Anti-TSH-Rezeptor (TRAK)-ELISA (IgG) Arbeitsanleitung

Anti-TSH-Rezeptor (TRAK)-ELISA (IgG)
Arbeitsanleitung
BESTELL-NR. ANTIKÖRPER GEGEN IG-KLASSE SUBSTRAT FORMAT
EA 1015-9601 G
TSH-Rezeptor
(Thyreotropin-Rezeptor)
IgG
Ag-beschichtete
Mikrotitergefäße
Indikation: Nachweis und Ausschluss sowie Therapiekontrolle von Morbus Basedow.
96 x 01 (96)
Testprinzip: Der vorliegende ELISA-Testsatz dient der quantitativen In-vitro-Bestimmung humaner
Autoantikörper gegen Thyreotropin (TSH)-Rezeptor (TRAK). Die Testpackung enthält Mikrotiterstreifen
zu je 8 vereinzelbaren Reagenzgefäßen, die mit TSH-Rezeptor beschichtet sind. Die Reagenzgefäße
werden im ersten Analyseschritt mit den Patientenseren inkubiert. Bei positiven Proben binden sich
spezifische Antikörper an die TSH-Rezeptoren. Die gebundenen Antikörper inhibieren die Bindung von
Biotin-markiertem TSH, welches in einem zweiten Inkubationsschritt in die Reagenzgefäße gegeben
wird. Zur Detektion des gebundenen Biotins wird ein dritter Inkubationsschritt mit Enzym-markiertem
Avidin (Enzymkonjugat) ausgeführt, das eine sich anschließende Farbreaktion katalysiert. Die
Intensität der gebildeten Farbe verhält sich umgekehrt proportional zur Konzentration der Antikörper
gegen TSH-Rezeptor.
Inhalt einer Testpackung:
Bezeichnung Farbe Format Symbol
1. Antigen-beschichtete Reagenzgefäße
12 Mikrotiterstreifen zu je 8 vereinzelbaren
Reagenzgefäßen im Rahmen, gebrauchsfertig
--- 12 x 8 .STRIPS.
2. Kalibrator 1
40 IE/l (IgG, human), gebrauchsfertig
farblos 1 x 1,0 ml .CAL 1.
3. Kalibrator 2
8 IE/l (IgG, human), gebrauchsfertig
farblos 1 x 1,0 ml .CAL 2.
4. Kalibrator 3
2 IE/l (IgG, human), gebrauchsfertig
farblos 1 x 1,0 ml .CAL 3.
5. Kalibrator 4
1 IE/l (IgG, human), gebrauchsfertig
farblos 1 x 1,0 ml .CAL 4.
6. Negative Kontrolle
0 IE/l (IgG, human), gebrauchsfertig
farblos 1 x 1,0 ml .NEG CONTROL.
7. Positive Kontrolle
(IgG, human), gebrauchsfertig
farblos 1 x 1,0 ml .POS CONTROL.
8. Probenpuffer, gebrauchsfertig gelb 1 x 10 ml .SAMPLE BUFFER.
9. TSH
Biotin-markiertes Thyreotropin, lyophilisiert
farblos 3 x 4,5 ml .TSH.
10. TSH-Puffer, gebrauchsfertig rot 1 x 15 ml .TSH BUFFER.
11. Enzymkonjugat
farblos 1 x 0,75 ml .CONJUGATE 20x.
Peroxidase-markiertes Avidin, 20fach konzentriert
12. Konjugatpuffer, gebrauchsfertig farblos 1 x 15 ml .CONJ BUFFER.
13. Waschpuffer, 10fach konzentriert farblos 1 x 100 ml WASH BUFFER 10x.
14. Chromogen/Substrat-Lösung
TMB/H2O2, gebrauchsfertig
farblos 1 x 15 ml .SUBSTRATE.
15. Stopplösung
farblos 1 x 10 ml .STOP SOLUTION.
0,5 M Schwefelsäure, gebrauchsfertig
16. Haftfolie --- 1 Stück
17. Qualitätskontrollzertifikat --- 1 Protokoll
18. Arbeitsanleitung --- 1 Heft
.LOT. Chargen-Bezeichnung Lagertemperatur
.IVD. In-vitro-Diagnostikum ungeöffnet verwendbar bis
Änderungen zur Vorversion sind grau unterlegt.

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Lagerung und Haltbarkeit: Die Testpackung ist bei +2 °C bis +8 °C aufzubewahren, nicht einfrieren!
Ungeöffnet sind die Testsatzkomponenten bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar.
Entsorgung: Patientenproben, Kalibratoren, Kontrollen und inkubierte Mikrotiterstreifen sind wie
infektiöser Abfall zu handhaben. Alle Reagenzien sind nach den gesetzlichen Vorschriften zu entsorgen.
Vorbereitung und Haltbarkeit der Reagenzien
Hinweis: Sämtliche Reagenzien müssen ca. 30 Minuten vor Gebrauch auf Raumtemperatur (+18 °C bis
+25 °C) gebracht werden. Nach erstmaligem Öffnen sind die Reagenzien bis zum angegebenen
Verfallsdatum haltbar, wenn sie bei +2 °C bis +8 °C gelagert und gegen Kontamination geschützt
werden, und es im nachfolgenden Text nicht ausdrücklich anders beschrieben ist.
- Beschichtete Reagenzgefäße: Gebrauchsfertig. Die Schutzhülle der Mikrotiterplatte aufschneiden.
Schutzhülle erst öffnen, wenn der Inhalt Raumtemperatur angenommen hat, damit die Präparate
nicht feucht werden! Nicht gebrauchte Reagenzgefäße einer angebrochenen Mikrotiterplatte sofort
wieder in die Schutzhülle legen und mit der integrierten Gripnaht dicht verschließen (Trockenbeutel
nicht entfernen).
Nach dem erstmaligen Öffnen der Schutzhülle sind die Antigen-beschichteten Reagenzgefäße
trocken bei +2 °C bis +8 °C gelagert bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar.
- Kalibratoren und Kontrollen: Gebrauchsfertig. Die Reagenzien sind vor Gebrauch gründlich zu
durchmischen.
- TSH: Lyophilisiert. Der Inhalt eines Fläschchens ist mit 4,5 ml TSH-Puffer zu rekonstituieren. Wenn
mehrere Fläschchen verwendet werden sollen, sind deren Inhalte nach Rekonstitution zu vereinigen.
Das rekonstituierte TSH ist vor Gebrauch gründlich zu durchmischen, ohne dass sich Luftblasen bil-
den.
Das rekonstituierte TSH ist, bei +2 °C bis +8 °C gelagert, maximal 4 Wochen lang haltbar. Wenn das
rekonstituierte TSH nicht vollständig aufgebraucht werden soll, kann dies bei -20 °C bis zum
angegebenen Verfallsdatum aufbewahrt werden.
- Enzymkonjugat: Das Enzymkonjugat ist 20fach konzentriert. Das benötigte Volumen ist dem
Fläschchen mit einer sauberen Pipettenspitze zu entnehmen und mit Konjugatpuffer zu verdünnen
(1 Teil Reagenz plus 19 Teile Konjugatpuffer). Das Enzymkonjugat ist vor Gebrauch gründlich zu
durchmischen.
Das gebrauchsfertige Enzymkonjugat ist, bei +2 °C bis +8 °C gelagert bis zum angegebenen
Verfallsdatum haltbar.
- Probenpuffer: Gebrauchsfertig.
- Waschpuffer: Der Waschpuffer ist 10fach konzentriert. Sollten im konzentrierten Puffer Salzkristalle
auftreten, den Puffer auf 37 °C erwärmen und vor dem Verdünnen gut durchmischen. Das benötigte
Volumen ist der Flasche mit einer sauberen Pipettenspitze zu entnehmen und mit entionisiertem oder
destilliertem Wasser zu verdünnen (1 Teil Reagenz plus 9 Teile Wasser).
Beispiel: Für 1 Mikrotiterstreifen 5 ml Konzentrat plus 45 ml Wasser.
Der gebrauchsfertig verdünnte Waschpuffer ist bei +2 °C bis +8 °C gelagert und bei sachgerechter
Handhabung bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar.
- Chromogen/Substrat-Lösung: Gebrauchsfertig. Die Flasche sofort nach Gebrauch wieder verschließen,
da die Lösung lichtempfindlich ist. Die Chromogen/Substrat-Lösung muss klar sein, wenn
sie vor Benutzung bereits bläulich gefärbt ist, darf sie nicht mehr verwendet werden.
- Stopplösung: Gebrauchsfertig.
- Warnung: In den Kontrollen und den Kalibratoren ließen sich weder HBsAg, noch Antikörper gegen
HCV, HIV-1 und HIV-2 nachweisen. Dennoch sollte man mit allen Testkomponenten ebenso
vorsichtig umgehen wie mit infektiösem Material. Einige der Reagenzien enthalten außerdem das
giftige Natri-umazid, Hautkontakt ist zu vermeiden.
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Probenmaterial: Humanes Serum.
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Vorbereitung und Haltbarkeit der Proben
Haltbarkeit: Die zu untersuchenden Patientenproben können in der Regel bei +2 °C bis +8 °C bis zu
14 Tage aufbewahrt werden. Stark hämolytische oder lipämische Serumproben sollten nicht verwendet
werden. Plasmaproben dürfen nicht verwendet werden.
Inkubation
Für die Durchführung eines quantitativen Tests verwendet man die Kalibratoren 1-4, negative
Kontrolle, positive Kontrolle und Patientenproben.
(Teil-) manuelle Testdurchführung
Proben-Inkubation:
(1. Schritt)
Jeweils 75 µl Probenpuffer in die zu verwendenden Reagenzgefäße
pipettieren. Entsprechend dem Pipettierschema je 75 µl Kalibrator, Negativund
Positivkontrolle oder Patientenproben in die einzelnen Reagenzgefäße
pipettieren. Die Reagenzgefäße abdecken und 2 Stunden auf einem
Mikrotiter-
plattenschüttler (500-700 U/min) bei Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C)
inkubieren.
Waschen: Manuell: Haftfolie entfernen. Reagenzgefäße entleeren und anschließend 1x
mit jeweils 350 µl gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer waschen.
Automatisch: Reagenzgefäße entleeren und anschließend 1x mit je 450 µl
gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer waschen (Programm-Einstellung:
z.B. TECAN Columbus Washer „Overflow Modus“).
TSH-Inkubation:
(2. Schritt)
Den Waschpuffer in jedem Reagenzgefäß 30-60 Sekunden einwirken lassen,
anschließend absaugen oder ausschütten. Nach dem Waschvorgang bei
manueller Durchführung die Mikrotiterplatte mit den Öffnungen nach unten
kräftig auf Vliespapier ausschlagen, um Waschpufferreste vollständig zu
entfernen.
Freie Positionen innerhalb des Mikrotiterstreifens sind mit leeren
Reagenzgefäßen desselben Plattenformates wie das des zu untersuchenden
Parameters aufzufüllen.
Jeweils 100 µl TSH (Biotin-markiertes Thyreotropin) in die Reagenzgefäße
pipettieren. 25 Minuten bei Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) inkubieren.
Waschen: Reagenzgefäße entleeren. Waschen wie oben.
Konjugat-Inkubation:
(3. Schritt)
Jeweils 100 µl Enzymkonjugat (Peroxidase-markiertes Avidin) in die
Reagenzgefäße pipettieren. 20 Minuten bei Raumtemperatur (+18 °C bis
+25 °C) inkubieren.
Waschen: Manuell: Reagenzgefäße entleeren, 2x mit jeweils 350 µl gebrauchsfertig
verdünntem Waschpuffer und anschließend 1x mit 350 µl entionisiertem
oder destilliertem Wasser waschen.
Automatisch: Reagenzgefäße entleeren und anschließend 3x mit je 450 µl
gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer waschen (Programm-Einstellung:
z.B. TECAN Columbus Washer „Overflow Modus“).
Achtung: Flüssigkeitsreste (>10 µl), die nach dem Waschvorgang in den
Reagenzgefäßen verbleiben, können einen Einfluss auf die Substratumsetzung
haben und zu falsch erniedrigten Extinktionswerten führen.
Unzureichendes Waschen (z.B. weniger als 3 Waschzyklen, zu geringe
Waschpuffervolumina oder zu geringe Einwirkzeiten) kann zu falsch erhöhten
Extinktionswerten führen.
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Substrat-Inkubation:
(4. Schritt)
Stoppen:
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Jeweils 100 µl Chromogen/Substrat-Lösung in die Reagenzgefäße pipettieren.
30 Minuten bei Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) inkubieren (vor direkter
Sonneneinstrahlung schützen).
Jeweils 50 µl Stopplösung in die Reagenzgefäße pipettieren, in der gleichen
Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit, wie bei der Zugabe der
Chromogen/Substrat-Lösung.
Messen: Die photometrische Auswertung der Farbintensität sollte innerhalb von
30 Minuten nach dem Stoppen erfolgen, bei 450 nm Messwellenlänge und
einer Referenzwellenlänge zwischen 620 nm und 650 nm. Vor dem Messen
die Mikrotiterplatte vorsichtig schütteln, um eine homogene Verteilung
der Farblösung zu gewährleisten.
Testdurchführung mit vollautomatischen Analysegeräten
Die Probenverdünnung und anschließende Testabarbeitung erfolgen vollautomatisch mit dem
Analysegerät. Die in der jeweiligen von EUROIMMUN autorisierten Software hinterlegten
Inkubationsbedingungen können geringfügig von den Angaben der ELISA-Testanleitung abweichen,
sind jedoch in der Kombination EUROIMMUN Analyzer I und dem vorliegenden EUROIMMUN-ELISA
validiert worden. Eine Validierungsdokumentation ist auf Anfrage erhältlich.
Eine Automatisierung auf weiteren offenen, vollautomatischen Analysegeräten ist möglich, die
Kombination muss jedoch vom Anwender validiert sein.
Pipettierschema
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A K 1 P 3 P 11 P 19
B K 2 P 4 P 12 P 20
C K 3 P 5 P 13 P 21
D K 4 P 6 P 14 P 22
E neg. P 7 P 15 P 23
F pos. P 8 P 16 P 24
G P 1 P 9 P 17 P 25
H P 2 P 10 P 18 P 26
Das für die Mikrotiterstreifen 1-4 angegebene Pipettierschema gilt beispielhaft für die quantitative
Analyse von 26 Patientenproben (P 1 bis P 26).
Kalibratoren (K 1 bis K 4), negative (neg.) und positive (pos.) Kontrolle, sowie Patientenproben werden
jeweils in Einzelbestimmung eingesetzt. Die Zuverlässigkeit der Bestimmung kann noch gesteigert
werden, wenn man jede Probe doppelt einsetzt.
Die positive und die negative Kontrolle dienen als interne Prüfung für die Zuverlässigkeit des
Testverlaufs. Sie sollten bei jedem Testdurchlauf verwendet werden.
Testauswertung
Quantitativ: Nach Auftragen der gemessenen Extinktionen für die 4 Kalibratoren und die negative
Kontrolle als Nullkalibrator im linearen Maßstab auf der y-Achse gegen die entsprechenden Konzen-
trationen im logarithmischen Maßstab auf der x-Achse kann eine Kalibrationskurve erstellt werden, mit
deren Hilfe die TSH-Rezeptor-Antikörper-Konzentrationen der unbekannten Proben ermittelt werden
können. Zur computergesteuerten Berechnung der Kalibrationskurve können folgende
Auswerteverfahren alternativ verwendet werden: 4 Parameter Logistik oder Spline-Funktion.
Nachfolgend ist ein typisches Beispiel für eine Kalibrationskurve aufgeführt. Verwenden Sie diese Kurve
bitte nicht zur Ermittlung der TSH-Rezeptor-Antikörper-Konzentrationen in Patientenproben.
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Liegt die Extinktion einer Patientenprobe unterhalb des Kalibrators 1 (40 IE/l), ist das Ergebnis mit
„>40 IE/l“ anzugeben. Es empfiehlt sich, diese Probe mit TRAK-negativem Serum z.B. 1:10 zu
verdünnen und in einem neuen Testansatz wiederholt zu messen. Das aus der Kalibrationskurve
ermittelte Ergebnis in IE/l muss entsprechend diesem Beispiel dann noch mit dem Verdünnungsfaktor 10
multipliziert werden.
Der von EUROIMMUN empfohlene obere Grenzwert des Normalbereiches (Cut-Off) beträgt
2 internationale Einheiten pro Liter (IE/l). EUROIMMUN schlägt folgende Befundinterpretation vor:

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Linearität: Zur Bestimmung der Linearität des Tests wurden Verdünnungsreihen von Patientenproben
mit hohen Antikörperkonzentrationen untersucht. Der ELISA ist im Konzentrationsbereich von 0 - 20 IE/l
linear.
Nachweisempfindlichkeit: Die untere Nachweisgrenze ist definiert als der mittlere Extinktionswert
abzüglich der zweifachen Standardabweichung einer analytfreien Probe (kompetitive Testkonfiguration)
und gibt den geringsten eindeutig erfassbaren Antikörpertiter an. Die untere Nachweisgrenze des TSH-
Rezeptor-Antikörper-ELISA beträgt 0,2 IE/l.
Funktionelle Sensitivität: Die funktionelle Sensitivität, die mittels des Präzisionsprofils des ELISA
bestimmt wurde, liegt nahe der Konzentration des Kalibrators 4 (1 IE/l).
Analytische Spezifität: Der vorliegende ELISA weist spezifisch die gegen TSH-Rezeptor gerichteten
Autoantikörper nach, die zu einer Bindungshemmung von TSH an TSH-Rezeptor führen (TBII, TSHbinding
inhibitory immunoglobulins). Die Analyse von 44 Seren von Patienten mit unterschiedlichen
Autoimmunerkrankungen (Herkunft: Europa) zeigte keinen Einfluss von Autoantikörpern gegen
Thyreoglobin, Thyreoperoxidase, Glutamat-Decarboxylase, 21-Hydroxylase, Acetylcholinrezeptoren,
dsDNS oder Rheumafaktoren auf den ELISA.
Interferenzen: Es wurde kein Einfluss durch humanes LH (bis 10 E/ml), hCG (bis 160 E/ml), humanes
FSH (bis 70 E/ml), humanes TSH (3 E/l), Hämoglobin (bis 5 mg/ml), Bilirubin (bis 0,2 mg/ml) oder
Intralipid (bis 30 mg/ml) beobachtet.
Reproduzierbarkeit: Zur Kontrolle der Reproduzierbarkeit wurden die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten
mit 4 Seren in verschiedenen Bereichen der Kalibrationskurve ermittelt. Den Intra-
Assay-Variationskoeffizienten liegen jeweils 12 Bestimmungen und den Inter-Assay-Variationskoeffizienten
6 Bestimmungen zugrunde.
Intra-Assay-Variation, n = 12
Serum Mittelwert VK
(IE/l)
(%)
1 1,0 15,5
2 3,0 3,9
3 8,0 2,4
4 22,0 5,5
6
Inter-Assay-Variation, n = 6
Serum Mittelwert VK
(IE/l)
(%)
1 1,0 18,0
2 2,8 13,0
3 8,5 6,9
4 15,8 6,5
Methodenvergleich: Es wurden die TRAK-Konzentrationen in 60 Seren (Herkunft: Europa) sowohl mit
dem ELISA der 2. Generation (y) als auch mit einem 125 I-RRA der 2. Generation (x) (BRAHMS
Diagnostica) bestimmt. Die Resultate der linearen Regressionsanalyse ergaben die Korrelationsgerade
y=1,26x + 0,1 und den Korrelationskoeffizient r = 0,95. Von den untersuchten 60 Seren waren 40 Seren
in beiden Assays positiv und 14 Seren in beiden Assays negativ. Von den restlichen 6 Seren wurden 5
Seren positiv im ELISA und 1 Serum positiv im RRA gemessen. Beide Assays sind gut vergleichbar.
Klinische Sensitivität und Spezifität: In einer Studie mit 415 klinisch charakterisierten Seren (Herkunft:
Europa, USA) wurde mit dem ELISA für 96 der 108 Seren von Patienten mit Morbus Basedow
unterschiedlicher Erkrankungsdauer und Therapie ein positives Resultat erhalten. Alle 168 untersuchten
Seren von Patienten mit anderen Erkrankungen sowie 139 Seren gesunder Blutspender waren negativ.
Die für den ELISA ermittelte Sensitivität beträgt 89%, bei einer Spezifität von 100%.
Referenzbereiche: In einer Studie mit 60 individuellen Seren gesunder Blutspender (Herkunft: Europa)
wurden für 59 Proben (98%) Konzentrationen von kleiner 1 IE/l (entspricht einer Inhibierung der TSH-
Bindung von kleiner 10%) gefunden.
Jedes Labor sollte jedoch unter Verwendung repräsentativer Seren seine eigenen Referenzbereiche
erstellen.

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Klinische Bedeutung
Die Schilddrüsenfunktionen werden vom Hypothalamus im Stammhirn über die Hypophyse gesteuert.
Die im Hypothalamus gebildeten Releasing- bzw. Inhibition-Factors stimulieren bzw. dämpfen die
Ausschüttung von TSH (schilddrüsenstimulierendes Hormon), das in der Hypophyse gebildet wird und
die Schilddrüse zur Freisetzung der Schilddrüsenhormone T3 (Triiodthyronin) und T4 (Tetraiodthyronin =
Thyroxin) veranlasst.
Die freien Schilddrüsenhormone fT3 und fT4 gehören zu den lebenswichtigen Hormonen, die den
Stoffwechsel nahezu sämtlicher Organe regulieren. Auf zellulärer Ebene steigern sie den
Sauerstoffverbrauch und die Wärmeproduktion und sind für die geistige Entwicklung und das Wachstum
des Gesamtorganismus verantwortlich [1].
Ein erhöhter T3- und T4-Spiegel wird im Allgemeinen mit einer Schilddrüsenüberfunktion
(Hyperthyreose) gleichgesetzt, während ein erniedrigter T3- und T4-Spiegel im Serum einer
Schilddrüsenunterfunktion (Hypothyreose) zugeordnet wird [2]. Unabhängig von der Ursache der
unterschiedlichen Schilddrüsenhormonspiegel sind die klinischen Zeichen einer
Schilddrüsenüberfunktion bzw. Schilddrüsenunterfunktion jeweils weitgehend einheitlich.
Die Symptome einer Hyperthyreose sind Nervosität, Reizbarkeit, Rastlosigkeit, Zittern der Hände,
Schlafstörungen, Schwitzen, feuchtwarme Haut, Heißhunger und Durst, Gewichtsverlust trotz gutem
Appetit, und bei Frauen Störungen im Menstruationszyklus (unregelmäßige oder verstärkte Blutungen,
Ausbleiben der Regelblutung) [1].
Die Symptome einer Hypothyreose sind niedrige Körpertemperatur, erhöhte Kälteempfindlichkeit,
Ödeme (besonders an Lidern, Gesicht und Extremitäten), Druckgefühl am oder im Hals,
Strangulationsgefühl (auch nur phasenweise), häufiges Räuspern und Hüsteln, heisere oder belegte
Stimme (Stimmbandödem), depressive Verstimmung, Antriebslosigkeit, Konzentrations- u.
Gedächtnisstörungen, Müdigkeit, Muskelschwäche, Muskelverhärtungen, trockene, rissige Haut und
damit verbundener Juckreiz, trockene Schleimhäute, brüchige Haare und Fingernägel, starke
Gewichtszunahme, Verdauungsstörungen, verringerte Libido, veränderter Zyklus (bei Frauen),
Gelenkschmerzen [1].
Neben einer Störung der Schildrüsenhormonregulation kann eine Thyreoiditis (Schilddrüsenentzündung)
für die Symptome einer Hyper- bzw. Hypothyreose verantwortlich sein [3]. Diese umfasst mehrere
Erkrankungen. Man unterscheidet zwischen einer akuten (bakterielle Infektion), einer subakuten
(nichtinfektiös) und einer chronischen Thyreoiditis (Autoimmunerkrankung) [4]. Autoimmunthyreopathien
sind chronisch entzündliche Schilddrüsenerkrankungen, die durch eine Fehlregulation der spezifischen
Immunabwehr (B-Zellen und T-Zellen) verursacht werden [5]. Sie treten meist nach Virusinfekten auf,
gelegentlich auch nach einer subakuten Thyreoiditis. Genetische Faktoren spielen für ihre Entwicklung
eine Rolle. Im Rahmen eines Autoimmunprozesses werden Antikörper gegen eines oder mehrere der
drei Autoantigene der Schilddrüse Thyreoperoxidase (TPO), Thyreoglobulin (TG) und TSH-Rezeptor
(TR) gebildet [4, 6, 7, 8, 9].
TSH-Rezeptor-Autoantikörper (TRAk) sind bezüglich ihrer biologischen Wirkungsweise heterogen. Es
gibt Antikörper, die funktionsstimulierend oder -blockierend auf den TR wirken, Antikörper, die das
Schilddrüsenwachstum stimulieren und Antikörper, welche die Bindung von TSH an den TR inhibieren
[6, 7, 10]. Die biologische Wirkung der TRAk eines individuellen Patienten kann im Laufe der Zeit auch
wechseln, z.B. von einer TR-blockierenden zu einer TR-stimulierenden Wirkung oder seltener umgekehrt
[7, 10].
Die Messung der TRAk wird hauptsächlich bei Verdacht auf Morbus Basedow durchgeführt, eine
Autoimmunerkrankung, die neben den Symptomen einer Hyperthyreose weitere Symptome aufweist wie
Struma, Exophthalmus und Tachykardie (Merseburger Trias). Schwere Verlaufsformen sind
gekennzeichnet durch Abmagerung, Herzinsuffizienz und Koma [2]. Etwa 2% der weiblichen und ca.
0,2% der männlichen Bevölkerung sind von einem manifesten Morbus Basedow betroffen. Der
Krankheitsbeginn liegt bei Frauen häufig in Zeiten des hormonellen Umbruches (Pubertät,
Schwangerschaft, Klimakterium). 60% aller Hyperthyreosen werden dem Morbus Basedow zugerechnet.
TRAk-Bestimmungen werden klinisch zur Bestätigung eines Morbus Basedow eingesetzt mit einer
Prävalenz von 90-100%. Somit gelten TRAk als diagnostische Marker und werden zur differentialdiagnostischen
Abgrenzung gegenüber einer disseminierten Autonomie der Schilddrüse eingesetzt [11].
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Die TRAk-Bestimmung im Krankheitsverlauf eines Morbus Basedow erlaubt eine prognostische Aussage
und bietet eine wichtige Entscheidungshilfe zur Therapiesteuerung. Hohe TRAk-Titer bei Patienten mit
Morbus Basedow nach einer längeren thyreostatischen Therapie zeigen ein erhöhtes Risiko für einen
Rückfall an [12]. Weiterhin weisen erhöhte TRAk-Konzentrationen im dritten Trimester der
Schwangerschaft von Frauen mit Morbus Basedow auf eine Hyperthyreose beim Feten hin. In Fällen mit
Normalwerten kann der Nachweis von Antikörpern gegen TPO die Diagnose unterstützen mit einer
Prävalenz von 60-70% [2, 8]. Zudem werden Antikörper gegen TG in 20-50% der Fälle gefunden [9].
Aufgrund von Assoziationen mit anderen Autoimmunerkrankungen wie Myasthenia gravis, perniziöse
Anämie, chronisch-atrophische Gastritis und Autoimmun-Polyendokrinopathie können weitere
Autoantikörper nachweisbar sein (z. B. ANA in ca. 30% der Fälle, AMA, ASMA, PCA etc.) [13]. TRAk-
Bestimmungen sind richtungsweisend in der Ophthalmologie, da viele Patienten mit M. Basedow zuerst
beim Augenarzt vorstellig werden.
Die Hashimoto-Thyreoiditis ist eine der häufigsten Autoimmunerkrankungen des Menschen und die
häufigste Ursache der primären Schilddrüsenunterfunktion. Bei der Hashimoto-Thyreoiditis
(Autoimmunthyreopathie Typ 1A und 2A mit Struma) handelt es sich um eine chronische Thyreoiditis mit
progredienter Zerstörung des Schilddrüsengewebes durch T-Lymphozyten [14]. Die Ord-Thyreoiditis
(Autoimmunthyreopathie Typ 1B und 2B), eine Sonderform der Hashimoto-Thyreoiditis, ist
gekennzeichnet durch eine Atrophie der Schilddrüse [15]. Bei diesen beiden Verlaufsformen kommt es
auf Dauer zu einer Schilddrüsenunterfunktion, wobei sich am Beginn der Erkrankung – bedingt durch die
Zerstörung bzw. den Untergang des Schilddrüsen-Gewebes – auch Phasen der Überfunktion zeigen
können (sog. "Leck-Hyperthyreose", im Extremfall Hashitoxikose).
Die Veranlagung für Hashimoto wird vererbt. Frauen erkranken deutlich öfter als Männer (Verhältnis ca.
8:1 bis 10:1). Auslöser können Stress, schwer verlaufende Viruserkrankungen (z. B. Pfeiffersches
Drüsenfieber, Gürtelrose), Dysfunktionen der Nebennierenrinde sowie genau wie beim Morbus Basedow
hohe Ioddosen (Iodexzess) sein. Die Hashimoto-Thyreoiditis ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht
heilbar; die Unterfunktion der Schilddrüse muss jedoch therapiert werden [16]. Serologisch sind
Antikörper gegen TPO mit einer Prävalenz von 60-70% nachweisbar. Antikörper gegen Thyreoglobulin
sind in 90-100% der Fälle initial erhöht [8, 17]. Bei Vorliegen von Hashimoto-Thyreoiditis und Myxoedem
können blockierende TRAk bei schwangeren Frauen die Plazenta passieren und so zu einer
vorübergehenden neonatalen Hypothyreose führen [11, 14].
Ca. 5% der Frauen sind von einer Postpartum-Thyreoiditis betroffen, einer passageren hypothyreoten
Autoimmunthyreoiditis, wobei das Risiko bei gleichzeitigem Vorliegen eines insulinpflichtigen Diabetes
mellitus besonders hoch ist. Wegen der therapeutischen Konsequenzen ist die Anti-TPO-Bestimmung
bei allen Wöchnerinnen indiziert.
Eine besondere Bedeutung kommt der Anti-TG-Bestimmung bei differenzierten Schilddrüsenkarzinomen
zu, da diese bei der TG-Bestimmung interferieren und die Konzentration im Serum
beeinträchtigen können.
Als Autoimmun-Testverfahren haben sich bewährt der Indirekte Immun-Fluoreszenz-Test (IIFT) und der
EUROASSAY zum Nachweis von Autoantikörpern gegen TPO und TG, der Enzyme Linked
Immunosorbent Assay (ELISA), und der Radioimmunoassay zum Nachweis von Autoantikörpern gegen
TPO, TG und TR. Inzwischen stehen fortentwickelte ELISA als hochsensitive und hochspezifische Tests
zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen TR zur Verfügung [6, 7, 10, 17, 18, 20, 21, 22].
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Literaturliste
1. EUROIMMUN AG. Stöcker W, Schlumberger W. Alle Beiträge zum Thema Autoimmundiagnostik. In:
Gressner A, Arndt T (Hrsg.) Springer Lexikon Klinische Chemie. Medizinische Labordiagnostik
von A-Z. Springer Medizin Verlag, Heidelberg 1 (2007).
2. Meng W. Diagnostik der Hyperthyreose. Z ärztl Fortbild Qual sich (ZaeFQ) 95 (2001) 51-60.
3. Leovey A, Nagy E, Balazs G, Bako G. Lymphocytes resided in the thyroid are the main source
of TSH-receptor antibodies in Basedow's-Graves' disease? Exp Clin Endocrinol 99 (1992) 147-
150.
4. Gentile F, Conte M, Formisano S. Thyroglobulin as an autoantigen: What we can learn about
immunopathogenecity from the correlation of antigenic properties with protein structure?
Immunology 112 (2004) 13-25.
5. Horn K. Strategien für die Stufendiagnostik von Schilddrüsenerkrankungen. DG Klin Chem Mitt
25 (1994) 107-113.
6. Kamijo K. TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and
Hashimoto´s thyroiditis: a comparison of two two-step assays, coated plate ELISA using
porcine TSH-receptor and coated tube radioassay using human recombinant TSH-receptor.
Endocrine Journal 50 (2003) 113-116.
7. Saravanan P, Dayan CM. Thyroid autoantibodies. Endocrinology and Metabolism Clinics of North
America 30 (2001) 315-337.
8. Engler H, Riesen WF, Keller B. Diagnostische Validität von Autoantikörpern gegen die
mikrosomale Schilddrüsenperoxidase (anti-TPO). Schweiz med Wschr 122 (1992) 1976-1980.
9. Latrofa F, Phillips M, Rapoport B, McLachlan SM. Human monoclonal thyroglobulin
autoantibodies: epitopes and immunoglobulin genes. J Clin Endocrinol Metab 89 (2004) 5116-
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10. Orgiazzi J. Anti-TSH receptor antibodies in clinical practice. Endocrinol Metab Clin North Am 29
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EUROIMMUN
Medizinische
Labordiagnostika
AG
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Pipettierschema für den ELISA
Kalibratoren Kontrollen Proben
Probenpuffer 75 µl
Kalibratoren 1 - 4 75 µl
Negative Kontrolle 75 µl
Positive Kontrolle 75 µl
Serumprobe 75 µl
2 Stunden bei RT auf Schüttler (500 - 700 U/min) inkubieren
1 x waschen
TSH 100 µl
25 Minuten bei RT inkubieren
1 x waschen
Enzymkonjugat 100 µl
20 Minuten bei RT inkubieren
3 x waschen
Substrat 100 µl
30 Minuten bei RT im Dunkeln inkubieren
Stopplösung 50 µl
Kurz schütteln und Messung der Extinktion bei 450 nm
EA_1015G_A_DE_C07.doc
Stand: 09.09.11