarrhoen ohne Colitis in der Humanmedizin
auf Cl. difficile zurückgeführt werden. Das klinische Bild der PMC ist gekennzeichnet durch
eine profuse Diarrhoe, Kolik, Fieber, Nausea, Anorexie, Dehydratation und in fulminanten
Fällen auch durch eine Tachycardie und Lethargie. Labordiagnostisch fällt der Patient durch
eine polymorphkernige Leukozytose im peripheren Blut und eine erhöhte Anzahl fäkaler
Leukozyten auf. Mithilfe der Sigmoidoskopie können die charakteristischen
Pseudomembranen als adhärente, gelbe Beläge auf der Schleimhaut des Colon descendens
dargestellt werden. Durch die Atonie der Colonmuskulatur kann sich als Komplikation der
PMC das toxische Megacolon manifestieren.
Die PMC wird aufgrund pathohistologischer Befunde in drei Typen unterteilt, die sich im
Ausmaß der Epithelzellnekrose, Exsudation von Fibrin und neutrophilen Granulozyten,

Schrifttum 45
Auftreten von Ulcera und Pseudomembranen aus Mucin, Fibrin, Leukozyten und Zelldetritus
unterscheiden (KELLY et al. 1994).
Zur Bestätigung der Verdachtsdiagnose einer Cl. difficile-Infektion wird in der
Humanmedizin meistens eine Stuhlprobe mit dem Zytotoxizitätstest oder ELISA direkt auf
die Toxine von Cl. difficile untersucht. Der kulturelle Nachweis von Cl. difficile besitzt
aufgrund der hohen Anzahl asymptomatischer Ausscheider in Krankenhäusern eine geringere
Aussagekraft (GERDING u. BRAZIER 1993).
Zu den Risikofaktoren, die in der Humanmedizin signifikant mit einer durch Cl. difficile
hervorgerufenen Diarrhoe bei hospitalisierten Patienten assoziiert sind, zählen
(MCFARLAND et al. 1990):
• fortgeschrittenes Alter
• eine schwere Grunderkrankung
• Antibiose
• gastrointestinale Stimulantien
• Laxantien
• Einläufe
2.2.17 Antibiotika als Risikofaktor für Cl. difficile-assoziierte Erkrankungen
In der Humanmedizin gilt die Applikation von Antibiotika als der größte iatrogene
Risikofaktor für eine durch Cl. difficile hervorgerufene intestinale Erkrankung (KELLY et al.
1994; SPENCER et al. 1998). Vor allem Clindamycin, Cephalosporine und Ampicillin
werden aufgrund ihrer Wirkung auf die anaerobe Darmflora als besonders prädisponierend
eingestuft. Erythromycin, Sulfonamide, Trimethoprim und Tetracycline fallen in die mittlere
Kategorie. Obwohl jedes Antibiotikum zu einer Cl. difficile-Infektion führen kann, gilt die
parenterale Applikation von Aminoglykosiden und Metronidazol diesbezüglich als relativ
ungefährlich (KELLY et al. 1994; SPENCER 1998). Während nur ein Prozent der
Erwachsenen Träger von Cl. difficile sind, führt die Behandlung mit Antibiotika bei ca. 25 %
der Erwachsenen zur Kolonisation mit Cl. difficile. Der größte Teil dieser Patienten ist
bezüglich der Cl. difficile-Kolonisation asymptomatisch (KELLY et al. 1994).
Die Typhlocolitis des Pferdes konnte bei einzelnen Versuchstieren experimentell durch die
Applikation von Oxytetracyclin, Clindamycin, Vancomycin und Erythromycin ausgelöst

Schrifttum 46
werden (2.1.7). Ferner wurde in unterschiedlichen Untersuchungen eine Assoziation von
Cl. difficile-assoziierten Typhlocolitisfällen mit der Applikation von Antibiotika festgestellt
(BÅVERUD et al. 1997; MADIGAN et al. 1998). BÅVERUD et al. (1997) konnten
beispielsweise bei zehn von 25 Pferden, die während einer antibiotischen Behandlung eine
Typhlocolitis entwickelten, Cl. difficile und/oder Toxin B feststellen. Bei keinem der 22
Typhlocolitispatienten ohne antibiotische Behandlung und bei keinem der 21 Pferde ohne
intestinale Erkrankung, aber mit antibiotischer Behandlung war Cl. difficile oder Toxin B
nachweisbar. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Applikation von Antibiotika für die
Cl. difficile-assoziierte Typhlocolitis des Pferdes eine ähnliche Bedeutung wie für die
Pseudomembranöse Colitis des Menschen hat.
Für das Verständnis dieser Zusammenhänge sind Untersuchungen zur Mikroökologie der
Darmflora und zur Verbreitung der Antibiotikaresistenzen von großer Bedeutung.
2.2.18 Untersuchungen zur Mikroökologie von Cl. difficile im Tiermodell
Durch die Applikation unterschiedlicher Antibiotika kann bei Syrischen Hamstern eine letale
Enterocolitis experimentell ausgelöst werden. BARTLETT et al. (1978) gelang dies mit den
Antibiotika Ampicillin, Vancomycin, Clindamycin, Erythromycin, verschiedenen
Cephalosporinen und Gentamicin (orale Applikation). Diese experimentell induzierte
Enterocolitis manifestiert sich vor allem als eine hämorrhagische Caecitis. Teilweise sind
auch Beläge aus Trümmern von Entzündungszellen, Bakterien und abgeschilferten
Epithelzellen vorhanden, die den Pseudomembranen gleichen. Die Toxine A und B von
Cl. difficile sind an der Pathogenese dieser experimentell induzierten Caecitis ursächlich
beteiligt (LYERLY et al. 1988). Durch die Applikation der Antibiotika steigt der Keimgehalt
von Cl. difficile auf 10 7 –10 8 KBE/g Caecumchymus (WILSON u. SHEAGREN 1983).
Cl. difficile kann bei gesunden ausgewachsenen Hamstern wie auch bei Menschen den
Darmtrakt nicht besiedeln. Dieses Phänomen wird als Kolonisationsresistenz bezeichnet und
kann auf den Antagonismus der residenten Darmflora gegenüber enteropathogenen Bakterien
zurückgeführt werden (WILSON 1993). Entscheidend für die Pathogenese der Enterocolitis in
dem Tiermodell Syrischer Hamster ist die Schwächung der Kolonisationsresistenz durch die
Applikation der Antibiotika.
Wie die residente Darmflora den Wirtsorganismus vor der Kolonisation mit Cl. difficile
schützt, ist noch nicht vollständig geklärt. Nach der Chemostattheorie wird die

Schrifttum 47
Zusammensetzung der Darmflora im Wesentlichen durch die Kompetition um die Nährstoffe
bestimmt. Die Dilutionsrate des Gastrointestinaltraktes, die Substrataffinität und die
Proliferationsrate eines Bakteriums bestimmen nach dieser Theorie, ob es sich in dieser
Kompetition durchsetzt (WILSON 1993). Es ist aber auch zu berücksichtigen, dass ein
Bakterium durch eine starke Adhärenz zur Mukosa einen entscheidenden Kompetitionsvorteil
erreichen kann. Die residente Darmflora produziert eine Reihe von Substanzen, die das
Wachstum von anderen Arten hemmen. Zu diesen Substanzen zählen Schwefelwasserstoff,
sekundäre Gallensäuren und flüchtige Fettsäuren.
Bei neugeborenen Syrischen Hamstern kann es wie bei neonatalen Menschen zu einer
Besiedlung mit toxinogenen Cl. difficile-Stämmen kommen. Obwohl oft ein hoher
spezifischer Keimgehalt vorliegt und Toxin A und/oder B nachgewiesen werden kann,
erkrankt der neonatale Wirtsorganismus in der Regel nicht. Die Ursache für diese Resistenz
ist zurzeit noch ungeklärt. Der Rückzug von Cl. difficile aus dem Darmkanal während der
weiteren Entwicklung des Neonatalen geht einher mit einer Zunahme an flüchtigen Fettsäuren
(ROLFE 1984; WILSON 1993). Buttersäure erreichte mit ca. 30 µeq/g Caecumchymus nach
den Ergebnissen von ROLFE (1984) am 19. Tag post partum eine Konzentration, die für die
Wachstumshemmung von Cl. difficile in vitro ausreichend war. Die von SU et al. (1987)
bestimmte minimale inhibitorische Konzentration von Buttersäure für Cl. difficile in vitro lag
aber mit mehr als 200 µeq/ml deutlich über den physiologischen Konzentrationen im Caecum.
Unterschiedliche in vitro-Experimente und in vivo-Versuche mit gnotobiotischen Mäusen von
SU et al. (1987) legen auch nahe, dass kurzkettige Fettsäuren nicht ausschlaggebend für die
Kolonisationsresistenz gegenüber Cl. difficile sind.
Die Kolonflora in einer Hirn-Infusionsbouillon-Durchflusskultur verliert ihre Fähigkeit zur
Ausbildung einer Kolonisationsresistenz gegenüber Cl. difficile (WILSON u. FRETER 1986).
Durch den Zusatz von Mucin oder Monosacchariden zu dieser Hirn-Infusionsbouillon-
Durchflusskultur behält die Kolonflora aber diese Eigenschaft bei (WILSON u. PERINI
1988). Aufgrund dieser und weiterer Ergebnisse postulieren die Autoren im Einklang mit der
Chemostattheorie, dass noch nicht näher bestimmte Bakterien der Darmflora erfolgreich mit
Cl. difficile um die Monosaccharide Glukose, N-Acetylglucosamin und Sialinsäure im
Dickdarm konkurrieren und so zur Kolonisationsresistenz beitragen.

Schrifttum 48
2.2.19 Antagonismus von toxinogenen Cl. difficile- durch atoxinogene Cl. difficile-
Stämme
Der Gastrointestinaltrakt von Cefoxitin-behandelten Hamstern wurde in einem Experiment
von WILSON und SHEAGREN (1983) vor der Applikation eines toxinogenen Cl. difficile-
Stammes mit einem atoxinogenen Cl. difficile-Stamm kolonisiert. Der in Folge applizierte
toxinogene Cl. difficile-Stamm konnte bei diesen Versuchstieren nur eine Population im
Caecum mit einer Größe von weniger als 0,2 % der Populationsgröße aufbauen, die er im
Caecum von Cefoxitin-behandelten Hamstern ohne eine Kolonisation mit einem atoxinogen
Cl. difficile-Stamm erreichte (Kontrollgruppe). Die Überlebensrate der Hamster, bei denen
eine Besiedlung mit atoxinogenen Cl. difficile-Stämmen stattfand, war mit 93 % deutlich
größer als jene der Kontrollgruppe mit 21 %. Im Einklang mit weiteren Experimenten im
gnotobiotischen Mausmodell (CORTHIER u. MULLER 1988) zeigen diese Ergebnisse, dass
die intestinale Besiedlung mit atoxinogenen Cl. difficile-Stämmen eine präventive Funktion
ausüben kann. In der Humanmedizin ist ein atoxinogener Cl. difficile-Stamm bei zwei
Patienten erfolgreich zur Prophylaxe gegenüber Rezidiven einer Cl. difficile-assoziierten
Diarrhoe eingesetzt worden (SEAL et al. 1987).
2.3 Clostridium perfringens
2.3.1 Allgemeine Eigenschaften und Nachweismöglichkeiten
Cl. perfringens ist in der Umwelt sehr weit verbreitet. Dieser Keim lässt sich häufig in
Boden-, Futter- und Darminhaltsproben von verschiedenen Tieren nachweisen (HATHEWAY
1990). Die Art Cl. perfringens wird in verschiedene Toxintypen eingeteilt, die für
unterschiedliche Erkrankungen bei verschiedenen Spezies eine ätiologische Bedeutung
besitzen (2.3.2).
Im Grampräparat sind plumpe, grampositive bzw. gramlabile Stäbchen mit einer Größe von
0,6–2,4 µm x 2–10 µm ohne Sporenbildung typisch für Cl. perfringens (CATO et al. 1986).
Auf dem Schaedler-Nährboden bildet dieser Keim nach 24 h anaerober Bebrütung 36 mm
große, meist hellgraue, glattrandige Kolonien mit einer doppelzonigen Hämolyse (CATO et
al. 1986; SCHALLEHN 1990). Nach längeren Inkubationszeiten zeigen die Kolonien häufig
rhizoide Ausläufer. Als Selektivnährboden für Cl. perfringens wird in der Diagnostik vor

Schrifttum 49
allem ein Clostridien-Selektivnährboden eingesetzt, der Kanamycin und Neomycin als
Hemmstoffe für die Begleitflora enthält. Auf diesem Nährboden bildet Cl. perfringens nach
24–48 h 2–4 mm große, gelbliche, glattrandige, hämolysierende Kolonien. Charakteristisch
für die Cl. perfringens-Kultur ist der Geruch nach Buttersäure.
Die Sporenbildung von Cl. perfringens kann durch die Kultivierung in speziellen Medien
erreicht werden (DUNCAN u. STRONG 1986). Zu den biochemischen Merkmalen von
Cl. perfringens zählt die Lecithinase- (Phospholipase C) und Phosphatase-Reaktion. In der
Nagler-Reaktion wird die Lecithinase von Cl. perfringens auf der Eigelbagarplatte spezifisch
nachgewiesen (SCHALLEHN 1990). Die Lecithinase ist identisch mit dem α-Toxin. Eine
Reihe von kommerziellen Anaerobierdifferenzierungssystemen, wie das „RapID-ANA II
System“ (Innogenetics GmbH) ermöglichen die zuverlässige Differenzierung von
Cl. perfringens gegenüber anderen Clostridienarten (CELIG u. SCHRECKENBERGER 1991;
MARLER et al. 1991).
2.3.2 Typisierung von Cl. perfringens
Die Einteilung von Cl. perfringens in die Toxintypen A bis E basiert auf Unterschieden
bezüglich der Bildung der Major-Toxine α, β, ε und ι, für die folgende Gene kodieren: cpa,
cpb, etxD und iap. Typ A-Stämme produzieren nur das α-Toxin, Typ B-Stämme α-, β- und ε-
Toxin, Typ C-Stämme α- und β-Toxin, Typ D α- und ε-Toxin, Typ E-Stämme α- und ι-
Toxin. Diese Typisierung wurde ursprünglich im Tierversuch durchgeführt (STERNE u.
BATTY 1975). Vor allem in der Diagnostik wurde der Tierversuch später durch alternative
ELISA-Verfahren ersetzt (NAGAHAMA 1991). Im Gegensatz zu diesen Phänotypisierungen,
die die Bildung des Toxins in vitro in ausreichenden Mengen voraussetzen, wird bei der
Genotypisierung mit der PCR das Toxingen nachgewiesen. Die Genotypisierung mit der PCR
ermöglicht auch eine weiterführende Subtypisierung, bei der die Stämme auf weitere
Toxingene, wie z. B. das β2-Toxingen und das Enterotoxingen, untersucht werden
(GARMORY et al. 2000). Bei dem Nachweis eines toxinogenen Stammes mit der PCR muss
grundsätzlich davon ausgegangen werden, dass dieser Stamm in vivo die Fähigkeit zur
Bildung des entsprechenden Toxins besitzt.

Schrifttum 50
2.3.3 Virulenzfaktoren von Cl. perfringens und deren Genetik
Das auffallendste Merkmal des Genoms von Cl. perfringens im Vergleich zu dem Genom von
Clostridium acetobutylicum, einer apathogenen Clostridienspezies, ist die reichhaltige
Ausstattung mit Virulenz-assoziierten Genen. Im Unterschied zu anderen bakteriellen
Infektionserregern sind die Virulenz-assoziierten Gene auf dem Chromosom nicht auf
Pathogenitätsinseln lokalisiert. Die Sequenzierung des gesamten Genoms des Cl. perfringens-
Stammes 13 offenbarte neben den ohnehin schon zahlreichen bekannten Virulenzfaktoren
noch weitere Gene mit Sequenzhomologien zu Virulenz-assoziierten Genen (SHIMIZU et al.
2002). Neben dieser beeindruckenden Ausstattung mit Virulenz-assoziierten Genen auf dem
Chromosom besitzen viele Cl. perfringens-Stämme noch Plasmide mit Toxingenen (PETIT et
al. 1999). In der Tabelle 4 und im folgenden Text wird eine Auswahl von Virulenzfaktoren
von Cl. perfringens vorgestellt, die für die Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes von
Bedeutung sein könnten.
Tabelle 4: Virulenzfaktoren von Cl. perfringens Typ A-Stämmen, die für die
Ätiopathogenese der Typhlocolitis des Pferdes von Bedeutung sein
könnten
Virulenzfaktor Gen
genetische
Lokalisation
α-Toxin cpa chromosomal
β2-Toxin cpb2 Plasmid
Enterotoxin
(CPE)
VirR/VirS
cpe
virR
virS
Chromosom/
Plasmid
chromosomal
Funktion Referenz
Phospholipase C /
Sphingomyelinase mit
zytolytischer und
hämolytischer Wirkung
zytolytisch (Zerreißen der
Zellmembran?)
Ausbildung einer Pore
(zytotoxisch)
Zweikomponentensystem für
die Regulation der
Toxingenexpression
AWAD et al.
(1995); ROOD
(1998)
GIBERT et al.
(1997)
MCCLANE et al.
(2000)
LYRISTIS et al.
(1994)

Schrifttum 51
2.3.4 Das α-Toxin
Das α-Toxin von Cl. perfringens ist ein bedeutungsvoller Virulenzfaktor für das Gasgangrän
des Menschen (AWAD et al. 1995; ROOD 1998). Auch die Pathogenese der durch
Cl. perfringens hervorgerufenen nekrotisierenden Enteritis des Geflügels wird auf das
α-Toxin zurückgeführt (AL-SHEIKHLY u. TRUSCOTT 1977 a; AL-SHEIKHLY u.
TRUSCOTT 1977 b). Das α-Toxin besitzt sowohl Phospholipase C als auch
Sphingomyelinase-Aktivität. Es wirkt hämolytisch, nekrotisierend, zytotoxisch und potentiell
letal (SONGER 1996). Das entsprechende Gen cpa (identisch mit plc) ist zusammen mit den
Genen für das θ-Toxin, die κ-Kollagenase und die µ-Hyaluronidase in einer variablen Region
auf dem Chromosom in der Nähe des Replikationsursprungs lokalisiert (ROOD 1998; PETIT
et al. 1999). Alle 2.659 von DAUBE et al. (1996) untersuchten Cl. perfringens-Isolate von
verschiedenen Tierarten waren positiv für das cpa-Gen. Es bestehen aber große Unterschiede
zwischen der cpa-Genexpression bzw. der α-Toxinakivität unter den verschiedenen
Cl. perfringens-Stämmen, die mit der unterschiedlichen Virulenz der Stämme in
Zusammenhang stehen soll (DAUBE et al. 1996; ROOD 1998). Nach SONGER (1996)
könnte das α-Toxin als Virulenzfaktor für die Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes von
Bedeutung sein. JOBST (2001) wies das α-Toxin mit einem ELISA-Verfahren nur in zwei
von 73 Kotproben von Pferden mit Typhlocolitis (n=18) bzw. von Pferden mit einer breiigen
bis flüssigen Kotkonsistenz (n=7) nach. Demnach spielt das α-Toxin für die Pathogenese der
Typhlocolitis keine entscheidende Rolle.
2.3.5 Das Enterotoxin (CPE)
Die durch Cl. perfringens Typ A-Stämme verursachte Lebensmittelvergiftung des Menschen
geht auf das Enterotoxin (CPE) zurück. Enterotoxinogenen Cl. perfringens Typ A-Stämmen
wird ferner eine ätiologische Bedeutung für 10–15 % der Fälle der Antibiotika-assoziierten
Diarrhoe des Menschen und für Durchfallerkrankungen bei verschiedenen Tierarten
beigemessen (SONGER 1996; MCCLANE et al. 2000; ASHA u. WILCOX 2002). Für das
Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankungen ist entscheidend, dass das Enterotoxin erst
nach der Induktion der Sporulation im Darm gebildet wird. Die Verknüpfung der
Enterotoxinbildung mit der Sporulation steht wahrscheinlich mit der Genregulation von cpe

Schrifttum 52
im Zusammenhang. Sequenzanalysen legen nahe, dass die zentralen Genregulatoren der
Sporulation, die σ-Faktoren SigE und SigK, die Expression des cpe-Gens bestimmen (ZHAO
u. MELVILLE 1998). Im Gegensatz zu den anderen vorgestellten Toxinen wird CPE nicht
sezerniert, sondern während der Sporulation durch die Lyse der Sporenmutterzelle freigesetzt.
Das Enterotoxin CPE ist ein 35 kDa großes Protein, das die Abschilferung von
Darmepithelzellen hervorruft. Die Schädigung der Enterozyten durch CPE erfolgt an der
Zytoplasmamembran durch die Ausbildung eines großen Proteinkomplexes, der sich aus CPE,
dem CPE-Rezeptor (ein RVP-1-homologes Protein) und zwei weiteren Proteinen der
Zytoplasmamembran zusammensetzt. Die Ausbildung dieses großen Proteinkomplexes geht
einher mit einer starken Permeabilitätszunahme der Zytoplasmamembran für verschiedene
Ionen und kleine organische Verbindung mit einer Größe bis 200 Da (MCCLANE et al.
2000).
BOWNESS et al. (1992) postulierten ferner eine Superantigenfunktion von CPE.
Umfassendere Untersuchungen über die Wirkung von CPE auf „peripheral blood
mononuclear cells“ von KRAKAUER et al. (1997) können dies aber nicht bestätigen.
KRAKAUER et al. (1997) konnten aber einen Anstieg von IL-6 feststellen. Ob dieses
proinflammatorische Zytokin eine Bedeutung für die Pathogenese der Enterotoxinvermittelten
Erkrankungen besitzt, ist noch offen.
Das cpe-Gen kann sowohl chromosomal als auch auf einem Plasmid lokalisiert sein (ROOD
1998). Die meisten Cl. perfringens-Isolate von Lebensmittelvergiftungen des Menschen
tragen ein chromosomal lokalisiertes cpe-Gen, während die enterotoxinogenen
Cl. perfringens-Isolate von Menschen mit einer Antibiotika-assoziierten Diarrhoe oder von
Tieren mit intestinalen Erkrankungen ein plasmidkodiertes cpe-Gen besitzen (CORNILLOT
et al. 1995; COLLIE u. MCCLANE 1998). Die Sequenz von cpe von einem equinen Isolat ist
identisch mit der von humanen Isolaten (NETHERWOOD et al. 1998).
2.3.6 Das β2-Toxin
Das Gen cpb2 wurde von GIBERT et al. (1997) erstmalig kloniert und sequenziert. Es kodiert
für ein 31 kDa großes Genprodukt mit einer Signalsequenz. Nach der Sekretion und
Prozessierung entsteht das 28 kDa große β2-Toxin. Die Sequenz des β2-Toxins zeigt keine
Homologie zu anderen bekannten Proteinsequenzen. Gereinigtes β2-Toxin ist nach der

Schrifttum 53
intravenösen Applikation von 3 µg letal für Mäuse. Für I407-Zellen ist das β2-Toxin in einer
Dosis von 20 µg/ml zytotoxisch. Es kommt zu einer Abrundung und Lyse der I407-Zellen,
ohne dass das Aktinzytoskelett modifiziert wird. Das β2-Toxin führt nicht wie die Toxine A
und B von Cl. difficile zu einer Glukosylierung der kleinen GTPasen (2.2.6; GIBERT et al.
1997). Die Autoren stellen heraus, dass das β2-Toxin sehr instabil ist und somit die
spezifische Aktivität sehr schnell abnimmt.
MANTECA et al. (2002) untersuchten vergleichend einen β2-toxinogenen (cpb2+), einen
enterotoxinogenen (cpe+) und zwei cpb2– cpe– Typ A-Stämme im Ligaturtest am Darm eines
Kalbes. Hämorrhagien, Nekrosen und die Infiltration der Lamina propria mit
Entzündungszellen waren am stärksten in der Darmschlinge, die mit dem β2-toxinogenen
Cl. perfringens-Stamm inokuliert wurde, vertreten. Im Gegensatz zu dem cpe+
Cl. perfringens-Stamm kam es aber nicht zur Flüssigkeitsakkumulation im Darmlumen. Der
Keimgehalt von Cl. perfringens in diesem Darmabschnitt betrug 7,5 x 10 9 KBE/g Kot. Da
dieser Cl. perfringens-Stamm auch größere Mengen an α-Toxin produziert, vermuten die
Autoren eine synergistische Wirkung des α- und β2-Toxins in Bezug auf die Ausbildung
nekrotischer und hämorrhagischer Veränderungen im Dünndarm im Rahmen der Pathogenese
der bovinen Enterotoxämie.
STRAUB und FREY (2000) berichten, dass das equine Cl. perfringens-Isolat E482/97 in
Kultur nur nach Zugabe von Gentamicin nachweisbare Mengen an β2-Toxin produzierte.
Aufgrund dieser Ergebnisse wird diskutiert, dass die Biosynthese des β2-Toxins nur unter
Stresssituationen angeschaltet wird.
Das β2-Toxingen cpb2 ist auf einem Plasmid lokalisiert (GIBERT et al. 1997) und kann bei
den unterschiedlichen Cl. perfringens-Toxintypen auftreten. GARMORY et al. (2000)
beschreiben β2-toxinogene Subtypen der Typ A-, C-, D- und E-Stämme.
2.3.7 Toxingenregulation von Cl. perfringens
Wie für Cl. difficile bereits erläutert, gibt es auch für Cl. perfringens Indizien, dass dieser
Keim unter bestimmten Umweltbedingungen verstärkt Toxine produziert. Das
Zweikomponentensystem VirR/VirS von Cl. perfringens spielt wahrscheinlich für die auf
Umwelteinflüsse abgestimmte Toxingenregulation eine zentrale Rolle. Die Histidinkinase
VirS ist in der Zytoplasmamembran der Bakterienzelle lokalisiert und wird vermutlich durch

Schrifttum 54
noch unbekannte Umweltstimuli aktiviert. In Folge phosphoryliert VirS den „response
regulator“ VirR. Durch die Phosphorylierung wird VirR aktiv und initiiert direkt oder indirekt
die Expression von zahlreichen Toxingenen, insbesondere cpa, pfoA, colA, prt und nan
(LYRISTIS et al. 1994; SHIMIZU et al. 1994; BANU et al. 2000). Diese Toxingene kodieren
für wichtige Virulenzfaktoren, die es Cl. perfringens ermöglichen, das Gasgangrän des
Menschen hervorzurufen (AWAD et al. 1995). Während LYRISTIS et al. (1994) die
Bedeutung des VirR/VirS-Zweikomponentensystems für diese Erkrankung im Tiermodell
demonstrieren konnten, fehlen bis jetzt noch Untersuchungen über die Bedeutung des
VirR/VirS-Zweikomponentensystems für die Pathogenese von gastrointestinalen
Erkrankungen.
2.3.8 Cl. perfringens als Enterotoxämie- und Enteritiserreger
Bei zahlreichen Tierarten ist Cl. perfringens ein bedeutungsvoller Enterotoxämie- und
Enteritiserreger (ROLLE u. MAYR 2002). Beim Schaf rufen Cl. perfringens Typ D-Stämme
beispielsweise eine Enterotoxämie hervor. Cl. perfringens Typ A ist hingegen vor allem beim
Hund, Saugferkel, Fohlen und Kalb ein Enteritiserreger (COLLINS et al. 1989;
NETHERWOOD et al. 1996; EAST et al. 1998; KLAASEN et al. 1999; MANTECA et al.
2001; WEESE et al. 2001 b). Diese Enteritiden manifestieren sich vor allem im Dünndarm,
zum Teil mit hämorrhagischen und nekrotisierenden Veränderungen (SASAKI et al. 1999;
KLAASEN et al. 1999; MANTECA et al. 2001). Auf welches Cl. perfringens-Toxin diese
Veränderungen zurückzuführen sind, bleibt in vielen Untersuchungen offen. Mit der Enteritis
necroticans der Saugferkel sind sowohl Typ C als auch β2-toxinogene Cl. perfringens Typ A-
Stämme assoziiert (KLAASEN et al. 1999; GARMORY et al. 2000). Beim Hund besteht eine
signifikante Korrelation zwischen dem Nachweis des Enterotoxins (CPE) bzw.
enterotoxinogener Cl. perfringens Typ A-Stämme und einer Diarrhoe (KRUTH et al. 1989;
WEESE et al. 2001 b; MARKS et al. 2002). Ferner kann durch die Applikation des
Enterotoxins beim Hund experimentell eine Diarrhoe ausgelöst werden (BARTLETT et al.
1972). Im Gegensatz zur Typhlocolitis des Pferdes treten diese Enteritiden in der Regel nicht
im Zusammenhang mit einer Hospitalisierung und nicht als Komplikation nach tierärztlichen
Behandlungsmaßnahmen auf. So konnten MARKS et al. (2002) keinen signifikanten
Unterschied in Bezug auf die Prävalenz enterotoxinogener Cl. perfringens-Stämme zwischen
hospitalisierten und nicht-hospitalisierten Hunden feststellen. Ferner war die Applikation von

Schrifttum 55
Antibiotika bei den nicht-hospitalisierten Hunden negativ korreliert mit dem Nachweis von
enterotoxinogenen Cl. perfringens-Stämmen. Als eine besondere Form ist die von KRUTH et
al. (1989) beschriebene nosokomiale Diarrhoe bei Hunden einzuordnen, die nur auf
enterotoxinogene Cl. perfringens-Stämme zurückgeführt werden konnte. Die große
Heterogenität der Cl. perfringens-Isolate spricht aber auch in dieser Studie gegen einen
nosokomialen enterotoxinogenen Cl. perfringens-Stamm. Ein Zusammenhang mit
tierärztlichen Behandlungsmaßnahmen konnten auch KRUTH et al. (1989) nicht erkennen.
2.4 Antibiotikaresistenzen von Cl. difficile und Cl. perfringens
2.4.1 Resistenzprüfung
Im Allgemeinen werden Anaerobier in der Routinediagnostik aufgrund des höheren Zeit- und
Arbeitsaufwandes keiner Resistenzprüfung unterzogen. Epidemiologische Untersuchungen
über die Entwicklung von Resistenzspektren bei Anaerobiern liefern aber wichtige
Informationen für Richtlinien über den Einsatz von Antibiotika (WEXLER 1991). Für die
Resistenzprüfung von Anaerobiern kommen folgende Methoden in Frage (WEXLER 1991):
• Agardilution
• Makrobouillondilution
• Mikrobouillondilution
• Bouillonplättchendilution
• Spiralgradientenendpunkt-Systeme
• Etest®
Nur die ersten drei Testverfahren werden in den NCCLS als anerkannte Methoden zur
Resistenzprüfung von Anaerobiern aufgeführt. Umfassende Evaluierungen des Etests®, die
auch Cl. difficile- und Cl. perfringens-Stämme mit einschließen, sprechen aber für eine sehr
gute Reproduzierbarkeit und eine sehr gute Korrelation mit den Ergebnissen der Agardilution
(CITRON et al. 1991; WÜST u. HARDEGGER 1992; BARBUT et al. 1999; POILANE et al.
2000).

Schrifttum 56
2.4.2 Resistenzspektren von Cl. difficile und Cl. perfringens
Zur Therapie der Antibiotika-assoziierten Diarrhoe und der Pseudomembranösen Colitis
werden in der Humanmedizin vor allem die Antibiotika Vancomycin und Metronidazol
eingesetzt (BARBUT et al. 1999). MCGORUM et al. (1998) berichten über den erfolgreichen
Einsatz von Metronidazol zur Therapie der Typhlocolitis des Pferdes. Alle acht Pferde mit
Typhlocolitis, denen die Autoren Metronidazol verabreichten, überlebten. Hingegen starben
fünf von acht Typhlocolitispatienten, denen kein Metronidazol appliziert wurde. Eine
Untersuchung auf Clostridien wurde jedoch nicht durchgeführt.
Cl. difficile und Cl. perfringens sind im allgemeinen sensibel gegenüber Metronidazol
(Tabelle 5 sowie WISE u. BALLARD 1989). Nur etwa 3 % der Cl. difficile-Isolate in der
Humanmedizin besitzen eine Resistenz gegenüber Metronidazol (BARBUT et al. 1999).
Hingegen zeigen die Untersuchungsergebnisse von JANG et al. (1997) Metronidazolresistenz
bei 19 % der Cl. difficile-Isolate (n = 105) von Pferden mit Diarrhoe auf. Nach den
Ergebnissen von JOBST (2001) ist allerdings fragwürdig, ob dieser erhöhte Anteil
Metronidazol-resistenter Stämme für equine Cl. difficile-Isolate allgemeingültig ist (Tabelle
5).
Das Antibiotikum Gentamicin wird bei der Resistenzprüfung von Cl. difficile und
Cl. perfringens meistens nicht berücksichtigt. Nach Ergebnissen von JOBST (2001) muss
davon ausgegangen werden, dass ein sehr großer Anteil der equinen Cl. difficile- und
Cl. perfringens-Isolate Gentamicin-resistent ist (Tabelle 5).
Eine humanmedizinische Untersuchung von BARBUT et al. (1999) verdeutlicht, dass
Erythromycinresistenz in den verschiedenen Serogruppen von Cl. difficile sehr
unterschiedlich weit verbreitet ist. Besonders hoch ist der Anteil Erythromycin-resistenter
Isolate mit 91 % in der Serogruppe C, die sich durch Resistenzen gegenüber zahlreichen
Antibiotika auszeichnet. Sowohl bei der atoxinogenen Serogruppe D als auch bei der
toxinogenen Serogruppe H beträgt der Anteil Erythromycin-resistenter Cl. difficile-Isolate in
dieser Studie über 50 % (86,7 % bzw. 66,7 %). Das Erythromycin-Resistenzmuster von
Cl. difficile-Isolaten aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover weist
aber eine deutliche Diskrepanz zwischen toxinogenen (0 % Erythromycin-resistent) und
atoxinogenen Isolaten (98 % Erythromycin-resistent) auf (Tabelle 5 sowie JOBST 2001).

Schrifttum 57
Tabelle 5: Verbreitung
Cl. perfringens
von Antibiotikaresistenzen bei Cl. difficile und
Spezies Anzahl
toxinogene
Cl. difficile
atoxinogene
Cl. difficile
Cl. difficile
(1991)
Cl. difficile
(1997)
Erythromycinresistent
(%)
Gentamicinresistent
(%)
Metronidazol
-resistent (%)
29 0 100 0
48 98 100 0
100 76 n.u. 4
100 52 n. u. 2
Cl. difficile 105 n. u. n. u. 19
Cl. perfringens 8 0 100 0
Quelle
JOBST
(2001)*
JOBST
(2001)*
BARBUT et
al. (1999)**
BARBUT et
al. (1999)**
JANG et al.
(1997)***
JOBST
(2001)*
* Untersuchungsmaterial aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule
Hannover, MHK-Bestimmung mit dem Etest ® : Cl. difficile-Isolate aus Kotproben von
Pferden und Umgebungsproben, Cl. perfringens-Isolate von Pferden mit Typhlocolitis
** humanmedizinische Isolate von Patienten mit Verdacht auf CDAD oder PMC
*** Isolate von Pferden mit Diarrhoe
2.4.3 Antibiotikaresistenzmechanismus von Cl. difficile und Cl. perfringens gegenüber
Makroliden
Von den für die Typhlocolitis des Pferdes prädisponierenden Antibiotika (2.2.17) gehören
Clindamycin, Vancomycin und Erythromycin zu der Makrolid-Lincosamid-Streptogramin-
B(MLS)-Gruppe. Der am weitesten verbreitete bakterielle Resistenzmechanismus gegenüber
MLS wird durch die Expression einer rRNA-Methyltransferase, die von dem Gen erm kodiert
wird, hervorgerufen. Die rRNA-Methyltransferase modifiziert die 23S rRNA des Ribosoms,
den Angriffspunkt der MLS-Antibiotika (LECLERQ u. COURVALIN 1991).

Schrifttum 58
Hybridisierungsexperimente von MLS-resistenten humanen Cl. difficile-Stämmen zeigen,
dass diese das erm(B)-Gen tragen (HÄCHLER et al. 1987; FARROW et al. 2000). Das Gen
erm von dem Cl. difficile-Stamm 630 ist auf dem Transposon Tn5398 lokalisiert. Das
Transposon Tn5398 kann durch Konjugation von einer Bakterienspezies bzw. einem
Bakterienstamm auf den anderen übertragen werden, z. B. von Cl. difficile auf Bacillus
subtilis und von Bacillus subtilis wieder zurück auf Cl. difficile (MULLANY et al. 1995;
FARROW et al. 2000; FARROW et al. 2001). Die Lokalisation von
Antibiotikaresistenzgenen auf mobilen genetischen Elementen, wie die von erm auf Tn5398,
führt unter entsprechendem Selektionsdruck zu einer schnellen Verbreitung des Resistenzgens
unter verschiedenen Bakterienspezies.
In Übereinstimmung mit den Ergebnissen über die MLS-Antibiotikaresistenz bei Cl. difficile
kann auch bei Erythromycin-resistenten Cl. perfringens-Isolaten das Gen erm nachgewiesen
werden. Auch bei diesem Bakterium ist das erm-Gen auf einem Transposon lokalisiert
(ROOD u. COLE 1991; BERRYMAN u. ROOD 1995).

Material und Methoden 59
3 Material und Methoden
3.1 Herkunft, Gewinnung und Aufbewahrung des Untersuchungsmaterials
In der vorliegenden Arbeit wurden von vier Versuchspferden im Verlauf von
unterschiedlichen Behandlungsmaßnahmen wiederholt Kotproben qualitativ und quantitativ
auf Cl. perfringens und Cl. difficile untersucht. Die während der Laparotomie gewonnenen
Caecumpunktate und die nach der Sektion erhaltenen Chymusproben aus Ileum, Caecum und
Colon ascendens dieser vier Versuchspferde durchliefen das gleiche diagnostische Verfahren
wie die Kotproben. Zusätzlich wurde mindestens eine Probe pro Woche und Pferd durch zwei
verschiedene Anreicherungsverfahren auf Salmonellen untersucht.
Um die enteropathogene Bedeutung β2-toxinogener Cl. perfringens-Stämme beim Pferd
weiter zu untersuchen, erfolgte eine Genotypisierung mit einer Multiplex-PCR (3.11.3) von
zusätzlichen 38 equinen Cl. perfringens-Isolaten aus 25 Darminhalts- bzw. zehn Kotproben,
die im Rahmen der Routinediagnostik des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen
bearbeitet wurden. Diese Proben werden in Tabelle 29 genauer beschrieben.
Herkunft
Während des gesamten Untersuchungszeitraumes waren die vier Versuchspferde in der Klinik
für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover aufgestallt. Die Sektion der Pferde fand in
dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt.
Probenentnahme
Die Kotproben wurden alle mit einem Plastikuntersuchungshandschuh rektal entnommen und
transportiert.
Während der Operation erfolgte nach der Vorverlagerung des Caecum die Punktion mit einer
dicklumigen Kanüle und einer 100 ml-Spritze (Abbildung 4). Der Caecuminhalt wurde vor
der Massage des Dünndarminhaltes in das Caecum entnommen.
Im Institut für Pathologie wurden während der Sektion, die innerhalb von zwei Stunden nach
der Euthanasie erfolgte, durch die Ligatur der entsprechenden Darmabschnitte die
verschiedenen Chymusproben gewonnen. Im Labor wurde der Darmabschnitt mit dem

Material und Methoden 60
Skalpell eröffnet und Untersuchungsmaterial aus dem Darmlumen mit einer Pipette
entnommen.
Bearbeitung und Aufbewahrung der Proben
Die Bearbeitung aller Proben für die folgenden kulturellen Untersuchungen und die
Gaschromatographie fand innerhalb von zwei bis sechs Stunden nach der Entnahme statt.
Noch vor dieser Bearbeitung erfolgte das Einfrieren von verschiedenen Aliquoten der Probe
bei –70 °C für spätere Untersuchungen.
3.2 Klinische Allgemeinuntersuchung
Vor jeder Probenentnahme erfolgte eine klinische Allgemeinuntersuchung des
Versuchspferdes, die folgende Parameter erfasste: die Haltung, das Verhalten, den Habitus,
den Ernährungszustand, den Pflegezustand, die Atmung, die Körperinnentemperatur, den
Puls, die Konjunktiven, die kapilläre Füllungszeit und die Mandibularlymphknoten. Ferner
wurden die Darmmotorik, der Hautturgor und die Kotbeschaffenheit klinisch beurteilt.
Bei einem gestörten Allgemeinbefinden wurden die Versuchspferde unabhängig von der
Probenentnahme alle sechs Stunden untersucht.
3.3 Hämatologische Untersuchung der Blutproben der Versuchspferde
Im Rahmen der Kotprobenentnahmen fand auch die Entnahme von Blutproben statt, die auf
folgende Parameter untersucht wurden (Blutstatus): Hämatokrit (Htk.), Gesamteiweiß (GE),
Erythrozyten, Hämoglobin und Leukozyten. Für die Leukozyten erfolgte eine Differenzierung
in Eosinophile, Basophile, Stabkernige, Segmentkernige, Lymphozyten und Monozyten. Für
ausgewählte Proben wurde die Untersuchung erweitert auf die Elektrolyte (Na + , Ca 2+ , K + ,
Cl - ), Harnstoff, Kreatinin, Glukose, Laktose und die Enzyme (Kreatin-Kinase, Aspartat-
Amino-Transferase, Laktat-Dehydrogenase und γ-Glutamyl-Transferase). Die hämato-
logischen Untersuchungen wurden von der Klinik für Pferde durchgeführt.

Material und Methoden 61
3.4 Parasitologische Untersuchung der Versuchspferde
Das Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover untersuchte
dankenswerterweise
Strongylidenlarven.
einzelne Kotproben der Versuchspferde auf Wurmeier und
3.5 Kennzeichen der Versuchspferde
Die Vorgeschichte und die Herkunft der vier Versuchspferde sind nicht bekannt. Die Tabelle
6 gibt einige Merkmale der vier Pferde wieder.
Tabelle 6: Kennzeichen der vier Versuchspferde
Name des
Versuchspferdes
„Ede“ „Agu“ „Resinale“ „Speranza“
Geschlecht Stute Wallach Stute Stute
Rasse
Oldenburger
Warmblut
Warmblut Warmblut Warmblut
Farbe Fuchs Rotschimmel Braun Rappe
Zahnalter 9 Jahre 10 Jahre 4,5 Jahre 9 Jahre
Gewicht zum
Zeitpunkt der
Einstallung in die
Klinik für Pferde
625 kg 465 kg 590 kg 540 kg
3.6 Experimentelle Behandlungsmaßnahmen der Versuchspferde
Die Art und der zeitliche Ablauf der Behandlungsmaßnahmen sowie die verschiedenen
Zeitpunkte der Probenentnahmen werden für die vier Versuchspferde in Tabelle 7 bis Tabelle
10 wiedergegeben. Für die durchgeführten Tierversuche liegt eine Genehmigung der
Bezirksregierung Hannover vor (Zeichen: 509c-42502-00/353).
Die in Tabelle 7 und Tabelle 8 aufgeführten Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen
der Versuchspferde „Ede“ und „Agu“ wurden parallel und identisch durchgeführt. Nur die

Material und Methoden 62
Operation und Euthanasie dieser beiden Pferde fand nicht an demselben Tag statt. Die
Versuchspferde „Resinale“ und „Speranza“ wurden vier Monate nach Ablauf der Versuche
mit „Ede“ und „Agu“ in der Klinik für Pferde aufgestallt. Die in Tabelle 9 und Tabelle 10
dargestellten Behandlungen und Probenentnahmen dieser beiden Pferde erfolgten ebenfalls
parallel und weitgehend identisch. Aufgrund des unterschiedlichen klinischen Verlaufs,
insbesondere aufgrund der akuten Niereninsuffizienz des Pferdes „Speranza“ am Ende der
Versuchsreihe, musste der Behandlungsplan jedoch, wie in der Tabelle 10 aufgezeigt, für
dieses Pferd modifiziert werden.

Material und Methoden 63
Tabelle 7: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Ede“
Zeitraum Behandlung
13.10.00 Einstallung in den Stall II der Klinik für Pferde
Zeitpunkt bzw. Art der
Probenentnahmen
bis 28.10.00 keine Behandlung 18.10., 25.10.
29.10. bis 30.10.00 36 h Nahrungskarenz 30.10.
31.10. bis 6.11. 00 keine Behandlung 31.10.
7.11. bis 10.11.00 72 h Nahrungskarenz 8.11., 9.11., 10.11.
bis 25./26.11. 00 keine Behandlung 15.11., 22.11.
27.11.00 Beginn der 24 h präoperativen Nahrungskarenz
28.11.00
28.11. bis 2.12.00
mediane Laparotomie mit Caecumpunktion in
2 h Narkose
Postoperative Behandlung mit Cefquinom,
Flunixin-Meglumin und Heparin
3.12. bis 9.12.00 keine Behandlung (Ausnahme: Heparin) 8.12.
10.12. bis 14.12.00
orale Erythromycin-Applikation von
1,25 mg/kg KG alle 24 h
während der OP
(Caecuminhalt und Kot)
29.11., 30.11., 1.12.
12.12., 14.12.
15.12.00 bis 13.1.01 keine Behandlung 15.12., 18.12., 12.1.
14.1. bis 18.1.01
orale Erythromycin-Applikation von
1,25 mg/kg KG alle 8 h
19.1. bis 24.1.01 keine Behandlung 19.1.
25.1. bis 28.1.01 72 h Nahrungskarenz 25.1., 27.1.
28.1.01
29.1.01
Beginn der oralen Erythromycin-Applikation
von 1,25 mg/kg KG alle 8 h in der
Anfütterungsphase nach der Nahrungskarenz
Flunixin-Meglumin um 8.00 Uhr
Euthanasie um 10.00 Uhr
15.1., 16.1., 17.1., 18.1.
Kot, Inhalt der Caecumspitze,
Inhalt des Colon
ascendens (Flexura
pelvis), Ileuminhalt

Material und Methoden 64
Tabelle 8: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Agu“
Zeitraum Behandlung
13.10.00 Einstallung in den Stall II der Klinik für Pferde
Zeitpunkt bzw. Art der
Probenentnahmen
bis 28.10.00 keine Behandlung 18.10., 25.10.
29.10. bis 30.10.00 36 h Nahrungskarenz 30.10.
31.10. bis 6.11. 00 keine Behandlung 31.10.
7.11. bis 10.11.00 72 h Nahrungskarenz 8.11., 9.11., 10.11.
11.11. bis 25.11. 00 keine Behandlung 15.11., 22.11.
26.11.00
27.11.00
27.11. bis 1.12.00
Beginn der 24 h präoperativen Nahrungskarenz
mediane Laparotomie mit Caecumpunktion in
2 h Narkose
Postoperative Behandlung mit Cefquinom,
Flunixin-Meglumin und Heparin
2.12. bis 9.12.00 keine Behandlung (Ausnahme: Heparin) 8.12.
10.12. bis 14.12.00
orale Erythromycin-Applikation von
1,25 mg/kg KG alle 24 h
während der OP
(Caecuminhalt und Kot)
28.11., 30.11.,1.12.
12.12., 14.12.
15.12.00 bis 13.1.01 keine Behandlung 15.12., 18.12., 12.1.
14.1. bis 18.1.01
orale Erythromycin-Applikation von
1,25 mg/kg KG alle 8 h
19.1. bis 24.1.01 keine Behandlung 19.1.
25.1. bis 28.1.01 72 h Nahrungskarenz 25.1., 27.1.
28.1.01
29.1.01
Beginn der oralen Erythromycin-Applikation
von 1,25 mg/kg KG alle 8 h in der
Anfütterungsphase nach der Nahrungskarenz
Flunixin-Meglumin: 4 mg/kg KG i. v.
ab 20.00 Uhr alle 6 h
30.1.01 Euthanasie um 8.00 Uhr
15.1., 16.1., 17.1., 18.1.
9.00 Uhr und 23.00 Uhr
Inhalt der Caecumspitze,
Inhalt des Colon
ascendens (Flexura
pelvis), Ileum- und
Rektuminhalt

Material und Methoden 65
Tabelle 9: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Resinale“
Zeitraum Behandlung
25.5.01 Einstallung in den Stall II der Klinik für Pferde
bis 5.6.01 keine Behandlung 30.5., 5.6.
6.6.01 Entwurmung mit Moxidectin
7.6. bis 9.6.01 keine Behandlung 8.6.
10.6. bis 13.6.01 72 h Nahrungskarenz 11.6., 12.6.
13.6. bis 15.6.01
Behandlung der Schlundverstopfungen am 13. 6.
mit der Sonde und Butylscopamin, restringierte
Fütterung von Mash und aufgeweichten
Graspellets
16.6. bis 24.6.01 keine Behandlung 20.6.
Zeitpunkt bzw. Art der
Probenentnahmen
14.6., 15.6.
25.6. bis 29.6.01 Gentamicin 25.6., 27.6., 28.6., 29.6.
30.6. bis 7.7.01 keine Behandlung 30.6., 2.7., 6.7.
8.7. bis 11.7.01 72 h Nahrungskarenz 9.7., 10.7.
11.7. bis 15.7.01
Gentamicin und restringierte Fütterung von Mash
und aufgeweichten Graspellets
12.7., 13.7., 14.7.
16.7. bis 22.7.01 keine Behandlung 16.7., 20.7.
23.7. bis 25.7.01
Futterumstellung:
Mash und aufgeweichte Graspellets
24.7., 25.7.
26.7. bis 4.8.01 keine Behandlung 26.7., 1.8.
5.8.01 Beginn der 24 h präoperativen Nahrungskarenz
6.8.01
6.8. bis 10.8.01
mediane Laparotomie mit Caecumpunktion und
Resektion von 3 cm x 1 cm Caecumwand in 2 h
Narkose
postoperative Behandlung mit Gentamicin,
Flunixin-Meglumin und Heparin
11.8. bis 18.8.01 keine Behandlung 15.8.
19.8. bis 23.8.01
orale Erythromycin-Applikation von
1,25 mg/kg KG alle 8 h
während der OP
(Caecuminhalt und Kot)
7.8., 8.8., 9.8., 10.8.
24.8. bis 30.8.01 keine Behandlung 24.8., 30.8.
30.8. (abends) bis
2.9.01
72 h Nahrungskarenz 31.8.
20.8., 21.8., 22.8., 23.8.

Material und Methoden 66
Zeitraum Behandlung
2.9. bis 6.9.01
orale Erythromycin-Applikation von
1,25 mg/kg KG alle 8 h
7.9. bis 11.9.01 orale Sulfonamid-Trimethoprim-Applikation 10.9.
12.9.01 Euthanasie um 9.00 Uhr
Zeitpunkt bzw. Art der
Probenentnahmen
2.9., 3.9., 4.9., 5.9., 6.9.
Inhalt der
Caecumspitze, Inhalt
des Colon ascendens
(Flexura pelvis), Ileumund
Rektuminhalt
Tabelle 10: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Speranza“
Zeitraum Behandlung
25.5.01 Einstallung in den Stall II der Klinik für Pferde
bis 5.6.01 keine Behandlung 30.5., 5.6.
6.6.01 Entwurmung mit Moxidectin
7.6. bis 9.6.01 keine Behandlung 8.6.
10.6. bis 13.6.01 72 h Nahrungskarenz 11.6., 12.6.
13.6. bis 14.6.01
restringierte Fütterung von Mash und
aufgeweichten Graspellets
15.6. bis 24.6.01 keine Behandlung 20.6.
Zeitpunkt und Art der
Probenentnahme
14.6., 15.6.
25.6. bis 29.6.01 Gentamicin 25.6., 27.6., 28.6., 29.6.
30.6. bis 7.7.01 keine Behandlung 30.6., 2.7., 6.7.
8.7. bis 11.7.01 72 h Nahrungskarenz 9.7., 10.7.
11.7. bis 15.7.01
Gentamicin und restringierte Fütterung von Mash
und aufgeweichten Graspellets
12.7., 13.7., 14.7.
16.7. bis 22.7.01 keine Behandlung 16.7., 20.7.
23.7. bis 25.7.01
Futterumstellung:
Mash und aufgeweichte Graspellets
24.7., 25.7.
26.7. bis 5.8.01 keine Behandlung 26.7., 1.8.
6.8.01 Beginn der 24 h präoperativen Nahrungskarenz
7.8.01
mediane Laparotomie mit Caecumpunktion und
Resektion von 3 cm x 1 cm Caecumwand in 2 h
Narkose
während der OP
(Caecuminhalt und Kot)

Material und Methoden 67
Zeitraum Behandlung
7.8. bis 11.8.01
postoperative Behandlung mit Gentamicin,
Flunixin-Meglumin und Heparin
11.8. bis 15.8.01 Cefquinom und Flunixin-Meglumin 15.8.
16.8.01 bis
18.8.01
19.8. bis 22.8.01
keine Behandlung
orale Erythromycin-Applikation von
1,25 mg/kg KG alle 8 h
23.8.01 Euthanasie um 7.00 Uhr
Zeitpunkt und Art der
Probenentnahme
7.8., 8.8., 9.8., 10.8.
20.8., 21.8., 22.8.
Inhalt der
Caecumspitze, Inhalt
des Colon ascendens
(Flexura pelvis), Ileumund
Rektuminhalt
Die eingesetzten Wirkstoffe bzw. Medikamente werden zusammen mit den eingesetzten
Dosierungen in Tabelle 11 aufgelistet. Die während der Laparotomie eingesetzten
Medikamente werden im nächsten Kapitel aufgeführt.

Material und Methoden 68
Tabelle 11: Eingesetzte Medikamente
Wirkstoff Medikament Dosierung
Moxidectin
Erythromycin
(Formulierung:
Erythromycinethylsuccinat)
Gentamicin
Cefquinomsulfat
Sulfadimidin, Sulfathiazol,
Trimethoprim
Heparin-Calcium
Heparin
Flunixin-Meglumin
Equest ®
(Fort Dodge)
Erythromycin forteratiopharm
® TS
(Ratiopharm)
Gent® 100
cp-pharma ® Burgdorf
Cobactan ® 2,5%
(Intervet)
Vetoprim ®
(Essex)
Heparin-Calcium-
20.000-ratiopharm ®
(Ratiopharm)
180000 Gel Heparinratiopharm
®
(Ratiopharm)
MeflosylC ®
(Fort Dodge)
Butylscopamin Buscopan ®
3.7 Durchführung der Laparotomie
400 µg/kg KG einmalig
1,25 mg/kg KG per os
alle 8 h für 5 Tage oder
alle 24 h für 5 Tage (s. o.)
4 mg/kg KG i. v.
alle 12 h für 5 Tage
1 mg/kg KG i. m.
alle 24 h für 5 Tage
15 mg/kg KG per os
alle 12 h für 5 Tage
perioperativ 80.000 IE s. c.
1.–2. Tag p. op.: 2 x 60.000 IE s. c.
3.–5. Tag p. op.: 2 x 40.000 IE s. c.
6.–9. Tag p. op.: 2 x 20.000 IE s. c.
1,1 mg Flunixin/kg KG i. v. alle 12 h
perioperativ und 1.–2. Tag p. op.
0,2 mg/kg KG i. v.
Die bei allen vier Versuchspferden durchgeführte mediane Laparotomie erfolgte innerhalb
einer zweistündigen Narkose. Als Sedation wurde Xylazin (1,1 mg/kg KG, Rompun ® , Bayer
Vital) und zur Induktion der Narkose Ketamin (2,2 mg/kg KG, Narketan ® , Chassot) und
Diazepam (0,05 mg/kg KG, Diazepam, Ratiopharm) intravenös appliziert. Nach endotrachealen
Intubation erfolgte die Narkose über eine Isofluraninhalation mit einer
Überwachung der Herz- und Lungenfunktion (Evaporation von insg. ca. 180 ml Isofluran).
Während der Operation bekam jedes Tier ca. 12 l Ringerlösung infundiert. Zur Aufrecht-

Material und Methoden 69
erhaltung eines arteriellen Blutdruckes von ≥ 60 mm Hg wurde bei Bedarf Dobutamin
(Ratiopharm) in einer Dosis von maximal 5 µg/kg KG und min appliziert. Nach der
Exploration der Bauchhöhle wurde das Caecum vorgelagert, punktiert und ca. 20 ml Inhalt für
die bakteriologische Untersuchung aspiriert (Abbildung 4). Bei den Pferden „Resinale“ und
„Speranza“ wurden 3 cm x 1 cm Caecumwand reseziert, die Wunde wurde mit einer
doppelten Naht (Schmieden- und Lembertnaht mit Biosyn ® 3 metric) verschlossen. Das
resezierte Stück Caecumwand wurde geteilt und ein Teil in Formaldehyd- und der andere in
einer Glutaraldehyd-Lösung für die geplante histologische Untersuchung fixiert. Es folgte bei
allen vier Pferden die Vorverlagerung des Dünndarmes und anschließend die Massage des
Dünndarminhaltes von oral nach aboral in das Caecumlumen. Der vorgelagerte Dünndarm
und das Caecum wurden reponiert. Zum Abschluss der explorativen Laparotomie erfolgte die
Vorlagerung und Reposition der Flexura pelvis und der linken Längslagen des Colon
ascendens. Nach der Peritoneallavage mit 10 l 0,9 % NaCl mit 20.000 I. E. Heparin wurde die
Bauchhöhle über eine dreischichtige Naht verschlossen (fortlaufende Peritonealnaht mit
Biosyn ® 3 metric, Sultansche Diagonalhefte der Linea alba mit Vicryl Nr. 8, Hautnaht mit
Donatiheften mit Supramid Nr. 4).
3.8 Fütterung und Durchführung der Nahrungskarenz
Die Fütterung der vier Versuchspferde wurde wie das Ausmisten der Ställe im Rahmen des
Routineablaufes in der Klinik für Pferde vorwiegend von den Tierpflegern durchgeführt. Die
Ration setzte sich überwiegend aus Heu und Stroh mit kleineren Mengen Kraftfutter
zusammen. Nur in den Anfütterungsphasen nach den Nahrungskarenzen und im
Kontrollexperiment (Futterumstellung) vom 23.7. bis zum 25.7.01 erhielten die Pferde eine
Ration aus aufgeweichtem Mash (Irish Mash, St. Hippolyt Nutrition Concepts, Schlitz,
Deutschland; Rohprotein 9,9 %, Rohfaser 10 %, Rohfett 4,8 %) und aufgeweichten
Graspellets (Rohprotein 9,5 %, Rohfaser 25 %) und kleineren Portionen von feuchtem Heu,
die auf vier Portionen am Tag verteilt wurde. Während der Nahrungskarenz, der
Anfütterungsphase und des Kontrollexperiments wurde durch Aufsetzen eines Maulkorbes die
Futteraufnahme kontrolliert. Wasser wurde zu jedem Zeitpunkt ad libitum bereitgestellt.

Material und Methoden 70
3.9 Gaschromatographie
3.9.1 Aufarbeitung der Proben für die gaschromatographische Analytik der
Fettsäuren (Wasserextraktion)
Für den direkten gaschromatographischen Nachweis von flüchtigen Fettsäuren wurden 2 g des
Probenmaterials in 8 ml destilliertes Wasser überführt, homogenisiert und bei 2.800 g für
10 min zentrifugiert. Anschließend erfolgten die Zugabe von 50 µl internem Standard (10 ml
Ameisensäure mit 100 µl 4-Methylvaleriansäure) zu 500 µl des Überstandes und das
Einfrieren bei –70 °C. Nach vier Proben wurde ein 500 µl Aliquot einer Standardlösung mit
allen 6 Fettsäuren in der gleichen Form bearbeitet wie die 500 µl des Überstandes des
Probenmaterials.
3.9.2 Gaschromatographie der Wasserextrakte des Probenmaterials
Essig-, Propion-, Iso- und n-Butter-, Iso- und n-Valeriansäure sowie der interne Standard
4-Methylvaleriansäure wurden in einer mit –10 % SP-1000/1% H3PO4 100/120 Chromosorb
WAW gefüllten Säule gaschromatographisch aufgetrennt und mit einem
Flammenionisationsdetektor registriert (Säulentemperatur: 155 °C, Injektortemperatur:
175 °C und Detektortemperatur: 180 °C). Die Berechnung der Konzentration der Fettsäuren
im Probenmaterial erfolgte unter Berücksichtigung des internen Standards und in Relation
zum zuvor injizierten Standardfettsäuregemisch automatisch. Die Durchführung der Messung
wurde dankenswerterweise von Herrn Rust, Institut für Tierernährung der Tierärztlichen
Hochschule Hannover, durchgeführt.
3.10 Kulturelle bakteriologische Diagnostik
3.10.1 Quantitativer Anaerobiernachweis
Die Herstellung einer 10fachen Verdünnungsreihe von 10 -1 bis 10 -6 in PRAS-Medium und das
Ausplattieren erfolgten wie von SUMMANEN et al. (1993) für Cl. difficile beschrieben.
Diese Methodik wurde sowohl für die Cl. difficile- als auch für die Cl. perfringens-Diagnostik
eingesetzt. Je Verdünnungsstufe wurden 100 µl auf vorreduzierten Schaedler-, Clostridien-
Selektiv- und „Clostridium difficile“-Nährböden ausplattiert. Die Vorreduktion erfolgte über

Material und Methoden 71
Nacht im Anaerobiertopf bei Raumtemperatur. Die Zusammensetzung des PRAS-Mediums
und der Nährböden wird im Anhang (9.1) aufgeführt.
3.10.2 Qualitativer Anaerobiernachweis
NETHERWOOD et al. (1996) zeigen für den Nachweis von Cl. perfringens aus dem Kot von
Fohlen, dass eine diagnostische Sensitivität über 80 % erst durch die gleichzeitige
Durchführung von verschiedenen Kultivierungsverfahren zu erzielen ist. Diese Kombination
soll sowohl in Bezug auf die Vorbehandlung als auch auf die Voranreicherung die
verschiedenen Möglichkeiten einschließen. Im Hinblick auf eine hohe diagnostische
Sensitivität wurden aus diesem Grund alle Kotproben neben dem quantitativen
Nachweisverfahren noch folgenden Kultivierungsverfahren unterzogen:
• Fraktionierter Ausstrich einer Öse aus der 10 -1 -Verdünnungslösung (1 g Kot in 9 ml
PRAS-Medium) auf Schaedler-, Clostridien-Selektiv- und „Cl. difficile“-Nährböden (ohne
Vorbehandlung und ohne Voranreicherung)
• Überführung von je 1 ml aus der 10 -1 -Verdünnungslösung in eine Leberbouillon und eine
Clostridium difficile-Bouillon (ohne Vorbehandlung und mit Voranreicherung)
• 9 ml PBS wurde 1 g Kot zugesetzt und bei 10 min für 70 °C im Wasserbad erhitzt und
anschließend fraktioniertert auf Schaedler-, Clostridien-Selektiv- und „Cl. difficile“-
Nährböden ausgestrichen (mit Hitze-Vorbehandlung und ohne Voranreicherung).
• Überführung von je 1 ml aus der erhitzten Kotsuspension in eine Leberbouillon und eine
„Cl. difficile“-Bouillon (mit Hitze-Vorbehandlung und mit Voranreicherung)
• 1 g Kot wurde mit 1 ml 96 % Ethanol versetzt und für 1 h bei Raumtemperatur mit
wiederholtem Homogenisieren inkubiert. Es folgte der fraktionierte Ausstrich einer Öse
des Ethanol-Kot-Gemisches auf Schaedler-, Clostridien-Selektiv- und „Cl. difficile“-
Nährböden (mit Alkohol-Vorbehandlung und ohne Voranreicherung).
• Die Hälfte des Ethanol-Kot-Gemisches wurde in eine Leberbouillon und eine
„Clostridium difficile“-Bouillon überführt (mit Alkohol-Vorbehandlung und mit
Voranreicherung).
Alle festen Nährböden und Bouillonkulturen der Anaerobierdiagnostik wurden bei 37 °C für
48 h anaerob inkubiert (im Anaerobiertopf). Nach 48 h erfolgte der fraktionierte Ausstrich der

Material und Methoden 72
verschiedenen Leberbouillonkulturen auf Schaedler-, Clostridien-Selektiv- und „Cl. difficile“-
Nährböden und der „Cl. difficile“-Bouillonkulturen auf Schaedler- und „Cl. difficile“-
Nährböden.
3.10.3 Untersuchung auf Salmonellen
Zur Anwendung kam ein Verfahren mit Selektivanreicherung. 1 g Probenmaterial wurde in
10 ml Tetrathionat-Brillantgrün-Galle(TBG)-Bouillon bzw. in 10 ml Rappaport-Vassiliadis-
Medium überführt und homogenisiert. Aus beiden Anreicherungskulturen erfolgten nach 48 h
Inkubation bei 42 °C Überimpfungen auf einen Brillantgrün-Phenolrot-Laktose-
Saccharose(BPLS)- und einen Rambach-Salmonellen-Selektivnährboden (RAMBACH 1990).
Der BPLS-Nährboden wurde 24 h bei 42°C und der Rambach-Salmonellen-
Selektivnährboden bei 24 h bei 37 °C bebrütet. Nach der Subkultur Salmonellen-verdächtiger
Kolonien auf einem bluthaltigen Columbia-Nährboden folgte eine serologische und
biochemische Untersuchung.
3.10.4 Diagnostisches Vorgehen zur Identifizierung von Cl. difficile und Cl. perfringens
3.10.4.1 Auswertung der quantitativen Anaerobierdiagnostik
Bei der Auswertung der Verdünnungsreihen wurde alle Nährböden auf Kolonien mit einer für
Cl. difficile und Cl. perfringens verdächtigen Morphologie, dem typischen Geruch dieser
beiden Clostridienarten und im Fall von Cl. perfringens auf das Vorhandensein von
Hämolysehöfen hin untersucht. Anschließend erfolgte die Auswertung aller Platten mit
verdächtigen und auszählbaren Kolonien. Von jedem verdächtigen Kolonietyp wurde eine
Subkultur angefertigt. Falls die Verdachtsdiagnose „Cl. perfringens“ ausschließlich für eine
niedrige Verdünnungsstufe auf dem Schaedler-Nährboden mit einem dichten Bakterienrasen
vorlag, wurden die typischen großen, doppelzonigen Hämolysehöfe ausgezählt,
Koloniematerial aus dem Hämolysezentrum subkultiviert und anschließend mit dem
Phosphatasereagenz überprüft, ob die zentralen Kolonien der ausgezählten Hämolysehöfe
Phosphatase-positiv waren. Alle Subkulturen wurden mit der Bakterienöse auf Schaedler-
Nährboden fraktioniert und 48 h bei 37 °C anaerob inkubiert. Die Subkultivierung wurde so
oft wiederholt, bis eine Reinkultur vorlag.

Material und Methoden 73
3.10.4.2 Auswertung der qualitativen Anaerobierdiagnostik
Die Suche nach Cl. difficile und Cl. perfringens sowie die Subkultiverung verdächtiger
Kolonien erfolgte im qualitativen Teil der Anaerobierdiagnostik wie bei der Bearbeitung der
Verdünnungsreihen.
3.10.4.3 Differenzierung Cl. perfringens-verdächtiger Subkulturen
Von Cl. perfringens-verdächtigen Subkulturen wurde ein Grampräparat angefertigt und der
Schnelltest mit dem Phosphatasereagenz durchgeführt. Von zweifelhaften Isolaten erfolgte
eine biochemische Untersuchung mit dem „RapID-ANA II System“ (Innogenetics GmbH,
Heiden, Deutschland). Falls die genannten Untersuchungen die Verdachtsdiagnose
„Cl. perfringens“ bestätigten, wurden Lyophilisate von den Isolaten angefertigt. Die zu einem
späteren Zeitpunkt durchgeführte Genotypisierung dieser Isolate mit einer Multiplex-PCR
(3.11.3) umfasste auch das α-Toxingen cpa, dessen Nachweis ausschlaggebend für die
Diagnose „Cl. perfringens“ war.
3.10.4.4 Differenzierung Cl. difficile-verdächtiger Subkulturen
Bestätigte sich die Verdachtsdiagnose „Cl. difficile“ in der Subkultur durch den typischen
Geruch, das Wachstum auf „Cl. difficile“-Selektivnährboden und den Nachweis grampositiver
subterminal sporulierender Stäbchen, erfolgte für alle Isolate die biochemische Untersuchung
mit dem „RapID-ANA II System“ und die gaschromatographische Analytik der Fettsäuren
des Etherextraktes einer Bakterienkultur. Bei der Bewertung der Ergebnisse des „RapID-ANA
II Systems“ wurde berücksichtigt, dass die Unterscheidung von Cl. subterminale und
Cl. difficile mit diesem Testsystem unzuverlässig ist (MARLER et al. 1991). Bei dieser
Beurteilung wurde vor allem der für Cl. difficile charakteristischen L-Prolin-Aminopeptidase-
Reaktion Bedeutung beigemessen (FEDORKO u. WILLIAMS 1997; GARCIA et al. 1997).
Entscheidend für die Diagnose „Cl. difficile“ war das Ergebnis des „RapID-ANA II Systems“
zusammen mit dem gaschromatographischen Nachweis von Essigsäure, Iso-Buttersäure,
Buttersäure, Iso-Valeriansäure, Valeriansäure und Iso-Capronsäure im Etherextrakt der
Bakterienkultur (HOLDEMANN et al. 1977).

Material und Methoden 74
3.10.4.5 Biochemische Untersuchung von Anaerobiern mit dem „RapID-ANA II
System“
Die Durchführung und Auswertung dieses Testsystems erfolgte nach den Angaben des
Herstellers (Innogenetics GmbH, Heiden, Deutschland).
3.10.4.6 Schnelltest mit dem Phosphatase-Reagenz
Einige Tropfen Phosphatase-Reagenz wurden direkt auf die zu testenden Kolonien appliziert.
Nach 1–3 min zeigte sich im positiven Fall eine dunkelbraunrote Färbung der Kolonien
aufgrund einer Azofarbstoff-Entstehung.
Herstellung des Phosphatase-Reagenz (SCHALLEHN 1990):
0,2 g α-Naphthyl-(1)-Phosphat (Merck 6815) und
0,4 g Diazonium-o-dianisidin (Echtblausalz B, Merck 3191)
in 10 ml 0,2 M Natriumcitratpuffer (pH = 4,5) oder Natriumacetatpuffer (pH = 4,5) lösen
und nach 1 h bei 4 °C filtrieren.
3.10.4.7 Herstellung eines Etherextraktes der flüchtigen Fettsäuren der Bakterien für
die gaschromatographische Analytik
Die von SUMMANEN et al. (1993) beschriebene Extraktion der flüchtigen Fettsäuren einer
Flüssigkultur wurde wie folgt modifiziert durchgeführt: Ausgangsmaterial für die Ether-
extraktion waren 5 ml Pepton-Hefe-Glukose-Bouillon-Kulturen von Cl. difficile-verdächtigen
Isolaten, die nach einer Vorreduzierung der Bouillon 5 Tage bei 37 °C anaerob bebrütet
wurden. Nach der Inkubation erfolgte durch die Zugabe von 2–3 Tropfen 50 % Schwefelsäure
und anschließendem Homogenisieren eine Hydrolyse der Esterbindungen der Triglyceride
und Phospolipide der Zellmembran, so dass die Fettsäuren frei vorlagen. Mit einem
Indikatorstreifen wurde der pH-Wert überprüft (Soll: ≤ 2). Die Extraktion der Fettsäuren mit
3 ml Diethylether erfolgte im Pyrex-Schraubröhrchen durch wiederholtes Schwenken für 1
min und Zentrifugation für 5 min bei 700 g. Die Etherphase wurde mit einer Pasteurpipette

Material und Methoden 75
abgenommen, in ein neues Pyrexröhrchen überführt und durch die Zugabe von ca. 1 g
Calciumchlorid dehydriert.
3.10.4.8 Gaschromatographische Analytik der Fettsäuren im Etherextrakt der
Bakterienkultur
Die extrahierten Fettsäuren wurden im Gaschromatographen „Anaerobic Identification
System, Modell 700A“ (Dodeca, Kalifornien, USA) aufgetrennt. Der Gaschromatograph
arbeitet mit dem Trägergas Helium, einer Betriebstemperatur zwischen 142 °C und 145 °C
und einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor. Der Heliumdurchfluss wurde auf 120 ml/min
eingestellt. Mit der ersten Injektion wurde so lange gewartet, bis der Detektionsschreiber
einen konstanten Wert aufzeichnete. Bei jeder Messung wurde vor und nach den
Bakterienextrakten ein Standardgemisch aus Ameisen-, Essig-, Propion-, Isobutter-, Butter-,
Isovalerian-, Valerian-, Isocapron- und Capronsäure gaschromatographisch aufgetrennt. Das
Injektionsvolumen der Extrakte betrug 15 µl. Auf dem Chromatogramm erfolgte die
Bestimmung der Retentionszeiten der verschiedenen Fettsäuren. Durch den Vergleich der
Retentionszeiten zwischen Probe und Standard konnten die Fettsäuren identifiziert werden.
Als Kontrolle wurde ein Diethyletherextrakt des Referenzstammes Cl. difficile DSM 1296
ebenfalls gaschromatographisch analysiert.
3.10.5 Salmonellendiagnostik
3.10.5.1 Serologische Differenzierung der Salmonellen-verdächtigen Kolonien
Die Salmonellen-verdächtigen Kolonien wurden mit der Objektträgerschnellagglutination
zunächst mit einem omnivalenten Salmonellen-Antiserum (Firma Behringwerke AG,
Marburg, Deutschland) untersucht. Bei positiven Reaktanten schloss sich eine
Serotypisierung mit den polyvalenten Salmonellen-Antiseren I, II und III an (Firma
Behringwerke AG). Für Salmonellen der Subspezies I von Salmonella enterica standen
weitere O- und H-Antiseren zur Differenzierung zur Verfügung (Firma Behringwerke AG).

Material und Methoden 76
3.10.5.2 Biochemische Untersuchung
Zur Überprüfung der Verdachtsdiagnose auf Salmonellen wurde eine „Bunte Reihe“ mit
Testmedien für Enterobacteriaceae nach BOCKEMÜHL (1992) zusammengestellt und
beimpft. Die Testmedien werden in der Nährbodenküche des Instituts für Mikrobiologie und
Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover für die Routinediagnostik regelmäßig
hergestellt.
3.10.6 Untersuchung des Probenmaterials auf die Cl. difficile-Toxine A und B
3.10.6.1 Enzymimmunoassay
Für den Nachweis der Toxine A und B von Cl. difficile wurde der „TOX A/B-II-TEST“
(TechLab, USA) eingesetzt. Der Test wurde nach den Anweisungen des Herstellers
durchgeführt.
3.10.6.2 Zytotoxizitätstest zum Nachweis der Cl. difficile-Toxine A und B
Zur Untersuchung ausgewählter Proben (n = 20) im Zytotoxizitätstest wurde der Dickdarm-
inhalt (Caecumpunktat aus der Operation und Sektionsprobe) mit 0,45 µm Millex®-GS-
Filtern (Millipore, Eschborn, Deutschland) filtriert. Im Fall von Kotproben wurde 1 g Kot
500 µl Wasser zugesetzt. Nach der Homogenisierung wurde das Gemisch bei 12.000 g
zentrifugiert und der Überstand anschließend wie oben beschrieben filtriert. Der
Zytotoxizitätstest erfolgte mit subkonfluenten Mausfibroblasten der Zelllinie Swiss 3T3, die
mit 1:2- und 1:20-Verdünnungen der Filtrate überschichtet wurden. Nach 3 h, 20 h und 44 h
wurden die Zellen beobachtet und mit einem 20er-Objektiv fotografiert. Als positiv für das
Cl. difficile-Zytotoxin wurden nur Proben bewertet, bei denen nach 3 h die typische
morphologische Abrundung bei über 90 % der Zellen festgestellt werden konnte. Der
Zytotoxizitätstest wurde dankenswerterweise von Herrn Dr. F. Hofmann aus der Abteilung
von Professor Dr. I. Just, Zentrum Pharmakologie und Toxikologie der Medizinischen
Hochschule Hannover, durchgeführt.

Material und Methoden 77
3.10.7 Resistenzprüfung
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) für Gentamicin, Metronidazol und
Erythromycin von Cl. perfringens- und Cl. difficile-Isolaten wurden mit dem Etest® (AB
Biodisk, Schweden) ermittelt. Die Durchführung erfolgte nach der Arbeitsanweisung des
Herstellers, unter Berücksichtigung der Ergebnisse von CITRON et al. (1991), WÜST und
HARDEGGER (1992), JANG et al. (1997), POILANE et al. (2000) und eigenen
Voruntersuchungen mit dem Referenzstamm Cl. perfringens ATCC 13124 (DSM 756) und
Cl. difficile DSM 1296. In den eigenen Voruntersuchungen wurden für beide Stämme und die
drei genannten Antibiotika unterschiedliche Inokulummengen (MF-Standard von 0,5 und 1,0)
und Inkubationszeiten (24 h und 48 h) getestet, da der Hersteller dies nicht genau festlegt und
die genannten Autoren widersprüchliche Angaben machen.
3.10.7.1 Durchführung des Etest ®
Wie in den NCCLS-Richtlinien empfohlen, kam für die Resistenzprüfung von Cl. difficile und
Cl. perfringens Wilkins-Chalgren-Nährboden zum Einsatz (WILKINS u. CHALGREN 1976).
Die Nährböden wurden vor dem Gebrauch bei 37 °C für 1 h getrocknet und anschließend für
24 h bei Raumtemperatur im Anaerobiertopf vorreduziert. Für Cl. difficile-Isolate wurde, wie
von POILANE et al. (2000) beschrieben, ein Inokulum mit einem MF-Standard von 1, für
Cl. perfringens-Isolate in Übereinstimmung mit CITRON et al. (1991) ein MF-Standard von
0,5 in 0,85 % NaCl (bioMérieux, Nürtingen, Deutschland) zum Überimpfen der Nährböden
mit einem sterilen Tupfer eingesetzt. Nach 10 min Trocknen der beimpften Nährböden folgte
die Applikation des Etest ® -Streifens mit der Pinzette. Es schloss sich die Inkubation bei 37 °C
unter anaeroben Bedingungen an (im Anaerobiertopf). Das Ablesen des MHK-Wertes nach
24 h erfolgte unter Berücksichtigung der Erläuterungen von AB Biodisk am Schnittpunkt der
Ellipse der Wachstumshemmung mit dem Etest ® -Streifen.
3.10.7.2 Bewertung der Antibiotikaempfindlichkeit
Zur Bewertung der Empfindlichkeit der Cl. difficile- und Cl. perfringens-Isolate gegenüber
den Antibiotika Erythromycin, Gentamicin und Metronidazol wurden die in der Tabelle 12
aufgeführten MHK-Grenzwerte berücksichtigt.

Material und Methoden 78
Tabelle 12: Bewertungsstufen der MHK-Werte
Antibiotikum
Bewertungsstufe der MHK-Werte
sensibel intermediär resistent
Erythromycin < 5 µg/ml ≥ 5 µg/ml
Gentamicin ≤ 1 µg/ml 2 – 4 µg/ml ≥ 8 µg/ml
Metronidazol < 16 µg/ml ≥ 16 µg/ml
3.11 Molekularbiologische Methoden
Quelle
British Society for
Antimicrobial Chemotherapy
(PHILLIPS 1991)
DIN 58940-4 Bbl. 1: 2000-01
(DIN 2000)
NCCLS-Dokument M11-A2
(NATIONAL COMMITTEE
FOR CLINICAL
LABORATORY
STANDARDS 1993).
In dieser Arbeit wurden 18 Cl. difficile-Isolate der vier Versuchspferde mit der PCR auf die
Toxingene tcdA und tcdB sowie auf das Erythromycinresistenzgen erm untersucht (3.11.2).
Die Bestimmung des Ribotyps von 17 dieser Isolate erfolgte mit der PCR-Ribotypisierung
(3.11.5).
Bei der Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate kam die in dieser Arbeit etablierte
Multiplex-PCR (3.11.3) zum Einsatz. Insgesamt wurden 122 Cl. perfringens-Isolate der vier
Versuchspferde (41 von „Ede“, 18 von „Agu“, 43 von „Resinale“, 20 von „Speranza“) und
38 equine Cl. perfringens-Isolate (4.2) aus dem Probenmaterial des Instituts für
Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit dieser Methode
differenziert. Die 16S rDNA-Ribotypisierung (3.11.4) von 63 der 122 Cl. perfringens-Isolate
der vier Versuchspferde war ein weiterer Bestandteil der molekularbiologischen
Charakterisierung.

Material und Methoden 79
3.11.1 DNA-Extraktion aus Cl. perfringens und Cl. difficile
Benötigte Reagenzien:
TEN-Puffer 50 mM Tris-HCl pH = 8; 1 mM EDTA,
100 mM NaCl
SDS-Lösung 20 %
Lysozym 100 mg/ml
RNAase 10 mg/ml
Proteinase K-Lösung 20 mg/ml
CTAB-Lösung 10 % in 0,7 M NaCl
NaCl-Lösung 4 M
Chloroform/Isoamylalkohol 24:1
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1
Isopropanol-Lösung 100 %
Ethanol-Lösung 80 %
Die Chemikalien wurden von Roth GmbH ( Karlruhe, Deutschland) bzw. im Fall von CTAB
von Sigma-Aldrich Chemie GmbH/Geschäftsbereich Fluka (Taufkirchen, Deutschland)
bezogen.
Durchführung:
5 bis 10 Bakterienkolonien wurden nach 24 h anaerober Bebrütung bei 37 °C auf Schaedler-
Agarplatten mit einer sterilen Plastiköse aufgenommen, in 500 µl TEN-Puffer mit 10 mg/ml
Lysozym sowie 180 µg/ml RNAase eingerührt und bei 37 °C für 1 h im Wasserbad inkubiert.
Nach der Zugabe von 15 µl 20%iger SDS-Lösung und 10 µl 20 mg/ml Proteinase K-Lösung
erfolgte nach wiederholtem Schwenken eine weitere Inkubation für 1 h unter den gleichen
Bedingungen. Anschließend wurden 125 ml 4 M NaCl und nach vorsichtigem Mischen noch
80 µl einer auf 50 °C erwärmten 10 % CTAB-Lösung zugegeben. Die Lösung wurde bei
65 °C im Wasserbad für 10 min erwärmt. Durch die Zugabe von 780 µl
Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) und wiederholtes Schwenken folgte die DNA-Extraktion.
Nach der Zentrifugation bei 12.000 g für 5 min wurde der Überstand ohne Anteile der weißen
Interphase in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Nach einem zweiten Extraktionsschritt
mit 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) schloss sich die Präzipitation der
DNA durch Zugabe von 500 µl Isopropanol an. Nach der Zentrifugation bei 12.000 g für

Material und Methoden 80
30 min bei Raumtemperatur wurde das DNA-Sediment durch Zugabe von 500 µl –20°C
kalter 80 % Ethanol-Lösung gewaschen. Nach 30 min langer Zentrifugation bei 4 °C wurde
der Überstand abgenommen, die DNA im Exikator getrocknet und anschließend in 50 µl
bidestilliertem, sterilem Wasser über Nacht bei 8 °C gelöst. Die DNA-Konzentrationsbestimmung
von einer 1:50-Verdünnung erfolgte photometrisch.
3.11.2 PCR der Toxingene tcdA und tcdB sowie des Erythromycinresistenzgens erm von
Cl. difficile-Isolaten
Benötigte Reagenzien:
DNA von Cl. difficile 10 ng je Reaktionsansatz
10 x PCR-Puffer 200 mM Tris-HCl pH = 8,4; 500 mM KCl
MgCl2-Lösung 50 mM
dATP, dCTP, dGTP, dTTP- 100 mM je dNTP
Lösungen (dNTP)
Taq DNA Polymerase 5 U/µl
Primer-Stammlösungen 50 µM
W-1 Detergenzlösung 1 %
100 bp DNA-Leiter
Alle PCR-Zusätze mit Ausnahme der DNA von Cl. difficile wurden von Invitrogen/Life
Technologies (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.
Durchführung:
Für den Nachweis der Toxingene tcdA und tcdB der Cl. difficile-Isolate, die für das Toxin A
und Toxin B kodieren, wurden folgende von KATO et al. (1998) beschriebenen Primer
eingesetzt: NK2 und NK3 für den nichtrepetitiven Teil von tcdA, NK9 und NK11 für den
repetitiven Teil von tcdA, NK104 und NK105 für den nichtrepetitiven Teil von tcdB. Die
PCR wurde als Monoplex-PCR in 50 µl mit 1 x PCR-Puffer (20 mM Tris-HCl pH = 8,4;
50 mM KCl); 1,5 mM MgCl2; je 200 µM dATP, dTTP, dCTP und cGTP; je 0,5 µM eines
Primers; 2,5 U Taq DNA Polymerase und 10 ng DNA von Cl. difficile durchgeführt.
Folgendes PCR-Programm kam zum Einsatz: initiale Denaturierung bei 94 °C für 2 min;
35 Zyklen: 1 min 94 °C, 1 min 55 °C und 1 min 72 °C; finale Kettenverlängerung bei 72 °C
für 5 min.

Material und Methoden 81
Der PCR-Nachweis des Erythromycinresistenzgens erm erfolgte mit den Primern ERMBL
und ERMBR (Tabelle 13) und ansonsten wie oben für die Toxingene tcdA und tcdB
beschrieben.
Tabelle 13: Primersequenzen, Zielsequenz und Amplifikatgröße der PCR zum
Nachweis des Erythromycinresistenzgens erm von Cl. difficile
Primerbezeichnung
Sequenz (5`- zum 3`-Ende)
ERMBL GTGGTTTTTGAAAGCCATGC
ERMBR GCGTGTTTCATTGCTTGATG
„gene accession“
Nummer der erm-
Zielsequenz
Amplifikatgröße
in bp
AJ294529 317
3.11.3 Multiplex-PCR zum Nachweis der Toxingene cpa, cpb, etxD, iap, cpb2 und cpe
von Cl. perfringens
3.11.3.1 Auswahl der Primer
Zur Auswahl geeigneter Primer für diese Multiplex-PCR (MP-PCR) wurde das Programm
Primer Picker aus www-genome.wi.mit.edu eingesetzt. Um dem Phänomen der PCR-
Selektion in der MP-PCR vorzubeugen, wurden Primer mit ähnlichen chemischen und
physikalischen Eigenschaften ausgewählt (ELNIFRO et al. 2000). Die Vorgaben für die
Primer waren: Tm zwischen 59 °C und 61 °C, Länge zwischen 20 b und 25 b, GC-Anteil
zwischen 35 % und 55 % und einer für die verschiedenen Zielsequenzen unterschiedlichen
Ampifikatlängenvorgabe zwischen 200 bp und 900 bp. Die Tabelle 14 führt die „gene
accession“-Nummern der Genbank für die eingesetzten Zielsequenzen der Toxingene auf. Die
Primersequenzen werden zusammen mit der Größe der Amplifikate der Toxingene in der
Tabelle 15 aufgeführt. Die Primer waren über Invitrogen/Life Technologies zu beziehen. Es
wurde bei der Primerauswahl versucht, Amplifikate mit Restriktionsenzymschnittstellen zu
erhalten, um einen Kontrollverdau der MP-PCR zu ermöglichen (3.11.3.4). Die Suche nach
Restriktionsenzymschnittstellen erfolgte mit dem NEBcutterV1 aus http://tools.neb.com. Die
Tabelle 16 gibt die zur Kontrolle der MP-PCR eingesetzte Restriktionsverdauanalyse wieder.

Material und Methoden 82
Tabelle 14: Zielsequenzen der MP-PCR für die Genotypisierung von Cl. perfringens
Toxingen Toxin
„gene accession“-Nummer der
verwendeten Zielsequenzen
cpa α-Toxin L43545
cpb β-Toxin X83275
cpe Enterotoxin CPE X81849
etxD ε-Toxin M95206
iap ι-Toxin X73562
cpb2 β2-Toxin L77965
Tabelle 15: Primersequenzen und Amplifikatgrößen der MP-PCR für die
Genotypisierung von Cl. perfringens
Primerbezeichnung
Sequenz (5`- zum 3`-Ende) Toxingen
CPA5L AGTCTACGCTTGGGATGGAA
CPA5R TTTCCTGGGTTGTCCATTTC
CPBL TCCTTTCTTGAGGGAGGATAAA
CPBR TGAACCTCCTATTTTGTATCCCA
CPEL GGGGAACCCTCAGTAGTTTCA
CPER ACCAGCTGGATTTGAGTTTAATG
CPETXL TGGGAACTTCGATACAAGCA
CPETXR TTAACTCATCTCCCATAACTGCAC
CPIL AAACGCATTAAAGCTCACACC
CPIR CTGCATAACCTGGAATGGCT
CPB2L CAAGCAATTGGGGGAGTTTA
CPB2R GCAGAATCAGGATTTTGACCA
Amplifikatgröße
in bp
cpa 900
cpb 612
cpe 506
etxD 396
iap 293
cpb2 200

Material und Methoden 83
3.11.3.2 Optimierung der MP-PCR
Alle aufgeführten Primerpaare wurden zunächst in einer Monoplex-PCR überprüft. Bei dieser
und den folgenden Etablierungsschritten wurde mit sechs Cl. perfringens-Kontrollstämmen
(NCTC 8798: enterotoxinogener Typ A; E482-97: β2-toxinogener Typ A; NCTC 8533:
Typ B; RE 1847: β2-toxinogener Typ C; RE1833: enterotoxinogener Typ D; NCTC 8084:
Typ E) und einer Mischkultur aus den genannten sechs Kontrollstämmen gearbeitet, die zuvor
mit bereits publizierten Primern überprüft wurden (HERHOLZ et al. 1999). Als
Negativkontrollen kamen 18 verschiedene Clostridienspezies zum Einsatz: Cl. baratii
DSM1401, Cl. bifermentans ATCC 192, Cl. botulinum, Cl. butyricum, Cl. cadaveris, Cl.
chauvoei DSM 7528, Cl. clostridioforme, Cl. difficile DSM 1296, Cl. intestinalis DSM 6191,
Cl. glycolicum DSM 1288, Cl. inoccuum DSM1286, Cl. ramosum DSM 1402, Cl. septicum,
Cl. sordellii, Cl. spiroforme, Cl. subterminale RE1255, Cl. tertium, Cl. tetani. Bei den nicht
näher spezifizierten Clostridienstämmen handelt es sich um Feldisolate des Institutes für
Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Im Rahmen der
Etablierung der MP-PCR wurden nach den Empfehlungen von ELNIFRO et al. (2000) die
Primer zunächst in equimolaren Konzentrationen eingesetzt und anschließend die
Primerkonzentrationen so verändert, dass alle Amplifikate in den verschiedenen
Kombinationen gleich starke Signale zeigten.
Da diese MP-PCR auch in der Routinediagnostik eingesetzt werden sollte, wurden in der
Phase der Optimierung in den Reaktionen bereits Bakterienlysate und keine isolierte DNA
eingesetzt. Um die Bildung von Primerdimeren und -multimeren zu minimieren, wird die MP-
PCR als vereinfachte „hot-start“-PCR durchgeführt (ELNIFRO et al. 2000).
3.11.3.3 Protokoll der MP-PCR
Benötigte Reagenzien:
Suspensionsmedium steriles bidestilliertes Wasser in Glasampullen
(bioMérieux, Nürtingen, Deutschland)
10 x PCR-Puffer 200 mM Tris-HCl pH = 8,4; 500 mM KCl
MgCl2-Lösung 50 mM

Material und Methoden 84
dATP, dCTP, dGTP, dTTP- 100 mM je dNTP
Lösungen (dNTP)
Taq DNA Polymerase 5 U/µl
Primer-Stammlösungen 50 µM
W-1 Detergenzlösung 1 %
100 bp DNA-Leiter
Alle aufgeführten Reagenzien bis auf das Suspensionsmedium und die Primer wurden von
Invitrogen/Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.
Durchführung:
Die in dieser Arbeit etablierte MP-PCR von Cl. perfringens kann sowohl mit isolierter DNA
als auch direkt mit lysierter Bakteriensuspension durchgeführt werden. Für die MP-PCR
wurde grundsätzlich Material von Cl. perfringens-Kolonien, die nach 12 h bis 48 h anaerober
Inkubation auf Schaedler- oder Clostridien-Selektiv-Agarplatten gewonnen wurden,
eingesetzt. Das Koloniematerial wurde mit einer sterilen Kunststofföse (Sarstedt AG,
Heidelberg, Deutschland) aufgenommen und eine Suspension mit einem Mac Farland-
Trübungsstandard (MF) von 1 hergestellt (Abbildung 12). Folgende Stämme dienten als
Kontrollen: NCTC 8798 (enterotoxinogener Typ A), E482-97 Bern (β2-toxinogener Typ A),
RE1847 (β2-toxinogener Typ C), NCTC 8533 (Typ B), RE 1833 (enterotoxinogener Typ D)
und NCTC 8084 (Typ E), Cl. difficile DSM 1296 (Negativkontrolle).
5 µl der Bakteriensuspension mit einem MF = 1 wurden nach Zugabe von 35 µl 0,07 % W-1
Detergenzlösung in einem 200 µl PCR-Reaktionsgefäß für 5 min bei 95 °C lysiert.
Anschließend erfolgte die Zugabe von 10 µl eines Mastermixes zu den auf Eis gekühlten
PCR-Reaktionsgefäßen, so dass im Reaktionsansatz folgende Konzentrationen vorlagen: 1 x
PCR-Puffer (20 mM Tris-HCl pH = 8,4; 50 mM KCl); 1,5 mM MgCl2; je 250 µM von dATP,
dTTP, dCTP und cGTP; 200 nM CPA5L; 200 nM CPA5R; 138 nM CPBL; 138 nM CPBR;
67 nM CPEL; 67 nM CPER; 46 nM CPETXL; 46 nM CPETXR; 83 nM CPIL; 83 nM CPIR;
117 nM CPB2L; 117 nM CPB2R und 2,5 U Taq DNA Polymerase. Die Proben durchliefen
sofort im Anschluss folgendes PCR-Programm: initiale Denaturierung bei 95 °C für 2,30 min;
35 Zyklen: 1 min bei 95 °C, 1 min bei 55 °C und 1,20 min bei 72 °C sowie eine finale
Kettenverlängerung bei 72 °C für 2 min. Die 1,2 % Agarosegelelektrophorese zur
Auftrennung von 10 µl des Reaktionsansatzes wurde nach MANIATIS et al. (1989) unter

Material und Methoden 85
Verwendung der 100 bp DNA-Leiter als Größenstandard durchgeführt. Im Anschluß erfolgte
die Fotografie des Agarosegels und digitale Verarbeitung mit MultiAnalyst (BioRad,
Kalifornien,USA).
3.11.3.4 Kontrollrestriktionsverdau der Amplifikate der MP-PCR der Toxingene von
Cl. perfringens
Mit dem „CONCERT Rapid PCR Purification System“ (Invitrogen/Life Technologies)
wurden nach den Angaben des Herstellers die PCR-Amplifikate vor dem
Kontrollrestriktionsverdau gereinigt. Die für den Restriktionsverdau der Amplifikate
eingesetzten Enzyme werden in Tabelle 16 spezifiziert. Die Durchführung erfolgte nach dem
Leitfaden des Herstellers der Restriktionsenzyme (New England Biolabs GmbH, Frankfurt)
und wie von MANIATIS et al. (1989) beschrieben.
Tabelle 16: Restriktionsverdauanalyse der Amplifikate der MP-PCR für die
Genotypisierung von Cl. perfringens
Toxingen cpa cpb2 cpe
Restriktionsverdau
Fragmente in
bp
– BamHI SpeI – HindIII – PstI SspI
900 680 784 200 161 506 348 363
200 116 39 158 143
Toxingen iap etxD cpb
Restriktionsverdau
Fragmente in
bp
– SpeI – SspI – SspI BspDI
293 179 396 350 612 342 354
114 46 247 258
23

Material und Methoden 86
3.11.4 Ribotypisierung von Cl. perfringens-Isolaten
In der vorliegenden Arbeit wurden alle Ribotypisierungen von Cl. perfringens mit
Fluoreszein- oder radioaktivmarkierten Sonden durchgeführt, die mit Sequenzen der 16S
rDNA hybridisieren.
3.11.4.1 PCR zur Gewinnung eines 16S rDNA-Amplifikates von Cl. perfringens-DNA
Bei dieser PCR kamen die Primer CL16S5 und CL16S3 (Tabelle 17) zum Einsatz, die
Sequenzenzabschnitten des Gens rrsB („Gene accession“-Nummer: M69264) entsprechen.
Das für die 16S RNA kodierende Gen rrsB ist Bestandteil des rrn Operons (GARNIER et al.
1991), das an zehn verschiedenen Positionen im Chromosom von Cl. perfringens vorkommt
(CANARD und COLE 1989). Das PCR-Programm war identisch mit dem oben für das
Primerpaar NK2 und NK3 beschriebenen Programm (3.11.2), nur dass die
Primerbindungsreaktion bei 60 °C durchgeführt, DNA von Cl. perfringens E482-97 und als
Primer CL16S5 und CL16S3 eingesetzt wurden. Mit einer 1 % Agarosegelelektrophorese
wurde wie oben beschrieben überprüft, dass diese PCR nur das gewünschte 594 bp lange
rrsB-Amplifikat generiert. Mit dem „CONCERT Rapid PCR Purification System“
(Invitrogen/Life Technologies) erfolgte nach den Angaben des Herstellers eine Reinigung
des 16S rDNA-Amplifikates. Die DNA-Konzentration wurde anschließend photometrisch
bestimmt.
Tabelle 17: Primer für die Generierung des 16S rDNA-Amplifikates von
Cl. perfringens-DNA
Primerbezeichnung Sequenz (5`- zum 3`-Ende)
CL16S5 ATATTGCACAATGGGGGAAA
CL16S3 TAAGGTTCTTCGCGTTGCTT

Material und Methoden 87
3.11.4.2 Ribotypisierung mit einer Fluoreszein-markierten 16S rDNA-Sonde
3.11.4.2.1 Präparation der Fluoreszein-markierten 16S rDNA-Sonde
Nach dem Protokoll in der Anleitung zum „ECL Random prime labelling and detection
systems, version II RPN 3040/3041“ (Amersham Life Science, Freiburg, Deutschland) wurde
mit 100 ng des 16S rDNA-Amplifikates die Synthese der Fluoreszein-markierten Sonde
vorgenommen.
3.11.4.2.2 Restriktionsenzymverdau der Cl. perfringens-DNA und Gelelektrophorese für
Southern Blot-Hybridisierung im Rahmen der Ribotypisierung
Benötigte Reagenzien:
HindIII-Restriktionsenzym 20 U/µl New England Biolabs GmbH, Frankfurt
10 x NEBuffer 2 New England Biolabs GmbH
6 x Ladepuffer 15 mg Bromphenolblau und 1,5 g Ficoll
in 9,5 ml bidestilliertem Wasser
10 x TBE Laufpuffer 0,9 M Tris/HCl (pH 7,5), 0,9 M Borsäure,
0,5 M EDTA
6 x Ladepuffer 0,25 % Bromphenolblau, 30% Glycerin
Durchführung:
3 µg DNA von Cl. perfringens wurden in einem Volumen von 30 µl 1 x NEBuffer 2 mit 30 U
HindIII über Nacht bei 37 °C verdaut. Nach MANIATIS et al. (1989) erfolgte die 1 %
Agarosegelelektrophorese bei 30 V von 1,5 µg verdauter DNA.
4.2.3 Southern Blot der HindIII-geschnittenen DNA von Cl. perfringens
Benötigte Reagenzien:
Denaturierungspuffer 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH
20 x SSC 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat
Durchführung:
Das Agarosegel wurde nach zweimaligem kurzem Waschen mit destilliertem Wasser 30 min
in 100 ml Denaturierungspuffer inkubiert. Anschließend erfolgte nach dreimaligem Waschen
mit destilliertem Wasser das zweiminütige Schwenken zunächst in 2 x SSC und anschließend

Material und Methoden 88
in 20 x SSC. Die Durchführung des Southern Blotting wurde wie von MANIATIS et al.
(1989) unter 9.31 beschrieben durchgeführt. Zum Einsatz kam die Positive TM Membrane®
(Q.BIOgene, Nordamerika). Nach dem Ablauf des Southern Blotting wurde die Membran bei
80 °C für zwei Stunden gebacken.
3.11.4.2.3 Hybridisierung der auf der Membran-fixierten DNA von Cl. perfringens mit
einer Fluoreszein-markierten 16S rDNA-Sonde
Benötigte Reagenzien:
Hybridisierungspuffer 5 x SSC, 5 mM EDTA, 0,1 % SDS
TE-Puffer 10 mM Tris-HCl pH=7,5; 1 mM EDTA
Lachsspermien-DNA Invitrogen/Life Technologies
Durchführung:
Die gebackenen Membranen wurden zweimal mit bidestilliertem Wasser gewaschen,
zusammengerollt, mit einer Pinzette in eine Hybridisierungsröhre platziert und zur
Prähybridisierung in 10 ml 66 °C heißem Hybridisierungspuffer für 2 h im Hybridisierungs-
ofen inkubiert. Am Ende der Prähybridisierung erfolgte die Denaturierung der Fluoreszeinmarkierten
16S rDNA-Sonde bei 95 °C für 5 min mit anschließendem Abkühlen auf Eis
(50 µl Reaktionsvolumen mit 30 ng Fluoreszein-markierter 16S rDNA-Sonde und 200 µg
Lachsspermien-DNA). Nach dem Abgießen des Hybridisierungspuffers der Prähybridisierung
wurde die 50 µl Lösung der denaturierten Sonde zu 4 ml 66 °C heißem Hybridisierungspuffer
hinzugefügt, gemischt, in die Hybridisierungsröhre mit der Nylonmembran überführt und
über Nacht bei 66 °C hybridisiert.
3.11.4.2.4 Chemilumineszenzdetektion der mit der Fluoreszein-markierten 16S rDNA-
Sonde hybridisierten Cl. perfringens-DNA
Reagenzien:
ECL Random prime labelling and detection systems, version II RPN 3040/3041
(Amersham Life Science, Freiburg, Deutschland)
Fixierer und Entwickler für die Filmentwicklung

Material und Methoden 89
Durchführung:
Das stringente Waschen, das Blocken, die Inkubation mit dem Anti-Fluoreszein-HRP-
Konjugat und das Waschen der Nylonmembran erfolgten, wie vom Hersteller des „ECL
Random prime labelling and detection systems“ unter 3.6 bzw. 4 der Gebrauchsanweisung
beschrieben. Zur Signalgenerierung wurde die Nylonmembran in eine neue
Hybridisierungsröhre überführt, 3 ml der Detektionslösung 1 mit 3 ml der Detektionslösung 2
des „ECL Random prime labelling and detection systems” gemischt und zur
Nylonmembran hinzugegeben. Nach 1 min langer Inkubation durch Rollen im
Hybridisierungsofen bei Raumtemperatur wurde die Detektionslösung vollständig
abgegossen. Die Nylonmembran wurde in einer Folie auf einem alten Autoradiographiefilm
mit Tesafilm fixiert. Es folgte die Exposition eines Bio-MaxMS-Films von Kodak für
3 min und von weiteren Filmen mit längeren Expositionszeiten in Abhängigkeit von der
Signalstärke und die Entwicklung des Autoradiographiefilms.
3.11.4.3 Ribotypisierung mit einer radioaktiven 16S rDNA-Sonde
3.11.4.3.1 Radioaktive Markierung des 16S rDNA-Amplifikates über Nick-Translation
Reagenzien:
[α- 32 P]-dCTP NEN, Köln, Köln
10 x Puffer 500 mM Tris-HCl pH=7; 85 mM MgCl2,
der DNA-Polymerase I/DNase I 100 mM 2-Mercaptoethanol, 100 µg/ml BSA
DNA-Polymerase I/DNase I Invitrogen/Life Technologies
dATP, dTTP, dGTP-Lösung Invitrogen/Life Technologies
Durchführung:
Mit der DNA-Polymerase I/DNase I wurde das 16S rDNA-Amplifikat durch den Einbau von
[α- 32 P]-dCTP über Nick-Translation in folgender Reaktion radioaktiv markiert: 100 ng des
16S rDNA-Amplifikates in 1 x Puffer der DNA Polymerase I/DNase I mit je 20 µM dATP,
dTTP, dGTP, 162,5 pmol [α- 32 P]-dCTP und 2,5 U DNA-Polymerase I/DNase in einem
Gesamtvolumen von 50 µl bei 16 °C für 1,5 h. Die radioaktiv markierte 16S rDNA-Sonde
wurde mittels einer Nick-Säule nach den Angaben des Herstellers (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Freiburg, Deutschland) gereinigt (Elution mit 450 µl).

Material und Methoden 90
3.11.4.3.2 Hybridisierung der auf der Membran-fixierten DNA von Cl. perfringens mit
einer [α- 32 P]-dCTP markierten 16S rDNA-Sonde
Reagenzien:
Hybridisierungspuffer 5 x SSC, 5 mM EDTA, 0,1 % SDS
Sonde gereinigte [α- 32 P]-dCTP markierte 16S rDNA-Sonde
Waschpuffer 1 2 x SSC, 1% SDS
Waschpuffer 2 0,2 x SSC, 0,1 % SDS
20 x SSC 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat
Fixierer und Entwickler für die
Filmentwicklung
Durchführung:
Bis einschließlich zur Prähybridisierung wurden für diese Hybridisierung genau die gleichen
Schritte ausgeführt wie bei der Hybridisierung mit einer Fluoreszein-markierten 16S rDNA-
Sonde (3.11.4.2.3). Am Ende der Prähybridisierung wurde die gereinigte [α- 32 P]-dCTP-
markierte 16S rDNA-Sonde bei 95 °C für 10 min (450 µl Eluat) denaturiert und anschließend
auf Eis abgekühlt. Nach der Zugabe von 100 µl der Lösung der denaturierten Sonde zu 4 ml
66 °C heißem Hybridisierungspuffer erfolgte wie bei der Fluoreszein-markierten 16S rDNA-
Sonde die Hybridisierung. Die Nylonmembran wurde mit 50 ml 66 °C heißem Waschpuffer 1
für 1 min und anschließend für 15 min gewaschen. Ein zweiter Waschschritt mit 50 ml 66 °C
heißem Waschpuffer 2 für 15 min folgte. Zum Abschluss wurde die Nylonmembran nach
kurzem Abspülen mit 2 x SSC in eine Folie gewickelt und in einer Filmkasette fixiert. Ein X-
OMAT-Film von Kodak wurde für 15 min bei –20 °C der Nylonmembran exponiert und
der Autoradiographiefilm entwickelt.
3.11.5 PCR-Ribotypisierung von Cl. difficile
Zur PCR-Ribotypisierung der Cl. difficile-Isolate wurde, wie von STUBBS et al. (1999)
beschrieben, die zwischen dem 16S rDNA und 23S rDNA lokalisierte, nichtkodierende
Sequenz („16S-23S rRNA gene intergenic spacer region“) amplifiziert.

Ergebnisse 91
4 Ergebnisse
Bei vier Versuchspferden wurden die Auswirkungen der Faktoren Nahrungskarenz,
Futterumstellung, Antibiose und operativer Eingriff während einer ca. drei Monate langen
Aufstallung in der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover untersucht. Am
Ende stand der Versuch, die von GUSTAFSSON et al. (1997) beschriebene Induktion der
Typhlocolitis durch die orale Applikation von Erythromycin zu reproduzieren (2.1.5.2 u.
2.1.7). Die Faktoren Erythromycin-Applikation und Nahrungskarenz kamen sowohl alleine
als auch in Kombination zum Einsatz. Im Verlauf der unterschiedlichen experimentellen
Phasen wurde die Intestinalflora der vier Pferde „Ede“, „Agu“, „Resinale“ und „Speranza“
regelmäßig auf Cl. perfringens und Cl. difficile untersucht (vorwiegend rektal entnommene
Kotproben).
Die Charakterisierung der Cl. difficile- und Cl. perfringens-Isolate aus den verschiedenen
Proben der vier Versuchspferde erfolgte durch PCR-Diagnostik der Toxingene, eine
Resistenzprüfung und eine Ribotypisierung.
Im Folgenden wird zunächst von jedem Pferd der Versuchsverlauf unter besonderer
Berücksichtigung der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik beschrieben. Im Anschluss
werden die Ergebnisse der Resistenzprüfung der Isolate vorgestellt (4.1.5). Die Auswirkungen
der einzelnen Behandlungsphasen und die Ergebnisse der Fettsäureanalytik kommen unter
4.1.7 bzw. 4.1.8 zusammenfassend zur Darstellung.
Um die Bedeutung β2-toxinogener Cl. perfringens-Stämme für die Typhlocolitis des Pferdes
weiter zu untersuchen, erfolgte auch die Genotypisierung von equinen Cl. perfringens-
Isolaten aus Proben der Diagnostik des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen (4.2).
4.1 Ergebnisse der Verlaufsuntersuchungen an vier Versuchspferden
4.1.1 Versuchspferd „Ede“
4.1.1.1 Klinischer Verlauf bis zur Operation einschließlich der Nahrungskarenzen
Die Stute „Ede“ zeigte in dem Zeitraum von der Einstallung in die Klinik für Pferde am
13.10.00 bis zur Operation am 28.11.00 ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Sowohl die 36 h
als auch die 72 h lange Nahrungskarenz verliefen in dieser Zeit ohne Komplikation. Der Kot

Ergebnisse 92
war immer geformt. Die wiederholte Untersuchung des Blutstatus zeigte keine
Auffälligkeiten.
4.1.1.2 Parasitologische Untersuchung
Am 17.10.00 konnten Eier von Strongylus spec. und Anoplocephala spec. im Kot des Pferdes
„Ede“ nachgewiesen werden.
4.1.1.3 Operationsbefund
Die Exploration der Bauchhöhle erbrachte keine pathologischen Befunde. Das Caecum war
mit ca. 5 l flüssigem, hellgrünem Inhalt mit wenigen faserigen Bestandteilen und einem pH-
Wert von 7,5 gefüllt. Auch das Colon ascendens hatte flüssigen Inhalt. Die Darmwand war in
allen dargestellten Abschnitten ohne besonderen Befund. Während der Operation stellte sich
bei dem Pferd „Ede“ eine ca. zehn minütige Tachycardie mit einem Puls von 60/min ein.
4.1.1.4 Postoperativer Verlauf
An den beiden ersten Tagen nach der Operation fiel die Stute „Ede“ durch ein geringgradig
gestörtes Allgemeinbefinden mit wiederholtem Flehmen und einer reduzierten
Nahrungsaufnahme auf. Am 1. Tag post operationem lag mit 11 x 10 9 Leukozyten/l eine
geringgradige Leukozytose vor. Ansonsten war der Blutstatus in den drei Tagen nach der OP
unauffällig. Der Kot war in der gesamten Woche nach der Operation zu jedem Zeitpunkt
geformt und roch säuerlich aromatisch. Ab dem 3. Tag post operationem war dieses
Versuchspferd wieder klinisch unauffällig.
4.1.1.5 Klinischer Verlauf in den Erythromycin-Applikationsphasen
In den ersten beiden Behandlungsphasen mit Erythromycin (1,25 mg/kg KG per os alle 24 h
für 5 Tage bzw. 1,25 mg/kg KG per os alle 8 h für 5 Tage) wurden zu jedem Zeitpunkt ein
ungestörtes Allgemeinbefinden, geformter Kot und physiologische Werte des Blutstatus
registriert. Der einzige auffällige Befund war Hypermotorik des Darmes am 2. Tag der
Erythromycin-Applikation. Die 72 h lange Nahrungskarenz vor der dritten Erythromycin-

Ergebnisse 93
Behandlung verlief ohne klinische und hämatologische Auffälligkeiten. In den ersten 19 h
nach dem Ende dieser Nahrungskarenz und dem Beginn der Erythromycin-Applikation war
dieses Pferd klinisch unauffällig und setzte wiederholt geformten Kot ab. 22 h nach dem Ende
dieser Nahrungskarenz hatte sich das klinische Bild deutlich verändert: Die Stute „Ede“ fiel
durch Mattigkeit, wiederholtes Flehmen, eine Erhöhung der Pulsfrequenz von 32/min auf
48/min und Kotabsatz im Strahl mit einem stark stinkendem Geruch auf. Die
Leukozytenkonzentration des Blutes sank von 8,2 x 10 9 /l am 27.1.00 auf 4,6 x 10 9 /l zu diesem
Zeitpunkt (am 29.1.00). Der Hämatokrit lag bei 47% und das Gesamteiweiß bei 72,1 g/l. Das
Pferd wurde 24 h nach dem Ende der Nahrungskarenz – und insgesamt dreimaliger
Applikation von 1,25 mg Erythromycin/kg KG in diesen 24 h – euthanasiert.
4.1.1.6 Sektionsbefund
Das Caecum und das Colon ascendens waren mit dünnflüssigem, grünlichem Inhalt gefüllt.
Ein Schleimhautödem war in diesen Darmabschnitten nicht nachweisbar. Im Caecum lagen
knötchenartige Umfangsvermehrungen mit einem Durchmesser von 2 mm in der Schleimhaut
und ein mittelgradiger Befall mit Anoplocephala spec. vor. Im Caecum und Colon ascendens
konnten eine geringgradige diffuse Hyperämie sowie fokal geringgradige petechiale
Blutungen festgestellt werden (Abbildung 9). Im Magen war eine mittel- bis hochgradige,
flächenhafte ulzerative Gastritis der Pars proventricularis auffällig. Histologisch konnten im
Caecum und Colon ascendens zahlreiche eosinophile Granulozyten und eine mittelgradige
Infiltration mit Lymphozyten und Plasmazellen in der Lamina propria und Tela submucosa
nachgewiesen werden. Ferner waren die Enterozyten der oberflächlichen Schleimhaut
überwiegend abgeschilfert. Im Caecum wurden vereinzelt parasitäre Larven in der
oberflächlichen Mukosa angeschnitten. In der parasitologischen Untersuchung waren im
Dickdarminhalt hochgradig Eier von Magen-Darm-Strongyliden nachweisbar.
4.1.1.6.1 Diagnosen
• geringgradige katarrhalische Enteritis im Bereich des Caecum und Colon ascendens
(eventuell sehr frühes Stadium einer Typhlocolitis)
• hochgradige Endoparasitose, unter anderem eine larvale Cyathostominose
• ulzerative Gastritis der Pars proventricularis

Ergebnisse 94
4.1.1.7 Ergebnisse der bakteriologischen Diagnostik
Die Untersuchung auf Salmonellen ergab bei dem Pferd „Ede“ immer ein negatives Ergebnis.
Cl. perfringens konnte in zwölf (38 %), Cl. difficile in fünf (16 %) der 31 Proben kulturell
nachgewiesen werden. Die Tabelle 18 stellt die Resultate der qualitativen und quantitativen
Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik der 31 Proben dieses Versuchspferdes unter
Berücksichtigung der Ergebnisse der PCR-Genotypisierung dieser Isolate zusammen. Die
Anzahl und der genaue Zeitpunkt der Probenentnahmen sowie die Dosierung der
Medikamente werden in der Tabelle 7 bzw. Tabelle 11 aufgeführt.
Tabelle 18: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Ede“
Zeitraum Behandlungsphase
13.10.00 bis
28.10.00
29.10.00 bis
26.11.00
27.11.00
Hospitalisierung ohne
Behandlung
36 h (29.10. bis 30.10.)
und 72 h (7.11. bis
10.11.) Nahrungskarenz
24 h präoperative
Nahrungskarenz
28.11.00 Laparotomie –
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
–
–
+
(25.10.)
+
(31.10. und
22.11.)
+
(Caecum)
– –
– –
– –
29.11.00 1. Tag post operationem – + – –
30.11.00 2. Tag post operationem + –
+
(8 x 10 2 KBE/g
Kot)
1.12.00 3. Tag post operationem + – + –
2.12. bis
9.12.00
Ruhephase – – – –
–

Ergebnisse 95
Zeitraum Behandlungsphase
10.12. bis
14.12.00
15.12.00 bis
13.1.01
14.1.01 bis
18.1.01
19.1.01 bis
24.1.01
25.1.01 bis
28.1.01
28.1.01 bis
29.01.01
Erythromycin
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
+
(insg.
5 x 10 3
KBE/g Kot
am 12.12.)
+
(insg.
5 x 10 3
KBE/g Kot
am 12.12.)
– +
Ruhephase – – – –
Erythromycin – – – +
Ruhephase – – – –
72 h Nahrungskarenz – – – –
Erythromycin nach
72 h Nahrungskarenz
(Euthanasie am 29.1.)
Anmerkung zu Tabelle 18:
–
(Caecum,
Colon
ascendens,
Ileum, Kot)
+
(3 x 10 3
KBE/g
Chymus im
Caecum und
Colon
ascendens)
–
(Caecum,
Colon
ascendens,
Ileum, Kot)
–
(Caecum,
Colon
ascendens,
Ileum, Kot)
Sofern in der Tabelle im Zusammenhang mit einem + keine Keimzahl angegeben ist, konnte
der Erreger nur im qualitativen Teil der bakteriologischen Diagnostik nachgewiesen werden,
so dass von einem Keimgehalt von < 10 2 KBE/g Untersuchungsmaterial ausgegangen werden
muss. Die unter den Bakteriennamen aufgeführten Toxingene und deren Genprodukte werden
in der Tabelle 2 und der Tabelle 4 charakterisiert.
4.1.1.8 Ergebnis der Geno- und Ribotypisierung der Cl. difficile-Isolate mit der PCR
Die beiden Cl. difficile-Isolate, s90 und s133, vom 2. und 3. Tag post operationem waren
PCR-positiv für die Toxingene tcdA und tcdB. Ansonsten bestand für alle anderen 29 Proben

Ergebnisse 96
dieses Pferdes kein Nachweis eines toxinogenen Cl. difficile-Stammes. Die beiden Isolate, s90
und s133, wiesen beide identische PCR-Ribotypisierungsmuster auf (Ribotyp A, Tabelle 27).
Alle drei Isolate aus den Erythromycin-Applikationsphasen waren atoxinogen und gehörten
zum Ribotyp B (Tabelle 27).
4.1.1.9 Untersuchung auf Cl. difficile-Toxin A und B (ELISA und Zytotoxizität)
In den Wasserextrakten der Proben vom 2. und 3. Tag post operationem, in denen toxinogene
Cl. difficile nachgewiesen wurden, konnte im Zytotoxizitätstest die für Cl. difficile-Toxine
typische, nach einer längeren Latenzzeit auftretende Abrundung der Zellen beobachtet werden
(Abbildung 5). Das Caecumpunktat der Laparotomie zeigte keine zytotoxische Wirkung.
Die Toxine A und B von Cl. difficile konnten mit dem ELISA nach der Euthanasie nicht im
Chymus des Caecum und Colon ascendens nachgewiesen werden. Bei diesen Proben kam es
allerdings im Zytotoxizitätstest zu einer schnellen Lyse der Zellen, die nicht auf die
Cl. difficile-Toxine zurückgeführt werden konnte. Die Ursache für diese Zytotoxizität ist
unbekannt.
4.1.1.10 Ergebnis der Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate mit der MP-PCR
und der 16S rDNA-Ribotypisierung
Von den 31 Proben des Pferdes „Ede“ konnten aus vier (13 %) β2-toxinogene
Cl. perfringens-Stämme isoliert werden. Zwei dieser vier Proben mit den Isolaten s117 und
s132 stammen aus der postoperativen Phase und zwei (s2001 und s183) aus der ersten
Erythromycin-Applikationsphase. Insgesamt wurden 23 Cl. perfringens-Isolate aus dem nach
der Euthanasie gewonnenen Ileum-, Caecum- und Colon ascendens-Inhalt mit der MP-PCR
untersucht. Alle 23 Isolate waren negativ für das β2-Toxingen cpb2. Enterotoxinogene
Cl. perfringens-Stämme konnten bei dem Pferd „Ede“ in keiner Probe nachgewiesen werden.
Abbildung 1 zeigt das Ergebnis der MP-PCR-Genotypisierung einer Auswahl von
Cl. perfringens-Isolaten des Versuchspferdes „Ede“ (A) und des Fingerprints dieser Stämme
in der 16S rDNA-Ribotypisierung (B). Die Cl. perfringens-Isolate von Pferd „Ede“ waren wie
auch die der anderen Pferde heterogen. Mit der 16S rDNA-Ribotypisierung konnten die
Cl. perfringens-Isolate des Pferdes „Ede“ in fünf verschiedene Ribotypen (A bis E) unterteilt
werden. Der Ribotyp D konnte zum ersten Mal am 2. Tag post operationem isoliert werden

Ergebnisse 97
(s117). Er trat am 3. Tag post operationem (s132) und am 3. Tag der ersten Erythromycin-
Behandlung (s160) wieder auf. Im Gegensatz zu s117 und s132 ergab die MP-PCR von s160
einen β2-Toxingen-negativen Genotyp (nicht gezeigt). Am 3. Tag der ersten Erythromycin-
Behandlung wurde weiterhin der Ribotyp E isoliert, der im weiteren Verlauf während der
Erythromycin-Applikation bei diesem Pferd wiederholt nachgewiesen werden konnte (s2001,
s183, s342, s348). Von den verschiedenen Isolaten des Ribotyps E waren nur s2001 und s183
β2-toxinogen (Abbildung 1).

Ergebnisse 98
Abbildung 1: Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate von Pferd „Ede“
A: Multiplex-PCR: 1. 100 bp Leiter; 2.–4. Kontrollen: 2. E482-97 (β2-toxinogener
Cl. perfringens Typ A-Stamm); 3. Mischkultur aus verschiedenen Cl. perfringens-
Referenzstämmen mit allen 6 Toxingenen; 4. Cl. difficile DSM1296 (Negativkontrolle); 5. bis
14. Cl. perfringens-Isolate von Pferd „Ede“: 5. bis 7.: Isolate aus Ruhephasen (5. s1; 6. s7;
7. s64); 8. Isolat aus dem Caecumpunktat der Laparotomie (s107); 9. Isolat vom 1. Tag post
operationem (s110); 10. Isolat vom 2. Tag post operationem (s117); 11. Isolat vom 3. Tag
post operationem (s132); 12. und 13. Isolate aus der 1. Erythromycin-Applikationsphase
(12. s2001, 13. s183); 14. Isolat aus dem Caecuminhalt (s342)
B: 16S rDNA-Ribotypisierung: 1. s1; 2. s7; 3. s64; 4. s107; 5. s110; 6. s117; 7. s132;
8. s2001; 9. s160 (Isolat aus der 1. Erythromycin-Applikationsphase); 10. s183; 11. s342;
12. s348 (Isolat aus dem Colon ascendens-Inhalt); 13. E482-97

Ergebnisse 99
Anmerkung zur Abbildung 1:
Wie unter 3.11.3 näher erläutert, wurde eine Multiplex-PCR (MP-PCR) etabliert, die eine
Typisierung und Subtypisierung von Cl. perfringens-Isolaten ermöglicht. Die Ergebnisse der
Genotypisierung von zahlreichen Referenzstämmen mit dieser MP-PCR und des
Restriktionsverdaus der Amplifikate entsprach immer den Erwartungen. Die Bestimmung des
Genotyps aller in dieser Arbeit untersuchten Cl. perfringens-Isolate erfolgte mit dieser MP-
PCR. Sie ermöglichte die Einteilung in die Toxintypen A–E anhand der Amplifikate der
Gene, die für die Majortoxine kodieren: cpa, cpb, etxD und iap (Tabelle 14). Die untersuchten
Cl. perfringens-Stämme vom Pferd konnten alle eindeutig dem Genotyp von Typ A-Stämmen
zugeordnet werden. Diese Stämme besaßen von den Majortoxingenen ausschließlich cpa
(Nachweis durch das 900 bp große Amplikon). Weiterhin umfasst die MP-PCR die
Untersuchung auf das β2-Toxingen cpb2 und das Enterotoxingen cpe. β2-toxinogene
Cl. perfringens-Stämme konnten durch den Nachweis des 200 bp großen Amplifikationsproduktes
von cpb2 bestimmt werden.
4.1.2 Versuchspferd „Agu“
1.1.1.1 Klinischer Verlauf bis zur Operation einschließlich der Nahrungskarenzen
In den ersten zwei Wochen nach der Einstallung zeigte der Wallach „Agu“ keine klinischen
oder hämatologischen Auffälligkeiten. Am 1. Tag nach der 36 h Nahrungskarenz setzte das
Pferd „Agu“ wiederholt breiigen Kot ab. Das Allgemeinbefinden war ungestört. In der Zeit
vom 9.11. bis zum 15.11.00, d. h. während und nach der 72 h Nahrungskarenz, konnten zum
ersten Mal spontaner Husten, eine geringgradige Leukozytose (10,7 x 10 9 Leukozyten/l), eine
geringgradige Anämie (29 % Htk., 5,28 x 10 12 Erythrozyten/l) und eine Hyperproteinämie
(87,6 g/l) registriert werden. Insbesondere die Leukozytose und die Anämie könnten mit der
Endoparasitose in Verbindung stehen, die bei diesem Pferd später diagnostiziert wurde
(4.1.2.6). Die Leukozytose trat mit Werten zwischen 10 x 10 9 und 13 x 10 9 Leukozyten/l bis
zum Ende der Versuchsreihe wiederholt auf. Die Kotbeschaffenheit war während und nach
der 72 h Nahrungskarenz immer geformt.

Ergebnisse 100
1.1.1.2 Parasitologische Untersuchung
Am 17.10.00 war die parasitologische Untersuchung des Kotes dieses Pferdes ohne
besonderen Befund.
1.1.1.3 Operationsbefund
Die Exploration der Bauchhöhle erbrachte keine pathologischen Befunde. Das Caecum war
mit ca. 7 l flüssigem, hellbräunlich-grünlichem Inhalt mit wenigen faserigen Bestandteilen
und einem pH-Wert von 7,5 gefüllt (Abbildung 4). Die Darmwand war in allen dargestellten
Abschnitten ohne besonderen Befund.
1.1.1.4 Postoperativer Verlauf
Am 1. Tag post operationem kam es zu einem Rezidiv der Leukozytose mit
12,7 x 10 9 Leukozyten/l und am 3. Tag post operationem zu einem Rezidiv der geringgradigen
Anämie mit 5,61 x 10 12 Erythrozyten/l und einem Hämatokrit von 28 %. Die klinische
Allgemeinuntersuchung und die anderen hämatologischen Parameter des Blutstatus zeigten
keine pathologischen Veränderungen in der Woche nach der Operation auf.
1.1.1.5 Klinischer Verlauf in den Erythromycin-Applikationsphasen
In den ersten beiden Phasen der Erythromycin-Applikation lag bei dem Pferd „Agu“ zu
keinem Zeitpunkt eine Störung des Allgemeinbefindens oder eine Diarrhoe vor. Die
Leukozytenkonzentration im Blut lag zwischen 9 x 10 12 und 12 x 10 12 Erythrozyten/l. Die
72 h Nahrungskarenz vor dem Beginn der dritten Erythromycin-Applikation am 28.1.01
verlief komplikationslos. Der Wallach „Agu“ fiel zum ersten Mal am 29.1.01 morgens durch
ungeformten Kot auf. Das Allgemeinbefinden war bis ca. 16.00 Uhr noch ungestört,
verschlechterte sich dann aber in der Nacht vom 29.1. auf den 30.1.01 rapide. Schließlich
zeigte das Pferd am Morgen des 30.1. ein hochgradig gestörtes Allgemeinbefinden mit
Koliksymptomatik, wässrigem Kotabsatz im Strahl, Leukopenie (4 x 10 9 Leukozyten/l) und
einer hochgradigen Hämokonzentration (74 %). Aufgrund dieser Symptome wurde das Pferd
am 30.1. um 7.00 Uhr euthanasiert.

Ergebnisse 101
1.1.1.6 Sektionsbefund
Der Inhalt des Dickdarmes war wässrig und stinkend. Im Caecum und im gesamten Colon
ascendens lag auf der Schleimhaut ein Fibrinbelag (Abbildung 10 und Abbildung 11). Die
Darmwand war im gesamten Dickdarm geringgradig ödematisiert. Im Colon ascendens lagen
multifokale petechiale Blutungen und Schleimhautulzerationen vor. Histologisch konnten vor
allem im Caecum und im Bereich der Flexura pelvis Nekrosen des oberflächlichen
Schleimhautepithels, Auflagerungen von Fibrin und eines Bakterienrasens sowie eine mittelbis
hochgradige Infiltration der Lamina propria und Tela submucosa mit eosinophilen
Granulozyten nachgewiesen werden. Die Tunica muscularis mucosae war multifokal
durchbrochen und herdförmig mit Lymphozyten und Makrophagen infiltriert. Im
Dickdarminhalt waren mittelgradig Eier von Magen-Darm-Strongyliden, in der Pars
proventricularis Gasterophiluslarven, an der vorderen Gekrösewurzel eine Endarteritis
verminosa tromboticans mit zahlreichen Larven von Strongylus vulgaris und in der Leber
verkalkte Parasitengranulome nachweisbar.
1.1.1.6.1 Diagnosen
• fibrinös-nekrotisierende Typhlocolitis
• mittel- bis hochgradige Endoparasitose
1.1.1.7 Ergebnisse der bakteriologischen Diagnostik
Salmonellen waren bei dem Pferd „Agu“ bei keiner Untersuchung festzustellen. In
elf (33,3 %) von 33 Proben konnte Cl. perfringens und in vier (12 %) Cl. difficile
nachgewiesen werden (Tabelle 19). Alle Cl. difficile-Isolate von Versuchspferd „Agu“
stammten aus Proben der Erythromycin-Applikationsphasen. Die Anzahl und der genaue
Zeitpunkt der Probenentnahmen sowie die eingesetzten Medikamente werden in der Tabelle 8
bzw. in der Tabelle 11 aufgeführt.

Ergebnisse 102
Tabelle 19: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Agu“
Zeitraum Behandlung
13.10. bis
28.10.00
29.10. bis
26.11.00
26.11.00
Hospitalisierung
ohne Behandlung
36 h (29.10. bis
30.10.) und 72 h
(7.11. bis 10.11.)
Nahrungskarenz
24 h präoperative
Nahrungskarenz
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
– – – –
–
+
(31.10. und
10.11.)
– –
27.11.00 Laparotomie – + – –
28.11.00
30.11.00
1.12.00
2.12. bis
9.12.00
10.12. bis
14.12.00
15.12.00 bis
13.1.01
14.1.01 bis
18.1.01
19.1.01 bis
24.1.01
1. Tag post
operationem
3. Tag post
operationem
4. Tag post
operationem
– – – –
– – – –
+ – –
Ruhephase – – – –
Erythromycin –
+
(6 x 10 3
KBE/g Kot
am 12.12.00)
+
(am 14.12.)
+
(am 12.12.)
Ruhephase – – – –
Erythromycin – – – +
Ruhephase – – – –

Ergebnisse 103
Zeitraum Behandlung
25.1.01 bis
28.1.01
28.1.01 bis
29.1.01
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
72 h Nahrungskarenz – – – –
30.01.01 Euthanasie
Erythromycin – – – –
+
(nur im
Caecum,
Ileum)
Anmerkungen zur Tabelle 19: s. Tabelle 18
+
(nur im
Colon
ascendens)
–
(Caecum,
Ileum, Kot,
Colon
ascendens)
–
(Caecum,
Colon
ascendens,
Ileum, Kot)
1.1.1.8 Ergebnis der Geno- und Ribotypisierung der Cl. difficile-Isolate mit der PCR
Der in der ersten Erythromycin-Applikationsphase isolierte Cl. difficile-Stamm s189 von
Versuchspferd „Agu“ war in der PCR positiv für die Toxingene tcdA und tcdB und gehörte
wie die toxinogenen Cl. difficile-Isolate des Versuchspferdes „Ede“ zum Ribotyp A. Die
anderen beiden Cl. difficile-Isolate des Pferdes „Agu“ gehörten zu dem atoxinogenen
Ribotyp B, der auch bei den anderen drei Versuchspferden während der Erythromycin-
Behandlung nachgewiesen wurde (Tabelle 27).
1.1.1.9 Untersuchung auf Cl. difficile-Toxin A und B (ELISA und Zytotoxizität)
Im Chymus des Caecum, Colon ascendens und Ileum vom 30.1.01 sowie in den beiden
Kotproben vom Tag vor der Sektion konnten Cl. difficile-Toxin A und B mit dem ELISA
nicht nachgewiesen werden. Das Filtrat der Chymusproben des Caecum und des Colon
ascendens führten wie die entsprechenden Proben von Pferd „Ede“ im Zytotoxizitätstest zu
einer Lyse der Zellen innerhalb von 1 h. Eine Aussage über das Vorkommen von Cl. difficile-
Toxinen in diesen Proben konnte mit dem Zytotoxizitätstest aufgrund dieser Lyse nicht
getroffen werden. Die Toxine von Cl. difficile würden im Zytotoxizitätstest nach einer ca. 2 h

Ergebnisse 104
langen Latenzzeit eine Abrundung der Zellen hervorrufen (2.2.4). Das Filtrat des
Caecumpunktates aus der Laparotomie sowie die Wasserextrakte aus den beiden Proben der
Erythromycin-Applikationsphasen vom 12.12.00 und vom 16.1.01 zeigten keine zytotoxische
Wirkung im Zytotoxizitätstest.
1.1.1.10 Ergebnis der Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate mit der MP-PCR
und der 16S rDNA-Ribotypisierung
In drei (9 %) der 33 Proben des Versuchspferds „Agu“ konnten β2-toxinogene
Cl. perfringens-Typ A-Stämme nachgewiesen werden. Das erste β2-toxinogene Isolat (s158)
von Pferd „Agu“ stammte aus der Probe vom 4. Tag post operationem. In keiner weiteren
Probe dieses oder eines der anderen drei Versuchspferde konnte ein Cl. perfringens-Stamm
mit dem gleichen 16S rDNA-Ribotypisierungsmuster (Ribotyp I) wie s158 identifiziert
werden. Der Ribotyp J trat bei „Agu“ wiederholt im Zusammenhang mit der Erythromycin-
Applikation auf (Tabelle 20). Beide Isolate mit diesem 16S rDNA-Fingerprint (s172 und
s207) waren negativ für cpb2. Aus den Chymusproben der Sektion konnten sowohl β2-
toxinogene (z. B. s433) als auch β2-Toxingen-negative Isolate gewonnen werden. Der 16S
rDNA-Fingerprint von s433 (Ribotyp K) trat nur bei diesem Isolat auf.

Ergebnisse 105
Tabelle 20: Merkmale der ribotypisierten Cl. perfringens-Isolate von Versuchspferd
„Agu“
Versuchspferd
„Agu“
Behandlung Isolat Probe
cpb2-
Genotyp Ribotyp
Erythromycin-
Empfindlichkeit
Anfütterungsphase
nach
s14 4. cpb2– F S
Nahrungskarenz s35 7. cpb2– G S
Caecumpunktat
nach
Nahrungskarenz
(Laparotomie)
1. Woche post
operationem
Erythromycin
Erythromycin nach
Nahrungskarenz
(Caecuminhalt)
s79 10. cpb2– H S
s158 15. cpb2+ I S
s172 16. cpb2– J R
s207 17. cpb2– J R
s433 31. cpb2+ K R
Anmerkungen zu Tabelle 22 (s. auch Abbildung 1):
Bei allen aufgeführten Cl. perfringens-Isolaten wurde auch das Gen cpa in der MP-PCR
nachgewiesen. Alle Cl. perfringens-Stämme von „Agu“ waren in der MP-PCR negativ für
cpe.
1.1.2 Versuchspferd „Resinale“
1.1.2.1 Klinisches Bild im Verlauf der 72 h Nahrungskarenz
Die Stute „Resinale“ war in den ersten beiden Wochen nach der Einstallung in die Klinik für
Pferde klinisch und labordiagnostisch unauffällig. In der Anfütterungsphase nach der 72 h
Nahrungskarenz kam es bei der Stute am 13.6.01 zweimal zu einer Schlundverstopfung, die
mit der Sonde nach der Applikation des Spasmolytikums Butylscopamin entfernt werden
konnte. Das Pferd wurde nicht antibiotisch behandelt. An den folgenden beiden Tagen war

Ergebnisse 106
das Allgemeinbefinden dieses Pferdes geringgradig gestört, und es trat eine Diarrhoe mit
breiigem Kot auf. Der Blutstatus war an beiden Tagen ohne besonderen Befund (Leukozytenkonzentration
zwischen 6 x 10 9 /l und 8 x 10 9 /l).
1.1.2.2 Klinischer Verlauf in den Gentamicin-Applikationsphasen
In der Phase der ersten Gentamicin-Applikation trat am 29.6.01 eine Periphlebitis acuta auf,
die lokal mit Heparinsalbe behandelt wurde und bereits am 1.7. ausgeheilt war. Ansonsten
war das Pferd „Resinale“ in der Zeit vom 16.6. bis zur Operation, einschließlich der Zeit der
Gentamicin-Applikation nach einer 72 h Nahrungskarenz, klinisch und hämatologisch ohne
besonderen Befund.
1.1.2.3 Parasitologische Untersuchung
Am 27.7.01 war die parasitologische Untersuchung des Kotes ohne besonderen Befund.
1.1.2.4 Operationsbefund und postoperative Phase
Das Caecum war mit ca. 8 l flüssigem, hellbraunem Inhalt mit einem pH-Wert von 8 gefüllt.
Die Operation lieferte keine Hinweise auf pathomorphologische Veränderungen und verlief
komplikationslos. Am 1. und 3. Tag post operationem war der Kot ungeformt. Hämatologisch
war in der postoperativen Phase nur die Leukozytose am 1. Tag post operationem auffällig
(13,3 x 10 9 Leukozyten/l).
1.1.2.5 Klinischer Verlauf in den Erythromycin-Applikationsphasen
In der ersten Erythromycin-Applikationsphase war das Allgemeinbefinden des Pferdes
„Resinale“ ungestört, der Kot geformt, und die Blutparameter lagen im physiologischen
Bereich. Im Gegensatz zu den Pferden „Ede“ und „Agu“ stellten sich bei diesem
Versuchspferd durch die Erythromycin-Applikation nach einer 72 h Nahrungskarenz keine
deutlichen klinischen oder labordiagnostischen Anzeichen einer Typhlocolitis ein. In den
ersten vier Tagen nach dieser Erythromycin-Applikation war das Allgemeinbefinden von
„Resinale“ ungestört. Der Kot war vorübergehend am 2. und 3. Tag der Erythromycin-

Ergebnisse 107
Applikation undeutlich geformt bis breiig. Am 6.9., dem 5. Tag der Erythromycin-
Applikation, fiel die Stute mit 39,2 °C Fieber auf. Trotz der klinischen Remission in den
folgenden Tagen wurde das Versuchspferd „Resinale“ aufgrund der diagnostizierten
Salmonellose am 12.9. euthanasiert.
1.1.2.6 Sektionsbefunde
Das Caecum und das Colon ascendens waren mit dickbreiigem, teils pastösem Inhalt gefüllt
und zeigten keine makroskopisch erkennbaren pathologischen Befunde. Bis auf eine
mittelgradige lymphoplasmazelluläre Infiltration der Lamina propria mit zahlreichen
eosinophilen Granulozyten und einer Aktivierung submuköser Lymphfollikel lagen auch
histologisch keine weiteren Alterationen vor. Der Dünndarm war makroskopisch ohne
besonderen Befund. Im Ileum lagen histologisch Anzeichen einer geringgradigen Entzündung
vor (multifokal geringgradige Infiltration mit Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen).
1.1.2.6.1 Diagnose
• Salmonellose
1.1.2.7 Ergebnisse der kulturellen bakteriologischen Diagnostik
Salmonella Typhimurium konnte bei dem Pferd „Resinale“ zum ersten Mal am 5.9. und in
Folge am 6.9., 10.9. sowie im Ileum- und Caecuminhalt am 12.9.01 nachgewiesen werden.
Dieser Erreger wurde bei einem Fohlen in der benachbarten Box bereits am 30.8.01 isoliert.
In 28 (55 %) von 51 Proben konnte Cl. perfringens und in 7 (14%) Cl. difficile, wie in der
Tabelle 21 genauer aufgeschlüsselt, nachgewiesen werden. Die Anzahl und der genaue
Zeitpunkt der Probenentnahmen sowie die Dosierung der Medikamente werden in der Tabelle
9 bzw. in der Tabelle 11 aufgeführt. Mit 3,2 x 10 5 und 1 x 10 4 KBE von Cl. perfringens/g Kot
am 14.6. bzw. 15.6.01 liegen diese Keimzahlen über den Werten aller anderen Proben.

Ergebnisse 108
Tabelle 21: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Resinale“
Zeitraum Behandlung
25.5.01 bis
9.6.01
10.6.01 bis
13.6.01
13.6. bis
15.6.01
16.6. bis
24.6.01
25.6. bis
30.6.01
1.7. bis
7.7.01
8.7.01 bis
11.7.01
11.7. bis
15.7.01
16.7. bis
22.7.00
23.7. bis
25.7.01
26.7. bis
4.8.01
Hospitalisierung, keine
Behandlung außer
Entwurmung am 6.6.
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
–
+
(nur 8.6.)
– –
72 h Nahrungskarenz – – – –
Anfütterungsphase nach
Nahrungskarenz
+
(bis zu insg.
3,2 x 10 5
KBE/g Kot)
+
(bis zu insg.
3,2 x 10 5
KBE/g Kot)
– –
Ruhephase – + – –
Gentamicin – + – –
Ruhephase – + – –
72 h Nahrungskarenz
Gentamicin nach
Nahrungskarenz
+
(nur 9.7.)
–
+ – –
+
(bis zu insg.
1 x 10 4
KBE/g Kot)
Ruhephase – –
Futterumstellung – –
Ruhephase
+
(nur 26.7.)
–
+
(nur 13.7.)
+
(nur 16.7.)
+
(nur 25.7.)
+
(nur 26.7.)
–
–
–

Ergebnisse 109
Zeitraum Behandlung
5.08. bis
6.8.01
24 h präoperative
Nahrungskarenz
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
6.8.01 Laparotomie – – – –
7.8.01 1. Tag post operationem – – – –
8.8.01 2. Tag post operationem – + cpe– – –
9.8.01 3. Tag post operationem – + cpe+ – –
10.8.01 4. Tag post operationem – + cpe– – –
11.8. bis
18.8.01
19.8. bis
23.8.01
24.8. bis
29.8.01
30.8. bis
2.9.01
2.9. bis
6.9.01
7.9. bis
11.9.01
Ruhephase – + cpe– – –
Erythromycin
+ cpe–
(insg.
1,4 x 10 3
KBE/g Kot
am 21.8.)
+ cpe–
(insg.
1,4 x 10 3
KBE/g Kot
am 21.8.)
–
+
(nur 21.8.)
Ruhephase – – – –
72 h Nahrungskarenz – + – –
Erythromycin nach
Nahrungskarenz
Sulfonamid u.
Trimethoprim
12.9.01 Euthanasie
– + –
+
(nur 4.9.)
– – – –
–
(Caecum,
Colon
ascendens,
Ileum, Kot)
+
(Caecum,
Ileum,
Colon
ascendens)
+
(nur im
Colon
ascendens)
–
(Caecum,
Ileum, Kot,
Colon
ascendens)

Ergebnisse 110
Anmerkung zu Tabelle 21: s. Tabelle 18
1.1.2.8 Ergebnis der Genotypisierung der Cl. difficile-Isolate mit der PCR
Die Abbildung 2 zeigt das Ergebnis der PCR-Untersuchung der Cl. difficile-Isolate des
Versuchspferdes „Resinale“. Toxinogene Cl. difficile-Stämme konnten bei diesem Pferd zum
ersten Mal in der Phase der Gentamicin-Applikation nach 72 h Nahrungskarenz festgestellt
werden. Im Gegensatz zu den zuvor isolierten Cl. difficile-Stämmen waren die Isolate aus
dem Zeitraum der Erythromycin-Applikation atoxinogen und Erythromycin-resistent (Tabelle
27). Der aus dem Colon ascendens-Inhalt nach der Sektion gewonnene Stamm s1031 gehört
zu den einzigen zwei Cl. difficile-Isolaten von allen vier Pferden, bei denen sowohl
Erythtomycin-Resistenz als auch Toxigenizität festgestellt wurden. Ferner war s1031 das
einzige toxinogene Metronidazol-resistente Cl. difficile-Isolat der vier Versuchspferde.
Bei dem Versuchspferd „Resinale“ konnten insgesamt vier verschiedene toxinogene
Cl. difficile-Ribotypen differenziert werden, die alle nur bei diesem Pferd nachgewiesen
wurden (Tabelle 27). Nur der 16S rDNA-Fingerprint der atoxinogenen Cl. difficile-Isolate des
Pferdes „Resinale“ war identisch mit dem der anderen atoxinogenen Stämme (Ribotyp B).

Ergebnisse 111
Abbildung 2: PCR der Toxingene tcdA (A) und tcdB (B) sowie des Erythromycin-
Resistenzgens erm (C) von Cl. difficile-Isolaten von Pferd „Resinale“:
1. 100 bp-Leiter; 2. und 3. Isolate aus der Phase der Gentamicin-Applikation nach 72 h
Nahrungskarenz (2. s707; 3. s694), 4. und 5. Isolate aus der Futterumstellungsphase (4. s739;
5. s745); 6. Isolat aus der Erythromycin-Applikationsphase (s946); 7. Isolat aus der
Erythromycin-Applikation nach der 72 h Nahrungskarenz (s997); 8. Isolat aus dem nach der
Euthanasie gewonnenen Chymus des Colon ascendens (s1031); 9. Cl. perfringens NCTC
8798 (Negativkontrolle); 10. Cl. difficile DSM 1296 (toxinogener Referenzstamm)
Anmerkung zur Abbildung 2: Das tcdA-Amplifikat in der Abbildung wurde mit dem
Primerpaar NK2 und NK3 generiert (nichtrepetitiver Teil von tcdA). Alle in dieser Arbeit
untersuchten toxinogenen Cl. difficile-Isolate waren positiv in beiden durchgeführten PCRs
für tcdA (repetitiver und nichtrepetitiver Teil), demnach waren verkürzte Formen von tcdA
nicht nachweisbar.

Ergebnisse 112
1.1.2.9 Untersuchung auf Cl. difficile-Toxin A und B (ELISA und Zytotoxizität)
Das Filtrat des nach der Sektion entnommenen Chymus des Colon ascendens von Pferd
„Resinale“ zeigte im Zytotoxizitätstest teilweise eine für die Cl. difficile Toxine A und B
typische Abrundung der Zellen. In dieser Probe konnte der toxinogene Cl. difficile-Stamm
s1031 nachgewiesen werden. Das während der Operation gewonnene Caecumpunktat sowie
der Wasserextrakt der Probe vom 21.8.01 (3. Tag der Erythromycin-Applikation) waren nicht
zytotoxisch.
1.1.2.10 Ergebnis der Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate mit der MP-PCR
und der 16S rDNA-Ribotypisierung
In sieben (14 %) der 51 Proben des Pferdes „Resinale“ konnten β2-toxinogene Cl. perfringens
Typ A-Stämme nachgewiesen werden (Tabelle 21). Der einzige enterotoxinogene Typ A-
Stamm, s820, stammte aus der Probe vom 3. Tag post operationem. Die 16S rDNA-
Ribotypisierung von 20 ausgewählten Isolaten dieses Pferdes war mit 14 verschiedenen
Typen sehr heterogen (Tabelle 22). Nur in der zweiten Hälfte der Experimente, vor allem im
Zusammenhang mit der Laparotomie und der Erythromycin-Behandlung, konnten
Cl. perfringens-Isolate einem Ribotyp zugeordnet werden, der bereits bei den Pferden „Ede“
und „Agu“ feststellbar war. Das β2-Toxingen-negative Cl. perfringens-Isolat s812 vom 2. Tag
post operationem (Tabelle 22) zeigte beispielsweise das gleiche Bandenmuster wie die β2-
toxinogenen Cl. perfringens-Isolate s117 und s132 von Pferd „Ede“ aus der 1. Woche post
operationem (Ribotyp D, Abbildung 1). Nur in der postoperativen Phase und im
Zusammenhang mit der Erythromycin-Applikation konnte bei dem Pferd „Resinale“ auch
wiederholt der gleiche Cl. perfringens-Ribotyp aus unterschiedlichen Proben isoliert werden,
z. B. der Ribotyp G mit den β2-toxinogenen und Erythromycin-resistenten Cl. perfringens-
Isolaten s872 und s888 während der Erythromycin-Applikation (Tabelle 22).

Ergebnisse 113
Tabelle 22: Merkmale der ribotypisierten Cl. perfringens-Isolate von Versuchspferd
„Resinale“
Versuchspferd
„Resinale“
Behandlung Isolat Probe
Genotyp
(cpb2 und cpe)
Ribotyp Erythromycin-
Empfindlichkeit
Ruhephase s490 3. cpb2–, cpe– L S
Anfütterungsphase
nach
s523 6. cpb2+, cpe– M S
Nahrungskarenz s548 7. cpb2+, cpe– N S
Ruhephase s564 8. cpb2–, cpe– O S
Gentamicin
s590 10. cpb2–, cpe– P S
s604 13. cpb2+, cpe– Q S
Ruhephase s616 14. cpb2–, cpe– R S
Gentamicin nach
Nahrungskarenz
s656 19. cpb2–, cpe– S S
s673 20. cpb2–, cpe– T (= S?) S
Futterumstellung s744 25. cpb2+, cpe– G S
1. Woche post
operationem
Erythromycin
s812 30. cpb2–, cpe– D S
s820 31. cpb2–, cpe+ B S
s828 32. cpb2–, cpe– B S
s872 35. cpb2+, cpe– G R
s877 35. cpb2 –, cpe– D n. u.
s888 36. cpb2+, cpe– G R
s931 37. cpb2–, cpe– D R
Nahrungskarenz s969 41. cpb2–, cpe– U S
Erythromycin nach
Nahrungskarenz
Euthanasie
(Caecuminhalt)
s994 44. cpb2–, cpe– V R
s1024 48. cpb2–, cpe– W S

Ergebnisse 114
Anmerkungen zu Tabelle 22:
Bei allen aufgeführten Cl. perfringens-Isolaten wurde auch das Gen cpa in der MP-PCR
nachgewiesen.
1.1.3 Versuchspferd „Speranza“
1.1.3.1 Klinischer Verlauf bis zur Operation
Bei der Stute „Speranza“ verliefen die 72 h Nahrungskarenz, die Gentamicin-Behandlung
sowie die Kombination dieser beiden Faktoren komplikationslos. Das Allgemeinbefinden war
immer ungestört. Die Untersuchungen des Blutstatus sowie der Harnstoff- und
Kreatininkonzentration im Serum ergaben keinen besonderen Befund.
1.1.3.2 Parasitologische Untersuchung
Am 27.7.01 war die parasitologische Untersuchung des Kotes dieses Pferdes ohne besonderen
Befund.
1.1.3.3 Operationsbefund und postoperative Phase
Das Caecum war mit ca. 7 l flüssigem, hellbraunem Inhalt mit einem pH-Wert von 7,5 gefüllt.
Die Exploration des Abdomens lieferte keine Hinweise auf pathologische Veränderungen.
Während des 1. bis 3. Tags post operationem war das Allgemeinbefinden von „Speranza“
ungestört. Die Werte der Blutparameter einschließlich Harnstoff (4,3 mmol/l) und Kreatinin
(132 µmol/l) lagen am 1. Tag post operationem und am 5. Tag post operationem (12.8.01)
innerhalb der physiologischen Grenzwerte. Am 4. Tag post operationem fiel das
Versuchspferd „Speranza“ durch ein mittelgradig gestörtes Allgemeinbefinden mit einem Puls
von 52/min, einer Körperinnentemperatur von 39,5 °C und Anorexie auf. Aufgrund dieser
Veränderung des klinischen Bildes wurde das Antibiotikum Gentamicin abgesetzt und die
Stute mit Cefquinom und Flunixin Meglumin weiterbehandelt. Das Allgemeinbefinden
verbesserte sich unter dieser Therapie. Es kam aber aufgrund der fortbestehenden reduzierten
Nahrungsaufnahme zu einer Verschlechterung des Ernährungszustandes.

Ergebnisse 115
1.1.3.4 Klinischer Verlauf in der Erythromycin-Applikationsphase
Am 2. Tag der Erythromycin-Behandlung (20.8.) wurden bei der Stute „Speranza“ zum ersten
Mal Anzeichen einer Harnwegsproblematik in Form von Strangurie, Polydipsie und Polyurie
beobachtet. Aufgrund des sich rapide verschlechternden Allgemeinbefindens und der
hochgradigen Urämie (22.8.: 54,6 mmol Harnstoff/l und 1044 µmol Kreatinin/l) wurde die
Stute „Speranza“ am 23.8. euthanasiert.
1.1.3.5 Sektionsbefunde
Die Schleimhaut des Caecum und Colon ascendens war geringgradig hyperämisch, ansonsten
war der gesamte Dünn- und Dickdarm makroskopisch ohne besonderen Befund. Die Nieren
dieses Pferdes zeigten folgende pathomorphologischen Veränderungen: hochgradige,
bilaterale Papillenspitzennekrose mit schwarz-grünlicher Verfärbung, chronische interstitielle
Nephritis, akute, eitrige Herdnephritis und eine akute Tubulusepithelschädigung.
1.1.3.5.1 Diagnose
• Nephropathie (1.1.3.5)
1.1.3.6 Ergebnisse der kulturellen bakteriologischen Diagnostik
In zwölf (29 %) von 41 Proben des Versuchspferds „Speranza“ konnte Cl. perfringens und in
drei (7 %) Cl. difficile kulturell nachgewiesen werden (Tabelle 23). Wie bei der Stute
„Resinale“ kam es in der Anfütterungsphase nach der 72 h Nahrungskarenz zum Auftreten
von β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen mit einem Keimgehalt von >10 3 KBE/g Kot.
Cl. difficile konnte bei diesem Pferd am Ende der Cefquinom-Therapie aus dem Kot und aus
dem Caecum- und Colon ascendens-Inhalt isoliert werden.
Salmonellen waren bei diesem Versuchspferd bei keiner Untersuchung festzustellen.
In den Sektionsproben der Niere und Harnblase lag ein hochgradiger Keimgehalt von
Escherichia (E.) coli vor. Die isolierten E. coli waren resistent gegenüber Erythromycin,
Gentamicin und Cefquinom.

Ergebnisse 116
Tabelle 23: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Speranza“
Zeitraum Behandlung
25.5.01 bis
9.6.01
10.6.01 bis
13.6.01
13.6. bis
15.6.01
16.6. bis
24.6.01
25.6. bis
30.6.01
1.7. bis
7.7.01
8.7.01 bis
11.7.01
11.7. bis
15.7.01
16.7. bis
22.7.00
23.7. bis
25.7.01
26.7. bis
5.8.01
Hospitalisierung,
keine Behandlung
außer Entwurmung
am 6.6.01
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
– – – –
72 h Nahrungskarenz – – – –
Anfütterungsphase
nach Nahrungskarenz
+
(bis zu insg.
2,9 x 10 3 KBE/g
Kot)
– – –
Ruhephase – – – –
Gentamicin – + – –
Ruhephase – + – –
72 h Nahrungskarenz – – – –
Gentamicin nach
Nahrungskarenz
Ruhephase –
+ auch cpe + – – –
+
(nur 16.7.)
– –
Futterumstellung – – – –
Ruhephase – – – –

Ergebnisse 117
Zeitraum Behandlung
6.08. bis
7.8.01
24 h präoperative
Nahrungskarenz
Kultureller Nachweis von
Cl. perfringens Cl. difficile
cpb2+ cpb2– tcdA+, tcdB+ tcdA–, tcdB–
7.8.01 Laparotomie – – – –
8.08. bis
11.8.01
12.8. bis
15.8.01
16.8. bis
18.8.01
19.8. bis
22.8.01
1.–4. Tag post
operationem
Cefquinom und
Flunixin Meglumin
Ruhephase
23.8.01 Euthanasie
Erythromycin +
Anmerkung zu Tabelle 23: s. Tabelle 18
–
+
(nur 9.8.)
– – –
–
(Caecum, Colon
ascendens,
Ileum, Kot)
+
(1 x 10 2
KBE/g Kot)
+
(nur Colon
ascendens)
– –
+
(nur 15.8.)
– –
–
+
(Caecum,
Colon
ascendens)
1.1.3.7 Ergebnis der Geno- und Ribotypisierung der Cl. difficile-Isolate mit der PCR
Die Typisierung von Cl. difficile ergab bei allen drei Isolaten (s856, s937, s938) des Pferdes
„Speranza“ einen atoxinogenen Genotyp und, wie bei den atoxinogen Isolaten der anderen
drei Pferde, Zugehörigkeit zum Ribotyp B (Tabelle 27).
1.1.3.8 Untersuchung auf Cl. difficile-Toxin A und B (ELISA und Zytotoxizität)
Das Caecumpunktat der Operation, der Wasserextrakt der Probe vom 21.8.01 (dem 3. Tag der
Erythromycin-Applikation) und die Filtrate des Chymus des Caecum sowie des Colon

Ergebnisse 118
ascendens wurden im Zytotoxizitätstest untersucht. Alle genannten Proben hatten keine
zytotoxische Wirkung.
1.1.3.9 Ergebnis der Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate mit der MP-PCR
und der 16S rDNA-Ribotypisierung
In vier (10 %) der 41 Proben dieses Pferdes wurden β2-toxinogene Cl. perfringens Typ A-
Stämme nachgewiesen. Das Cl. perfringens-Isolat s703, das aus der Probe des 4. Tags der
Gentamicin-Applikation nach der 72 h Nahrungskarenz stammte, war das einzige von allen
160 mit dieser MP-PCR typisierten equinen Cl. perfringens-Isolaten, dass sowohl
enterotoxinogen als auch β2-toxinogen war.
Unter den elf Cl. perfringens-Isolaten des Pferdes „Speranza“, die mit der 16S rDNA-
Ribotypisierung charakterisiert wurden, konnten sieben verschiedene Typen unterschieden
werden (Tabelle 24). In beiden Proben der Anfütterungsphase nach der 72 h Nahrungskarenz
konnte der Ribotyp M festgestellt werden, dem ausschließlich β2-toxinogene Isolate
zugeordnet wurden und der auch bei dem Pferd „Resinale“ in dieser experimentellen Phase
zum Nachweis kam (Tabelle 22).

Ergebnisse 119
Tabelle 24: Merkmale der ribotypisierten Cl. perfringens-Isolate von Versuchspferd
„Speranza“
Versuchspferd
„Speranza“
Behandlung Isolat Probe
Anfütterungsphase
nach
Nahrungskarenz
Genotyp
(cpb2 und cpe)
Ribotyp Erythromycin-
Empfindlichkeit
s535 6. cpb2+, cpe– M S
s552 7. cpb2+, cpe– M S
s558 7. cpb2+, cpe– X S
Gentamicin s614 12. cpb2–, cpe– R S
Gentamicin nach
Nahrungskarenz
1. Woche post
operationem
Erythromycin
(s940 aus dem
Colon ascendens-
Inhalt)
s703 20. cpb2+, cpe+ G S
s698 21. cpb2–, cpe– R S
s834 31. cpb2–, cpe– B S
s862 35. cpb2–, cpe– G R
s903 35. cpb2–, cpe– C R
s950 36. cpb2+, cpe– Y R
s940 40. cpb2–, cpe– B R
Anmerkungen zu Tabelle 24:
Bei allen aufgeführten Cl. perfringens-Isolaten wurde auch das Gen cpa in der MP-PCR
nachgewiesen.
1.1.4 Resistenzprüfung
Bei der Etablierung des Etest ® wurde für Cl. perfringens ATCC 13124 (NCTC 8237,
DSM 756) mit einem MF-Standard von 0,5 nach 24 h ein MHK-Wert von 0,8 µg/ml für
Metronidazol ermittelt, der in den Grenzbereich dieses Stammes nach E DIN 58940-83: 1999-
08 von 0,25 bis 1 µg/ml fällt (DIN 2000). Für MHK-Werte für Gentamicin und Erythromycin
von Cl. perfringens- sowie von Cl. difficile-Referenzstämmen lagen keine Grenzbereiche in

Ergebnisse 120
den DIN- und NCCLS-Richtlinien vor. Mit dem Referenzstamm Cl. difficile DSM 1296
konnte mit einem MF-Standard von 1 nach 24 h ein ausreichendes Wachstum mit einer
deutlichen Ellipsenbildung beobachtet werden, die das Ablesen des MHK-Wertes
ermöglichte.
Für 52 Cl. perfringens- und 18 Cl. difficile-Isolate der vier Versuchspferde wurde mit dem
Etest ® die MHK der Antibiotika Erythromycin, Gentamicin und Metronidazol bestimmt
(Tabelle 25).
Tabelle 25: Resistenzmuster der Cl. difficile- und Cl. perfringens-Isolate
Spezies Anzahl Antibiotikum
MHK-Bereich
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
Cl. difficile 18 0,5 – ≥ 256 ≥ 256 ≥ 256
Erythromycin
Cl. perfringens 52
1 – ≥ 256 2 ≥ 256
Cl. difficile 18 24 – ≥128 32 128
Gentamicin
Cl. perfringens 52
32 – ≥ 1024 256 ≥1024
Cl. difficile 18 0,064 – ≥ 256 0,094 16
Metronidazol
Cl. perfringens 51
0,19 – ≥ 256 0,5 0,75
Anmerkung zur Tabelle 25: Die Bewertungsstufen der MHK-Werte werden in Tabelle 12
aufgeführt.
Von 20 untersuchten Cl. perfringens-Isolaten aus den Proben der Erythromycin-
Applikationsphasen waren 18 Erythromycin-resistent (MHK ≥ 256 µg/ml). Alle 31
Cl. perfringens-Isolate, die aus anderen Abschnitten der Versuchsreihe stammten, waren
hingegen sensibel gegenüber Erythromycin (MHK ≤ 3 µg/ml). Die Erythromycin-Applikation
hat bei den Pferden „Ede“, „Agu“ und „Resinale“ auch zum Auftreten von Erythromycinresistenten
Cl. difficile-Stämmen im Probenmaterial geführt, die vorher bei keinem dieser
Tiere isoliert werden konnten. Nur aus einer vor dem Beginn der Erythromycin-Applikation
gewonnenen Probe von dem Pferd „Speranza“ konnte ein Erythromycin-resistenter
Cl. difficile-Stamm isoliert werden (s856).

Ergebnisse 121
Von den insgesamt sechs Erythromycin-sensitiven Cl. difficile-Stämmen waren alle
toxinogen, von den zwölf Erythromycin-resistenten jedoch zehn atoxinogen (Tabelle 27).
Diese atoxinogenen Erythromycin-resistenten Cl. difficile-Stämme konnten bei jedem der vier
Pferde während der oralen Applikation von 1,25 mg Erythromycin/kg KG alle 8 h isoliert
werden.
β2-toxinogene Cl. perfringens-Isolate zeigten das gleiche Resistenzmuster in Bezug auf alle
drei untersuchten Antibiotika wie β2-Toxingen-negative Stämme (Tabelle 26).
Alle untersuchten Cl. difficile- und Cl. perfringens-Isolate waren Gentamicin-resistent
(Tabelle 26). Der Median des MHK-Wertes von Gentamicin für die Cl. perfringens-Isolate
aus den Gentamicin-Applikationsphasen ist mit 256 µg/ml identisch mit dem der Isolate aus
den anderen Zeiträumen (für die Pferde „Resinale“ und „Speranza“). Für die beiden
Cl. difficile-Isolate aus der Gentamicin-Behandlung (s707 und s694) wurde ein MHK von
32 µg/ml für Gentamicin bestimmt, der dem MHK50 aller Isolate entspricht (Tabelle 25).
Von allen untersuchten Stämmen waren nur ein Cl. perfringens- (s448) und zwei Cl. difficile-
Isolate (s997 und s1031) resistent gegenüber Metronidazol (Tabelle 26).
Tabelle 26: Verbreitung von Antibiotikaresistenzen bei Cl. difficile- und
Cl. perfringens-Isolaten der vier Versuchspferde
Spezies Anzahl Erythromycinresistent
(%)
Gentamicinresistent
(%)
Metronidazolresistent
(%)
tcdA+ tcdB+ Cl. difficile 8 25 100 12,5
tcdA– tcdB– Cl. difficile 10 100 100 10
cpb2+ Cl. perfringens 16 37,5 100 0
cpb2– Cl. perfringens 36 33,3 100 2,9
1.1.5 Untersuchung der Cl. difficile-Isolate auf das Erythromycin-Resistenzgen erm
Um den Resistenzmechanismus der Cl. difficile-Isolate gegenüber Erythromycin aufzudecken,
wurden alle 18 Isolate mit der PCR auf das Gen erm hin untersucht. erm kodiert für eine
rRNA-Methyltransferase, deren Expression unter anderem zur Erythromycinresistenz führt
(2.4.3). Bei allen zwölf Cl. difficile-Isolaten mit einem Erythromycin-resistenten Phänotyp

Ergebnisse 122
(MHK ≥ 256 µg/ml) konnte das Gen erm nachgewiesen werden (Abbildung 2 C). Die anderen
sechs Erythromycin-sensiblen Cl. difficile-Isolate waren negativ für erm in der PCR.
1.1.6 Vergleichende Darstellung der Ergebnisse
1.1.6.1 Hospitalisierung
Deutliche klinische Auswirkungen der Hospitalisierung, d. h. der Einstallung in die Klinik für
Pferde ohne weitere Behandlungsmaßnahmen, konnten bei keinem der vier Versuchspferde
festgestellt werden. In den beiden Kotproben der ersten zwei Wochen erfolgte bei keinem der
vier Pferde ein Nachweis von Cl. difficile oder ß2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen.
1.1.6.2 Nahrungskarenz und Anfütterungsphase
Am 2. und 3. Tag der 72 h Nahrungskarenz konnten bei keinem der vier Pferde
Cl. perfringens oder Cl. difficile nachgewiesen werden. Auch in den während der Operation
nach einer 24 h Nahrungskarenz gewonnenen Caecumpunktaten von „Resinale“ und
„Speranza“ waren die beiden Clostridienarten nicht feststellbar (Tabelle 21 und Tabelle 23).
In den Caecumpunktaten der anderen beiden Pferde, traten ausschließlich ß2-Toxingennegative
Cl. perfringens-Stämme mit einem Keimgehalt von < 10 2 KBE/g Chymus auf
(Tabelle 18 und Tabelle 19).
Im Gegensatz zu den während der Nahrungskarenz erhobenen Befunden unterschieden sich
die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung der Anfütterungsphase nach der 72 h
Nahrungskarenz von denen der Ruhephasen. Die Abbildung 3 zeigt den Keimzahlanstieg von
Cl. perfringens in der Anfütterungsphase nach der 72 h Nahrungskarenz für die
Versuchspferde „Resinale“ und „Speranza“. Bei der Stute „Resinale“ trat im Zusammenhang
mit dem Anstieg der Keimzahl von Cl. perfringens eine Diarrhoe auf. Bei „Resinale“ und
„Speranza“ konnten am 2. und 3. Tag nach dem Ende der 72 h Nahrungskarenz zum ersten
Mal ß2-toxinogene Cl. perfringens-Isolate des Ribotyps M bzw. des sehr ähnlichen Ribotyps
N nachgewiesen werden (Tabelle 22 und Tabelle 24). Cl. difficile konnte weder während der
Nahrungskarenz noch in der Anfütterungsphase bei keinem der vier Pferde festgestellt
werden.

Ergebnisse 123
Das Pferd „Resinale“ entwickelte am Tag nach der Nahrungskarenz zwei
Schlundverstopfungen. Im Kombinationsexperiment der Gentamicin-Antibiose mit einer 72 h
Nahrungskarenz kam es bei diesem Pferd in der Anfütterungsphase ebenfalls zu einem
Anstieg von Cl. perfringens auf 1 x 10 4 KBE/g Kot, ohne dass eine Schlundverstopfung
auftrat.
Zu einem späteren Zeitpunkt wurde den beiden Pferden „Resinale“ und „Speranza“ die
gleiche Ration der Anfütterungsphase jedoch ohne eine vorausgegangene Nahrungskarenz
gefüttert (Futterumstellung). In diesem Kontrollexperiment waren Cl. perfringens nicht oder
nur ß2-Toxingen-negative Cl. perfringens-Stämme mit einem Keimgehalt < 10 2 KBE/g Kot
nachweisbar.
Abbildung 3: Keimzahl von Cl. perfringens im Verlauf der 72 h Nahrungskarenz bei
den Versuchspferden „Resinale“ und „Speranza“

Ergebnisse 124
1.1.6.3 Gentamicin
In den Proben der Gentamicin-Applikationsphase, bei der keine weitere
Behandlungsmaßnahme erfolgte, konnte Cl. difficile nicht und nur einmal ein β2-toxinogener
Cl. perfringens-Stamm nachgewiesen werden. Der Keimgehalt von Cl. perfringens war
immer geringgradig.
Die Applikation von Gentamicin in der Anfütterungsphase nach einer 72 h Nahrungskarenz
führte weder bei „Resinale“ noch bei „Speranza“ zu einer Diarrhoe oder zu einer Störung des
Allgemeinbefindens. Während dieser experimentellen Phase konnten bei dem Versuchspferd
„Resinale“ zum ersten Mal toxinogene Cl. difficile-Stämme und bei dem Versuchspferd
„Speranza“ ein entero- und β2-toxinogener Cl. perfringens-Stamm isoliert werden (Tabelle 21
und Tabelle 23).
1.1.6.4 Operation
Nach einer Ruhephase von mindestens einer Woche wurden die Pferde einer zweistündigen
Laparotomie mit Caecumpunktion unterzogen, der eine 24 h Nahrungskarenz vorausging. Die
postoperative Antibiose erfolgte über fünf Tage mit Cefquinom (1 mg/kg KG alle 24 h i.m.)
oder Gentamicin (4 mg/kg KG alle 12 h i.v.). Bei keinem der Pferde stellten sich als
Komplikation dieses Eingriffs deutliche klinische oder labordiagnostische Anzeichen einer
Typhlocolitis ein. Das Pferd „Ede“ fiel am 2. und 3. Tag post operationem durch Anorexie
und wiederholtes Flehmen auf. In den Caecumpunktaten aus der Operation konnte bis auf
ß2-Toxingen-negative Cl. perfringens-Stämme mit einem Keimgehalt von < 10 2 KBE/g
Chymus bei zwei Pferden kein weiterer Erreger festgestellt werden. Bei dem Pferd „Ede“
wurden am 3. Tag post operationem zum ersten Mal toxinogene Cl. difficile- und
ß2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme nachgewiesen (Tabelle 18). Mit dem Zytotoxizitätstest
konnte in dieser Probe die Wirkung von Cl. difficile-Toxin in geringer Konzentration
demonstriert werden (Abbildung 5). Bei den Pferden „Agu“ und „Resinale“ wurden am 4.
bzw. 3. Tag post operationem ß2-toxinogene bzw. enterotoxinogene Cl. perfringens-Stämme
isoliert (Tabelle 19 und Tabelle 21), die in keiner Probe dieser Tiere zuvor feststellbar waren.
Der Cl. perfringens-Ribotyp D wurde bei dem Pferd „Ede“ wiederholt und auch einmal bei
dem Pferd „Resinale“ in der postoperativen Phase nachgewiesen. Der Keimgehalt von

Ergebnisse 125
Cl. difficile und Cl. perfringens lag in der postoperativen Phase aller vier Pferde immer
< 10 2 KBE/g Kot.
1.1.6.5 Erythromycin
Die in der gleichen Weise, wie von GUSTAFSSON et al. (1997) beschrieben, durchgeführte
orale Applikation von Erythromycin (1,25 mg/kg KG alle 8 h) ohne vorausgegangene
Nahrungskarenz induzierte bei keinem der vier Pferde eine Typhlocolitis. Das
Allgemeinbefinden war bei allen Tieren während dieser Versuchsphase immer ungestört und
der Kot deutlich geformt. Bei allen vier Pferden konnte während der Erythromycin-
Applikation in mindestens einer Probe Cl. difficile kulturell nachgewiesen werden. Alle
Cl. difficile-Isolate aus diesem Experiment waren im Gegensatz zu sechs vor der
Erythromycin-Applikation gewonnenen Isolaten Erythromycin-resistent, atoxinogen und
gehörten zum Ribotyp B (Tabelle 27). Zum Vergleich erfolgte die PCR-Ribotypisierung von
acht willkürlich ausgewählten, atoxinogenen Cl. difficile-Stämmen, die 1998 von JOBST
(2001) aus Probenmaterial der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover
isoliert wurden (vier Isolate aus Kotproben: 154, 162, 178, 180 sowie vier Isolate aus
Umgebungsproben von vier verschiedenen Pferdeboxen: 66, 67, 69, 79). Diese acht
atoxinogenen Cl. difficile-Isolate zeigten alle den PCR-Fingerprint des Ribotyps B.
Bei drei Pferden konnten im Rahmen der oralen Applikation von Erythromycin
ß2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme mit einem Keimgehalt bis zu 10 3 KBE/g Kot
nachgewiesen werden, die im Gegensatz zu allen zuvor isolierten Cl. perfringens-Stämmen
Erythromycin-resistent waren.

Ergebnisse 126
Tabelle 27: Merkmale der Cl. difficile-Isolate der vier Versuchspferde
Versuchspferd Behandlung Isolat Probe Genotyp Ribotyp Erythromycin-
Empfindlichkeit
„Ede“
1. Woche post
operationem
Erythromycin
„Agu“ Erythromycin
„Resinale“
„Speranza“
Gentamicin nach
Nahrungskarenz
Futterumstellung
s90 13. tcdA+, tcdB+ A S
s133 14. tcdA+, tcdB+ A S
s194 16. tcdA–, tcdB– B R
s238 23. tcdA–, tcdB– B R
s274 24. tcdA–, tcdB– B R
s197 16. tcdA–, tcdB– B R
s189 17. tcdA+, tcdB+ A R
s279 24. tcdA–, tcdB– B R
s707 19. tcdA+, tcdB+ C S
s694 21. tcdA+, tcdB+ D S
s739 24. tcdA+, tcdB+ E S
s745 25. tcdA+, tcdB+ E S
Erythromycin s946 35. tcdA–, tcdB– B R
Erythromycin
nach
s997 44. tcdA–, tcdB– B R
Nahrungskarenz s1031 50. tcdA+, tcdB+ F R
Gentamicin nach
Nahrungskarenz
Erythromycin
s856 34. tcdA–, tcdB– B R
s937 39. tcdA–, tcdB– B R
s938 40. tcdA–, tcdB– B R
Anmerkung zu Tabelle 27:
In dieser Arbeit konnten sechs Ribotypen von Cl. difficile unterschieden werden, die in der
Reihenfolge ihres Auftretens mit A, B, C, D, E oder F bezeichnet wurden.

Ergebnisse 127
1.1.6.6 Erythromycin-Applikation
Nahrungskarenz
in der Anfütterungsphase nach einer
Am Ende der Versuchsreihe sollte bei drei der Pferde ermittelt werden, welche Auswirkungen
die Kombination der zuvor einzeln ausgeführten Faktoren Nahrungskarenz und orale
Erythromycin-Applikation hat. Den Pferden wurde in der Anfütterungsphase nach einer 72 h
Nahrungskarenz Erythromycin appliziert (1,25 mg/kg KG per os alle 8 h). Zwei Pferde
(„Ede“ und „Agu“) entwickelten 20 bis 30 h nach der ersten Erythromycin-Applikation
deutliche klinische und labordiagnostische Anzeichen der Typhlocolitis (Kotabsatz im Strahl,
Schocksymptomatik, Hämokonzentration und Leukopenie). Bei dem dritten Pferd
(„Resinale“) war zu keinem Zeitpunkt eine Störung des Allgemeinbefindens feststellbar. Am
zweiten und dritten Tag der Erythromycin-Applikation war der Kot dieses Tieres breiig,
ansonsten immer deutlich geformt. Die beiden Pferde mit Typhlocolitis-Symptomatik wurden
euthanasiert und seziert. Bei dem bereits 24 h nach der ersten Erythromycin-Applikation
euthanasierten Pferd „Ede“, bei dem eine geringgradige Leukopenie (4,6 x 10 9 /l) und
Hämokonzentration (Htk. 47 %) vorlag, wurde eine geringgradige katarrhalische Enteritis,
insbesondere im Bereich des Caecum und Colon ascendens diagnostiziert, die ein sehr frühes
Stadium der Typhlocolitis darstellen kann. Im Caecum- und Colon ascendens-Inhalt dieses
Pferdes konnten Cl. difficile sowie Toxin A und B nicht nachgewiesen werden.
Cl. perfringens lag in einem Keimgehalt von 2 x 10 3 und 4 x 10 3 KBE/g Chymus im Caecum
bzw. Colon ascendens vor. 24 getestete Cl. perfringens-Isolate aus dem Darminhalt dieses
Pferdes waren alle negativ für das ß2- und Enterotoxingen.
Bei dem zweiten („Agu“) in einem fortgeschritteneren Stadium (Htk. 74 %) euthanasierten
Pferd wurde eine fibrinös-nekrotisierende Typhlocolitis diagnostiziert. In zwei am Tag vor
der Euthnasie gewonnenen Kotproben sowie in dem Caecum- und Colon ascendens-Inhalt
dieses Pferdes waren Cl. difficile sowie Toxin A und B nicht nachweisbar. Cl. perfringens lag
in dem Caecum- und Coloninhalt in einem Keimgehalt von < 10 2 KBE/g Chymus vor. Die
Genotypisierung dieser Cl. perfringens-Isolate ergab, dass sowohl ß2-toxinogene als auch ß2-
Toxingen-negative Typ A-Stämme vorlagen (alle negativ für das Enterotoxingen). Für alle
Proben der beiden Pferde mit Typhlocolitisanzeichen wurden Salmonellen ausgeschlossen.
Beim dritten Pferd („Resinale“) ohne Typhlocolitissymptomatik waren während dieser
Erythromycin-Applikationsphase nur ß2-Toxingen-negative und Enterotoxingen-negative
Cl. perfringens- und atoxinogene Cl. difficile-Stämme in einem Keimgehalt < 10 2 KBE/g Kot

Ergebnisse 128
nachweisbar. Im Verlauf dieses Experimentes manifestierte sich bei diesem Pferd eine
Salmonellose aufgrund einer nosokomialen Infektion, die wahrscheinlich von einem Fohlen
in der benachbarten Box ausging.
1.1.7 Ergebnisse der gaschromatographischen Fettsäureanalytik im Probenmaterial
Nach MEYER (1994) könnte der Konzentrationsabfall der flüchtigen Fettsäuren insbesondere
der Buttersäure im Darmlumen infolge einer Nahrungskarenz ein bedeutungsvoller Schritt in
der Pathogenese der Typhlocolitis darstellen (2.1.5.7). Um die Auswirkungen einer 24 h
langen präoperativen Nahrungskarenz auf den Gehalt an flüchtigen Fettsäuren im
Caecumchymus zu dokumentieren und Hinweise auf eine mögliche Bedeutung dieser
Veränderungen für die Pathogenese der Typhlocolitis zu erhalten, wurden die in der
Laparatomie nach der 24 h Nahrungskarenz aspirierten Caecumpunktate und die nach der
Sektion gewonnenen Caecuminhalte auf den Gehalt an flüchtigen Fettsäuren hin untersucht
(Tabelle 28). Der Gehalt an Buttersäure im Caecum lag nach der 24 h Nahrungskarenz bei
allen vier Pferden unterhalb der Nachweisgrenze. Bei dem Pferd „Speranza“, das vor der
Euthanasie mehrere Tage Anorexie zeigte, konnte ebenfalls in dem nach der Sektion
gewonnenen Caecuminhalt keine Buttersäure festgestellt werden. Der Caecumchymus des
Pferdes „Agu“ mit der fibrinös-nekrotisierenden Typhlocolitis zeichnete sich durch einen
relativ hohen Anteil an Iso- und n-Valeriansäure aus.

Ergebnisse 129
Tabelle 28: Konzentration kurzkettiger Fettsäuren im Caecumchymuswasser der
vier Versuchspferde nach der 24 h Nahrungskarenz in der Laparotomie
und nach der Sektion in mmol/l
Versuchspferd
(Sektionsbefund)
„Ede“
(katarrhalische
Probe
Caecumpunktat
(OP)
Typhlocolitis) Caecuminhalt
(Sektion)
„Agu“
(fibrinösnekrotisierende
Caecumpunktat
(OP)
Typhlocolitis) Caecuminhalt
(Sektion)
Caecumpunktat
(OP)
„Resinale“
(Salmonellose)
Caecuminhalt
(Sektion)
Caecumpunktat
(OP)
„Speranza“
(Nephropathie)
Caecuminhalt
(Sektion)
Gesamtkonzentration
der kurzkettigen
Fettsäuren
Essigsäure
Propionsäure
Iso-Buttersäure
n-Buttersäure
Iso-Valeriansäure
n-Valeriansäure
8,46 7,35 1,11 n. n. n. n. n. n. n. n.
90,62 65,66 13,90 n. n. 10,05 1,01 n. n.
56,08 43,89 12,19 n. n. n. n. n. n. n. n.
112,02 53,72 29,11 4,16 16,11 4,69 4,23
15,72 14,06 1,66 n. n. n. n. n. n. n. n.
102,04 53,74 11,45 n. n. 36,85 n. n. n. n.
15,60 15,60 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
13,52 13,52 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.

Ergebnisse 130
1.2 Ergebnis der Genotypisierung von equinen Cl. perfringens-Isolaten aus dem
Probenmaterial des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der
Tierärztlichen Hochschule Hannover
Um die Bedeutung β2-toxinogener Cl. perfringens-Isolate für die Pathogenese der
Typhlocolitis des Pferdes weiter zu untersuchen und einen Vergleich mit den Cl. perfringens-
Isolaten der vier Versuchspferde zu ermöglichen, durchliefen noch weitere 38 equine
Cl. perfringens-Isolate die Genotypisierung mit der Multiplex-PCR (Tabelle 29). Diese
38 Cl. perfringens-Isolate wurden aus 25 Darminhalts- und zehn Kotproben gewonnen, die
dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen vom 1.9.00 bis zum 15.7.02 zugeschickt
wurden. 17 (45 %) dieser 38 Cl. perfringens-Isolate von 17 (49 %) der 35 Pferde waren
positiv für das β2-Toxingen cpb2. In drei Fällen konnten aus dem Verdauungstrakt eines
Pferdes sowohl β2-toxinogene als auch β2-Toxingen-negative Cl. perfringens-Stämme
isoliert werden. Alle Isolate waren vom Typ A. Enterotoxinogene Stämme konnten aus
diesem Probenmaterial nicht nachgewiesen werden. Nach den Angaben im Vorbericht und
gegebenenfalls nach Rücksprache mit dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover wurden die 35 Fälle wie in der Tabelle 29 wiedergegeben kategorisiert.
Es ist festzuhalten, dass bei 50 % der Cl. perfringens-Isolate von Pferden mit einer fibrinös-
nekrotisierenden Typhlocolitis oder klinischen Anzeichen einer Typhlocolitis das β2-
Toxingen nachgewiesen werden konnte (Tabelle 29).

Ergebnisse 131
Tabelle 29: Ergebnis der Genotypisierung von equinen Cl. perfringens-Isolaten aus
dem Untersuchungsmaterial des Instituts für Mikrobiologie und
Tierseuchen vom 1.9.00 bis zum 15.7.02
Probenmaterial vom
Pferd, aus dem
Cl. perfringens isoliert
wurde
Darminhalt von Pferden
mit einer fibrinösnekrotisierender
Typhlocolitis
Darminhalt von Pferden
mit einer
katarrhalischen Enteritis
und/oder klinischem
Verdacht auf eine
Typhlocolitis
Darminhalt nach
perakutem, tödlichem
Verlauf ohne
pathomorphologische
Veränderungen
Darminhalt von Pferden
mit anderen Diagnosen
Kotproben von Pferden
mit Diarrhoe oder
klinischem Verdacht
auf eine Typhlocolitis
Kotproben von Pferden
ohne nähere Angaben
Anzahl
Cl. perfringens Gleichzeitiger Nachweis von
der
Proben cpb2+ cpb2–
Cl.
difficile
Cl.
difficile-
Toxin
Salmonellen
5 3 3 0 0 0
15 7 9 2 1 0
2 2 0 0 0 0
3 1 2 0 0 0
2 1 1 0 0 0
3 1 2 1 0 0
Kotproben von Fohlen 5 2 4 0 0 0
insgesamt 35 17 21 3 1 0

Diskussion 132
2 Diskussion
Die Typhlocolitis des Pferdes tritt häufig als Komplikation bei hospitalisierten Pferden auf.
Verschiedene tierärztliche Manipulationen werden als prädisponierende Faktoren
insbesondere unter nosokomialen Bedingungen diskutiert, u. a. Nahrungsentzug, Antibiose
und operative Eingriffe. β2-toxinogenen sowie enterotoxinogenen Clostridium (Cl.)
perfringens- und toxinogenen Cl. difficile-Stämmen wird für die Pathogenese der
Typhlocolitis des Pferdes eine enteropathogene Bedeutung beigemessen (BÅVERUD et al.
1997; HERHOLZ et al. 1999; JONES 2000; WEESE et al. 2001). Der hochgradige
Keimgehalt von Cl. difficile und/oder Cl. perfringens bei einigen Typhlocolitispferden im
Gegensatz zu gesunden Pferden (GREIß et al. 1996) legt die Arbeitshypothese nahe, dass die
Ansiedlung und Vermehrung der genannten toxinogenen Clostridien im Dickdarm des
Pferdes ein bedeutungsvoller Schritt im Ablauf der Pathogenese der Typhlocolitis sein
könnte. Toxinogene Cl. difficile-Stämme werden bei chirurgischen Patienten vor allem
zwischen dem ersten und vierten Tag post operationem nachgewiesen (JOBST et al. 2002), so
dass die Operation im Zusammenhang mit der postoperativen Behandlung im Verdacht steht,
die Ansiedlung dieses Erregers zu begünstigen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht,
ob tierärztliche Behandlungsmaßnahmen unter Klinikbedingungen die Ansiedlung und
Vermehrung von toxinogenen Cl. difficile- und Cl. perfringens-Stämmen im Intestinaltrakt
des Pferdes hervorrufen können.
2.1 Verlaufsuntersuchung von vier Versuchspferden
Bei der Interpretation der bakteriologischen Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung der vier
Versuchspferde in dieser Arbeit stellt sich die Frage, wie sich eine intestinale Ansiedlung von
einer transienten Darmpassage unterscheiden lässt. Nach SAVAGE (1982) stellt die
Ansiedlung von pathogenen Bakterien im Darmtrakt, die bei Tieren mit einer ungestörten
Darmflora den Gastrointestinaltrakt nur transient passagieren, einen wichtigen ätiologischen
Faktor im Krankheitsgeschehen von intestinalen Erkrankungen dar. Die Ansiedlung der
transienten Bakterien wird durch eine Störung des Mikroökosystems der Darmflora
ermöglicht. Folgende Ergebnisse, die im Rahmen der quantitativen bakteriologischen

Diskussion 133
Diagnostik und der Charakterisierung der Clostridien-Isolate in dieser Arbeit gewonnen
wurden, werden als Indizien für eine intestinale Kolonisation interpretiert:
• der Nachweis des gleichen Cl. difficile-Ribotyps in zwei aufeinander folgenden Proben,
• der Nachweis von Cl. perfringens in einem Keimgehalt von ≥ 10 2 KBE/g Kot in zwei
aufeinander folgenden Proben,
• der Nachweis von Clostridien-Stämmen, die sich im Gegensatz zu den zuvor isolierten
Stämmen durch eine Resistenz gegenüber dem eingesetzten Antibiotikum auszeichnen,
• der Nachweis des gleichen Cl. perfringens-Ribotyps in zwei aufeinander folgenden
Proben.
Die ersten beiden Befunde können als Anzeichen einer Ansiedlung verstanden werden, da
sowohl der Nachweis von Cl. difficile als auch der von Cl. perfringens mit einem Keimgehalt
von ≥ 10 2 KBE/g Kot nur in einem geringen Anteil der Proben (12 % bzw. 9 %) vorlag. Die
Ribotypisierung der Cl. perfringens-Stämme offenbarte eine sehr heterogene
Zusammensetzung der Isolate, so dass die aufeinander folgende, wiederholte transiente
Darmpassage von demselben Stamm ein unwahrscheinliches Ereignis darstellt.
Im Gegensatz zu einer transienten Darmpassage liegt für die intestinale Kolonisation während
eines Versuches ein kausaler Zusammenhang mit den Behandlungsmaßnahmen nahe. Im
Folgenden werden die Auswirkungen der experimentell ausgeführten Behandlungen vor allem
unter diesem Gesichtspunkt diskutiert. Aufgrund der niedrigen Zahl der Versuchstiere können
an dieser Stelle nur tendenzielle Aussagen getroffen werden.
2.1.1 Hospitalisierung
Die Untersuchungen von Umgebungsproben aus einer Großtier- bzw. Pferdeklinik von
WEESE et al. (2000) und JOBST et al. (2002) demonstrieren eine relativ weite Verbreitung
von Cl. difficile in diesen Kliniken. In Analogie zur Situation in der Humanmedizin
(DELMÉE 2002) besteht somit für hospitalisierte Pferde eine erhöhte Gefahr einer
nosokomialen Infektion mit Cl. difficile.
Es liegen keine Hinweise vor, dass die Einstallung der vier Versuchspferde in der Klinik für
Pferde ohne weitere Behandlungsmaßnahmen für eine intestinale Besiedlung mit Cl. difficile
oder β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen ausreichend gewesen wäre. Bei keinem der

Diskussion 134
vier Pferde konnten die beiden Erreger in den ersten beiden Wochen nach der Einstallung im
Kot festgestellt werden. Außerdem war auffällig, dass bei drei der vier Pferde im Gegensatz
zu den Proben aus den Behandlungsphasen in keiner der Proben der Ruhephase Cl. difficile
und β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme nachgewiesen werden konnten. In
Untersuchungen von VAN DEN BULCK et al. (2002) waren 25,4 % der Kotproben von 63
hospitalisierten Pferden ohne Diarrhoe positiv für Cl. perfringens in der Direktkultur mit einer
angegebenen Nachweisgrenze von 10 3 KBE/g Kot. 58,3 % dieser Isolate wurden als
β2-toxinogen typisiert. Da eine signifikante Assoziation zwischen einer antibiotischen
Behandlung oder einer Operation und dem Nachweis von Cl. perfringens bzw.
β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen nicht vorlag, kommen die Autoren zu dem Schluss,
dass die Hospitalisierung als solche ein entscheidender Risikofaktor für die Präsenz von
Cl. perfringens im Darmkanal des Pferdes ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten
jedoch darauf hin, dass in Bezug auf die Kolonisation mit β2-toxinogenen Cl. perfringens-
Stämmen und einem spezifischen Keimgehalt von ≥ 10 3 KBE/g Kot die Hospitalisierung als
solche nicht ausreichend ist und mindestens noch ein weiterer Faktor auf das Pferd einwirken
muss, um die Kolonisationsresistenz des Intestinaltraktes zu schwächen. Als Faktoren
kommen neben der Antibiose und Operation auch die Futterumstellung, eine Nahrungskarenz
und eine gastrointestinale Erkrankung infrage.
2.1.2 Nahrungskarenz
In der Maus konnte gezeigt werden, dass die Kolonisationsresistenz der residenten Darmflora
des Dickdarms durch Hungerphasen beeinträchtigt werden kann (TANNOCK u. SAVAGE
1974; SAVAGE 1982). Infolge einer herabgesetzten Kolonisationsresistenz besteht,
insbesondere unter nosokomialen Bedingungen, die Gefahr der Ansiedlung von
enteropathogenen Bakterienarten, wie Cl. difficile und ß2-toxinogenen Cl. perfringens-
Stämmen. DEEGEN et al. (1995) untersuchten die physiologischen Auswirkungen einer
100 h Nahrungskarenz bei drei Versuchspferden. Die Autoren führen die pH-Verschiebung in
den leicht alkalischen Bereich, die starke Abnahme der Gesamtmenge an flüchtigen
Fettsäuren und den erhöhten Anteil von Valeriansäure im Dickdarm infolge der
Nahrungskarenz auf Veränderungen der Darmflora zurück. Der Anstieg der Konzentration an
Valeriansäure könnte nach DEEGEN et al. (1995) mit der Zunahme von Clostridien während

Diskussion 135
der Nahrungskarenz zusammenhängen. Da die durch die Nahrungskarenz hervorgerufenen
metabolischen Veränderungen in ähnlicher Form auch bei der Typhlocolitis auftreten sollen,
postulieren die Autoren, dass die Induktion der Typhlocolitis durch eine längere
Nahrungskarenz begünstigt werden kann. In dieser Arbeit wurde diese Arbeitshypothese
aufgegriffen, und die Auswirkungen der Nahrungskarenz auf den Gehalt an flüchtigen
Fettsäuren sowie die Ansiedlung und Vermehrung von Cl. difficile und ß2-toxinogenen
Cl. perfringens-Stämmen wurden näher untersucht.
Die nach einer 24 h Nahrungskarenz während der Laparotomie gewonnenen Caecumpunktate
zeichneten sich durch leicht erhöhte pH-Werte, eine deutliche Verflüssigung des Chymus
(Abbildung 4) und einen niedrigen Gehalt an flüchtigen Fettsäuren aus. Besonders auffällig
war, dass bei allen vier Versuchspferden Buttersäure in den Caecumpunktaten nicht mehr
nachgewiesen werden konnte (Tabelle 28). Es ist hervorzuheben, dass die von DEEGEN et al.
(1995) nach einer 100 h Nahrungskarenz beobachteten Veränderungen offensichtlich auch
schon zum Teil nach einer 24 h Nahrungskarenz auftreten können. Valeriansäure konnte in
den Caecumpunktaten nach der 24 h Nahrungskarenz allerdings nicht nachgewiesen werden.
MEYER (1994) misst dem Abfall der flüchtigen Fettsäuren, vor allem der Buttersäure,
während einer Nahrungskarenz im Caecum eine ätiologische Bedeutung für die Pathogenese
der Typhlocolitis bei. Da das Dickdarmepithel vor allem Buttersäure zur Energieversorgung
nutzt, könnte die Nahrungskarenz zu einem Energiemangel dieser Zellen und somit zu einer
Störung der Absorptionsfunktion führen.
Die Bewertung der bakteriologischen Ergebnisse der nach der 72 h Nahrungskarenz
entnommenen Kotproben muss unter Vorbehalt erfolgen, da die Chymuspassage während-
dessen stark reduziert ist (DEEGEN et al. 1995). Veränderungen der Keimflora im Caecum
während einer solchen Nahrungskarenz würden sich somit nicht unmittelbar in der
Bakterienflora des Kotes manifestieren. Die während der Operation nach einer 24 h
Nahrungskarenz gewonnenen Caecumpunktate spiegeln die Veränderungen im Caecum dieser
Pferde nach einer kürzeren Nahrungskarenz direkt wieder. Weder in den Kotproben noch in
den Caecumpunktaten konnten Cl. difficile oder β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme
nachgewiesen werden, so dass keine Hinweise für eine begünstigte Ansiedlung oder
Vermehrung dieser Keime während einer Nahrungskarenz bestehen.
In der Anfütterungsphase nach der 72 h Nahrungskarenz von Versuchspferd „Resinale“ und
„Speranza“ kam es zu einem Anstieg des Keimgehaltes von Cl. perfringens auf über

Diskussion 136
≥ 10 3 KBE/g Kot und zum erstmaligen Auftreten von β2-toxinogenen Stämmen. Der
beobachtete Anstieg des Keimgehaltes von Cl. perfringens in der Anfütterungsphase konnte
mit der gleichen Fütterung ohne vorausgegangene Nahrungskarenz nicht provoziert werden.
Der vorausgegangenen Nahrungskarenz wird somit eine Bedeutung für die Vermehrung von
Cl. perfringens in der Anfütterungsphase beigemessen.
Eine Kolonisation des Dickdarms in der Anfütterungsphase der beiden Versuchspferde
„Resinale“ und „Speranza“ mit β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen ist wahrscheinlich,
da in zwei aufeinander folgenden Proben der spezifische Keimgehalt über ≥ 10 3 KBE/g Kot
lag und wiederholt der Ribotyp M isoliert wurde. Die bei dem Pferd „Resinale“
währenddessen beobachtete Diarrhoe wird auf den hochgradigen Keimgehalt an β2-
toxinogenen Cl. perfringens von 10 5 KBE/g Kot zurückgeführt. Dieser spezifische
Keimgehalt liegt im Gegensatz zu allen anderen in dieser Arbeit bestimmten deutlich über
dem von WIERUP und DIPIETRO (1981) für eine klinische Relevanz angegebenen
Grenzwert von 10 2 KBE/g Kot. Da es sich bei Cl. perfringens um einen schnell
proliferierenden Keim handelt, ist vorstellbar, dass dieser Keim in der Anfütterungsphase
besonders konkurrenzstark ist und die sich währenddessen schnell verbessernden
Bedingungen für eine kurzfristige Ansiedlung nutzen kann.
2.1.3 Gentamicin
STRAUB und FREY (2000) konnten bei dem β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stamm
E482/97, der aus einer Darminhaltsprobe von einem Pferd mit Typhlocolitis isoliert wurde,
die Bildung des β2-Toxins in vitro erst nach Zugabe von Gentamicin feststellen. Außerdem
berichten die Autoren von einem Rückgang der Letalitätsrate der Typhlocolitispatienten, seit
die postoperative Antibiose mit Gentamicin eingestellt wurde. Aufgrund dieser
Beobachtungen wurde bei den Pferden „Resinale“ und „Speranza“ in dieser Arbeit mehrmals,
unter anderem als postoperative Antibiose, Gentamicin eingesetzt. Die klinischen und
bakteriologischen Auswirkungen wurden mit den Ergebnissen der Pferde „Ede“ und „Agu“
verglichen, die postoperativ mit Cefquinom behandelt wurden. Bereits vor Beginn der
Gentamicin-Applikation konnten bei den Pferden „Resinale“ und „Speranza“ Gentamicin-
resistente β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme in hoher Keimzahl in der
Anfütterungsphase nach der 72 h Nahrungskarenz nachgewiesen werden. Trotz dieser

Diskussion 137
vorausgegangen Besiedlung wurden unter den wiederholten Applikationen von Gentamicin zu
keinem Zeitpunkt klinische oder hämatologische Anzeichen einer Typhlocolitis festgestellt.
Die Applikation von Gentamicin führte im Gegensatz zur oralen Applikation von
Erythromycin auch in der Anfütterungsphase nach einer 72 h Nahrungskarenz nicht zur
Induktion der Typhlocolitis. Den Ergebnissen der bakteriologischen Diagnostik zufolge
profitieren Gentamicin-resistente β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme auch nicht in
besonderem Maße von der Gentamicin-Applikation. So konnten im Gegensatz zu den beiden
postoperativ mit Cefquinom behandelten Pferden „Resinale“ und „Speranza“ keine β2-
toxinogenen Cl. perfringens-Stämme in der postoperativen Phase isoliert werden. Die
vorgestellten Daten liefern somit keine Hinweise für die Bedeutung von Gentamicin für die
Pathogenese der mit β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen assoziierten Typhlocolitis des
Pferdes. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die kurzfristige Kolonisation mit
β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen in der Anfütterungsphase nach der ersten 72 h
Nahrungskarenz im Sinne einer Immunisierung wirkte. In der Humanmedizin konnten
WARNY et al. (1994) bei Patienten mit Rezidiven der Clostridium difficile-assoziierten
Diarrhoe (CDAD) im Vergleich zu Patienten mit einer singulären CDAD-Episode signifikant
niedrigere Titer an Serum-Immunoglobulin (Ig) G und fäkalem IgA Antitoxin A-Antikörpern
feststellen. Der protektive Effekt von Antitoxin A-Antikörpern gegenüber einer
pseudomembranösen Colitis wurde im Tiermodell direkt nachgewiesen (CORTHIER et al.
1991). Ob die Immunantwort auf das Toxin A von Cl. difficile und das β2-Toxin von Cl.
perfringens eine ähnliche Bedeutung im Typhlocolitis-Geschehen des Pferdes besitzt, gehört
zu den offenen Fragen dieser Erkrankung.
Der erstmalige Nachweis von toxinogenen Cl. difficile-Stämmen bei dem Versuchspferd
„Resinale“ und von sowohl enterotoxinogenen als auch β2-toxinogenen Cl. perfringens-
Stämmen bei dem Versuchspferd „Speranza“ aus den Proben der Gentamicin-
Applikationsphase nach der 72 h Nahrungskarenz spricht in Bezug auf die Kolonisation des
Intestinaltraktes mit toxinogenen Clostridien für eine synergistische Wirkung der Faktoren
Antibiose und vorausgegangene Nahrungskarenz. Unter der Gentamicin-Applikation ohne
vorausgegangene Nahrungskarenz konnten bei denselben Versuchspferden weder Cl. difficile
noch enterotoxinogene bzw. β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme nachgewiesen werden.
Da alle untersuchten Cl. difficile- und Cl. perfringens-Isolate im Einklang mit den
Ergebnissen von JOBST (2001) Gentamicin-resistent waren und die Konzentration von

Diskussion 138
Gentamicin im Gastrointestinaltrakt durch die überwiegend renale Elimination wahrscheinlich
sehr gering war, führte die Gentamicin-Applikation im Vergleich zu der Erythromycin-
Verabreichung nicht zu einem Selektionsvorteil für bestimmte Stämme der beiden
Clostridienarten.
Bei dem aufgrund einer hochgradigen Urämie euthanasierten Pferd „Speranza“ wurde u. a.
post mortem eine akute Tubulusepithelschädigung diagnostiziert, die für die akute
Nephrotoxizität von Gentamicin typisch ist (CONFER u. PANCIERA 1995;
POHLENZ 2001). Weiterhin lag eine chronische, interstitielle Nephritis vor, die für die
Gentamicin-assozierte Nephrotoxizität und die Papillenspitzennekrose eine prädisponierende
Rolle spielen kann (POHLENZ 2001). Im Zusammenspiel mit einer durch Gentamicinresistente
E. coli hervorgerufenen akuten, eitrigen Herdnephritis führten diese pathologischen
Veränderungen zu einer akuten Niereninsuffizienz.
2.1.4 Operation
Die Typhlocolitis tritt häufig als Komplikation nach operativen Eingriffen bei Kolikpatienten
auf. Welche kausale Bedeutung die Operation in diesem Zusammenhang besitzt, ist noch
unklar und umstritten. Die Ischämie und Reperfusion des Darmes kann bei diesen Patienten
zu einer erhöhten Endotoxinresorption führen (KING u. GERRING 1988). Die Folge ist eine
Endotoxämie, die eine große Rolle bei der Pathogenese der Typhlocolitis spielen könnte
(POHLENZ u. KEMPER 1994). Einen weiteren Aspekt der Pathogenese der Typhlocolitis
beim Kolikpatienten demonstrieren folgende Ergebnisse von GREIß et al (1996): Im
Zusammenhang mit einer Dysbiose können bei Kolikpatienten ohne Anzeichen einer
Typhlocolitis und bei Typhlocolitispatienten im Darmkanal im Vergleich zu gesunden
Pferden häufiger Clostridien einschließlich der enteropathogenen Arten Cl. perfringens und
Cl. difficile auftreten. Diese enteropathogenen Clostridienspezies können insbesondere bei
einer herabgesetzten Kolonisationsresistenz, wie sie bei einem Kolikpatienten aufgrund der
Dysbiose zu erwarten ist, den Darmtrakt erfolgreich kolonisieren, sich vermehren und durch
ihre Toxinbildung schließlich die fibrinös-nekrotisierende Entzündung im Caecum und Colon
ascendens hervorrufen. Ob die Operation eines Kolikpatienten auf die Entstehung der
Typhlocolitis Einfluss nimmt, und wenn ja welchen, ist aufgrund der prädisponierenden
Einflüsse der Grunderkrankung bei dieser Patientengruppe schwer zu erkennen. In der
vorliegenden Arbeit wurden die klinischen und bakteriologischen Auswirkungen einer an vier

Diskussion 139
gesunden Pferden durchgeführten experimentellen Laparotomie untersucht. Bei diesem
Eingriff wurde eine Kolikoperation simuliert, ohne jedoch eine Ischämie und Reperfusion des
Darmes hervorzurufen. Keines der vier Versuchspferde zeigte in Folge der Laparotomie
klinische und/oder hämatologische Anzeichen einer Typhlocolitis. Nur bei dem Pferd „Ede“
trat am zweiten und dritten Tag post operationem eine von Anorexie und
Schmerzsymptomatik gekennzeichnete, geringgradige Störung des Allgemeinbefindens auf.
Dieses klinische Bild war assoziiert mit dem erstmaligen Nachweis von toxinogenen
Cl. difficile- und β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen an beiden Tagen, die allerdings im
Vergleich zu Typhlocolitisfällen nur in einem Keimgehalt von

Diskussion 140
vorstellbar, dass von dem Cl. perfringens-Ribotyp D in vivo eine cpb2-positive und eine
cpb2-negative Population existieren.
Der erstmalige Nachweis von ß2-toxinogenen bzw. enterotoxinogenen Cl. perfringens-
Stämmen bei drei der vier Pferde („Ede“ und „Agu“ bzw. „Resinale“) und eines toxinogenen
Cl. difficile-Stammes bei „Ede“ in der ersten Woche post operationem spricht dafür, dass die
Laparotomie in Verbindung mit der postoperativen Behandlung unter Klinikbedingungen die
Besiedlung des Intestinaltraktes mit toxinogenen Clostridienspezies begünstigen kann. Dieses
experimentelle Ergebnis steht im Einklang mit der Beobachtung, dass Cl. difficile bei
Patienten meistens am ersten bis vierten Tag post operationem erstmalig nachgewiesen
werden kann (JOBST et al. 2002). Im Gegensatz zu Kolikpatienten wurde bei den
Versuchspferden wahrscheinlich keine Dysbiose hervorgerufen, so dass die genannten
toxinogenen Clostridienstämme aufgrund der vorhandenen Kolonisationsresistenz keine
hohen Keimzahlen erreichen und die Toxine nicht ihre mögliche pathogene Wirkung entfalten
konnten.
2.1.5 Erythromycin
Nach Abschluss der Untersuchungen zu den Auswirkungen der iatrogenen
Behandlungsmaßnahmen wurde das Ziel verfolgt, bei denselben Versuchspferden eine
Clostridien-assoziierte Typhlocolitis experimentell auszulösen. GUSTAFSSON et al. (1997)
konnten bei zwei von vier Versuchspferden nach der oralen Applikation von Erythromycin
deutliche klinische und hämatologische Anzeichen einer Typhlocolitis beobachten (2.1.7).
Die Dosierung lag mit 1,25 mg/kg KG alle 8 h deutlich unter der beim Fohlen zur Therapie
der Rhodococcose üblichen Dosierung von 12,5 bis 25 mg/kg KG alle 6–8 h (HIGGINS u.
WRIGHT 1998). Das von BÅVERUD et al. (1998) beschriebene vermehrte Auftreten von
Typhlocolitisfällen bei Stuten, deren Fohlen mit Erythromycin behandelt wurden, wird auf die
unbeabsichtigte Aufnahme von Erythromycin durch die Stuten zurückgeführt. Vor diesem
klinischen Hintergrund und aufgrund der von GUSTAFSSON et al. (1997) in einem der
beiden induzierten Typhlocolitisfälle nachgewiesenen Assoziation mit dem Cl. difficile-Toxin
wurde in dieser Arbeit versucht, diese Induktion der Typhlocolitis mit Erythromycin zu
reproduzieren, um eine Beteiligung von Cl. perfringens bzw. Cl. difficile näher untersuchen
zu können. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von GUSTAFSSON et al. (1997) konnten
während einer fünftägigen oralen Applikation von Erythromycin mit einer Dosierung von

Diskussion 141
1,25 mg/kg KG alle 8 h bei keinem der vier Versuchspferde klinische oder hämatologische
Anzeichen einer Typhlocolitis festgestellt werden. Das Allgemeinbefinden war bei allen
Tieren während dieser Versuchsphase immer ungestört und der Kot deutlich geformt. Die
Erythromycin-Behandlung zeigte aber bei den vier Pferden in Form einer Selektion von
Cl. perfringens und Cl. difficile deutliche bakteriologische Auswirkungen. Bei drei Pferden
wurden ß2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme mit einem Keimgehalt bis zu 10 3 KBE/g Kot
festgestellt, die im Gegensatz zu allen zuvor isolierten Cl. perfringens-Stämmen
Erythromycin-resistent waren. Bei allen vier Pferden konnte während der Erythromycin-
Behandlung in mindestens einer Probe Cl. difficile kulturell nachgewiesen werden. Alle
Cl. difficile-Isolate aus diesem Experiment waren im Gegensatz zu den sechs vor der
Erythromycin-Applikation gewonnenen Isolaten Erythromycin-resistent und atoxinogen. Der
Vergleich der Ergebnisse von GUSTAFSSON et al. (1997) und BÅVERUD et al. (1998) mit
denen von JOBST (2001) und den eigenen Resultaten wirft die Frage auf, ob Unterschiede
bezüglich der Verbreitung der Erythromycin-Resistenz unter toxinogenen und atoxinogenen
Cl. difficile-Stämmen zwischen der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und den betroffenen Pferdekliniken in Schweden mit der schlechten Reproduzierbarkeit der
klinischen Auswirkungen der Erythromycin-Applikation in Zusammenhang stehen könnten.
In den von JOBST (2001) untersuchten Proben, die ausschließlich aus der Klinik für Pferde
der Tierärztlichen Hochschule Hannover stammten, waren 98 % der atoxinogenen
Cl. difficile-Isolate Erythromycin-resistent, hingegen alle 29 toxinogenen Cl. difficile-Isolate
Erythromycin-sensibel. Unter diesen Voraussetzungen erscheint die in Folge der
Erythromycin-Applikation beobachtete Kolonisation mit einem atoxinogenen, aber nicht mit
einem toxinogenen Cl. difficile-Stamm als naheliegend. Im Zusammenhang mit der
Erythromycin-Applikation wurde bei allen vier Versuchspferden der atoxinogene und
Erythromycin-resistente Cl. difficile-Ribotyp B isoliert. Acht untersuchte atoxinogene
Cl. difficile-Isolate, die 1998 aus Umgebungs- oder Kotproben der Klinik für Pferde
gewonnen wurden, gehörten gleichfalls zu diesem Ribotyp B (1.1.6.5). Dieser atoxinogene
Ribotyp war offensichtlich in der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover
seit längerem verbreitet. Die in dieser Untersuchung in Bezug auf das PCR-
Ribotypisierungsmuster festgestellte Homogenität atoxinoger Cl. difficile-Isolate ist keine
allgemeine Eigenschaft atoxinogener Cl. difficile-Stämme. STUBBS et al. (1999) konnten mit
derselben PCR-Ribotypisierungsmethode unter 2030 humanen Cl. difficile-Isolaten 116

Diskussion 142
verschiedene Ribotypen differenzieren. 37 dieser 116 Ribotypen gehen auf atoxinogene
Cl. difficile-Stämme zurück.
Die Kolonisation des Darmkanals mit dem atoxinogenen Cl. difficile-Ribotyp B könnte bei
den vier Versuchspferden zu einer Protektion gegenüber einer Cl. difficile-assoziierten
Typhlocolitis geführt haben. Im Tiermodell des Syrischen Hamsters konnte gezeigt werden,
dass die vorausgegangene Besiedlung des Intestinaltraktes mit atoxinogenen Cl. difficile-
Stämmen die Tiere vor einer Antibiotika-assoziierten Colitis schützt, die durch toxinogene
Cl. difficile-Stämme hervorgerufen wird (WILSON u. SHEAGREN 1983). Diese Ergebnisse
stehen im Einklang mit der molekularen Charakterisierung und mit in vitro Untersuchungen
zur Adhäsion von toxinogenen und atoxinogenen Cl. difficile-Stämmen. Zwischen
atoxinogenen und toxinogenen Cl. difficile-Stämmen bestehen nach dem derzeitigen
Kenntnisstand keine Unterschiede in Bezug auf die Ausstattung mit Adhäsinen (WALIGORA
et al. 1999; WALIGORA et al. 2001). Atoxinogene Cl. difficile-Stämme könnten demnach
mit toxinogenen Stämmen um die Kolonisation des Intestinaltraktes konkurrieren.
GUSTAFSSON et al. (1997) und BÅVERUD et al. (1998) konnten in ihrem Probenmaterial,
das von Typhlocolitisfällen in Schweden stammt, die mit einer Erythromycin-Behandlung in
Zusammenhang gebracht wurden, gleichzeitig Cl. difficile-Zytotoxin im Kot und
Erythromycin-resistente Cl. difficile-Stämme nachweisen. Diese Befunde sprechen dafür, dass
Erythromycin-Resistenz unter toxinogenen Cl. difficile-Stämmen in den betroffenen
schwedischen Pferdekliniken verbreitet war und hier somit auch keine vergleichbare
protektive Wirkung durch atoxinogene Cl. difficile-Stämme eintrat. Das Auftreten von
Cl. difficile-assoziierten Typhlocolitisfällen in Pferdekliniken könnte demnach auch durch
klinikspezifische Resistenzspektren von nosokomialen atoxinogenen und nosokomialen
toxinogenen Cl. difficile-Stämmen bestimmt werden.
Bei allen Erythromycin-resistenten Cl. difficile-Isolaten der vier Versuchspferde wurde das
für die Erythromycin-Resistenz kodierende Gen erm nachgewiesen. erm liegt auf einem
Transposon und kann durch Konjugation zwischen verschiedenen Cl. difficile-Stämmen bzw.
auch unterschiedlichen Bakterienarten übertragen werden (WÜST u. HARDEGGER 1983;
HÄCHLER et al. 1987; MULLANY et al. 1995; FARROW et al. 2001). Aus diesem Grund
ist zu erwarten, dass unter einem durch die wiederholte Exposition mit Erythromycin
ausgelösten Selektionsdruck das Gen erm bei den verschiedenen Bakterienstämmen und
-arten eine erhöhte Verbreitung erreichen wird. Das einzige von sieben Cl. difficile-Isolaten

Diskussion 143
des Versuchspferds „Resinale“, das sowohl Erythromycin-resistent als auch toxinogen war,
wurde nach dem Abschluss der zweiten Erythromycin-Applikation bei diesem Pferd
gewonnen (Abbildung 2). Diese Tatsache könnte Ausdruck einer Selektion eines toxinogenen
Cl. difficile-Stammes sein, dem das erm-Gen durch Konjugation übertragen wurde.
2.1.6 Kombination der Faktoren Nahrungskarenz und Erythromycin
Im Hinblick auf die Zuordnung der Typhlocolitis zu den Faktorenerkrankungen (DEEGEN
2000) wurden die Auswirkungen der Kombination der Faktoren Nahrungskarenz und
Erythromycin-Applikation, die zuvor in gleicher Form bei denselben Pferden einzeln
ausgeführt wurden, bei drei der vier Versuchspferde untersucht. Erst durch die Kombination
dieser beiden Faktoren konnte bei zwei Pferden das klinische Bild der Typhlocolitis mit den
charakteristischen hämatologischen Veränderungen induziert werden. Diese experimentellen
Ergebnisse bestätigen die klinischen Beobachtungen, dass die Gefahr der Auslösung der
Typhlocolitis vor allem bei dem gleichzeitigen Einwirken von verschiedenen
prädisponierenden Faktoren besteht (BARTMANN et al. 1998). Bei dem in einem
fortgeschrittenen Stadium euthanasierten Pferd „Agu“ konnte die klinische
Verdachtsdiagnose in der Sektion in Form einer fibrinös-nekrotisierenden Typhlocolitis
eindeutig bestätigt werden. Bei dem zweiten Pferd „Ede“ bei dem eine katarrhalische
Typhlitis und Colitis vorlagen, kann davon ausgegangen werden, dass es sich um ein frühes
Stadium der Typhlocolitis handelt, da sich:
• der klinische Verlauf mit Kolik, Diarrhoe und Leukozytenabfall in gleicher typischer
Weise darstellte wie bei dem Pferd „Agu“, das jedoch in einem fortgeschritteneren
Stadium euthanasiert wurde, und
• das Caecumfiltrat der Sektionsproben von „Ede“ und „Agu“ sich im Gegensatz zu allen
anderen untersuchten Filtraten im Zytotoxizitätstest durch eine schnell eintretende
zytotoxische Wirkung auszeichnete.
Obwohl in den Experimenten zuvor gezeigt werden konnte, dass ß2-toxinogene
Cl. perfringens-Stämme in der Anfütterungsphase nach einer dreitägigen Nahrungskarenz im
Keimgehalt auf bis zu 10 5 KBE/g Kot ansteigen können und die Erythromycin-Behandlung
die Ansiedlung von Cl. difficile begünstigt, liegen keine eindeutigen Hinweise für die

Diskussion 144
Beteiligung der beiden genannten Erreger an der Auslösung dieser beiden Typhlocolitisfälle
vor. In beiden Fällen konnte weder Cl. difficile-Toxin mit dem ELISA noch Cl. difficile selbst
nachgewiesen werden. Im Ileum- und Caecuminhalt des Pferdes „Agu“ mit der fibrinösnekrotisierenden
Typhlocolitis waren ß2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme nachweisbar,
aber nur mit einem geringgradigen Keimgehalt. Im Colon ascendens und in den beiden
Kotproben vom Tag zuvor, an dem die Symptome einsetzten, konnten, wie auch in allen nach
der Sektion gewonnenen Darminhaltsproben des Pferds „Ede“, keine ß2-toxinogenen
Cl. perfringens-Stämme isoliert werden. Es ist unwahrscheinlich, dass in allen negativen
Fällen, wie von FREY (2002) beschrieben, eine Sauerstoffexposition der Isolate zu einem
Verlust des cpb2-Plasmides geführt hat und somit die Typisierung als ß2-Toxingen-negativer
Typ A-Stamm in Bezug auf den Ausgangsstamm ein falsch negatives Ergebnis darstellt. Die
Proben wurden alle auf vorreduzierten Nährböden und in vorreduzierte Leberbouillon
überführt, um die Sauerstoffexposition zu minimieren. Außerdem erfolgte die Typisierung
von 23 Isolaten, von denen zahlreiche nur ein oder zwei Passagen durchliefen.
Bei der Interpretation der bakteriologischen Ergebnisse ist aber zu berücksichtigen, dass die
Ansiedlung und Vermehrung von enteropathogenen Cl. perfringens- und Cl. difficile-
Stämmen wahrscheinlich nur ein Teilaspekt der Pathogenese der Clostridien-assoziierten
Typhlocolitis des Pferdes darstellt, da u. a.:
• die Toxingene tcdA und tcdB von Cl. difficile wie auch einige Toxingene von
Cl. perfringens reguliert exprimiert werden (HUNDSBERGER et al. 1997; DUPUY u.
SONENSHEIN 1998; BANU et al. 2000), so dass die Menge an gebildetem Toxin nicht
direkt proportional zum spezifischen Keimgehalt der beiden toxinogenen Clostridien sein
muss;
• es bei der Typhlocolitis insbesondere durch pH-Wertabsenkungen und freigesetztes
Endotoxin zu einer reduzierten Funktion der Darmbarriere kommt, durch die eine
Toxinresorption aus dem Lumen begünstigt wird (POHLENZ u. KEMPER 1994).
Aufgrund dieser Zusammenhänge kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Toxine A
und B von Cl. difficile bzw. das β2-Toxin von Cl. perfringens doch ursächlich an den beiden
induzierten Typhlocolitisfällen beteiligt waren.
Sowohl bei „Ede“ als auch bei „Agu“ konnten im Dickdarminhalt mittel- bis hochgradig Eier
von Magen-Darm-Strongyliden nachgewiesen werden. Als Differentialdiagnose zur

Diskussion 145
Clostridien-assoziierten Colitis führt LARSEN (1997) und DEEGEN (2000) die larvale
Cyathostominose in der akuten Form auf. REILLY et al. (1993) beschreiben zwei akute fatale
Colitisfälle, die der Clostridien-assoziierten Typhlocolitis durch ihren akuten Verlauf mit
Todesfolge ähnlich waren, aber nur mit einer larvalen Cyathostominose in Verbindung
gebracht werden konnten. Bei dem in einem frühen Stadium der Typhlocolitis euthanasierten
Pferd „Ede“ konnte eine larvale Cyathostominose histologisch nachgewiesen werden. Die
larvale Cyathostominose könnte auch für die Induktion der Typhlocolitis bei den Pferden
„Ede“ und „Agu“ eine kausale Rolle gespielt haben. Im Gegensatz zu diesen beiden
Versuchspferden traten bei dem Pferd „Resinale“, bei dem zu Versuchsbeginn eine
Entwurmung durchgeführt wurde und bei dem keine Cyathostominose festgestellt werden
konnte, keine Anzeichen einer Typhlocolitis infolge der Erythromycin-Applikation nach der
72 h Nahrungskarenz auf. Außerdem muss berücksichtigt werden, dass die Induktion der
Typhlocolitis am 29. und 30. Januar und in einer Anfütterungsphase nach einer
Nahrungskarenz gelang, so dass die synchrone Aktivierung zahlreicher hypobiontischer
Larven eine kausale Rolle gespielt haben könnte (LOVE 1992; LARSEN 1997). Folgende
Befunde sprechen aber dagegen, dass die larvale Cyathostominose in der Pathogenese der
beiden induzierten Typhlocolitiden im Vordergrund stand:
• Der bei den beiden Versuchspferden „Ede“ und „Agu“ beobachtete akute bis perakute
Verlauf von einem ungestörten zu einem hochgradig gestörten Allgemeinbefinden mit
dem klinischen Bild eines toxämischen Schocks innerhalb von weniger als 24 h ist für die
Parasiten-assoziierten Diarrhoen des Pferdes bis jetzt noch nicht beschrieben worden,
hingegen typisch für die Clostridien-assoziierte Typhlocolitis oder Colitis X des Pferdes.
• Keiner der beiden induzierten Typhlocolitisfälle zeigte die für die larvale
Cyathostominose charakteristische Hypoproteinämie und Neutrophilie (LOVE 1992;
DEEGEN 2000). Stattdessen wurden die für die Clostridien-assoziierte Typhlocolitis oder
Colitis X charakteristische initiale Leukopenie und Hämokonzentration mit sekundärer
Hyperproteinämie beobachtet.
• Der Caecuminhalt der beiden induzierten Typhlocolitisfälle zeichnete sich durch eine
zytotoxische Wirkung aus, die weder die Caecumpunktate aus der Operation dieser Pferde
noch die Caecuminhalte der beiden anderen Versuchspferde ohne Typhlocolitis
hervorriefen. Eine solche zytotoxische Wirkung lässt sich schwer durch eine larvale
Cyathostominose erklären.

Diskussion 146
MEYER (1994) postuliert, dass der Abfall der flüchtigen Fettsäuren im Dickdarm während
einer Nahrungskarenz eine zentrale Rolle in der Pathogenese der Typhlocolitis spielen kann.
Der in diesem Zusammenhang zu erwartende Energiemangel der Enterozyten führt zu einer
Störung der Absorption von Natrium und Wasser. Durch einen Circulus vitiosus soll
schließlich das klinische Bild der Typhlocolitis hervorgerufen werden. Die Ergebnisse dieser
Arbeit weisen jedoch darauf hin, dass die Nahrungskarenz in der Pathogenese der
Typhlocolitis noch eine andere Rolle spielen kann. Bei beiden Typhlocolitisfällen war der
Gesamtgehalt an flüchtigen Fettsäuren einschließlich der Buttersäure im Caecum und Colon
ascendens (Tabelle 28) in dem Wertebereich der Kontrollgruppe (80,9 ± 31,6 mmol/l) der
Untersuchung von DEEGEN et al. (1995). Das Pferd „Agu“ zeigte 24 h nach dem Ende der
72 h Nahrungskarenz noch keine wässrige Diarrhoe. Insbesondere unter Berücksichtigung des
zu diesem Zeitpunkt bei dem Pferd „Ede“ gemessenen Gehalts an Buttersäure ist mit hoher
Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass sich auch im Caecum und Colon ascendens des
Pferdes „Agu“ der Gesamtgehalt an flüchtigen Fettsäuren einschließlich der Buttersäure nach
der Nahrungskarenz wieder normalisiert hat. Mit einer monokausalen Theorie eines
Energiemangels der Enterozyten lässt sich somit der erst 36 h nach dem Ende der
Nahrungskarenz eintretende wässrige Durchfall des Pferdes „Agu“ schwer erklären. Es ist
auch zu berücksichtigen, dass alle vier Pferde die zuvor einzeln durchgeführte 72 h
Nahrungskarenz komplikationslos überstanden. HOSPES et al. (2002) führten wiederholt
wesentlich längere Nahrungskarenzen von fünf bis neun Tagen bei Stuten durch, ohne dass
das Auftreten der Typhlocolitis beobachtet wurde.
Die Bedeutung der Nahrungskarenz für die beiden induzierten Typhlocolitisfälle lässt sich
durch den Rückgang der Kolonisationsresistenz, die im Tiermodell demonstriert werden
konnte (TANNOCK u. SAVAGE 1974; SAVAGE 1982), erklären. Nach einer herabgesetzten
Kolonisationsresistenz ist mit einer erhöhten Gefahr einer durch das Antibiotikum
Erythromycin hervorgerufenen Dysbiose zu rechnen. Ausdruck dieser von GREIß (1995)
näher untersuchten Dysbiose ist vor allem der hochgradige Keimgehalt an verschiedenen
Clostridienarten. Auch wenn für die beiden induzierten Typhlocolitisfälle kein erhöhter
Keimgehalt der beiden enteropathogenen Arten Cl. difficile und Cl. perfringens aufgezeigt
werden konnte, ist die relativ hohe Konzentration an Iso- und n-Valeriansäure im Caecum und

Diskussion 147
Colon ascendens (Tabelle 28) mit einem erhöhten Keimgehalt an anderen Clostridien als
Ausdruck einer Dysbiose zu verstehen (CATO et al. 1986).
Bei dem Versuchspferd „Resinale“ manifestierte sich während der Erythromycin-Applikation
nach der 72 h Nahrungskarenz eine Salmonellose. Der Rückgang der Kolonisationsresistenz
im Zusammenhang mit den Faktoren Nahrungskarenz und Erythromycin-Applikation könnte
auch für diesen Verlauf prädisponierend gewirkt haben.
2.2 Metronidazol-Resistenz der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Isolate
JANG et al. (1997) stellten bei 19 % von 105 getesteten Cl. difficile-Isolaten von Pferden mit
Diarrhoe Metronidazol-Resistenz fest. Dieser Anteil liegt deutlich über den Werten, die in
humanmedizinischen Studien festgestellt wurden (Tabelle 5). Unter Berücksichtigung der
Ergebnisse von JOBST (2001) konnte unter 95 Stämmen bis jetzt erst ein Metronidazolresistenter
toxinogener und ein Metronidazol-resistenter atoxinogener Cl. difficile-Stamm aus
dem Probenmaterial der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover
nachgewiesen werden. Es wird somit angenommen, dass die von JANG et al. (1997)
festgestellte starke Verbreitung der Metronidazol-Resistenz unter equinen Cl. difficile-Isolaten
im Vergleich zu humanmedizinischen Isolaten nicht allgemeingültig ist. Ob der erste
Nachweis der Metronidazol-Resistenz unter Cl. difficile-Isolaten aus der Klinik für Pferde der
Tierärztlichen Hochschule Hannover eine Veränderung der Resistenzlage widerspiegelt, ist
aufgrund der Einzelfälle zweifelhaft. PELÁEZ et al. (2002) konnten in der Untersuchung von
415 humanmedizinischen Cl. difficile-Isolaten aus den Jahren 1993 bis 2000 keine Zunahme
der Metronidazol-Resistenz feststellen.
2.3 Genotypisierung von equinen Cl. perfringens-Isolaten aus dem Probenmaterial des
Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule
Hannover
Bakteriologische Untersuchungen von Darminhaltsproben von Pferden mit Anzeichen einer
Typhlocolitis sollten eine Subtypisierung der Cl. perfringens Typ A-Stämme beinhalten, da
den verschiedenen Subtypen eine unterschiedliche Bedeutung beigemessen wird. Während
WEESE et al. (2001) die Assoziation von Typhlocolitisfällen mit enterotoxinogenen Typ A-
Stämmen herausstellen, messen HERHOLZ et al. (1999) aufgrund ihrer Untersuchungs-

Diskussion 148
ergebnisse β2-toxinogenen Cl. perfringens-Typ A-Stämmen eine Bedeutung im Typhlo-
colitisgeschehen bei. Die entwickelte Multiplex-PCR (MP-PCR) ermöglichte sowohl eine
Typisierung der Cl. perfringens-Isolate durch den Nachweis der vier Majortoxingene als auch
eine Subtypisierung durch den Nachweis des Enterotoxin- und β2-Toxingens. Es wurde ein
Protokoll für die direkte Durchführung der MP-PCR mit Bakterienlysaten etabliert, so dass
diese Methode in die Routinediagnostik des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen
integriert werden konnte.
Mit dieser MP-PCR konnte die Typisierung der Cl. perfringens-Isolate der vier
Versuchspferde und von weiteren 38 equinen Cl. perfringens-Stämmen, die in der
Routinediagnostik aus Darminhaltsproben von Pferden isoliert wurden (Tabelle 29),
erfolgreich durchgeführt werden. 24 der 38 equinen Cl. perfringens-Stämme aus der
Routinediagnostik wurden aus Darminhaltsproben von Pferden mit intestinalen Erkrankungen
(einschließlich fünf bestätigter fibrinös-nekrotisierender Typhlocolitiden) isoliert. Bei keinem
dieser 38 equinen Cl. perfringens-Stämme konnte das für das Enterotoxin kodierende Gen cpe
festgestellt werden. Im Widerspruch zu den Ergebnissen einer kanadischen Studie von
WEESE et al. (2001), aber im Einklang mit früheren Untersuchungen von Proben aus dem
gleichen Einzugsbereich von GAUTSCH et al. (1993) liegen somit keine Hinweise auf eine
Bedeutung von enterotoxinogenen Cl. perfringens-Stämmen für intestinale Erkrankungen des
Pferdes vor.
HERHOLZ et al. (1999) konnten in 13 von 25 typischen und atypischen Typhlocolitisfällen
β2-toxinogene Cl. perfringens-Stämme nachweisen. Der Anteil β2-toxinogener
Cl. perfringens-Isolate war mit 87 % (13 von 15) deutlich höher als der anhand der eigenen
Resultate ermittelte 50%-Anteil unter den Isolaten von Pferden mit intestinalen
Erkrankungen. THIEDE et al. (2000) wiesen das cpb2-Toxingen in 61 % der 23 Stämme von
Typhlocolitis-Pferden und in 33 % der 15 Stämme von gesunden Pferden nach. Aufgrund der
relativ kleinen Probenanzahl in allen drei Untersuchungen muss schon aus statistischen
Gründen mit größeren Abweichungen gerechnet werden. Weitere Erklärungsmöglichkeiten
sind:
• geographische Unterschiede in der Verbreitung und Bedeutung von β2-toxinogenen
Cl. perfringens-Stämmen,
• unterschiedliche Probenzuordnung („atypische Typhlocolitisfälle“),

Diskussion 149
• unterschiedliche Kulturbedingungen, insbesondere Zahl der Passagen und die Dauer der
Sauerstoffexposition, die zu einem Verlust des cpb2-Plasmids führen können (FREY
2002),
• Mischkulturen von β2-toxinogenen und β2-Toxingen-negativen Cl. perfringens-Stämmen,
so dass die Zahl der untersuchten Ausgangskolonien den Nachweiserfolg des β2-
Toxingens bestimmt.
Es wird ausgeschlossen, dass die relativ niedrige Nachweisrate des β2-Toxingens in den
untersuchten Typhlocolitisfällen mit dem möglichen Phänomen der PCR-Selektion (auch als
Primerkompetition bezeichnet) in der Multiplex-PCR zusammenhängt. Durch die Auswahl
von Primern mit gleichen physikalischen und chemischen Eigenschaften wurde die Gefahr der
PCR-Selektion schon bei der Etablierung der Multiplex-PCR minimiert (ELNIFRO et al.
2000). Die Positivkontrollen der verschiedenen Referenzstämme zeigten immer ein cpb2-
Amplifikat. Auch in dem Kontrollreaktionsansatz der Mischkultur, bei dem alle sechs
Toxingene gleichzeitig amplifiziert wurden und die Gefahr der PCR-Selektion wesentlich
größer war als bei der Genotypisierung von equinen Typ A-Stämmen, bei denen nur ein
Majortoxingen vorlag, konnte immer ein cpb2-Amplifikat nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse von HERHOLZ et al. (1999), THIEDE et al. (2000) und die der eigenen
Untersuchung zeigen, dass β2-toxinogene Stämme im Probenmaterial von Pferden mit
intestinalen Erkrankungen und Typhlocolitispatienten im Vergleich zu gesunden Pferden
vermehrt auftreten, so dass von einer enteropathogenen Bedeutung dieser Stämme
ausgegangen werden muss. Bei klinisch gesunden Pferden können β2-toxinogene
Cl. perfringens-Stämme auch auftreten, wie die Untersuchungsergebnisse der vier
Versuchspferde „Ede“, „Agu“, „Resinale“ und „Speranza“ sowie die von THIEDE et al.
(2000) zeigen. Cl. perfringens besitzt aber grundsätzlich in Darminhaltsproben von klinisch
gesunden Pferden eine niedrigere Prävalenz und kommt, wenn überhaupt, nur in einem
geringgradigen Keimgehalt vor (GAUTSCH et al. 1993).

Diskussion 150
2.4 Schlussfolgerungen
Tierärztliche Behandlungsmaßnahmen können unter Klinikbedingungen auch bei klinisch
gesunden Pferden zu einer Ansiedlung und Vermehrung von enteropathogenen Clostridien,
insbesondere toxinogenen Cl. difficile- und β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen,
beitragen. Im Zusammenhang mit einer Laparatomie und der postoperativen Behandlung kann
vor allem vom zweiten bis fünften Tag post operationem eine Kolonisation des Darmkanals
mit diesen toxinogenen Clostridienstämmen auftreten. Bei gesunden Pferden scheint aber die
Kolonisationsresistenz der intakten Darmflora zu verhindern, dass diese enteropathogenen
Arten hohe Keimzahlen erreichen und den Darmkanal langfristig besiedeln.
Die Anfütterungsphase nach längerer Nahrungskarenz prädisponiert die Entstehung einer
Typhlocolitis. In dieser Phase ist vor allem die Ansiedlung und Vermehrung von β2toxinogenen
Cl. perfringens-Stämmen zu erwarten. Im Zusammenhang mit weiteren
Risikofaktoren wie z. B. der oralen Aufnahme von geringen Mengen an Erythromycin
(1,25 mg/kg KG alle 8 h) kann in der Anfütterungsphase nach einer 72 h Nahrungskarenz die
Typhlocolitis des Pferdes experimentell ausgelöst werden. Diese experimentelle Induktion der
Typhlocolitis des Pferdes bestätigt die klinische Beobachtung, dass die Pathogenese der
Typhlocolitis des Pferdes vor allem als Faktorenerkrankung zu verstehen ist.
Die im Darmkanal anzutreffenden toxinogenen Cl. difficile- und vor allem Cl. perfringens-
Isolate eines Pferdes sind oft sehr heterogen. Es können in einer Darminhaltsprobe sogar
unterschiedliche Toxin- und Ribotypen von Cl. perfringens vorliegen. Durch die orale
Aufnahme von geringen Mengen an Erythromycin kann eine Selektion Erythromycinresistenter
Stämme dieser beiden Clostridienarten eintreten. Klinikspezifische
Resistenzspektren der toxinogenen und atoxinogenen Cl. difficile-Stämme könnten
bestimmend dafür sein, ob es durch die orale Aufnahme von Erythromycin zum Auftreten
einer Cl. difficile-assoziierten Typhlocolitis kommt. Die Kolonisation des Dickdarms mit
einem atoxinogenen Cl. difficile-Stamm verhindert wahrscheinlich auch beim Pferd die
Ansiedlung und Vermehrung toxinogener Stämme und führt dadurch möglicherweise zur
Protektion gegenüber einer Cl. difficile-assoziierten Typhlocolitis.

Zusammenfassung 151
3 Zusammenfassung
Baums, Christoph:
Untersuchungen zur Pathogenese der Typhlocolitis des Pferdes
Die Typhlocolitis des Pferdes tritt vor allem als Komplikation beim hospitalisierten Patienten
auf. 20 bis 30 % der Typhlocolitisfälle sind mit toxinogenen Cl. perfringens- und Cl. difficile-
Stämmen assoziiert. Toxinogene (tcdA+; tcdB+) Cl. difficile- und wahrscheinlich auch β2-
toxinogene (cpb2+) Cl. perfringens-Stämme müssen als nosokomiale Erreger der
Typhlocolitis des Pferdes eingestuft werden. Durch zahlreiche quantitative bakteriologische
Untersuchungen (n zwischen 31 und 51 pro Pferd) wurde an vier Versuchspferden untersucht,
ob tierärztliche Behandlungsmaßnahmen (Nahrungskarenz, Laparotomie und Antibiose) unter
Klinikbedingungen die intestinale Ansiedlung und Vermehrung von toxinogenen Cl. difficile-
und β2-toxinogenen Cl. perfringens-Stämmen begünstigen.
In der Anfütterungsphase nach einer 72 h Nahrungskarenz wurde bei zwei Pferden die
Ansiedlung und Vermehrung von β2-toxinogenenen Cl. perfringens-Stämmen festgestellt.
Der Anstieg des Keimgehaltes von β2-toxinogenenen Cl. perfringens-Stämmen auf
> 10 5 KBE/g Kot in dieser Anfütterungsphase war bei einem Pferd („Resinale“) mit einer
Diarrhoe assoziiert.
Aus den Untersuchungsergebnissen der Gentamicin-Applikationsphasen ergab sich kein
Hinweis, dass die Verabreichung dieses Antibiotikums die Ansiedlung und Vermehrung β2-
toxinogener Cl. perfringens-Stämme begünstigt, obwohl alle Isolate Gentamicin-resistent
waren.
Bei keinem der vier Versuchspferde kam es infolge einer medianen Laparotomie zu
klinischen oder hämatologischen Anzeichen einer Typhlocolitis. Am zweiten und dritten Tag
post operationem wurde bei einem Versuchspferd („Ede“) erstmalig ein toxinogener
Cl. difficile- und ein β2-toxinogenener Cl. perfringens-Stamm isoliert. Der wiederholte
Nachweis des gleichen Ribotyps in dieser postoperativen Phase sprach bei beiden Erregern
für eine kurzfristige intestinale Kolonisation. Auch bei zwei weiteren Versuchspferden
wurden post operationem β2-toxinogene und enterotoxinogene Cl. perfringens-Stämme
erstmalig festgestellt, so dass die Laparotomie in Zusammenhang mit der postoperativen

Zusammenfassung 152
Behandlung als Risiko für die Ansiedlung dieser enteropathogenen Clostridien eingestuft
werden muss.
Die von GUSTAFSSON et al. (1997) beschriebene experimentelle Induktion der
Typhlocolitis des Pferdes durch die orale Applikation von Erythromycin ohne vorherige
Nahrungskarenz konnte nicht reproduziert werden. Keines der vier Pferde zeigte Diarrhöe
oder andere Anzeichen einer Typhlocolitis. Die orale Applikation von Erythromycin in dieser
niedrigen Dosierung (1,25 mg/kg KG alle 8 h für 5 Tage) führte aber zu einer Selektion von
Erythromycin-resistenten Cl. difficile- und β2-toxinogenenen Cl. perfringens-Stämmen. Bei
den Cl. difficile-Isolaten wurde eine Assoziation zwischen der Erythromycin-Resistenz und
einem atoxinogenem (tcdA–, tcdB–) Genotyp festgestellt. Diese Assoziation konnte auf einen
bestimmten atoxinogenen Cl. difficile-Stamm (Ribotyp B) zurückgeführt werden, der in der
Klinik weit verbreitet war und das Erythromycin-Resistenzgen erm trug. Die durch die orale
Applikation von Erythromycin hervorgerufenene Ansiedlung dieses atoxinogen Cl. difficile-
Stammes könnte zu einer Protektion gegenüber einer Clostridien-assoziierten Typhlocolitis
beigetragen haben.
Die zuvor einzeln ausgeführten Faktoren Nahrungskarenz und Erythromycin-Applikation
wurden in einem weiteren Experiment kombiniert. Bei zwei Versuchspferden konnte durch
die orale Applikation von Erythromycin (1,25 mg/kg KG alle 8 h per os für 24 bis 48 h) in der
Anfütterungsphase nach einer 72 h Nahrungskarenz die Typhlocolitis experimentell induziert
werden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Klassifizierung der Typhlocolitis als
Faktorenerkrankung. Eine Beteiligung von Cl. difficile und β2-toxinogenenen Cl. perfringens-
Stämmen an der Pathogenese dieser beiden induzierten Typhlocolitisfälle konnte nicht
nachgewiesen werden.
Die Bestimmung des Toxintyps der Clostridien erfolgte mit der PCR. Für die
Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate wurde eine zuverlässige Multiplex-PCR (MP-
PCR) etabliert, die durch den Nachweis der vier Majortoxingene (cpa, cpb, etxD, iap) sowie
des Enterotoxingens (cpe) und des β2-Toxingens (cpb2) eine Typisierung und Subtypisierung
der Cl. perfringens-Isolate ermöglichte. Durch die Entwicklung eines anwendungsfreundlichen
Protokolls, bei dem die MP-PCR direkt mit Bakterienlysaten durchgeführt wird,
konnte diese Methode in die Routinediagnostik des Instituts für Mikrobiologie und
Tierseuchen integriert werden.

Zusammenfassung 153
Neben den 122 Cl. perfringens-Isolaten der vier Versuchspferde wurden noch 38 equine
Cl. perfringens-Stämme aus der Routinediagnostik mit dieser MP-PCR typisiert. Bei 50 % der
Cl. perfringens-Isolate von Pferden mit einer fibrinös-nekrotisierenden Typhlocolitis oder
einem klinischem Verdacht auf eine Typhlocolitis konnte das β2-Toxingen nachgewiesen
werden. Dieser erhöhte Anteil spricht für eine enteropathogene Bedeutung des β2-Toxins
beim Pferd.

Summary 154
4 Summary
Baums, Christoph:
Investigations on the pathogenesis of typhlocolitis in horses
Typhlocolitis in horses is mainly a complication in the hospitalised patient. Twenty to thirty
per cent of all typhlocolitis cases are associated with toxigenic Clostridium (Cl.) perfringens
and Cl. difficile strains. Toxigenic (tcdA+, tcdB+) Cl. difficile and most likely β2-toxigenic
(cpb2+) Cl. perfringens strains should be classified as nosocomial pathogens that may cause
typhlocolitis in horses. Numerous quantitative bacteriological examinations (n between 31
and 51 for each of four experimental horses) were performed to investigate whether veterinary
treatments such as fasting, laparotomy and antibiosis under clinical conditions may promote
the colonisation and proliferation of toxigenic Cl. difficile and β2-toxigenic Cl. perfringens
strains. During resumption of feeding after a 72 h period of starvation the colonisation and
proliferation of β2-toxigenic Cl. perfringens strains was registered. The increase of the
content of β2-toxigenic Cl. perfringens to more than 10 5 colony-forming units/g faeces during
resumption of feeding was associated with diarrhoea in one horse (“Resinale”). The results of
the gentamicin experiments do not indicate that the administration of gentamicin may cause
colonisation and proliferation of β2-toxigenic Cl. perfringens strains, although all of the
isolates were gentamicin resistant.
None of the four experimental horses developed clinical or haematological signs of
typhlocolitis subsequently to median laparotomy. However, on the second and third day post
operationem a toxigenic Cl. difficile and a β2-toxigenic Cl. perfringens strain were isolated
for the first time from faecal samples of the horse “Ede”. The repeated proof of the same
ribotype in this postoperative period is evidence of short-term intestinal colonisation. In
addition β2-toxigenic und enterotoxigenic Cl. perfringens strains were isolated for the first
time post operationem in two other experimental horses. Thus, laparotomy together with
postoperative treatment is considered to be a risk factor for the colonisation of these
enteropathogenic clostridia.
The experimental induction of typhlocolitis through the oral application of erythromycin
without previous fasting described by GUSTAFSSON et al. (1997) could not be reproduced.
None of the four experimental horses showed diarrhoea or any other sign of typhlocolitis.

Summary 155
However, the oral administration of erythromycin at a low dosage (1.25 mg/kg bwt every 8 h
for 5 days) caused selection of erythromycin-resistant Cl. difficile und β2-toxigenic
Cl. perfringens strains. There was an association between erythromycin-resistance and an
atoxigenic (tcdA–, tcdB–) genotype among the Cl. difficile isolates. This association is
attributed to an atoxigenic Cl. difficile strain (ribotype B), which carried the erythromycinresistence
gene erm and was widely distributed in the Clinic for Horses of the School of
Veterinary Medicine Hannover. The colonisation of the atoxigenic Cl. difficile strain caused
by the oral administration of erythromycin might have resulted in protection against
clostridial typhlocolitis.
The risk factors starvation and erythromycin administration, which had already been tested
separately, were capable of causing typhlocolitis only if they occurred together. In two
experimental horses typhlocolitis could be induced through the oral administration of
erythromycin (1.25 mg/kg bwt every 8 h for 24 h to 48 h) during resumption of feeding after
72 hours of fasting. These results are in accordance with the classification of equine
typhlocolitis as a multiple-factor disease. No involvement of Cl. difficile and β2-toxigenic
Cl. perfringens strains in the pathogenesis of these two induced typhlocolitis cases could be
demonstrated.
Different PCR assays were used to determine the toxintype of the clostridia. For genotyping
of Cl. perfringens isolates a reliable multiplex PCR (MP-PCR) was established to detect the
four major toxin genes (cpa, cpb, etxD, iap) as well as the enterotoxin gene (cpe) and β2-toxin
gene (cpb2) and thus to allow typing and subtyping of Cl. perfringens isolates. The
development of a user-friendly protocol made it possible to integrate the MP-PCR into the
routine diagnostic procedure of the Institute for Microbiology and Epidemic Diseases of the
School of Veterinary Medicine Hannover. In addition to the 122 Cl. perfringens-isolates of
the four experimental horses 38 further equine Cl. perfringens strains which were isolated by
routine diagnostic testing were typed with this MP-PCR. The β2-toxin gene was detected in
about 50 % of Cl. perfringens isolates from horses with signs of typhlocolitis. This increased
proportion is evidence of enteropathogenic relevance of the β2-toxin in the horse.

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Antagonism of toxigenic Clostridium difficile by nontoxigenic C. difficile.
J. Infect. Dis. 147, 4, 733–736
WISE, R., u. R. C. BALLARD (1989):
Review of the in vitro evaluation of ECE 22101.
J. Antimicrob. Chemother. 23 (Suppl.), 7–16
WÜST, J., u. U. HARDEGGER (1983):
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difficile.
Antimicrob. Agents Chemother. 23, 784–786
WÜST, J., u. U. HARDEGGER (1992):
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anaerobic bacteria.
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11, 1169–1173
ZHAO, Y., u. S. B. MELVILLE (1998):
Identification and characterization of sporulation-dependent promoters upstream of the
enterotoxin gene (cpe) of Clostridium perfringens.
J. Bacteriol. 180, Nr. 1, 136–142

Anhang 199
6 Anhang
6.1 Nährmedien
Brillantgrün-Phenolrot-Laktose-Saccharose-Selektivnährboden:
Herstellung nach den Anweisungen des Herstellers (Merck, Darmstadt, Deutschland)
„Clostridium difficile“-Nährboden:
Clostridium-Difficile-Agar-Basis
(Oxoid, Wesel, Deutschland)
69 g
Natrium Taurocholat 1,0 g
dest. H20 1000 ml
Herstellung: Nach dem Autoklavieren bei 110°C für 15 min wurde das Nährmedium auf
50 °C abgekühlt und 2 Flaschen Clostridium-Difficile-Supplement (Oxoid, Wesel,
Deutschland) hinzugefügt. 1 Flasche Clostridium-Difficile-Supplement enthält 0,25 g
Cystein-HCl, 0,006 g Norfloxacin und 0,016 g Moxalactam. Anschließend erfolgte die
Zugabe von 70 ml defibriniertem Pferdeblut.
„Clostridium difficile“-Bouillon:
Clostridium-Difficile-Basis 69 g
(Oxoid, Wesel, Deutschland)
Natrium Taurocholat 1,0 g
dest. H20 1000 ml
Herstellung: Autoklavieren bei 110°C für 15 min, Abkühlen auf 50 °C und 2 Flaschen
Clostridium-Difficile-Supplement (Oxoid, Wesel, Deutschland) hinzufügen.
Clostridien-Selektiv-Nährboden:
Clostridium-Agar
(Oxoid, Wesel, Deutschlan)
52,5 g
Agar 2,0 g
Kanamycin 0,012 g
dest. H20 1000 ml
Herstellung: Autoklavieren bei 110 °C für 15 min, Abkühlen auf 55 °C und Zugabe von:
Neomycin 0,075g
defibriniertem Rinderblut 100 ml

Anhang 200
Columbia-Blutagar:
Fertiger Nährboden der Firma Oxoid (Wesel, Deutschland)
Leberbouillon:
Herstellung: Leberstücke mit einer Größe von 3 x 1 x 1 cm wurden auf Reagenzröhrchen
verteilt. Nach dem Lösen von 0,8 g Agar in 1000 ml Nährbouillon erfolgte die Zugabe von
8 ml zu jedem Röhrchen und das Autoklavieren bei 121 °C für 15 min.
Nährbouillon:
NaCl 5 g
Pepton 10 g
Fleischextrakt 10 g
NaOH 1,5 ml
dest. H20 1000 ml
Autoklavieren bei 110°C für 15 min
PRAS-Medium (HOLDEMAN et al. 1977):
KH2PO4 0,5 g
K2HPO4 0,5 g
NaHCO3 5,0 g
NaCl 1,0 g
CaCl2 0,1 g
MgSO4 x 7 H20 0,1 g
Resazurin 0,001g
Cysteinhydrochlorid 5,0 g
Lösen in heißem dest. H20 1000 ml
Herstellung: CaCl2 und MgSO4 wurde in je 10 ml heißem dest. H20 separat gelöst und
anschließend zur Salzlösung hinzufgefügt. Die Lösung wurde bis zur Resazurin-Reduktion
erhitzt. Anschließend erfolgte das Abfüllen von je 9 ml in Glasröhrchen, die in einer
Pressvorrichtung fixiert und bei 110°C für 15 min autoklaviert wurden.
Rambach-Salmonellen-Selektivagar (RAMBACH ® -Agar):
Herstellung nach den Anweisungen des Herstellers (Oxoid, Wesel, Deutschland)

Anhang 201
Rappaport-Vassiliadis-Anreicherungsmedium:
Herstellung nach den Anweisungen des Herstellers (Oxoid, Wesel, Deutschland)
Schaedler-Nährboden:
Schaedler-Agar
(Becton-Dickinson, Heidelberg)
41,9 g
dest. H20 950 ml
Herstellung: Autoklavieren bei 110 °C für 15 min, Abkühlen auf 55 °C und Zugabe von:
Vitamin K1-Lösung 1,0 ml
defibriniertem Rinderblut 50 ml
Vitamin K1-Lösung:
Vitamin K1 0,2 g
Lösen in 96 % Ethanol 20 ml
Tetrathionat-Brillantgrün-Galle-Bouillon (TBG-Bouillon):
Herstellung nach den Anweisungen des Herstellers (Merck, Darmstadt, Deutschland)
Wilkins-Chalgren-Nährboden:
Wilkins-Chalgren-Anaerobier-Agar 43 g
(Oxoid, Hampshire, England)
dest. H20 1000 ml
Autoklavieren bei 110 °C für 15 min.

Anhang 202
6.2 Abbildungen
Abbildung 4: Caecum von Versuchspferd „Agu“ intra operationem nach 24 h
Nahrungskarenz; Punktion zur Gewinnung von Caecuminhalt für die
bakteriologische und gaschromatographische Untersuchung

Anhang 203
Abbildung 5: Cl. difficile-Zytotoxinnachweis (Abrundung): Subkonfluente Swiss 3T3
Fibroblasten nach 3 h Exposition mit 1:2 verdünntem Wasserextrakt der
Kotprobe vom 2. Tag post operationem von Pferd „Ede“
Abbildung 6: Negativkontrolle des Zytotoxizitätstests (vitale Swiss 3T3 Fibroblasten)

Anhang 204
Abbildung 7: Etest ® zur MHK-Bestimmung von Erythromycin für das β2-toxinogene
Cl. perfringens-Isolat s117 vom 2. Tag post operationem von „Ede“
(MHK = 2 µg/ml)
Abbildung 8: Etest ® zur MHK-Bestimmung von Erythromycin für das β2-toxinogene
Cl. perfringens-Isolat s183 aus der 1. Erythromycin-Applikationsphase
von „Ede“ (MHK ≥ 256 µg/ml)

Anhang 205
Abbildung 9: Caecum von Pferd „Ede“ nach der Euthanasie: katarrhalische
Typhlocolitis 24 h nach Beginn der Erythromycin-Applikation
(1,25 mg/kg KG alle 8 h per os) nach 72 h Nahrungskarenz
Abbildung 10: Caecum von Pferd „Agu“ nach der Euthanasie: fibrinös-nekrotisierende
Typhlocolitis mit einzelnen Ulcera 48 h nach Beginn der Erythromycin-
Applikation (1,25 mg/kg KG alle 8 h per os) nach 72 h Nahrungskarenz

Anhang 206
Abbildung 11: Colon ascendens von Pferd „Agu“ nach der Euthanasie: fibrinösnekrotisierende
Typhlocolitis mit Pseudomembranen 48 h nach Beginn
der Erythromycin-Applikation (1,25 mg/kg KG alle 8 h per os) nach 72 h
Nahrungskarenz
Abbildung 12: Direkte Durchführung der MP-PCR mit 24 h bei 37°C auf Schaedler-
Nährboden anaerob inkubierten Cl. perfringens-Kolonien nach Hitzelyse

Anhang 207
6.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Experimentelle Induktionen der Typhlocolitis des Pferdes durch die
Applikation von Antibiotika .............................................................................. 33
Tabelle 2: Einige Virulenzfaktoren von Cl. difficile........................................................... 35
Tabelle 3: Typisierung von Cl. difficile .............................................................................. 44
Tabelle 4: Virulenzfaktoren von Cl. perfringens Typ A-Stämmen, die für die
Ätiopathogenese der Typhlocolitis des Pferdes von Bedeutung sein
könnten............................................................................................................... 50
Tabelle 5: Verbreitung von Antibiotikaresistenzen bei Cl. difficile und
Cl. perfringens ................................................................................................... 57
Tabelle 6: Kennzeichen der vier Versuchspferde ............................................................... 61
Tabelle 7: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Ede“.................................................................................................................. 63
Tabelle 8: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Agu“ ................................................................................................................. 64
Tabelle 9: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Resinale“ .......................................................................................................... 65
Tabelle 10: Behandlungsmaßnahmen und Probenentnahmen von Versuchspferd
„Speranza“ ......................................................................................................... 66
Tabelle 11: Eingesetzte Medikamente .................................................................................. 68
Tabelle 12: Bewertungsstufen der MHK-Werte ................................................................... 78
Tabelle 13: Primersequenzen, Zielsequenz und Amplifikatgröße der PCR zum
Nachweis des Erythromycinresistenzgens erm von Cl. difficile........................ 81
Tabelle 14: Zielsequenzen der MP-PCR für die Genotypisierung von Cl. perfringens ....... 82
Tabelle 15: Primersequenzen und Amplifikatgrößen der MP-PCR für die
Genotypisierung von Cl. perfringens................................................................. 82
Tabelle 16: Restriktionsverdauanalyse der Amplifikate der MP-PCR für die
Genotypisierung von Cl. perfringens................................................................. 85
Tabelle 17: Primer für die Generierung des 16S rDNA-Amplifikates von
Cl. perfringens-DNA ......................................................................................... 86
Tabelle 18: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Ede“ ......................................................................................... 94

Anhang 208
Tabelle 19: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Agu“....................................................................................... 102
Tabelle 20: Merkmale der ribotypisierten Cl. perfringens-Isolate von Versuchspferd
„Agu“ ............................................................................................................... 105
Tabelle 21: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Resinale“................................................................................ 108
Tabelle 22: Merkmale der ribotypisierten Cl. perfringens-Isolate von Versuchspferd
„Resinale“ ........................................................................................................ 113
Tabelle 23: Ergebnis der Cl. perfringens- und Cl. difficile-Diagnostik von
Versuchspferd „Speranza“ ............................................................................... 116
Tabelle 24: Merkmale der ribotypisierten Cl. perfringens-Isolate von Versuchspferd
„Speranza“ ....................................................................................................... 119
Tabelle 25: Resistenzmuster der Cl. difficile- und Cl. perfringens-Isolate......................... 120
Tabelle 26: Verbreitung von Antibiotikaresistenzen bei Cl. difficile- und Cl.
perfringens-Isolaten der vier Versuchspferde.................................................. 121
Tabelle 27: Merkmale der Cl. difficile-Isolate der vier Versuchspferde............................. 126
Tabelle 28: Konzentration kurzkettiger Fettsäuren im Caecumchymuswasser der vier
Versuchspferde nach der 24 h Nahrungskarenz in der Laparotomie und
nach der Sektion in mmol/l.............................................................................. 129
Tabelle 29: Ergebnis der Genotypisierung von equinen Cl. perfringens-Isolaten aus
dem Untersuchungsmaterial des Instituts für Mikrobiologie und
Tierseuchen vom 1.9.00 bis zum 15.7.02 ........................................................ 131

Anhang 209
6.4 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Genotypisierung der Cl. perfringens-Isolate von Pferd „Ede“ ........................ 98
Abbildung 2: PCR der Toxingene tcdA (A) und tcdB (B) sowie des Erythromycin-
Resistenzgens erm (C) von Cl. difficile-Isolaten von Pferd „Resinale“: ....... 111
Abbildung 3: Keimzahl von Cl. perfringens im Verlauf der 72 h Nahrungskarenz bei
den Versuchspferden „Resinale“ und „Speranza“ ......................................... 123
Abbildung 4: Caecum von Versuchspferd „Agu“ intra operationem nach 24 h
Nahrungskarenz; Punktion zur Gewinnung von Caecuminhalt für die
bakteriologische und gaschromatographische Untersuchung........................ 202
Abbildung 5: Cl. difficile-Zytotoxinnachweis (Abrundung): Subkonfluente Swiss 3T3
Fibroblasten nach 3 h Exposition mit 1:2 verdünntem Wasserextrakt der
Kotprobe vom 2. Tag post operationem von Pferd „Ede“ ............................. 203
Abbildung 6: Negativkontrolle des Zytotoxizitätstests (vitale Swiss 3T3 Fibroblasten)..... 203
Abbildung 7: Etest ® zur MHK-Bestimmung von Erythromycin für das β2-toxinogene
Cl. perfringens-Isolat s117 vom 2. Tag post operationem von „Ede“
(MHK = 2 µg/ml)........................................................................................... 204
Abbildung 8: Etest ® zur MHK-Bestimmung von Erythromycin für das β2-toxinogene
Cl. perfringens-Isolat s183 aus der 1. Erythromycin-Applikationsphase
von „Ede“ (MHK ≥ 256 µg/ml) ..................................................................... 204
Abbildung 9: Caecum von Pferd „Ede“ nach der Euthanasie: katarrhalische
Typhlocolitis 24 h nach Beginn der Erythromycin-Applikation
(1,25 mg/kg KG alle 8 h per os) nach 72 h Nahrungskarenz......................... 205
Abbildung 10: Caecum von Pferd „Agu“ nach der Euthanasie: fibrinös-nekrotisierende
Typhlocolitis mit einzelnen Ulcera 48 h nach Beginn der Erythromycin-
Applikation (1,25 mg/kg KG alle 8 h per os) nach 72 h Nahrungskarenz..... 205
Abbildung 11: Colon ascendens von Pferd „Agu“ nach der Euthanasie: fibrinösnekrotisierende
Typhlocolitis mit Pseudomembranen 48 h nach Beginn
der Erythromycin-Applikation (1,25 mg/kg KG alle 8 h per os) nach
72 h Nahrungskarenz ..................................................................................... 206
Abbildung 12: Direkte Durchführung der MP-PCR mit 24 h bei 37°C auf Schaedler-
Nährboden anaerob inkubierten Cl. perfringens-Kolonien nach Hitzelyse... 206

Danksagung
Ich möchte mich an dieser Stelle vor allem bei Herrn Prof. Dr. G. Amtsberg für die
Bereitstellung des interessanten Themas sowie die jederzeit engagierte Betreuung und
Unterstützung herzlich bedanken.
Herrn Prof. Dr. E. Deegen und Herrn Dr. C. Bartmann sowie zahlreichen weiteren
Mitarbeitern der Klinik für Pferde danke ich für die Unterstützung meiner Arbeit, unter
anderem für die Bereitstellung und Versorgung der Pferde, die Durchführung der
Laparotomie und die labordiagnostischen Messungen.
Herrn Prof. Dr. J. Pohlenz und Herrn Dr. M. Peters sowie weiteren Mitarbeitern des Instituts
für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover möchte ich für die Durchführung der
Sektionen, die histologischen Untersuchungen und die Anfertigung der Bilder meinen Dank
aussprechen.
Weiterhin richtet sich mein Dank an Herrn Prof. Dr. M. Coenen und Herrn P. Rust aus dem
Institut für Tierernährung für die gaschromatographischen Messungen.
Herrn Prof. Dr. I. Just und Herrn Dr. K. Hofmann, Zentrum Pharmakologie und Toxikologie
der Medizinischen Hochschule Hannover, danke ich für die Durchführung der
Zytotoxizitätstests.
Weiterhin richtet sich mein Dank an alle Mitarbeiter und Doktoranden des Instituts für
Mikrobiologie und Tierseuchen für die Hilfsbereitschaft und Freundlichkeit. Herrn Dr.
R. Goethe möchte ich herzlich für die Betreuung der molekularbiologischen Arbeiten und die
Auseinandersetzung mit meiner Dissertation danken. Weiterhin möchte ich Herrn J. Merkel
für die Hilfestellungen zur digitalen Bearbeitung sowie allen Mitarbeitern des diagnostischen
Labors, der Nährboden- und Spühlküche für die starke Unterstützung meinen Dank
aussprechen.
Ich möchte mich an dieser Stelle auch bei Herrn Prof. Dr. M. Wittenbrink bedanken. Ohne ihn
wäre ich nie zu der netten Arbeitsgruppe von Prof. Amtsberg gestoßen.
Besonders bedanke ich mich bei meinen Eltern und Cordula, die mir während des Studiums
und der Promotion immer zur Seite standen und mir das Erreichen meiner Ziele ermöglichen.