View/Open - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

Enantioselektive C-C Knüpfung
mit Enzymen
Charakterisierung und reaktionstechnische
Bearbeitung der Benzaldehydlyase
aus Pseudomonas fluorescens Biovar I
Thomas Stillger
Lebenswissenschaften
Life Sciences

Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Lebenswissenschaften / Life Sciences Band / Volume 31

Forschungszentrum Jülich GmbH
Institut für Biotechnologie 2
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Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Lebenswissenschaften / Life Sciences Band / Volume 31
ISSN 1433-5549 ISBN 3-89336-457-9

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Druck: Grafische Medien, Forschungszentrum Jülich GmbH
Copyright: Forschungszentrum Jülich 2006
Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Lebenswissenschaften/Life Sciences Vol. 31
D 5 (Diss., Bonn, Univ., 2004)
ISSN 1433-5549
ISBN-10:3-89336-457-9
ISBN-13: 978-3-89336-457-2
Alle Rechte vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf in irgendeiner Form (Druck, Fotokopie oder
in einem anderen Verfahren) ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert oder unter
Verwendung elektronischer Systeme verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden.

Für Alexandra

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Biotechnologie 2 der Forschungszentrum
Jülich GmbH durchgeführt. Eine solche Arbeit ist nur mit der Unterstützung vieler
durchführbar, bei einigen möchte ich mich besonders bedanken:
• Prof. Dr. C. Wandrey als meinem Doktorvater für die interessante Themenstellung,
die Aufrechterhaltung der hervorragenden Arbeitsbedingungen und die
gewährte Freiheit bei der Bearbeitung des Themas,
• Prof. Dr. H. Wamhoff, Kékulé-Institut für Organische Chemie und Biochemie
der Universität Bonn, für die freundliche Übernahme des Korreferats,
• Denise Herzog, Lilia Härter, Heike Offermann und Daniela Müller für die qualifizierte
und engagierte Unterstützung bei der täglichen Arbeit im Labor,
• Dr. Murillo de Oliveira Villela Filho für die anregende Diskussion, die erfolgreiche
Kooperation bei den Untersuchungen zum Zweiphasensystem und die erbaulichen
Abende in Bonn,
• Prof. Dr. Andreas Liese für die stete Diskussionsbereitschaft, die Anregungen
und das offene Wort,
• den Mitgliedern der Enzymgruppe, insbesondere Christoph Hoh, Dr. Jürgen
Haberland und Dr. Lasse Greiner für die hilfreichen Diskussionen, das gute Arbeitsklima
und die gewährte Unterstützung,
• Priv.-Doz. Dr. Martina Pohl und Prof. Dr. Michael Müller für die freundliche
Durchsicht der Arbeit und die Hilfestellung zu Beginn der Arbeit,
• Prof. Dr. D. Vasic-Racki für die Unterstützung bei der Entwickung des kinetischen
Modells,
• Dr. Elena Janzen für die Klonierung und rekombinante Expression der Benzaldehydlyase,
• den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der bioorganischen Gruppe, insbesondere
Pascal Dünkelmann und Dr. Doris Kolter, für die Hilfestellung bei analytischen
Fragen,
• allen Mitarbeitern des Instituts für Biotechnologie 2 der Forschungszentrum Jülich
GmbH und des Instituts für Molekulare Enzymtechnologie der Heinrich-
Heine Universität Düsseldorf, für die gewährte Unterstützung und das angenehme
Arbeitsklima,
• meiner Familie für den steten Rückhalt,
• und bei Alexandra für die Unterstützung auch in schwierigen Situationen, den
bedingungslosen Rückhalt und für alles andere.

Charakterisierung und reaktionstechnische Bearbeitung der Benzaldehydlyase aus
Pseudomonas fluorescens Biovar I
Chirale 2-Hydroxyketone sind wichtige Vorläufersubstanzen für die Synthese von Liganden,
Agrochemikalien und pharmakologisch aktive Verbindungen. Ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd katalysiert die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens (BAL, E.C.
4.1.2.38) enantioselektiv die Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon (HPP). Parallel
mit der Bildung von HPP geht die Benzoinbildung als Folge der Selbstkondensation von
Benzaldehyd einher (Abbildung 1). Obwohl auch (R)-Benzoin als Substrat für die BAL
fungiert und in Gegenwart von Acetaldehyd zu HPP umgesetzt wird, stellt die geringe
Wasserlöslichkeit von Benzoin insbesondere mit Hinblick auf ein kontinuierliches Verfahren
zur Produktion von HPP eine Herausforderung dar.
O
O
O
H
Acetaldehyd
H
Benzoinbildung
H
Benzaldehyd
O
OH
( R)-Benzoin, ee>
99%
O
H
BAL
ThDP / Mg 2+
HPP-Bildung
Benzoin- spaltung
O
H
O
OH
( R)-2-Hydroxy-1-phenyl
propanon (HPP), ee > 99%
Abbildung 1: Reaktionssystem der BAL-katalysierten Carboligation von Benzaldehyd und
Acetaldehyd.
Das unterschiedliche kinetische Verhalten der HPP- und Benzoinbildung ausgehend von
Benzaldehyd bietet einen Angriffspunkt zur gezielten Diskriminirung der Benzoinbildung im
vorliegenden Reaktionssystem (Abbildung 2 links). Während im Batch- und
Strömungsrohrreaktor die Substratkonzentrationen mit der Reaktionszeit (Batch) bzw. dem
Ort im Reaktor (Strömungsrohr) variieren, kann in einem kontinuierlich betriebenen
Rührkessel (CSTR, engl. continuously stirred tank reactor) ein steady state mit konstanter
Substratkonzentration eingestellt werden. Dadurch wird eine gezielte Diskriminierung der
Benzoinbildung bei der Produktion von HPP ermöglicht (Abbildung 2 links).

Aktivität /Umg -1
30
25
20
15
10
5
CSTR
Batch
O O
0
0 5 10
Benzaldehyd / mM
15 20
2
O
+ O
O
OH
OH
Konzentration / mM
20
16
12
8
4
� =1h 0.5 h 1h 0.25 h 1h
HPP
Benzaldehyd
Benzoin
Simulation
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Zeit / h
Abbildung 2: Kinetische Charakterisierung der HPP- und Benzoinbildung (links).
Kontinulierliche Produktion von HPP im EMR (rechts).
Ein Enzym-Membran-Reaktor (EMR) kann als kontinuierlicher Rührkessel betrieben werden.
Abbildung 2 (rechts) zeigt die kontinuierliche Produktion von HPP im EMR. Es wurde ein
Umsatz von > 91 % erreicht. Bei allen Verweilzeiten (60, 30, 15 min) blieb die
Benzoinkonzentration unterhalb von 0,4 mM und damit deutlich unterhalb der
Löslichkeitsgrenze von Benzoin im Reaktionsmedium (1,5 mM). Für die BAL konnte durch
die Anwendung eines kontinuierlichen Verfahrens eine maximale Zyklenzahl von 188000
erreicht werden. Die maximale Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) lag bei 1120 g L -1 d -1 . Die
erfolgreiche Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxy-1-propanon (RZA = 1210 g L -1
d -1 ) im EMR zeigt die allgemeine Anwendbarkeit des entwickelten Bioreaktors.
Für begrenzt wasserlösliche Substrate der BAL bietet sich die Verwendung eines organisch /
wässrigen Zweiphasensystems an. Vorraussetzung für die Anwendbarkeit eines
Zweiphasensystems ist die Stabilität des Biokatalysators im Reaktionsmedium. In einem breit
angelegten Lösungsmittelscreening zeigte die BAL eine hohe Lagerstabilität (t1/2 > 500 h) im
Zweiphasensystem, wenn offenkettige Ether mit verzweigten aliphatischen Seitenketten
verwendet wurden. Für die Biotransformationen im organisch / wässrigen Zweiphasensystem
erwies sich ein Reaktorkonzept mit membranunterstütztem Phasenkontakt als vorteilhaft.

Characterization and reaction engineering of benzaldehyde lyase from Pseudomonas
flourescens Biovar I
Chiral 2-hydroxyketones are important precursors in the synthesis of ligands, agro chemicals
and biologically active compounds. Starting from benzaldehyde and acetaldehyde the enzyme
benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens (BAL, E.C. 4.1.2.38) catalyzes the
enantioselective formation of (R)-2-hydroxy-1-phenylpropanone (HPP). Parallel to the
formation of HPP the self-ligation of benzaldehyde yielding (R)-benzoin is observed
(Figure 1). Though (R)-benzoin itself is a substrate for the formation of HPP the low water
solubility of benzoin is a major drawback of the reaction system especially with regard to a
continuous process for HPP production.
O
O
O
H
acetaldehyde
H
benzoin formation
H
benzaldehyde
O
OH
( R)-benzoin, ee>
99%
O
H
BAL
ThDP / Mg 2+
HPP-formation
benzoin- cleavage
O
H
O
OH
( R)-2-hydroxy-1-phenyl
propanone (HPP), ee > 99%
Figure 1. Enzymatic carboligation of benzaldehyde and acetaldehyde catalyzed by
benzaldehyde lyase.
Different kinetics of HPP and benzoin formation turned out to be a suitable tool for the
selective discrimination of the benzoin formation within the reaction system. In a batch and a
plug flow reactor the substrate concentrations depend on reaction time (batch) and on the
place within the reactor (plug flow). In contrast the continuously operated stirred tank reactor
(CSTR) performs at a steady state with constant reactant concentrations allowing the selective
discrimination of the formation of benzoin while HPP production (Figure 2 left).

Activity /Umg -1
30
25
20
15
10
5
CSTR
Batch
O O
0
0 5 10 15 20
Benzaldehyde / mM
2
O
+ O
O
OH
OH
Concentration / mM
20
16
12
8
4
� =1h 0.5 h 1h 0.25 h 1h
HPP
Benzaldehyde
Benzoin
Simulation
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Time/h
Figure 2. Kinetics of HPP and benzoin formation (left). Continuous production of HPP in an
EMR (right).
An enzyme membrane reactor (EMR) exhibits CSTR characteristics. Figure 2 (right) shows
the continuous production of HPP in an EMR. A conversion of > 91 % was achieved. The
benzoin concentration never exceeded 0.4 mM within the reaction time which is less than one
third of the maximum solubility of benzoin in the reaction medium (1.5 mM). A total turnover
number of 188000 was achieved by the applications of a continuous process. The maximum
space time yield (STY) was calculated to 1120 g L -1 d -1 . The successful synthesis of (R)-1-(3chlorophenyl)-2-hydroxy-1-propanone
(STY = 1210 g L -1 d -1 ) in the EMR demonstrates a
broader applicability of the developed bioreactor.
In order to open up substrates with limited water solubility to biocatalysis an aqueous /
organic biphasic system was established. A key parameter for the successful application of a
biphasic system is the stability of the biocatalyst in the reaction media. In a broad solvent
screening benzaldehyde lyase showed a high storage stability in the presence of branched
chain aliphatic ethers (t1/2 > 500 h). A reactor concept with membrane mediated phase contact
was developed for biotransformations in an aqueous / organic biphasic system.

Inhaltsverzeichnis
I. Allgemeiner Teil 1
1. Einleitung 3
1.1. Biotransformation - quo vadis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2. Chirale2-Hydroxyketone.......................... 4
1.2.1. Anwendung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.2. Synthese mit chemischen Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.3. SynthesemitbiochemischenMethoden .............. 6
1.3. Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.1. Der Cofaktor Thiamindiphosphat . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.2. Transketolase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.3. Dihydroxyaceton Synthase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.4. 1-Desoxyxylulose-5-phosphat Synthase . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.5. Pyruvatdecarboxylase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.6. Benzoylformiatdecarboxylase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.7. Benzaldehydlyase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2. Motivation und Zielsetzung 15
II. Biotransformationen im homogenen System 19
3. Systemcharakterisierung 21
3.1. Enzymassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.1.1. Lyaseaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.1.2. Ligaseaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2. Cofaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.2.1. Enzymstabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.2.2. Enzymaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.3. pH-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.4. Lösungsvermittler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.4.1. Organische Lösungsmittel als Lösungsvermittler . . . . . . . . . 26
3.4.2. DimethylsulfoxidalsCosolvent .................. 27
i

Inhaltsverzeichnis
3.4.2.1. Einfluss auf die Enzymaktivität . . . . . . . . . . . . . 27
3.4.2.2. Einfluss auf die Enzymstabilität . . . . . . . . . . . . . 27
3.5. Puffersystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.6. Zusammenfassung und Auswahl der Reaktionsbedingungen . . . . . . . 30
4. Kinetik 33
4.1. Auswahl der Einzelreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.2. Bestimmung der kinetischen Parameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.1. Allgemeine Anmerkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.2. Benzoinbildung (Reaktion 01) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.2.3. Benzoinspaltung (Reaktion 02) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2.4. Racematspaltung (Reaktion 03) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.2.5. Bildung von 2-Hydroxy-1-phenylpropanon (Reaktion 04) . . . . 45
4.3. Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5. Biotransformationen im homogenen System 49
5.1. Diskontinuierliche Reaktionsführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.1.1. Satzreaktor (Batch) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.1.2. Simulation des Satzreaktors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.3. Repetitive Batch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2. Kontinuierliche Reaktionsführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.1. Reaktorkonzept . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.2.2. Regelung des Enzym-Membran-Reaktors . . . . . . . . . . . . . 60
5.2.3. Simulation des Enzym-Membran-Reaktors . . . . . . . . . . . . 61
5.2.4. Synthese von 2-Hydroxy-1-phenylpropanon im Enzym-Membran-
Reaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.2.5. Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute im Enzym-Membran-Reaktor 64
5.3. Kontinuierliche Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon 66
5.4. Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
6. tert-Butylmethylether als Cosolvent 71
6.1. Problemstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
6.2. Stabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
6.3. Satzreaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
6.3.1. Vergleich der Reaktionsbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . 73
6.3.2. Präparativer Batchversuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
6.4. Enzym-Membran-Reaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
6.5. Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
III. Nicht-konventionelle Reaktionsmedien 79
ii

Inhaltsverzeichnis
7. Einleitung 81
7.1. Einsatz von organischen Lösungungsmitteln . . . . . . . . . . . . . . . 81
7.1.1. Rein organische Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
7.1.2. Mikroemulsionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
7.1.3. Zweiphasensystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
7.1.4. Wassermischbare Cosolventien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
7.2. Wahl des Lösungsmittels für Multiphasensysteme . . . . . . . . . . . . 86
8. Untersuchungen zur Stabilität der Benzaldehydlyase im Zweiphasensystem
89
8.1. Beschreibung der Enzymdesaktivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
8.2. Lösungsmittelscreening........................... 90
8.2.1. Lösungsmittelklassen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
8.2.2. Ether . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
8.3. Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
9. Biotransformationen im Zweiphasensystem 97
9.1. Verteilungskoeffizienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
9.2. Synthese von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon . . . . . . . . . . . . . 97
9.2.1. Emulsions-Batchreaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
9.2.2. Repetitive Batch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
9.3. Batchreaktor mit membranunterstütztem Phasenkontakt . . . . . . . . 103
9.4. Racematspaltung von Benzoin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
9.4.1. Charakterisierung der Racematspaltung . . . . . . . . . . . . . . 106
9.4.2. Racematspaltung im Zweiphasensystem . . . . . . . . . . . . . . 107
9.4.3. Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
IV. Diskussion und Ausblick 109
10.Diskussion und Ausblick 111
10.1.Homogene Reaktionsmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
10.2.Reaktionen im Zweiphasensystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
10.3. Vergleich zwischen einphasiger und zweiphasiger Reaktionsführung . . . 115
11.Zusammenfassung 119
12.Material und Methoden 123
12.1.Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
12.2.Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
12.3.Aufreinigung der Benzaldehydlyase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
12.4. Arbeitsvorschriften für das homogene Reaktionssystem . . . . . . . . . 125
12.4.1. Aktivitätsbestimmung (Standardassay) . . . . . . . . . . . . . . 126
12.4.2.AnalytischeBatchversuche.....................126
iii

Inhaltsverzeichnis
12.4.3. Repetitive Batch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
12.4.4. Präparative Batchversuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
12.4.5. Kontinuierliche Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
12.5. Arbeitsvorschriften für das Zweiphasensystem . . . . . . . . . . . . . . 128
12.5.1. Stabilitätsuntersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
12.5.2. Analytischer Batchversuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
12.5.3. Repetivitve Batch im Emulsionsreaktor . . . . . . . . . . . . . . 129
12.5.4. Repetitive Batch mit membranunterstütztem Phasenkontakt . . 129
12.6.Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
12.6.1. Proteinbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
12.6.2. Thermische Massenflussmessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
12.6.3. HPLC-Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
V. Anhang 131
A. Modelle für die Simulation 133
A.1. Modell HPP-Bildung im Batch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
A.2. Modell der Bildung von 2-Hydroxy-1-phenylpropanon im kontinuierlich
betriebenen Rührkessel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
Literaturverzeichnis 135
iv

Abbildungsverzeichnis
1.1. Mögliche Anwendung von 2-Hydroxyketonen zur Synthese pharmakologisch
aktiver Wirkstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2. Strukturformel von Thiamindiphosphat . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3. Allgemeiner Katalysemechnismus Thiamindiphosphat-abhängiger Enzyme
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4. Reaktion der Transketolase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5. Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Ephedrin . . . . . . . 10
1.6. Durch BAL katalysierte C-C Bindungsbildung . . . . . . . . . . . . . . 11
1.7. BAL-katalysierte Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend
von Benzaldehyd und Acetaldehyd . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.8. BAL-katalysierte kinetische Racematspaltung von Benzoin . . . . . . . 13
2.1. Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2. Kinetische Racematspaltung von Benzoin durch die Benzaldehydlyase. . 17
3.1. Gekoppelter Enzymassay zur Bestimmung der Lyaseaktivität . . . . . . 21
3.2. Gemessene Enzymaktivität in Abhängigkeit der eingesetzten Proteinkonzentration
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3. Einfluss der Cofaktoren auf die Enzymstabilität . . . . . . . . . . . . . 24
3.4. Aktivität der BAL in Abhängigkeit der Konzentration von ThDP und
Magnesiumionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.5. Einfluss des pH-Werts auf Enzymaktivität und -stabilität . . . . . . . . 25
3.6. Einfluss der DMSO-Konzentration auf Enzymstabilität und Benzoinlöslichkeit
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7. pH-Shift von Kaliumphosphatpuffer nach Zusatz organischer Lösungsmittel
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.8. Aktivität und Stabilität der BAL in unterschiedlichen Puffersubstanzen 30
4.1. Postulierter Mechanismus der Benzaldehydlyase . . . . . . . . . . . . . 36
4.2. Aktivität der Benzoinbildung in Abhängigkeit der Benzaldehydkonzentration
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.3. Abnahme der Benzoinbildung durch HPP und Acetaldehyd . . . . . . . 39
4.4. Rate der Benzaldehydbildung bei variierter Benzoinkonzentration . . . 40
v

Abbildungsverzeichnis
vi
4.5. Versuchsreihe mit konstanter Acetaldehyd- und variierter Benzoinkonzentration
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.6. Versuchsreihe mit konstanter Benzoin- und variierter Acetaldehydkonzentration
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.7. Rate der BAL-katalysierten HPP-Bildung in Abhängigkeit der Benzaldehydund
Acetaldehydkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.8. Rate der Benzoinbildung in Abhängigkeit der Benzaldehyd- und Acetaldehydkonzentration
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.1. Konzentrations - Zeit - Verlauf eines Satzreaktorversuchs zur HPP-
Bildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.2. Einfluss der Acetaldehydkonzentration auf das thermodynamische Gleichgewicht
der HPP-Bildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.3. Verlauf der Benzoinkonzentration in Abhängigkeit der Acetaldehydkonzentration
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.4. Modell für die Simulation der HPP-Bildung . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.5. Vergleich der gemessenen und simulierten Konzentrationen im Batchreaktor
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.6. Prinzip des Repetitive Batch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.7. Repetitive Batch: BAL-katalysierte HPP-Synthese . . . . . . . . . . . . 57
5.8. Vergleich kontinuierlicher Verfahren mit dem Satzreaktor . . . . . . . . 59
5.9. Schema des EMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.10. Kontinuierliche BAL-katalysierte HPP-Synthese im EMR . . . . . . . . 62
5.11. Kontinuierliche BAL-katalysierte HPP-Synthese im EMR mit unterschiedlichen
Betriebspunkten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
5.12. Raum-Zeit-Ausbeuten der eingestellten Betriebspunkte . . . . . . . . . 64
5.13. Kontinuierliche BAL-katalysierte HPP-Synthese im EMR mit kurzen
Verweilzeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5.14. Vergleich der bei der kontinuierlichen HPP-Synthese im EMR erreichten
Raum-Zeit-Ausbeuten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.15. Prozessdaten des in Abbildung 5.13 gezeigten Reaktorlaufs . . . . . . . 67
5.16. Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon ausgehend von
3-Chlorbenzaldehyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.17. BAL-katalysierte kontinuierliche Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-
2-hydroxypropanon im EMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
6.1. Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
6.2. Stabilität der Benzaldehydlyase in homogenen Reaktionsmedien . . . . 72
6.3. Batchversuche zur BAL-katalysierten HPP-Bildung . . . . . . . . . . . 74
6.4. Vergleich der Produktaufarbeitung beider Reaktionssysteme . . . . . . 74
6.5. (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon nach dem Umkristallisieren . . . . . . 75
6.6. BAL-katalysierte Synthese von HPP mit MTBE als Cosolvent im EMR 76

Abbildungsverzeichnis
7.1. Systeme für die Biokatalyse in organisch / wässrigen Medien . . . . . . 82
7.2. Prinzip organisch / wässriges Zweiphasensystem . . . . . . . . . . . . . 85
7.3. DarstellungeinesZweiphasensystems ................... 85
8.1. Beispiel einer Stabilitätsmessung mit und ohne Inhibierung . . . . . . . 90
8.2. Screening nach Lösungsmittelklassen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
8.3. Enzymstabilität der BAL in Gegenwart verschiedener Ether . . . . . . 95
9.1. Verteilungskoeffizienten in MTBE / Puffer und DIPE / Puffer . . . . . 98
9.2. Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
9.3. Batch zur BAL-katalysierten HPP-Bildung im Zweiphasensystem . . . 99
9.4. Kinetik der BAL im homogenen Reaktionsmedium . . . . . . . . . . . . 100
9.5. Repetitive Batch zur BAL-katalysierten HPP-Bildung im Zweiphasensystem
mit MTBE und DIPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
9.6. DesaktivierungderBALimRepetitiveBatch...............102
9.7. Prinzip eines Reaktors mit membranunterstütztem Phasenkontakt . . . 104
9.8. Batchreaktor zur BAL-katalysierten HPP-Bildung im Zweiphasensystem104
9.9. BAL-katalysierte kinetische Racematspaltung von Benzoin . . . . . . . 105
9.10.Kinetische Racematspaltung von Benzoin . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
9.11. BAL-katalysierte Racematspaltung von Benzoin im Zweiphasensystem . 107
10.1. Modell für die Simulation der HPP-Bildung . . . . . . . . . . . . . . . 112
10.2. Zweistufige, kontinuierliche Synthese von Diolen ausgehend von BenzaldehydundAcetaldehydinwässrigerLösung
..............113
10.3. Halbwertszeiten der PDC im organisch / wässrigen Zweiphasensystem . 114
10.4. Zweistufige, kontinuierliche Synthese von Diolen ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd im Zweiphasensystem . . . . . . . . . . . . . 117
vii

Abbildungsverzeichnis
viii

Tabellenverzeichnis
4.1. Kinetische Parameter der BAL-katalysierten Benzoinbildung ausgehend
von Benzaldehyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.2. Kinetische Parameter der BAL-katalysierten Benzoinspaltung . . . . . 41
4.3. Kinetische Parameter der BAL-katalysierten HPP-Bildung ausgehend
von (R)-Benzoin und Acetaldehyd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4. Kinetische Parameter der HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd . . 45
5.1. ÜbersichtüberdieimModellverwendetenParameter.......... 55
5.2. Vergleich der beiden Reaktortypen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
6.1. Vergleich der Desaktivierungskonstanten (kdes) für die BAL im homogenen
Reaktionssystem mit DMSO bzw. MTBE als Cosolvent . . . . . 77
8.1. Vertreter verschieder Verbindungsklassen, die im ersten Lösungsmittelscreening
eingesetzt wurden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
8.2. Verschiedene Ether, die im zweiten Lösungsmittelscreening eingesetzt
werden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
10.1. Vergleich zwischen homogenem Reaktionssystem und Zweiphasensystem 116
10.2. Übersicht über die Halbwertszeiten der BAL in den untersuchten Reaktionsmedien
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
ix

Tabellenverzeichnis
x

Abkürzungen und Symbole
Abk. Abkürzung
AA Acetaldehyd
Abb. Abbildung
ACN Acetonitril
ADH Alkoholdehydrogenase
Akt. Aktivität
BA Benzaldehyd
BAACC Benzaldehyd als Elektronenakzeptor
BADO Benzaldehyd als Elektronendonor
BAL Benzaldehydlyase
Bdg. Bildung
BFD Benzoylformiatdecarboxylase
BSA Rinderserum-Albumin
BZ Benzoin
CoA Coenzym A
CSTR kontinuierlich betriebener Rührkessel, engl. continuously
operated stirred tank reactor
DHAS Dihydroxyaceton Synthase
DIPE Diisopropylether
DMSO Dimethylsulfoxid
DNS Desoxyribonucleinsäure
DSM Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
DTT Dithiothreitol
DXP 1-Desoxyxylulose-5-phosphat
DXPS 1-Desoxyxylulose-5-phosphat Synthase
EC Enzymklasse, engl. enzyme class
ee Enantiomerenüberschuss, engl. enantiomeric excess
EMR Enzym-Membran-Reaktor
engl. englisch
er Enantiomerenverhältnis, engl. enantiomeric ratio
FDA Food and Drug Administration, Gesundheitsbehörde der
USA
FDH Formiatdehydrogenase
Fortsetzung nächste Seite
xi

xii
Abk. Abkürzung
GDH Glyceroldehydrogenase
His Histidin
HLADH Pferdeleber-Alkoholdehydogenase, engl. alcohol dehydrogenase
from horse liver
HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, engl. high performance
liquid chromotography
HPP 2-Hydroxy-1-phenylpropanon
IMAC Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
KPi
Kaliumphosphat
LBADH Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis
MFM (thermischer) Massenflussmesser
MTBE tert-Butylmethylether
NAD + Nicotinamid-adenin-dinucleotid (oxidiert)
NADH Nicotinamid-adenin-dinucleotid (reduziert)
NADP + Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (oxidiert)
NADPH Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (reduziert)
NMR Kernspinresonanz, engl. nuclear magnetic resonance
NTA Nitrilo-tri-essigsäure
O/W Öl in Wasser
PAC Phenylacetylcarbinol, IUPAC: 1-Hydroxy-1-phenyl-2propanon
PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
PDC Pyruvatdecarboxylase
PEEK Polyetheretherketon
PEG Polyethylenglykol
Ph Phenylrest
PTFE Polytetrafluorethylen
Rac. Racemat
RP engl.: reversed phase
RNA Ribonucleinsäure
SDS Natriumdodecylsulfat, engl. sodium dodecylsulfate
Spal. Spaltung
Tab. Tabelle
TBADH Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobium brockii
TEA Triethanolamin
tert tertiär
ThDP Thiamindiphosphat (Cocarboxylase)
THF Tetrahydrofuran
TK Transketolase
TRIS 1,1,1-Tris-(hydroxymethyl)-methylamin
Fortsetzung nächste Seite

Abk. Abkürzung
ttn maximale Zyklenzahl, engl. total turnover number
[mol mol −1 ]
UpM Umdrehungen pro Minute [min −1 ]
UV Ultraviolett
W/O Wasser in Öl
Symbol Einheit Bedeutung
[A] verschiedene Konzentration der Komponente A
A Umg −1 Enzymaktivität
d m Durchmesser
I verschiedene Inhibierungsfaktor
K - Gleichgewichtskonstante
kdes h −1 Desaktivierungskonstante
KI mM Inhibierungskonstante
KM mM Michaelis Konstante
l m Länge
M gmol −1
molare Masse
n mol Stoffmenge
νA mol L−1 min−1 Reaktionsgeschwindigkeit bzgl. der Komponente A
P - Verteilungskoeffizient in einem n-Oktanol/Wasser System
p bar Druck, engl. pressure
pH - negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
RZA gL−1 d−1 Raum-Zeit-Ausbeute
t s Zeit, engl. time
T ◦C Temperatur
t1/2 h Halbwertzeit
U µmol min−1 katalytische Aktivität, Unit
U - Umsatz
V m3 Volumen
vmax Umg−1 maximale Geschwindigkeit
x m Strecke
∆ - Differenz
η - Ausbeute
ρ kg m−3 Dichte
σ - Selektivität
τ min Verweilzeit
xiii

xiv

Teil I.
Allgemeiner Teil
1

1. Einleitung
1.1. Biotransformation - quo vadis
Obwohl sich die Menscheit schon seit Jahrtausenden die Hilfe von Mikroorganismen
zunutze macht, geht die Geschichte der wissenschaftlichen Behandlung dieser Thematik
nur etwa zwei Jahrhunderte zurück. 1858 führte Pasteur die erste mikrobielle Racematspaltung
von Weinsäure mit Hilfe des Schimmelpilzes Penicillium glaucum durch
(Pasteur, 1858). Die Milchsäure war wohl das erste chirale Produkt, das um 1880 in
den USA durch Fermentation erhalten wurde (Sheldon, 1993). 1893 gelang Buchner
die alkoholische Gärung durch Verwendung eines zellfreien Hefeextrakts (Buchner,
1897). Damit beendete er nicht nur die bis dahin intensiv geführte Diskussion um die
vis vitalis, sondern er eröffnete auch die Verwendung ruhender Zellen für Biotransformationen.
1926 kristallisierte Summer das erste Enzym und führte damit endgültig
den Beweis, dass Enzyme rein chemische Substanzen sind (Summer, 1926).
Der Chemiker Otto Röhm zog als einer der ersten Konsequenzen für eine technische
Verwendung (Buchholz & Kasche, 1997). Er benutzte Enzyme aus dem Verdauungstrakt,
insbesondere aus der Bauchspeicheldrüse, als Beize für die Gerberei in
der Lederindustrie und löste damit das unhygienische Verfahren mit Hundekot oder
Taubenmist ab. Der Mitarbeiterstand der neu gegründeten Firma vergrößerte sich innerhalb
von nur vier Jahren von vier auf 100 Mitarbeiter. Dieses Beispiel zeigt eine
wichtige Vorraussetzung für den Erfolg einer Innovation auf: den Bedarf.
In den Fünfziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurde die Struktur und die chemische
Zusammensetzung von DNA und RNA aufgeklärt (Watson & Crick, 1953). Damit
war der Grundstein für die moderne Biotechnologie gelegt. Durch die Entwicklung der
„Rekombinanten DNA - Technologie“ war es nun möglich, die quantitative Verfügbarkeit
von Enzymen wesentlich auszudehnen. Die klassische Entwicklungsdauer von 5 -
10 Jahren für industrielle Enzyme konnte dadurch auf 1 - 2 Jahre verkürzt werden
(Hodgson, 1994). Verschiedene Methoden zur Veränderung von Proteinen 1 eröffneten
darüberhinaus eine Möglichkeit zur direkten Manipulation der Enzymeigenschaften,
wie z.B. Substratspezifität, Stabilität, Enantioselektivität oder Cofaktorselektivität.
Es war also durch diese Techniken möglich geworden, Enzyme hinsichtlich bestimmter
Katalyseanforderungen zu optimieren.
Das zunehmende Wissen über die Funktion von Wirkstoffen auf molekularer Ebene
hat die Chiralität als die grundlegende Eigenschaft für die Wirkweise dieser Verbin-
1 Im Allgemeinen werden zwei Methoden unterschieden. Rationales Proteindesign, wobei gezielt
Aminosäuren ausgetauscht werden (Wrede & Schneider, 1994) und kombinatorische Verfahren,
bei denen Aspekte der natürlichen Evolution angewendet werden (Arnold, 1998).
3

1. Einleitung
dungen herausgestellt. Als Konsquenz dieser Entwicklung lässt z.B. die FDA seit 1996
für Pharmaka im Falle enantiomerer Verbindungen nur noch enantiomerenreine Wirkstoffe
zu (Stinson, 1998; Stinson, 1999). Vor diesem Hintergrund hat in den letzten
zehn Jahren das Bewusstsein für das enorme Potential der Enzyme in der organischen
Synthese als Katalysatoren mit hoher Chemo-, Regio- und Enantioselektivität
zugenommen (Faber, 2000; Patel, 2000). Gegenüber den klassisch chemischen Routen
zur Synthese enantiomerenreiner Verbindungen zeigen die Enzyme ihre katalytischen
Eigenschaften unter milden Bedingungen in wässriger Lösung, was Probleme mit Nebenreaktionen
wie Isomerisierung, Racemisierung, Epimerisierung und Umlagerung
minimiert.
Derzeit handelt es sich bei den meisten industriell verwendeten Enzymen um hydrolytisch
aktive Enzyme wie Esterasen, Proteasen und Lipasen (Kirk et al., 2002;
Straathof et al., 2002). Die etablierten enzymatischen Prozesse finden weitverbreitet
Anwendung in der Synthese von Pharmazeutika, Agrochemikalien, Vitaminen und
Aromen. Doch damit ist das synthetische Potential der Biokatalysatoren bei weitem
noch nicht ausgeschöpft. Faber und Patel stellen in ihrem Übersichtsartikel im
aktuellen Verlauf der Entwicklung von Biokatalysatoren zwei Schwerpunkte fest (Faber
& Patel, 2000): Ein Schwerpunkt liegt auf der biokatalytischen Deracemisierung.
Die Kombination verschiedener Enzyme ermöglicht die Durchführung einer Racematspaltung,
an deren Ende nur noch ein Enantiomer mit 100% theoretischer Ausbeute
vorliegt (Strauss et al., 1999). Der zweite Schwerpunkt liegt bei der Entwicklung von
Biokatalysatoren für Reaktionen, die mit den klassisch chemischen Methoden nur sehr
schwierig durchzuführen sind, wie z.B. die katalytische Decarboxylierung, die stereoselektive
Oxidation sowie die asymmetrische C-C Bindungsbildung in wässriger Lösung,
was auch Gegenstand dieser Arbeit ist.
1.2. Chirale 2-Hydroxyketone
1.2.1. Anwendung
Chirale 2-Hydroxyketone sind wichtige Synthesebausteine in der präparativen organischen
Chemie und spielen als funktionelle Gruppen in biochemisch aktiven Molekülen
eine wichtige Rolle. Durch enantioselektive Reduktion der Ketogruppe bzw.
reduktive Aminierung lassen sich chirale Diole, bzw. Aminoalkohole herstellen, die
bei der Synthese von Liganden und chiralen Auxilliaren weitverbreitet zum Einsatz
kommen (Kihumbu et al., 2002). Große Bedeutung besitzen chirale 2-Hydroxyketone
bei der Synthese von pharmakologisch aktiven Verbindungen, wie Abbildung 1.1 auf
der nächsten Seite zeigt. Nitidanin (Abb. 1.1 a) stammt aus der Rinde der Heilpflanze
Silybum marianum und fand schon in der Volksmedizin Anwendung zur Heilung
von Leberkrankheiten (Morazzoni & Bombardelli, 1995). (-)-Cytoxazon (Abb. 1.1 b)
inhibiert die Bildung von Typ 1 Cytokinen und wird zur Behandlung allergischer Reaktionen
eingesetzt (Kakeya et al., 1999). 5-Methoxyhydnocarpin (Abb. 1.1 c) wirkt
als Inhibitor der MDR (multi drug pump) mikrobieller Zellen, die diesen Zellen eine
4

Resistenz gegen Antibiotika verleiht (Stermitz et al., 2000).
MeO
HO
OH
HO
MeO
NH
O
O
O
HO
O
OMe
H
O
O
Nitidanin
OH
(-)-Cytoxazon
OMe
O
O
OH
OH
OMe
OH
5-Methoxyhydnocarpin
b
c
R
a
O
OH
F
R'
Cl
O
O
OH
OH
F
N
N
N
HO
SO
F F
2CH3 Sch 42427 / Sm 9164
g
F
F
d
1.2. Chirale 2-Hydroxyketone
O
f
OH
Cl
e
F
O
F
NH
Bupropion
N
N
N
OH
O
HO
F N
N
F
S
ER-303465
Ro 09-3355
CN
H
1555U88
Abbildung 1.1.: Mögliche Anwendung von 2-Hydroxyketonen zur Synthese pharmakologisch
aktiver Wirkstoffe.
Neben diesen allgemeinen Beispielen findet auch die u.a. durch die BAL-Katalyse
zugängliche Struktureinheit des (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon direkt Verwendung
als Vorläufer bei der Synthese pharmazeutisch aktiver Verbindungen. (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon
(Abb. 1.1 d) findet Verwendung als Vorläufer für die Synthese
von Bupropion. Bei dieser Verbindung handelt es sich um den aktiven Wirkstoff
in den Antidepressiva Wellburtin � und Zyban � (Glaxo Wellcome) (Fang et al.,
2000). (R)-1-(3,5-Difluorphenyl)-2-hydroxypropanon (Abb. 1.1 e) ist Ausgangsverbindung
für das Antidepressiva 1555U88. Das Regioisomer (R)-1-(2,4-Difluorphenyl)-2hydroxypropanon
ist Vorläufer für die Fungizide Ro 09-3355 (Abb. 1.1 f)(Leuenberger
et al., 1999) und SM 8668 / Sch 39304 (1.1 g) (Gala et al., 1996a; Gala et al., 1996b;
Gala & DiBebedetto, 1997; Kitazaki et al., 1999; Montheit, 1999).
1.2.2. Synthese mit chemischen Methoden
Für die Synthese chiraler 2-Hydroxyketone steht eine Vielzahl chemischer und biologischer
Methoden zur Verfügung. Bei den chemischen Verfahren findet die enantioselek-
5

1. Einleitung
tive Oxidation von Enolethern weitverbreitet Anwendung, wobei als Oxidationsmittel
elektrophile Sauerstoffdonoren wie Osmiumtetraoxid in Gegenwart chiraler Auxilliare
(ee 86 - 95 %) (Hashiyama et al., 1992), Mangan-(III)-Salen-Komplexe (ee 11 -
89 %) (Adam et al., 1996; Adam et al., 1998a), Dioxiranderivate der Fructose (ee 0-
82 %) (Adam et al., 1998b) oder N -Sulfonyloxaziridine (ee 3 - 95 %) (Davis & Chen,
1992) zum Einsatz kommen. Auch O-Isopropylidenderivate diastereomerenreiner Diole
können durch Dioxyrane zu 2-Hydroxyketonen oxidiert werden (ee 60 - 99 %). Die
Oxidation erfolgt unter Retention der Konfiguration am verbleibenden Chiralitätszentrum
(Curci et al., 1996).
Auch die regio- und enantioselektive Reduktion der entsprechenden 1,2-Diketoverbindung
führt zu chiralen 2-Hydroxyketonen (ee 0 - 65 %). Durch Hydrierung
von 1-Phenyl-1,2-propandion an modifizierten Platinkatalysatoren konnte neben geringer
Mengen des Regioisomers und des Diols das (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
als Hauptprodukt isoliert werden (Toukoniitty et al., 2001). Eine weitere Möglichkeit
zur enantioselektiven Reduktion von Dionen stellt die asymmetrische Transferhydrierung
an chiralen Rutheniumkatalysatoren dar (ee 25 - 99 %). Die Regioselektivität
der Reaktion (Bildung von Hydroxyketon oder Diol) kann durch die Wahl der Reaktionsbedingungen
beeinflusst werden (Koike et al., 2000).
Eine elegante konvergente Syntheseroute zu 2-Hydroxyketonen ist die Verknüpfung
von Aldehyden unter C-C Bindungsbildung im Sinne der Benzoinkondensation. Als
Katalysatoren können anstelle der ursprünglich verwendeten Cyanidionen Thiazoliumsalze
verwendet werden, was eine Reaktionsführung unter milderen Bedingungen
ermöglicht (Ugai et al., 1943; Breslow, 1958). 1966 berichten Sheehan et. al. über eine
asymmetrische Variante der Benzoinkondensation, die durch chirale Thiazoliumsalze
katalysiert wird (Sheehan & Hunneman, 1966). Mit diesen Katalysatoren können jedoch
nur moderate Enantioselektivitäten bis zu einem ee von 57 % erreicht werden
(Knight & Leeper, 1997). Deutlich höhere Enantiomerenüberschüsse (ee bis 95 %) können
durch Verwendung chiraler, bicyclischer Triazoliumsalze erzielt werden (Enders
et al., 1996; Knight & Leeper, 1998; Enders & Kallfass, 2002).
1.2.3. Synthese mit biochemischen Methoden
Auch durch den Einsatz von Biokatalysatoren ist eine enantio- und regioselektive Reduktion
von 1,2-Diketoverbindungen zu 2-Hydroxyketonen möglich. Bei Verwendung
von Hefezellen ist dabei eine Kontrolle der Chemo- und Regioselektivitäten durch Additive
und Katalysatorvorbehandlung nötig, um eine hinreichende Selektivitäten zu
erzielen (ee 98 %) (Nakamura et al., 1996).
Die NAD-abhängige Glyceroldehydrogenase (GDH, EC 1.1.1.6) aus Enterobacter
aerogenes oder Cellulomonas species katalysiert die wechselseitige Überführung von
1,2-Diole in 2-Hydroxyketone. Das Enzym ermöglicht also die Synthese von chiralen
2-Hydroxyketonen entweder durch die kinetische Racematspaltung von 2-Hydroxyketonen
durch R-enantioselektive Reduktion oder durch stereoselektive Oxidation von
cis-1,2-Diolen (ee 99 %) (Lee & Whitesides, 1986).
Wie bei vielen anderen biotechnologischen Verfahren finden auch bei der Synthese
6

1.3. Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme
von chiralen 2-Hydroxyketonen Lipasen weitverbreitet Anwendung. Dabei ist sowohl
eine Racematspaltung durch enantioselektive Acylierung von Hydroxyketonen als auch
eine selektive Hydrolyse der acylierten Species möglich (ee 66 - 96 %) (Adam et al.,
1999).
Eine weitere wichtige Gruppe von Biokatalysatoren zur Synthese chiraler 2-Hydroxyketone
stellen die Thiamindiphosphat-abhängigen Enzyme dar, auf die im folgenden
Unterkapitel eingegangen wird.
1.3. Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme
1.3.1. Der Cofaktor Thiamindiphosphat
Thiamin (Vitamin B1) enthält einen Pyrimidinring, der über eine Methylengruppe
mit einem Thiazolkern verbunden ist. Es findet sich in fast allen pflanzlichen und
tierischen Geweben, vor allem in Getreideschalen, Hefe und Kartoffeln. Therapeutisch
wird es bei Neuritiden und Neuralgien verwendet. Außerdem ist es ein wichtiger
Wuchsstoff für viele Organisman. Biochemisch große Bedeutung hat das Thiamindiposphat
2 (ThDP, Abbildung 1.2), das als Kofaktor für eine weitverbreitete Gruppe
von Enzymen fungiert. ThDP-abhängige Enzyme kommen in den unterschiedlichsten
Organismen vor und katalysieren dort eine Vielzahl verschiedener Reaktionen.
H 3C
3’
N
2’
NH 2
N
1’
4’
5’
6’
CH 2 N
3
CH 3
H S
O P 3-
2 5
2O6 Pyrimidin Thiazol
Abbildung 1.2.: Strukturformel von Thiamindiphosphat.
So sind z.B. die Pyruvatdehydrogenase (EC 1.2.4.1) und die Oxoglutaratdehydrogenase
(EC 1.2.4.2) Bestandteile von Multienzymkomplexen, die eine oxidative Decarboxylierung
von 2-Oxosäuren und die Übertragung des gebildeten Acylrestes auf CoA
katalysieren. Der Pyruvatdehydrogenasekomplex dient der Synthese von Acetyl-CoA,
und der 2-Ketoglutaratdehydrogenasekomplex katalysiert die Synthese von Succinyl-
CoA, einem Intermediat im Citronensäurecyclus (Robinson & Chun, 1993). Die Pyruvatdecarboxylase
(EC 4.1.1.1), die ein Schlüsselenzym bei der alkoholischen Gärung
darstellt, katalysiert dagegen die nicht-oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu
Acetaldehyd und CO2 (Lehninger, 1987). Während die Phenylpyruvatdecarboxylase
(EC 4.1.1.43) am Phenylalaninkatabolismus beteiligt ist (Costacurta et al., 1994),
spielt die Acetolactatsynthase (EC 4.1.3.18) eine wichtige Rolle bei der Biosynthese
von Valin, Leucin und Isoleucin, in dem sie die Vorstufen dieser Aminosäuren
2 INN : Cocarboxylase
1
4
7

1. Einleitung
2-Acetolactat bzw. 2-Aceto-2-hydroxybutyrat synthetisiert (Oh et al., 2001; Schloss,
1984).
Allen Reaktionen, die durch ThDP-abhängige Enzyme katalysiert werden liegt ein
gemeinsames Prinzip zugrunde, das in Abbildung 1.3 dargestellt ist (Schellenberger,
1998). Der Katalysezyklus beginnt mit der Deprotonierung des ThDP am C-2 des
Thiazoliumrings. Dadurch wird der Cofaktor in die Ylid-Form überführt. Durch Reaktion
des mesomeriestabilisierten Ylids mit der Carbonylgruppe des Substratmoleküls
wird unter Abspaltung der Abgangsgruppe X die elektronische Situation an
diesem Reaktionszentrum im Sinne einer Umpolung modifiziert. Die vormals elektrophile
Carbonylgruppe stellt jetzt ein nucleophiles Reaktionszentrum des aktivierten
Aldehyds dar, wodurch eine Reaktion mit einem elektrophilen Akzeptormolekül ermöglicht
wird. Unter Freisetzung des Cofaktors kann der aktivierte Aldehyd mit dem
Akzeptormolekül Y reagieren. Die Regenerierung des Cofaktors erfolgt im Katalysezyklus.
Der Mechanismus durch ThDP-abhängiger Enzyme katalysierter Reaktionen
wird von Jordan in einem aktuellen Übersichtsartikel detailliert diskutiert (Jordan,
2003).
R
O
X
+ThDP OH
+Y O
-X R ThDP -ThDP R Y
Abbildung 1.3.: Allgemeiner Katalysemechnismus Thiamindiphosphat-abhängiger
Enzyme.
Im weiteren Verlauf des Kapitels werden einige wichtige ThDP-abhängige Enzyme
kurz vorgestellt. Das Kapitel wird durch eine dataillierte Beschreibung der durch die
Benzaldehydlyase katalysierten Reaktionen abgeschlossen.
1.3.2. Transketolase
Die Transketolase (TK, EC 2.2.1.1) ist am Pentosephosphatweg einer Vielzahl von Organismen
beteiligt (Schenk et al., 1998). Die natürliche Funktion der TK ist die reversible
Übertragung einer Hydroxyacetaldehydfunktion von einem Ketosedonor auf einen
Aldoseakzeptor (Abbildung 1.4). Das Kohlenstoffgerüst des Akzeptors wird dadurch
unter Ausbidung eines zusätzlichen Chiralitätszentrums um eine C2-Einheit verlängert
(Theil, 1997). Für Biotransformationen ist die Verwendung der TK aus Escherichia
coli, Hefe und Spinat besonders interessant. Die genannten Enzyme akzeptieren α-
Hydroxypyruvat als C2-Donor, wodurch eine irreversible Reaktionsführung möglich
wird. Anwendung findet dieser Schritt bei der Synthese von Vorläufern, z. B. für das
Pheromon α-exo-Brevicomin (Myles et al., 1991), des Aromastoffs Furanel (Hecquet
et al., 1996) oder für den Glucosidaseinhibitor Fagomin (Schörken & Sprenger, 1998).
Hinsichtlich der Akzeptoren setzt das Enzym selektiv (R)-2-Hydroxyaldehyde um. 2-
8

1.3. Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme
Hydroxyaldehyde mit (S)-Konfiguration werden nicht akzeptiert, was eine kinetische
Racematspaltung von 2-Hydroxyaldehyden zulässt (Effenberger et al., 1992; Kobori
et al., 1992).
OH
O
2-
O3PO OH
D-Xylose-
5-phosphat
OH
+
O
OH
OPO 3 2-
OH OH
D-Ribose-
5-phosphat
TK
Abbildung 1.4.: Reaktion der Transketolase.
1.3.3. Dihydroxyaceton Synthase
OH OH OH
2-
OPO3 +
OH
O OH OH
2-
O3PO O
D-Sedoheptulose- Glycerinaldehyd-
7-phosphat 3-phosphat
Die Dihydroxyaceton Synthase (DHAS) wurde aus den Peroxysomen der methylotrophen
Hefe Candida boidinii sowie aus dem Bakterium Acinetobacter sp. DSM
3038 isoliert. Ihre natürliche Funktion ist die katalytische Übertragung einer C2-
Einheit von Xylulose-5-phosphat auf Formaldehyd, dem ersten Metabolit der Methanoloxidation.
Die DHAS akzeptiert viele nicht-natürliche Substrate mit und ohne
α-Hydroxyfunktion. Als Donorsubstrat kann neben Xylulose-5-phosphat Hydroxypuruvat,
Fructose-6-phosphat und im Fall des bakteriellen Enzyms Ribulose-5-phosphat
verwendet werden (Yanase et al., 1995).
1.3.4. 1-Desoxyxylulose-5-phosphat Synthase
Die 1-Desoxyxylulose-5-phosphat Synthase (DXPS) wurde aus Escherichia coli isoliert
(Sprenger et al., 1997). Die DXPS katalysiert eine Ligasereaktion zwischen Glyceraldehyd,
bzw. Glyceraldehydphosphat (Acylakzeptor) und Pyruvat (Acyldonor) unter Abspaltung
von CO2. Das gebildete Produkt ist 1-Desoxyxylulose bzw. 1-Desoxyxylulose-
5-phosphat (DXP).
1.3.5. Pyruvatdecarboxylase
Die Pyruvatdecarboxylase (PDC, EC 4.1.1.1) ist ein weitverbreitetes ThDP-abhängiges
Enzym, dem eine Schlüsselrolle bei der alkoholischen Gärung zukommt. Die PDC
katalysiert die nicht oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetaldehyd, der im
weiteren Verlauf durch die Alkoholdehydrogenase zu Ethanol reduziert wird. Neben
der Decarboxylierung, die bei der PDC die Hauptaktivität ausmacht, katalysiert das
Enzym in einer Nebenaktivität die Carboligation. Dabei wird der durch Decarboxylierung
entstandene aktivierte Acetaldehyd auf einen Akzeptoraldehyd übertragen. Im
9

1. Einleitung
Falle von Benzaldehyd ist das Produkt der Carboligation (R)-1-Hydroxy-1-phenyl-2propanon
(PAC 3 ).
Schon 1921 beobachteten Neuberg und Hirsch die Bildung von (R)-PAC ausgehend
von Benzaldehyd, Pyruvat und Hefe (Neuberg & Hirsch, 1921). Auf Basis dieser
Reaktion wurde ein biotechnologisches Verfahren zur Darstellung von l-Ephedrin entwickelt.
Ephedrin und Pseudoephedrin werden zur Behandlung von Bronchialerkrankungen
eingesetzt. Es handelt sich dabei um das bislang erste Verfahren, bei dem ein
Thiamindiphosphat-abhängiges Enzym zum Einsatz kommt und das im industriellen
Maßstab durchgeführt wird. Das durch Carboligation gebildete (R)-PACwirdineiner
zweistufigen Synthese in Ephedrin, bzw. Pseudoephedrin überführt (Abbildung 1.5).
O
H
+
O
PDC
OH
O
( R)-1-Hydroxy-
1-phenyl-2-propanon
+ CH NH
+ H / Pt
3 2
2
OH
HN
(1 R, 2 S)-Ephedrin
Abbildung 1.5.: Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Ephedrin.
1.3.6. Benzoylformiatdecarboxylase
Die Benzoylformiatdecarboxylase (BFD) kommt im Mandelsäurekatabolismus vor und
wurde bisher in den Bakterien Pseudomonas putida (Hegeman, 1966b; Hegeman,
1966a; Hegeman, 1970), Pseudomonas aeruginosa (Barrowman et al., 1986) und Acinetobacter
calcoaceticus (Barrowman & Fewson, 1985) gefunden. Diese Organismen
können aromatische Verbindungen metabolisieren und dadurch auf Medien wachsen,
die diese Verbindungen als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Die Hauptaktivität der
BFD ist die Decarboxylierung von Benzoylformiat (Benzoylameisensäure) zu Benzaldehyd.
Darüber hinaus katalysiert das Enzym in eine Nebenaktivität eine Carboligation
im Sinne der Acyloinkondensation, was das hohe synthetische Potential der BFD
ausmacht. Ausgehend von Benzaldehyd (Donor) und Acetaldehyd (Akzeptor) kann
(S)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon erhalten werden, wobei ein Enantiomerenüberschuss
von90-96%(Pseudomonas putida) bzw. von über 98 % (Acinetobacter calcoaceticus)
berichtet wird (Wilcocks et al., 1992a; Wilcocks et al., 1992b; Prosen & Ward,
1994). Auf Seiten des Donors akzeptiert die BFD verschiede substituierte Aromaten
und Heteroaromaten sowie aliphatische und ungesättigte Aldehyde. Auf Seiten des
Akzeptoraldehyds ist das Substratspektrum im Bereich der aliphatischen Aldehyde
auf Acetaldehyd beschränkt (Dünnwald et al., 2000; Iding et al., 2000). Durch Carboligation
zweier aromatischer Aldehyde sind Benzoinderivate zugänglich (Demir et al.,
3 Die Abkürzung PAC leitet sich von dem Trivialnamen Phenylacetylcarbinol ab.
10

1.3. Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme
1999). Für das unsubstituierte Benzoin wird dabei ein Enantiomerenüberschuss von
99 % des (R)-Enantiomers beobachtet.
1.3.7. Benzaldehydlyase
Das Bakterium Pseudomonas fluorescens Biovar I wurde aus Holzresten einer Zellulose
Fabrik isoliert und ist in der Lage, ligninähnliche Verbindungen wie Anisoin und
Benzoinzumetabolisieren(Gonzaleset al., 1986). Das dafür notwendige Enzym ist
die ThDP- abhängige Benzaldehydlyase (BAL, EC 4.1.2.38). Durch die Aktivität der
BAL ist der Stamm in der Lage auf Medien zu wachsen, die ausschließlich Anisoin oder
Benzoin sowohl als Kohlenstoff-, als auch als Energiequelle enthalten (Gonzales & Vicuna,
1989). Dazu katalysiert die BAL zunächst die Spaltung der Acyloinbindung der
2-Hydroxyketone, wobei die entsprechenden Aldehyde entstehen. Diese werden dann
wahrscheinlich in einem für aromatische Verbindungen gemeinsamen β-Ketoadipatweg
weiter metabolisiert (Stanier & Ornston, 1973).
Gonzales und Vicuna beschrieben die durch die BAL katalysierte Spaltung der Hydroxyketone
Benzoin und Anisoin in die korrespondierenden Aldehyde als irreversibel
(Gonzales & Vicuna, 1989). Im Gegensatz dazu gelang Demir et. al. eine enzymatische
C-C Bindungsbildung im Sinne einer Umkehrung der C-C Spaltung (Demir et al.,
2000). Ausgehend von Benzaldehyd als Substrat und BAL als Katalysator wird das
Hydroxyketon Benzoin als Produkt der Carboligation erhalten. Bei dieser Reaktion
handelt es sich um eine Selbstkondensation von Benzaldehyd im Sinne der Benzoinreaktion.
Dabei fungiert das eine Aldehydmolekül als Elektronendonor, das andere als
Elektronenakzeptor (vgl. Abbildung 1.6). Die Konfiguration des stereogenen Zentrums
am Benzoin wird als R beschrieben, wobei eine hohe Enantioselektivität beobachtet
wird (ee > 99%). Ein Zusatz von Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsvermittler
hat sich als vorteilhaft erwiesen 4 . (Demir et al., 2001). Durch diese Arbeiten wurde eine
vielversprechende Methode zur enantioselektiven Synthese von 2-Hydroxyketonen
durch enzymatische C-C Knüpfung in wässriger Lösung eröffnet.
O
H
+
H
O
R'
R
Benzaldehyd Benzaldehyd
Donor Akzeptor
BAL
Abbildung 1.6.: Durch BAL katalysierte C-C Bindungsbildung.
.
R
O
OH
(R)-Benzoin
ee > 99%
4 Der Einsatz von DMSO als Lösungsvermittler und dessen Auswirkung auf das Reaktionssystem
wurde im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht. Vergleiche hierzu Kapitel 3.
R'
11

1. Einleitung
Die BAL weist bei den für die Benzoinbildung akzeptierten Aldehyden ein ausgesprochen
breites Substratspektrum auf. Es werden verschiedenartige Substituenten in
ortho-, meta- und para-Position, sowie mehrfach substituierte Aldehyde akzeptiert.
Durch Verwendung von unterschiedlich substituierten Aldehyden sind unsymmerisch
substituierte Benzoine zugänglich. Diese Untersuchungen sind Gegenstand der Dissertation
von Pascal Dünkelmann (Dünkelmann et al., 2002).
Ist zusätzlich zu Benzaldehyd noch Acetaldehyd als zweites Substrat zugegen, ist das
Produkt der Carboligation (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon (HPP). Charakteristisch
für die HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd ist die intermediäre
Bildung von (R)-Benzoin (Abbildung 1.7). Ob das Benzoin als Zwischenstufe
für die HPP-Bildung nötig ist, oder ob es nur aufgrund der hohen Startkonzentration
von Benzaldehyd zu dieser intermediären Beznoinbildung kommt ist bislang ungewiss.
Durch eine leicht erhöhte Acetaldehydkonzentration ist es jedoch möglich, die Thermodynamik
des Reaktionssystems hinsichtlich einer quantitativen Ausbeute von HPP
zu beeinflussen 5 (Demir et al., 2002).
O
H
O
BAL BAL
OH
Benzaldehyd (R)-Benzoin
(R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
O
ee > 99%
H
Acetaldehyd
Abbildung 1.7.: BAL-katalysierte Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd.
Auch bei der Bildung von HPP-Derivaten werden auf Seiten des (aromatischen) Donoraldehyds
unterschiedliche Substituenten in ortho-, metha- und para-Position, sowie
in gemischten Positionen akzeptiert. Dabei können die Ausbeuten bei Aldehyden mit
ortho-ständigen Substituenten niedriger liegen als bei den meta- und para-Derivaten
(Demir et al., 2001; Demir et al., 2002). Auf Seiten des (aliphatischen) Akzeptoraldehyds
werden neben Acetaldehyd auch längerkettige und ungesättigte Aldehyde
akzeptiert.
Neben der direkten Verknüpfung von Aldehyden zu chiralen 2-Hydroxyketonen kann
auch die Lyaseaktivität der BAL zur enantioselektiven Synthese dieser Verbindungen
ausgenutzt werden. Bei Verwendung racemischen Benzoins als Substrat wird in Gegenwart
von Acetaldehyd nur das (R)-Enantiomer von dem Enzym zu (R)-2-Hydroxy-
1-phenylpropanon umgesetzt. Das (S)-Enantiomer reagiert nicht und bleibt als nicht
umgesetztes Substrat zurück (Abbildung 1.8). Sowohl für das (S)-Benzoin als auch
5 Vgl. hierzu auch Kapitel 3.
12
O
OH

1.3. Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme
für das gebildete (R)-HPP wird eine hohe Enantioselektivität (ee jeweils > 99%) beobachtet
(Demir et al., 2002).
O
OH
rac-Benzoin
+
O
H
Acetaldehyd
BAL
O
OH
(S)-Benzoin
ee > 99%
+
O
OH
(R)-2-HPP
ee > 99%
Abbildung 1.8.: BAL-katalysierte kinetische Racematspaltung von Benzoin.
Durch diese elegante Art der Reaktionsführung sind zwei Enantiomere durch Verwendung
eines Katalysators zugänglich.
13

1. Einleitung
14

2. Motivation und Zielsetzung
Wie in Kapitel 1.2 gezeigt, existiert eine Vielzahl von sowohl chemischen als auch
biokatalytische Methoden für die enantioselektive Synthese von chiralen 2-Hydroxyketonen.
Problematisch bei vielen dieser Reaktionen ist die oft nur geringe Enantioselektivität
sowie das Erreichen nicht vollständiger Umsätze. Darüberhinaus handelt es
sich bei den Ausgangsverbindungen vielfach schon um komplexere Moleküle, die nicht
kommerziell erhältlich sind. Die Methodik der enantioselektiven Carboligation geht
von einfachen Ausgangsverbindungen aus, jedoch ist die stereoselektive C-C Bindungsbildung
in wässriger Lösung bislang eines der ungelösten Probleme in der katalytischen
asymmetrischen Synthese (Faber & Patel, 2000). Wie bereits in Kapitel 1.2 auf Seite 4
beschrieben, benötigen die klassisch organischen Verfahren wasserfreie Lösungsmittel,
da die vorkommenden Intermediate carbanionischen Charakter besitzen und mit wässrigen
Systemen nicht kompatibel sind. Darüberhinaus erfordern alle vorkommenden
funktionellen Gruppen mit aciden Protonen eine aufwendige Schutzgruppenchemie.
Eine Alternative zu den klassisch chemischen Verfahren stellt die enzymatische C-C
Bindungsbildung mit Hilfe Thiamindisphosphat-abhängiger Enzyme dar. Das hohe
synthetische Potential der ThDP-abhängigen Enzyme resultiert aus der Kombination
von eleganter, konvergenter Syntheseroute über die C-C Bindungsbildung zu chiralen
2-Hydroxyketonen mit den für die Enzymkatalyse charakteristischen milden Reaktionsbedingungen
in wässriger Lösung. Wie in Kapitel 1.3.7 gezeigt, eröffnet sich durch
die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens Biovar I in Kombination mit den
verschiedenen Substraten ein divergentes Reaktionssystem, das ein attraktives Ziel für
eine reaktionstechnische Bearbeitung darstellt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung und die reaktionstechnische
Bearbeitung der Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens Biovar I.
Wie in Kapitel 1.2 dargestellt sind chirale 2-Hydroxyketone, insbesondere (R)-2-
Hydroxy-1-phenylpropanon und die halogen-substituierten Derivate, wertvolle Vorläufer
für die Synthese pharmakologisch aktiver Verbindungen. Daher soll im ersten Teil
der Arbeit die chemoenzymatische Synthese von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon als
Modellsystem mit einem reaktionstechnischen Hintergrund untersucht werden (Abbildung
2.1 auf der nächsten Seite). Dieser Teil macht auch den Hauptteil der Arbeit
aus. Dazu wird die Vorgehensweise wie folgt gegliedert.
• Grundlegende Charakterisierung der Enzymeigenschaften und des Reaktionssystems.
Da bislang nur sehr wenige Informationen über die BAL verfügbar sind, muss
15

2. Motivation und Zielsetzung
O
H
O
BAL BAL
OH
Benzaldehyd (R)-Benzoin
(R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
O
ee > 99%
H
Acetaldehyd
Abbildung 2.1.: Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend von
Benzaldehyd und Acetaldehyd.
zunächst die Verwendbarkeit des Enzyms für einen reaktionstechnischen Ansatz
überprüft werden. Dies ist eine grundlegende Voraussetzung für die Durchführbarkeit
dieser Arbeit. Weiterhin ist der Einfluss von DMSO, das dem Reaktionssystem
als Lösungsvermittler zugesetzt wird, sowohl auf das Enzym als auch auf
die Reaktanden von hohem Interesse. Anhand der bei der Charakterisierung gewonnenen
Daten sollen für die BAL geeignete Reaktionsbedingungen formuliert
werden.
• Kinetische Charaterisierung des Reaktionssystems.
Das Reaktionssystem der HPP-Bildung soll zunächst in Einzelreaktionen aufgeteilt
werden, deren kinetisches Verhalten getrennt untersucht werden kann.
Hier ist vor allem die Funktion des bei der HPP-Bildung intermediär gebildeten
Benzoins von großem Interesse.
• Simulation eines Satzreaktors auf Basis der zuvor bestimmten kinetischen
Parameter.
Aufgrund seiner Instationarität eignet sich die Simulation eines Satzreaktors besonders
gut für die Überprüfung der kinetischen Parameter. Das der Simulation
zugrundeliegende Modell soll durch Kombination der zuvor kinetisch charakterisierten
Einzelreaktionen zusammengesetzt werden.
• Entwicklung eines Reaktorkonzenpts
Auf Grundlage der in den vorhergehenden Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse
soll ein für das Reaktionssystem geeignetes Reaktorkonzept entwickelt werden.
Der Reaktor soll sowohl eine gute Ausnutzung des Katalysators als auch eine
gute Ausnutzung des Reaktorvolumens ermöglichen.
Viele Substrate und Produkte in der chemoenzymatischen Synthese sind ausgesprochen
schlecht wasserlöslich. Neben dem Einsatz von Cosolventien 1 ist die Ver-
1 Bei Cosolventien handelt es sich um mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, deren Zusatz
die Löslichkeit organischer Verbindungen in wässriger Lösung erhöht.
16
O
OH

wendung weiterer nicht-konventioneller Reaktionsmedien denkbar. Bei diesen
Reaktionsmedien findet besonders das wässrig-organische Zweiphasensystem weitverbreitet
Anwendung. Diesen Aspekt hat der zweite Teil dieser Arbeit zum Inhalt. Bei
den Untersuchungen sollen folgende Punkte berücksichtigt werden.
• Lösungsmittelscreening
In einem breitangelegten Lösungsmittelscreening, soll die Stabilität der BAL in
Gegenwart organischer, mit Wasser nicht mischbarer Lösungsmittel untersucht
werden. Dazu soll in einem ersten Schritt zunächst eine geeignete Lösungsmittelklasse
gefunden werden. Nachfolgend sollen dann mehrere Lösungsmittel aus
dieser Klasse auf ihre Biokompatibilität hin getestet werden.
• C-C Knüpfung in nicht-konventionellen Lösungsmitteln
Wird durch das Lösungsmittelscreening ein geeignetes Lösungsmittel gefunden,
so wird exemplarisch eine Biotransformation unter diesen Bedingungen durchgeführt.
Dazu soll zunächst die HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd und
Acetaldehyd untersucht werden, da für dieses Reaktionssystem auf die im Teil
1 gewonnenen Erkenntnisse zurückgegriffen werden kann.
• Entwicklung eines Reaktorkonzenpts für nicht-konventionelle Lösungsmittel
Auf Basis der bei den Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse soll ein geeignetes
Reaktorkonzenpt für den Einsatz der Benzaldehydlyase in nicht-konventionellen
Lösungsmitteln entwickelt werden.
• Racematspaltung in nicht-konventionellen Lösungsmitteln
Ein denkbares Reaktionssystem der BAL für die Anwendung nicht-konventioneller
Reaktionsmedien ist die Racematspaltung von Benzoin in Gegenwart von Acetaldehyd
(Abbildung 2.2).
O
OH
rac-Benzoin
+
O
H
Acetaldehyd
BAL
O
OH
(S)-Benzoin
ee > 99%
+
O
OH
(R)-2-HPP
ee > 99%
Abbildung 2.2.: Kinetische Racematspaltung von Benzoin durch die Benzaldehydlyase.
Abschließend werden die Ergebnisse beider Teile zusammengefasst und vergleichend
diskutiert.
17

2. Motivation und Zielsetzung
18

Teil II.
Biotransformationen im
homogenen System
19

3. Systemcharakterisierung
Bei der in dieser Arbeit verwendeten Benzaldehydlyase handelt es sich um ein rekombinantes
Protein, das als Hexahistidinfusionsprotein in E.coli überexpremiert wurde.
Die genaue Bezeichnung des Stamms lautet E.coli SG13009 / BALHis. DasEnzym
wurde vor der Verwendung durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie
(IMAC) aufgereinigt und die Präparation als Lyophilisat eingesetzt. Alle im weiteren
Verlauf dieser Arbeit angegebenen Konzentrationen wurden per HPLC-Analytik ermittelt.
Die grundlegenden Charakterisierung der Carboliogation in diesem Kapitel erfolgt
am Modellsystem der Benzoinbildung ausgehend von Benzaldehyd.
3.1. Enzymassay
Eine präzise Bestimmung der Katalysatoraktivität ist von grundlegender Bedeutung
für jede Untersuchung mit reaktionstechnischem Hintergrund. Die zeitabhängige Verfolgung
der Enzymaktivität ermöglicht es, je nach Versuchsaufbau und -bedingung
Aussagen über Stabilität und kinetisches Verhalten des Biokatalysators zu treffen.
3.1.1. Lyaseaktivität
Die Lyaseaktivität der Benzaldehydlyase (BAL) wird durch einen gekoppelten Enzymassay
bestimmt. Die Grundlage des Assays bildet der Enzymassay zur Bestimmung
der Decarboxylaseaktivität der Benzoylformatdecarboxylase (BFD) (Iding et al., 2000).
Im Falle von BAL wird der Benzaldehyd nicht durch Decarboxylierung von Benzoylameisensäure,
sondern durch die Spaltung von (R)-Benzoin erhalten (Abbildung 3.1).
O
OH
(R)-Benzoin
BAL
O
H
NADH + H +
Benzaldehyd
HLADH
NAD +
OH
H
H
Benzylalkohol
Abbildung 3.1.: Gekoppelter Enzymassay zur Bestimmung der Lyaseaktivität.
Der durch die BAL gebildete Benzaldehyd stellt wiederum ein Substrat für die
Pferdeleber-Alkoholdehydrogenase (HLADH) dar. Unter NADH-Verbrauch wird der
21

3. Systemcharakterisierung
Aldehyd in Benzylalkohol überführt. Die Abnahme der NADH-Konzentration lässt
sich photometrisch bei 340 nm verfolgen. Um eine ausreichende Menge Benzion lösen
zu können, wird dem Substratpuffer Polyethylenglykol (PEG400) als Lösungsvermittler
zugegeben 1 (Janzen, 2002).
3.1.2. Ligaseaktivität
Ein Nachteil des gekoppelten Assaysystems ergibt sich für den Rahmen dieser Arbeit
dadurch, dass nicht die Ligaseaktivität, sondern die Lyaseaktivität der BAL gemessen
wird. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit zur Entwicklung eines Assaysystems,
das die Aktivität der C-C Bindungsbildung erfassen kann. Dazu wird zunächst ein
geeignetes Reaktionssystem ausgewählt.
Mögliche Reaktionssysteme sind zum einen die HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd und die Bildung von Benzoin ausgehend von Benzaldehyd.
Bei der HPP-Bildung kommen zwei Substrate zum Einsatz, wobei hier besonders
Acetaldehyd durch seine leichte Flüchtigkeit und der Neigung zur Polymerisierung
problematisch ist2 . Bei diesem Reaktionssystem kommt es nicht nur zur Bildung von
HPP, sondern, als Folge der Selbstkondensation von Benzaldehyd, auch zur Benzoinbildung.
Das gebildete Benzoin steht wiederum als Substrat für weitere BAL katalysierte
Reaktionen zur Verfügung (vergleiche Kapitel 4).
Ein deutlich einfacheres Reaktionssystem stellt die Benzoinkondensation ausgehend
von Benzaldehyd dar, bei der nur ein Substrat benötigt wird. Zur Ermittlung einer geeigneten
Substratkonzentration ist die Löslicheit von Benzoin in Wasser zu berücksichtigen.
Eine Konzentration von 30 vol% DMSO bewirkt eine Steigerung der Löslichkeit
von Benzoin auf ca. 1,5 mM (Kapitel 3.4.2). Ausgehend von 20 mM Benzaldehyd kann
unter Wahrung der Anfangsreaktionsbedingungen (Umsatz < 10%) maximal 1 mM
Benzoin gebildet werden. Der Einsatz von 30 vol% DMSO genügt also, um das im
Assay gebildete Produkt zu in Lösung zu halten.
Zur Frage der Cofaktorkonzentrationen und des verwendeten Puffermaterials siehe
die nachfolgenden Unterkapitel. Die im Folgenden angegebenen Assaybedingungen
sind auf Basis der in diesem Kapitel gezeigten Ergebnisse gewählt worden. Abbildung
3.2 zeigt die gemessene Enzymaktivität bezogen auf die Benzoinbildung ausgehend
von Benzaldehyd in Abhängigkeit zur eingesetzten Enzymmenge. Der Graph zeigt
einen linearen Zusammenhang beider Größen.
1 vgl. Kapitel 3.4.2
2 Im Verlauf dieser Arbeit konnte bei der HPP-Bildung eine nicht näher charakterisierte Nebenreaktion
beobachtet werden, die durch gealterten Acetaldehyd hervorgerufen wird. Folge der Nebenreaktion
ist eine nicht quantitative HPP-Ausbeute. Acetaldehyd steht außerdem im Verdacht
cancerogen zu wirken.
22

Enzymaktivität / U · mL −1
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Enzymkonzentration / µg · mL−1 3.2. Cofaktoren
Abbildung 3.2.: Gemessene Enzymaktivität in Abhängigkeit der eingesetzten Proteinkonzentration
(35 mM TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM
MgSO4, 30 vol% DMSO, 20 mM Benzaldehyd, T = 20 ◦ C).
Allen im weiteren Verlauf der Arbeit angegebenen Enzymaktivitäten liegt dieser
Standardassay zugrunde. 1 U Benzaldehydlyase ist definiert als die Enzymmenge, die
erforderlich ist, um, ausgehend von 20 mM Benzaldehyd, in einer Minute 1 µmol
Benzoin zu synthetisieren (35 mM TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4,
30 vol% DMSO, 20 mM Benzaldehyd, T = 20 ◦ C).
3.2. Cofaktoren
3.2.1. Enzymstabilität
Essentiell für die katalytische Aktivität der BAL ist der Cofaktor Thiamindiphosphat
(ThDP). Darüber hinaus benötigt das Enzym Magnesiumionen, die an der Bindung
des Cofaktors an das Enzym beteiligt sind. Beide Komponenten werden im Folgenden
als Cofaktoren bezeichnet. Da beide Cofaktoren nicht kovalent an das aktive Zentrum
des Enzyms gebunden sind, besteht die Möglichkeit, dass in cofaktorfreier Lösung die
Cofaktoren vom aktiven Zentrum dissoziieren und das Enzym an Aktivität verliert.
Eine Untersuchung des Einflusses der Cofaktoren ist also nicht nur hinsichtlich der
Enzymaktivität, sondern auch der Enzymstabilität von Interesse.
Abbildung 3.3 auf der nächsten Seite zeigt die Stabilität der BAL in verschiedenen
Medien. Ausgehend von einer Enzymlösung in reinem Wasser werden in getrennten
Ansätzen sukzessive Puffersubstanz und Cofaktoren zugegeben. Im letzten Schritt
wird zusätzlich der Einfluss des bei Biotransformationen weitverbreiteten Antioxidationsmittels
Dithiothreitol (DTT) untersucht.
Da das Protokoll zur Aufreinigung der BAL als letzten Schritt eine Lyophilisation
23

3. Systemcharakterisierung
relative Aktivität / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0 1 2 3 4
Zeit / h
5 6 7 8
Wasser
KPi
KPi + Mg 2+
KPi + ThDP
2+
KPi + Mg + ThDP
2+
KPi + Mg + ThDP + DTT
Abbildung 3.3.: Einfluss der Cofaktoren auf die Enzymstabilität (50 mM KPi, pH
= 8, 0,5 mM ThDP, 0,5 mM Mg 2+ , 1 mM DTT, T = 0 ◦ C).
(Gefriertocknung) aus cofaktorhaltiger Lösung vorsieht, ist die eingesetzte Enzympräparation
nicht cofaktorfrei. Wird die für diesen Versuch benötigte Menge der Enzympräparation
in reinem Wasser gelöst, resultiert eine 0,015 mM Lösung von ThDP
und Magnesiumionen. Das Enzym verliert in dieser „rein wässrigen Lösung“ unter
den gegebenen Bedingungen innerhalb von 3 Stunden nahezu seine gesamte Aktivität.
Auch in Kailumphosphatpuffer bzw. Puffer in Kombination mit einem einzelnen
Cofaktor (0,5 mM ThDP oder Mg 2+ ) ist immer noch ein rascher Aktivitätsverlust zu
beobachten. Erst bei Anwesenheit beider Cofaktoren in gepufferter Lösung wird eine
signifikante Steigerung der Stabilität erreicht. Auch die Zugabe von DTT wirkt auf
das Enzym stabilisierend. Um die Produktaufarbeitung nicht zu erschweren, wurde
auf den Einsatz dieses Antioxidationsmittels verzichtet.
3.2.2. Enzymaktivität
Abbildung 3.4 auf der nächsten Seite zeigt den Einfluss der Cofaktorkonzentration
auf die Aktivität des Enzyms. Untersucht wurde ein Bereich bis 1 mM. Die geringste
Cofaktorkonzentration liegt auch bei diesem Versuch aufgrund der cofaktorhaltigen
Enzympräparation bei 0,015 mM. Die Konzentration an Thiamindiphosphat und Magnesiumionen
zeigt im Bereich bis 1 mM keinen signifikanten Einfluss auf die Enzymaktivität.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwesenheit der Cofaktoren für die
Stabilität der BAL notwendig ist. Bis zu einer Konzentration von 1 mM zeigt die
Cofaktorkonzentration keinen signifikanten Einfluss auf die Enzymaktivität. Für die
weiteren Untersuchungen scheint somit eine Konzentration von 0,3 bis 0,5 mM ThDP
und Magnesiumionen als vorteilhaft.
24

Enzymaktivität / U · mL −1
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ThDP-Konzentration / mM
Enzymaktivität / U · mL −1
0,08
0,06
0,04
0,02
3.3. pH-Wert
0,00
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Mg 2+ -Konzentration / mM
Abbildung 3.4.: Aktivität der BAL in Abhängigkeit der Konzentration von ThDP
(links) und Magnesiumionen (rechts) (35 mM KPi, pH = 8,
0,35 mM ThDP oder Mg 2+ , 20 mM Benzaldehyd, 30 vol% DMSO,
T=20 ◦ C).
3.3. pH-Wert
Abbildung 3.5 zeigt den Einfluss des pH-Werts auf die Stabilität und Aktivität der
BAL. Das Enzym zeigt eine maximale Stabilität bei einem pH-Wert von 6,75 - 7,0.
Das Maximun der Enzymaktivität liegt bei einen pH-Wert von ca. 8,75.
relative Stabilität / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Stabilität
Aktivität
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
pH-Wert
Abbildung 3.5.: Einfluss des pH-Werts auf Enzymaktivität und -stabilität (Bedingungen
Stabilitätsmessung: 10 mM KPi, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM
Mg 2+ , T = 0 ◦ C; Bedingungen Aktivitätsmessung: 10 mM KPi,
pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM Mg 2+ , 20 mM Benzaldehyd,
30 vol% DMSO, T = 20 ◦ C).
relative Aktivität / -
25

3. Systemcharakterisierung
Nach Abbildung 3.5 auf der vorherigen Seite liegt der ideale pH-Wert für die Carboligation
ausgehend von Benzaldehyd bei ungefährt 7,8, da in diesem Bereich bei noch
vorhandener Enzymstabilität schon eine signifikante Enzymaktivität besteht. Wie in
Kapitel 3.4.2 noch gezeigt wird, bewirkt ein DMSO-Zusatz zum Reaktionssystem eine
deutliche Stabilisierung des Enzyms. Es sollte also für die weiteren enzymatischen
Reaktionen möglich sein, die höhere Aktivität bei einem pH-Wert von 8,0 zu nutzen,
ohne dass die bei diesem pH-Wert stärkere Enzymdesaktivierung limitierend wird (vgl.
Kapitel 3.4.2.
3.4. Lösungsvermittler
3.4.1. Organische Lösungsmittel als Lösungsvermittler
Wie in Kapitel 1.3.7 gezeigt, liefert sowohl die BAL-katalysierte Carboligation wie
auch die enzymatische Spaltung der C-C Bindung einen wertvollen Beitrag zur chemoenzymatischen
Synthese. Die Schwerlöslichkeit von Benzoin in Wasser stellt dabei
eine reaktionstechnische Herausforderung dar. Demir et. al. konnten zeigen, dass sich
ein Zusatz von DMSO zum Reaktionssystem vorteilhaft auf die Bildung von Acyloinen
ausgehend von Aldehyden auswirkt (Demir et al., 2001; Pohl et al., 2002). Auch bei
der BAL-katalysierten Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend von
Benzaldehyd und Acetaldehyd wird, obwohl am Ende der Reaktion der Benzaldehyd
quantitativ in HPP überführt ist, intermediär die Bildung von Benzoin beobachtet
werden. In rein wässriger Lösung ist das intermediär gebildete Benzoin nahezu unlöslich
(

• erschwerte Produktaufarbeitung.
3.4. Lösungsvermittler
Ein wichtiger Punkt bei der Verwendung von wassermischbaren Lösungsmitteln in
Kombination mit Biokatalysatoren ist die Auswirkung des Lösungsmittels auf den
Katalysator. Mozhaev et. al. beobachteten für die Enzyme α-Chymotrypsin, Trypsin,
Laccase, Chymotrysinogen, Cytochrom C und Myoglobin eine mit steigender Cosolventkonzentration
zunächst gleichbleibende Aktivität. Ab einer für jedes Lösungmittel
unterschiedlichen Grenzkonzentration fällt die Aktivität dann rasch auf nahezu null
ab. Die Inaktivierung der Enzyme wird als reversibel beschrieben und auf den Austausch
von Wassermolekülen durch Lösungsmittelmoleküle in der essentiellen Wasserschicht
des Enzyms zurückgeführt (Mozhaev et al., 1989; Khmelnitsky et al., 1991).
Gupta et. al. konnten zeigen, dass die Reversibilität der Enzyminaktivierung mit
der Dauer der Exposition des Enzyms im organischen Lösungsmittel bis hin zur vollständigen
Irreversibilität abnimmt (Gupta et al., 1997). Der Rückgang der Reversibilität
wird einer irreversiblen Desaktivierung zugeschrieben, die auf konformativen
Änderungen im Enzym beruht. Dieses Beispiel zeigt wie wichtig es ist, die Parameter
Enzymaktivität und Enzymstabilität getrennt voneinander zu behandeln.
3.4.2. Dimethylsulfoxid als Cosolvent
3.4.2.1. Einfluss auf die Enzymaktivität
Der Einfluss von DMSO auf die Lyase- und Ligaseaktivität der BAL wurde von Elena
Janzen im Rahmen ihrer Dissertation untersucht (Janzen, 2002). Für die Lyaseaktivität
kann eine deutliche Inhibierung durch DMSO beobachtet werden. Bei einem
DMSO-Gehalt von 20 vol% im Reaktionsmedium wird die Lyaseaktivität um
über 80 % verringert (50 mM KPi, pH = 7, 0,1 mM ThDP, 5 mM Mg 2+ ,20vol%
DMSO, 1,5 mM Benzoin). Die Ligaseaktivität wird durch Anwesenheit von DMSO
nicht signifikant beeinfusst (50 mM KPi, pH = 7, 0,1 mM ThDP, 2,5 mM Mg 2+ ,
20 vol% DMSO, 30 mM Benzaldehyd).
3.4.2.2. Einfluss auf die Enzymstabilität
Um den Einfluss von DMSO auf die Stabilität der BAL zu untersuchen, wurde das Enzym
unterschiedlichen DMSO-Konzentrationen ausgesetzt. Mit fortschreitender Versuchszeit
wurden Proben entnommen und die Restaktivität wurde unter Standardbedingungen
bestimmt. Aufgrund des geringen Probenvolumens erfolgt keine signifikante
Änderung der DMSO-Konzentration im Enzymassay, sodass die Aktivitätsmessungen
alle unter gleichen Bedingungen erfolgen (Gupta, 1993).
Abbildung 3.6 auf der nächsten Seite links, zeigt die Stabilität der BAL bei unterschiedlichen
DMSO-Konzentrationen. Als Maß für die Stabilität wird der zeitabhängige
Verlauf der Enzymaktivität dokumentiert. Mit steigender DMSO-Konzentration ist
zunächst eine gesteigerte Enzymstabilität zu erkennen. Bei einer DMSO-Konzentration
zwischen 20 und 30 vol% erreicht die Stabilität ein Maximum. Bei weiter steigendem
27

3. Systemcharakterisierung
DMSO-Gehalt nimmt die Stabilität wieder ab. Eine Quantifizierung der Enzymstabilität
im Reaktionsmedium erfolgt ausführlich in Kapitel 5. Im Rahmen der Suche nach
einem geeignetem Cosolvent wurde die Stabilität der BAL in Kombination mit weiteren
Lösungsmitteln untersucht. 1-Propanol, Ethanol und Dioxan zeigen eine deutlich
stärkere Enzymdesaktivierung als DMSO und sind deshalb als Cosolventien ungeeignet.
Relative Enzymaktivität / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0% DMSO
20% DMSO
30% DMSO
40% DMSO
0,0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit / h
Benzoin / mM
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0 5 10 15 20 25 30
DMSO / vol %
Abbildung 3.6.: Einfluss der DMSO-Konzentration auf Enzymstabilität (links) und
Benzoinlöslichkeit (rechts) (Bedingungen Stabilität: 50 mM KPi,
pH = 8, 0,5 mM ThDP, 0,5 mM Mg 2+ ,T=20 ◦ C. Die Konzentrationsangaben
beziehen sich auf die wässrige Lösung vor DMSO-
Zugabe; Bedingungen Benzoinlöslichkeit: 50 mM KPi, pH = 8,
0,5mMThDP,0,5mMMg 2+ ,T=20 ◦ C).
Abbildung 3.6 rechts, zeigt den Einfluss der DMSO-Konzentration auf die Löslichkeit
von Benzoin im Reaktionssystem. Mit steigendem DMSO-Gehalt nimmt die
Löslichkeit von Benzoin zu. Bei einem Gehalt von 30 vol% DMSO können sich 1,5 mM
Benzoin lösen, was im Vergleich zum rein wässrigen System einer Steigerung der Löslichkeit
um den Faktor 15 entspricht. Für Reaktionssysteme, bei denen Benzoin lediglich
als Intermediat auftritt, ist diese Steigerung der Löslichkeit zunächst ausreichend.
Für Reaktionssysteme bei denen das Benzoin als Ausgangsverbindung eingesetzt wird,
sind jedoch höhere Konzentrationen wünschenswert. Diese Problematik wird in Teil
III der vorliegenden Arbeit behandelt.
3.5. Puffersystem
Wie in Kapitel 3.4.2 gezeigt, kann durch Verwendung von DMSO als Cosolvent sowohl
die Benzoinlöslichkeit gesteigert, als auch die Enzymstabilität verbessert werden.
Allerdings ergaben sich bei den Untersuchungen zum DMSO-Einsatz einige Inkompatibilitäten
des verwendeten Kaliumphosphatpuffers mit dem Cosolvent.
28

3.5. Puffersystem
Die Anwesenheit der Cofaktoren ThDP und Mg 2+ ist nicht nur für die Enzymaktivität
essentiell, sondern führt auch zu einer signifikanten Stabilisierung von BAL
(Kapitel 3.2). Bei längerer Aufbewahrung der DMSO-haltigen Reaktionslösung (Phosphatpuffer
/ Magnesiumionen / DMSO) kommt es im Laufe einiger Stunden zu einem
Niederschlag von Magnesiumphosphat. Dies bedeutet bei längerer Versuchsdauer eine
Veränderung der Reaktionsbedingungen, was bei systematischen Untersuchungen
nicht akzeptabel ist.
Eine weitere Beobachtung ist das Ansteigen des pH-Wertes bei Zugabe von Cosolventien
zu wässrigem Phosphatpuffer, wie in Abbildung 3.7 gezeigt.
∆ pH / -
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Wasser
1-PrOH
MeOH
EtOH
DMSO
50mM KPi
10mM KPi
Abbildung 3.7.: pH-Shift von Kaliumphosphatpuffer nach Zusatz von 30 vol% Wasser,
1-Propanol, Methanol, Ethanol oder DMSO.
Durch reines Verdünnen der Pufferlösung mit Wasser (30 vol%) wird keine signifikante
Änderung des pH-Wertes erreicht. Durch Zusatz der Alkohole 1-Propanol,
Methanol und Ethanol erhöht sich der pH-Wert um ca. 0,4 Einheiten. Ein Anstieg
um 0,7 pH-Einheiten ist nach Zusatz von 30 vol% DMSO zu beobachten. Die Pufferkonzentration
hat keinen Einfluss auf den pH-Shift. Eine plausible Erklärung für den
beobachteten pH-Shift ist derzeit nicht möglich.
Da die Verwendung von Phosphatpuffer sich im Laufe der Untersuchungen zur Systemcharakterisierung
als nicht ideal herausgestellt hat, wurden zwei weitere Puffersubstanzen
auf ihre Anwendbarkeit hin untersucht. Dabei handelt es sich um Triethanolamin
(TEA) und Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS). Abbildung 3.8 auf der
nächsten Seite links, zeigt die Aktivität und rechts die Stabilität der Benzaldehydlyase
in den verschiedenen Puffersubstanzen.
Im Vergleich zu Kaliumphosphatpuffer zeigt die BAL in TEA eine leicht gesteigerte
und in TRIS-Puffer eine etwas erniedrigte Aktivität (Abbildung 3.8 links). Auf
die Stabilität des Enzyms zeigt die verwendete Puffersubstanz keinen signifikanten
Einfluss. Abbildung 3.8 (rechts) zeigt aber noch einmal deutlich den stabilisierenden
29

3. Systemcharakterisierung
Enzymaktivität / U · mL −1
0,16
0,12
0,08
0,04
0,00
TEA TRIS KPi
Relative Enzymaktivität / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
TEA - DMSO
TRIS - DMSO
KPi - DMSO
TEA
TRIS
KPi
0,0
0 10 20 30 40 50
Zeit / h
Abbildung 3.8.: Links: Aktivität der BAL in unterschiedlichen Puffersubstanzen.
Rechts: Stabilität der BAL in unterschiedlichen Puffermaterialien
bei An- und Abwesenheit von DMSO. (Bedingungen links: 35 mM
Puffer, pH = 8, 0,35 mM ThDP und Mg 2+ , 20 mM Benzaldehyd,
30 vol% DMSO; Bedingungen rechts: 35 mM Puffer, pH =
8, 0,35 mM ThDP und Mg 2+ ,30%DMSO,T=20 ◦ C).
Effekt von DMSO. Die Stabilisierung kann bei allen drei Puffersubstanzen beobachtet
werden. Der für Kaliumphosphatpuffer beschriebene pH-Shift bei Zugabe von organsichen
Lösungsmittel wird bei TEA-Puffer nicht beobachtet. Auch ist in diesem Puffer
die Bildung von schwerlöslichem Magnesiumphosphat unterbunden. Da das Enzym
in TEA-Puffer die höchste Aktivität zeigt, wird dieser Puffer für die weiteren Untersuchungen
verwendet. Eine mögliche Reaktion der am Reaktionssystem beteiligten
Aldehyde mit dem Puffermaterial findet unter den eingestellten Bedingungen nicht
statt.
3.6. Zusammenfassung und Auswahl der
Reaktionsbedingungen
30
• Die Ligaseaktivität der BAL kann anhand der Geschwindigkeit der Benzoinbildung
ausgehend von Benzaldehyd quantifiziert werden.
• Der Puffer Triethanolamin (TEA) bewirkte eine gute Aktivität der BAL.
Bei Verwendung von TEA besteht keine Gefahr des Ausfällens von Magnesiumphosphat
und der pH-Wert bleibt bei Zugabe eines organischen Lösungsmittels
unverändert. Die beteiligten Reaktanden sind im Puffer stabil. Für die
weiteren Untersuchungen wird eine Konzentration von 30 - 50 mM TEA
eingestellt.
• 20 bis 30 vol% Dimethylsulfoxid (DMSO) im Reaktionsmedium stabilisieren

3.6. Zusammenfassung und Auswahl der Reaktionsbedingungen
das Enzym signifikant. Ein Zusatz von 30 vol% DMSO erhöht die Löslichkeit
von Benzoin im Reaktionsmedium um den Faktor 15 auf 1,5 mM.
• Eine Konzentration von 0,3 bis 0,5 mM der Cofaktoren ThDP und Magnesium
wirkt stabilisierend auf das Enzym in wässriger Lösung. Bis zu einer
Cofaktorkonzentration von 1 mM wird die Enzymaktivität nicht signifikant beeinflusst.
• Bei einem pH-Wert von 8 zeigt die Benzaldehydlyase eine gesteigerte Ligaseaktivität.
Durch den Zusatz von DMSO wird auch bei diesem pH-Wert eine für
die Biotransformationen ausreichende Stabilität erreicht.
31

3. Systemcharakterisierung
32

4. Kinetik
Dieses Kapitel hat die kinetische Charakterisierung der durch die Benzaldehydlyase
katalysierten Reaktionen zum Inhalt. Da sowohl die Struktur als auch der genaue Reaktionsmechanismus
des Enzyms bislang unbekannt ist, ist die Einteilung des Reaktionssystems
in Einzelreaktionen schwierig. Zum Beispiel ist die Fragestellung ob HPP
durch direkte Kondensation von Benzaldehyd und Acetaldehyd entsteht oder ob Benzoin
als Intermediat im Sinne einer Folgereaktion bei der HPP-Bildung beteiligt ist,
bislang nicht eindeutig beantwortet worden. Auf Basis mechanistischer Untersuchungen
zu anderen ThDP-abhängigen Enzymen (Kluger et al., 1995; Kluger, 1997; Kern
et al., 1997) postulierten Demir et. al. einen Reaktionsmechanismus für die BAL, der
auch den kinetischen Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit zugrunde gelegt wird
(Demir et al., 2001). (Hierauf wird im nachfolgenden Unterkapitel noch näher eingegangen.)
Dazu werden zunächst die Einzelreaktionen identifiziert, aus denen sich das
Reaktionssystem zusammensetzt. Im Anschluss daran werden die kinetischen Parameter
der Einzelreaktionen bestimmt. Wichtig für eine reaktionstechnische Bearbeitung
und damit Ziel der kinetischen Untersuchung ist die Simulation von Reaktionsverläufen
in Reaktoren und nicht die endgültige Aufklärung des Reaktionsmechanismus.
Aufgrund der Instationarität eines Batchreaktors (vgl. Kapitel 5.2.1) eignet sich die
Simulation dieses Reaktortyps sehr gut zur Überprüfung der Kinetik.
Es sei an dieser Stelle ausdrücklich darauf hingewiesen, dass durch kinetische Untersuchungen
zwar ein vorgeschlagener Mechanismus widerlegt werden kann, aber der
Beweis eines postulierten Mechnismus nicht möglich ist. Zu jedem vorgeschlagenem
einfachen Mechnismus sind komplexere Alternativen denkbar, die das gleiche kinetische
Verhalten zur Folge hätten. Zum endgültigen Beweis eines Mechnismus müssen
weitere Methoden hinzugezogen werden, die die direkte Untersuchung von Zwischenprodukten
zulassen, wie z.B. spektroskopische Methoden.
4.1. Auswahl der Einzelreaktionen
Abbildung 4.1 auf Seite 36 zeigt den von Demir et. al. postulierten Reaktionsmechanismus.
Die durch Deprotonierung entstandene Ylid-Form 1 des ThDP greift im ersten
Schritt die Carbonylgruppe des (R)-Benzoins an. Unter Abspaltung eines Moleküls
Benzaldehyd entsteht aus dem Addukt 2 das resonanzstabilisierte Carbanion 3. Bei
Abwesenheit eines Akzeptors kann nach erfolgter Protonierung ein weiteres Molekül
Benzaldehyd abgespalten werden, wodurch sich der Katalysezyklus schließt. Steht ein
Akzeptor zu Verfügung so kann das Carbanion 3 unter Ausbildung einer C-C Bindung
den Carbonylkohlenstoff des Akzeptoraldehyds nucleophil angreifen.
33

4. Kinetik
Auch die Carbonylgruppe eines Benzaldehyds kann elektrophiler Reaktionspartner
für die Ylid-Form des ThDP sein. Es bildet sich das Hydroxybenzyl-ThDP 4, das durch
Deprotonierung in das Carbanion 3 übergeht. Je nach Natur des zur Verfügung stehenden
Akzeptoraldehyds bildet sich ein Benzoinderivat im Falle eines aromatischen
Akzeptors oder ein Derivat des HPP im Falle eines aliphatischen Akzeptoraldehyds.
Für das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Reaktionssystem ergeben sich damit
folgende Reaktionsmöglichkeiten:
34
1. Bildung von (R)-Benzoin ausgehend von Benzaldehyd. Diese Reaktion wird im
weiteren Verlauf dieser Arbeit als Benzoinkondensation bezeichnet.
O O
O
H
+
H
2. Bildung von Benzaldehyd durch Spaltung von (R)-Benzoin. Im Folgenden wird
diese Reaktion als Benzoinspaltung bezeichnet.
O
OH
3. Bildung von (R)-HPP durch Reaktion von Benzoin und Acetaldehyd. Pro gebildetem
Molekül (R)-HPP muss auch ein Molekül Benzaldehyd entstehen, da
aus dem Benzoin zunächst das Carbanion 3 gebildet werden muss. Da im Falle
racemischen Benzoins als Substrat bei dieser Reaktion nur das (R)-Benzoin von
der BAL akzeptiert wird, nicht aber das (S)-Benzoin, wird diese Reaktion im
weiteren Verlauf der Arbeit als Racematspaltung bezeichnet. Für die kinetische
Charakterisierung dieser Reaktion wird jedoch nur das (R)-Benzoin als
Substrat eingesetzt.
O
OH
+
O
H
O
H
O
+
OH
OH
+
O
H
O
H

4.1. Auswahl der Einzelreaktionen
4. Bildung von (R)-HPP aus Benzaldehyd und Acetaldehyd. Durch Reaktion der
Ylid-Form 1 entsteht das Hydroxybenzyl-ThDP 4, das durch Deprotonierung
in das Carbanion 3 übergeht. Nach Anlagerung des Acetaldehyds an das Carbanion
3 wird das (R)-HPP unter Regenerierung des Cofaktors freigesetzt. Für
diese Reaktion wird im Folgenden die Bezeichnung HPP-Bildung verwendet.
O
H
+
O
H
O
OH
35

4. Kinetik
36
Abbildung 4.1.: Postulierter Mechanismus der Benzaldehydlyase.
Hydroxybenzyl-ThDP, 4
ThDP (Ylid-Form), 1
( R)-2-HPP
S
H
O
C
O P 2O 6 3-
S
OH
N
O P 2O 6 3-
H
CH 3
N
CH 3
Pyr
O
Pyr
+
H
O
- H +
H
+ H +
+
-
H
O
O
3-
O P
S
2O6 ThDP (Ylid-Form), 1
ThDP
S
- H +
H
O P 2O 6 3-
N
CH 3
N
CH 3
+ H +
Pyr
Pyr
Pyr
Pyr
CH3 CH3 H O N
H O N
C
3-
O P C
3-
S
2O6 O P
S
2O6 Enamin Carbanion, 3
OH
-
+
H
O
O
OH
+
O
1,2-Dihydroxy-
1,2-Diphenylethyl-ThDP, 2
-
H
O
S
HO
C
O P 2O 6 3-
N
O
CH 3
Pyr

4.2. Bestimmung der kinetischen Parameter
4.2. Bestimmung der kinetischen Parameter
4.2.1. Allgemeine Anmerkung
Allen in diesem Kapitel vorgestellten Aktivitätsmessungen liegt der in Kapitel 3.1.2
vorgestellte Assay zugrunde, wobei für die kinetischen Untersuchungen die beteiligten
Reaktionspartner in den Assays je nach Fragestellung variieren. Der zeitabhängige
Konzentrationsverlauf der Reaktanden wurde mittels Probenahme und anschließender
HPLC-Analytik dokumentiert. Bei allen angegebenen Aktivitäten handelt es sich
um Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten. Das Enzym wurde als Lyophilisat eingesetzt.
Durch den Vorgang der Gefriertrocknung werden die Proteine der einzelnen Enzymchargen
unterschiedlich starken Belastungen ausgesetzt, was sich in unterschiedlichen
Graden der Enzymdesaktivierung während der Aufreinigung bemerkbar macht. Einzelne
Enzymchargen unterscheiden sich daher in ihren gewichtsspezifischen Aktivitäten.
Aus diesem Grund werden die Aktivitäten zur Simulation der Reaktoren in volumenspezifischen
Aktivitäten (U · mL −1 ) angegeben. Die Aktivität jeder der für die
Kinetik-Assays verwendeten Enzymlösungen wurde über einen Standardassay (Kapitel
3.1.2) quantifiziert. Über den Standardassay ist eine Normierung aller gemessenen
Aktivitäten möglich, wodurch die Aktivitätsunterschiede der einzelnen Enzymchargen
ausgeglichen werden. Um eine Vergleichbarkeit mit anderen Arbeiten zu ermöglichen,
werden die maximalen Aktivitäten (Vmax) zusätzlich in U · mg −1 angegeben. Diese
Daten sind jedoch unter Berücksichtigung der zuvor gemachten Anmerkungen zu verstehen.
In dieser Arbeit liegt der mathematischen Beschreibung der Enzymaktivitäten ein
formalkinetischer Ansatz nach Michaelis und Menten zugrunde (Michaelis & Menten,
1913; Briggs & Haldane, 1925). Dabei ist die Kenntnis des Mechanismus der Reaktion
nicht erforderlich. Die kinetischen Parameter werden durch nichtlineare Anpassung
der Geschwindigkeitsgleichungen an die Messwerte erhalten. Die Modellierung und
Anpassung erfolgt dabei nach dem Kriterium der kleinsten Quadratsumme der Fehlerdifferenzen
(Cornish-Bowden, 1995) und wird mit dem Programm Scientist c○ (Version
2.0, Micromath c○ , USA) durchgeführt. Die Standardabweichungen der Anpassungen
sind als Fehler angegeben.
37

4. Kinetik
4.2.2. Benzoinbildung (Reaktion 01)
O O
O
H
+
H
Abbildung 4.2 zeigt die Geschwindigkeit der Benzoinbildung in Abhängigkeit der
Benzaldehydkonzentration. Im Rahmen der Löslichkeitsgrenzen von Benzaldehyd unter
den gegebenen Reaktionsbedingungen (0 bis ca. 50 mM) ist mit zunehmender
Substratkonzentration ein nahezu linearer Anstieg der Reaktionsgeschwindigkeit zu
beobachten. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass das Enzym innerhalb der Substratlöslichkeit
den Sättigungsbereich nicht erreicht. Ein analoges Verhalten wird auch
für das ebenfalls ThDP-abhängige Enzym Benzoylformiatdecarboxylase beobachtet
(Iding et al., 2000).
BZ-Bildung / U mL −1
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
Experiment
Anpassung
0,00
0 10 20 30 40 50
Benzaldehyd / mM
BZ-Bildung / U mL −1
0,8
0,6
0,4
0,2
OH
Löslichkeitsgrenze BA
Experiment
Anpassung
0,0
0 100 200 300 400 500
Benzaldehyd / mM
Abbildung 4.2.: Aktivität der Benzoinbildung in Abhängigkeit der Benzaldehydkonzentration.
Die Interpolation der Aktivität außerhalb der Löslichkeitsgrenze
von Benzaldehyd ist als gestrichelte Linie dargestellt
(35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4,
30 % DMSO, T = 20 ◦ C).
Wie Abbildung 4.3 auf der nächsten Seite zeigt, wird die Aktivität der Benzoinbildung
sowohl durch HPP als auch durch Acetaldehyd erniedrigt. Der Einfluss von
Acetaldehyd auf die Benzoinbildung wird in Gleichung 4.1 als Inhibierung beschrieben,
doch hat die bei Anwesenheit von Acetaldehyd einsetzende HPP-Bildung (Parallelreaktion)
sicher auch einen Anteil.
Tabelle 4.1 auf der nächsten Seite zeigt die kinetischen Parameter der nichtlinearen
Anpassung von Gleichung 4.1. Die für die Benzoinbildung angegebene Maximalgeschwindigkeit
von 917 U · mg −1 wird unter realen Bedingungen aufgrund der eingeschränkten
Löslichkeit von Benzaldehyd in wassrigen Medien nicht erreicht. Wird
38

BZ-Bildung / U mL −1
0,16
0,12
0,08
0,04
10mM BA
20mM BA
30mM BA
Anpassung
0,00
0 5 10 15 20 25 30
HPP / mM
4.2. Bestimmung der kinetischen Parameter
BZ-Bildung / U mL −1
0,16
0,12
0,08
0,04
10mM BA
20mM BA
30mM BA
Anpassung
0,00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Acetaldehyd / mM
Abbildung 4.3.: Erniedrigung der Benzoinbildungsrate durch HPP und Acetaldehyd
(35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4,
30 % DMSO, T = 20 ◦ C).
eine Benzaldehydlöslichkeit von 50 mM zugrunde gelegt, kann eine „reale” maximale
Aktivität von 277 U · mg −1 angegeben werden.
R1 = vmax1 ·
KM,BAACC
[BA]
�
1+ [HPP]
KI,HPP
Parameter Wert Fehler Einheit
vmax1 = 0,825 ± 0,096 U mL −1
= 916,67 ± 106,56 U mg−1 = 111,93 ± 16,50 mM
KM,BAACC
KI,HPP = 7,18 ± 0,51 mM
KI,AA = 6,41 ± 0,42 mM
��
1+ [AA]
KI,AA
�
+[BA]
Tabelle 4.1.: Kinetische Parameter der BAL-katalysierten Benzoinbildung
ausgehend von Benzaldehyd.
(4.1)
39

4. Kinetik
4.2.3. Benzoinspaltung (Reaktion 02)
O
OH
Zur Untersuchung der Lyaseaktivität bezogen auf (R)-Benzoin wird die Rate der Benzaldehydbildung
bei variierter Benzoinkonzentration gemessen. Bei dieser Reaktion
wird nur das (R)-Benzoin als Substrat akzeptiert. Das (S)-Enantiomer reagiert nicht.
Der Konzentrationsbereich für das vorgelegt Substrat ist durch die geringe Löslichkeit
des Benzoins im Reaktionsmedium eingeschränkt und liegt zwischen 0 und 1,5 mM.
Der Verlauf der Enzymaktivität in diesem Konzentrationsbereich ist in Abbildung 4.4
dargestellt.
BA-Bildung / U mL −1
0,012
0,008
0,004
0,000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
O
H
+
(R)-Benzoin/ mM
Experiment
Anpassung
Abbildung 4.4.: Rate der Benzaldehydbildung bei variierter Benzoinkonzentration
(35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4,
30 % DMSO)
Der Graph 4.4 zeigt die typische hyperbolische Form einer klassischen Michaelis-
Menten Kinetik. Tabelle 4.2 auf der nächsten Seite zeigt das Ergebnis der Anpassung
von Gleichung 4.2 an die Meßwerte.
40
R2 = vmax2 ·
[BZ]
KM,BZ +[BZ]
O
H
(4.2)

Parameter Wert Fehler Einheit
vmax2 = 0,012 ± 0,001 U mL −1
= 13,67 ± 1,00 U mg −1
KM,BZ = 0,13 ± 0,03 mM
4.2. Bestimmung der kinetischen Parameter
Tabelle 4.2.: Kinetische Parameter der BAL-katalysierten Benzoinspaltung.
41

4. Kinetik
4.2.4. Racematspaltung (Reaktion 03)
O
OH
+
O
H
In zwei parallelen Versuchsreihen wird jeweils die Rate der HPP- und Benzaldehydbildung
untersucht. In der ersten Versuchsreihe wird die Konzentration von (R)-Benzoin
bei konstanter Acetaldehydkonzentration (60 mM) variiert (Abbildung 4.5). In der
zweiten Versuchsreihe wird bei konstanter Benzoinkonzentration (1,5 mM) die Acetaldehydkonzentration
variiert (Abbildung 4.6). Auch bei dieser Reaktion wird jeweils
nur das (R)-Enantiomer umgesetzt. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 4.5
und 4.6 auf der nächsten Seite dargestellt.
HPP-Bildung / U mL −1
0,016
0,012
0,008
0,004
Experiment
Anpassung
0,000
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
(R)-Benzoin/ mM
BA-Bildung / U mL −1
0,016
0,012
0,008
0,004
O
OH
+
0,000
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
O
H
(R)-Benzoin/ mM
Experiment
Simulation
Abbildung 4.5.: Versuchsreihe mit konstanter Acetaldehyd- und variierter Benzoinkonzentration
(60 mM Acetaldehyd, 35 mM TEA-Puffer, pH = 8,
0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30%DMSO,T=20 ◦ C).
Tabelle 4.3 auf der nächsten Seite zeigt das Ergebnis der nichtlinearen Anpassung
von Gleichung 4.3 im Sinne einer Doppelsubstratkinetik. Für die Anpassung wurden
jeweils die Raten der HPP-Bildung verwendet (Abbildung 4.5 links, Variation von
(R)-Benzoin bei konstantem Acetaldehyd, und 4.6 links, Variation von Acetaldehyd
bei konstantem (R)-Benzoin).
[BZ]
R3 = vmax3 ·
KM,BZ +[BZ] ·
[AA]
(4.3)
KM,AA +[AA]
In Abbildung 4.5 zeigt die Rate der HPP- und der Benzaldehydbildung einen nahezu
identischen Verlauf, was in Einklang mit der im Punkt 3 in Kapitel 4.1 gemachten
Überlegung steht. Das Carbanion 3 (siehe Abbildung 4.1 auf Seite 36) entsteht unter
Freisetzung eines Moleküls Benzaldehyd und reagiert mit Acetaldehyd als Akzeptor
42

HPP-Bildung / U mL −1
0,016
0,012
0,008
0,004
Experiment
Anpassung
0,000
0 20 40 60 80 100
Acetaldehyd / mM
4.2. Bestimmung der kinetischen Parameter
BA-Bildung / U mL −1
0,016
0,012
0,008
0,004
gemessen
0,000
0 20 40 60 80 100
Acetaldehyd / mM
Abbildung 4.6.: Versuchsreihe mit konstanter Benzoin- und variierter Acetaldehydkonzentration
(1,5 mM (R)-Benzoin, 35 mM TEA-Puffer, pH = 8,
0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30%DMSO,T=20 ◦ C).
Parameter Wert Fehler Einheit
vmax3 = 0,019 ± 0,003 U mL −1
= 20,89 ± 3,00 U mg −1
KM,BZ = 0,16 ± 0,07 mM
KM,AA = 17,32 ± 7,89 mM
Tabelle 4.3.: Kinetische Parameter der BAL-katalysierten HPP-Bildung
ausgehend von (R)-Benzoin und Acetaldehyd.
43

4. Kinetik
zu HPP. Zusätzlich dazu besteht eine weitere Möglichkeit darin, dass das gebildete
Carbanion unter Abspaltung des zweiten Moleküls Benzaldehyd im Sinne der Benzoinspaltung
weiterreagiert. Dies würde für Abbildung 4.5 bedeuten, dass deutlich
mehr Benzaldehyd als HPP gebildet wird (der durch die Benzoinspaltung gebildete
Benzaldehyd käme so zu sagen noch hinzu). Dass dies, wie Abildung 4.5 zeigt, nicht
der Fall ist lässt den Schluss zu, dass das aus dem Benzoin gebildete Carbanion, sobald
ein Akzeptor zu Verfügung steht, immer mit diesem Akzeptor unter C-C Bindungsbildung
weiterreagiert und nicht unter Abspaltung von Benzaldehyd die Benzoinspaltung
vollzieht. Diese Beobachtung ist bei der Entwicklung des Modells zu berücksichtigen.
In Abbildung 4.6 verlaufen die Raten für die HPP- und Benzaldehydbildung nicht
identisch. Mit abnehmender Akzeptorkonzentration (Abb. 4.6 links) kann das Carbanion
3 nicht mehr unter C-C Bindungsbildung zum HPP weiterreagieren. Daher geht,
wenn die Acetaldehydkonzentration gegen null geht, auch die HPP-Bildung gegen
null. Es bleibt aber noch die Möglichkeit durch Abspaltung eines weiteren Moleküls
Benzaldehyd den Katalysezyklus wieder zu schließen (Benzoinspaltung). Die Rate der
Benzaldehydbildung geht daher nicht auf null zurück (Abb. 4.6 rechts). Geht die Acetaldehydkonzentration
gegen null so läuft die Rate der Benzaldehydbildung gegen ca.
0,012 U mL −1 , was der Aktivität der Benzaldehydbildung in Kapitel 4.2.3 bei 1,5 mM
Benzoin entspricht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Spaltung von Benzoin in zwei Moleküle Benzaldehyd
vernachlässigt werden kann, sobald Acetaldehyd als Akzeptoraldehyd zur Verfügung
steht und mit dem das aus dem Benzoin entstandene Carbanion 3 unter C-C
Bindungsbildung weiterreagieren kann. Unter den gegebenen Reaktionsbedingungen
(Acetaldehyd immer im Überschuss) kann also für die geplante Simulation die Benzoinkondensation
als irreversibel angesehen werden. Der in Kapitel 4.2.3 bestimmte
KM-Wert für (R)-Benzoin kann im Rahmen der Fehlergrenzen bestätigt werden.
44

4.2.5. HPP-Bildung
O
H
+
O
H
4.2. Bestimmung der kinetischen Parameter
Die Rate der HPP-Bildung wird jeweils bei Variation des einen Substrats und Konstanthaltung
des anderen Substrats gemessen. Das Ergebnis ist in Abbildung 4.7 dargestellt.
HPP-Bildung / U mL −1
0,012
0,008
0,004
Experiment
Anpassung
0,000
0 10 20 30 40 50
Benzaldehyd / mM
HPP-Bildung / U mL −1
0,012
0,008
0,004
O
OH
Experiment
Anpassung
0,000
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Acetaldehyd / mM
Abbildung 4.7.: Rate der HPP-Bildung in Abhängigkeit der Benzaldehyd- und Acetaldehydkonzentration.
(35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM
ThDP,0,35mMMgSO4, 30%DMSO,T=20 ◦ C; links: 60 mM
Acetaldehyd, rechts: 20 mM Benzaldehyd).
Die nichtlineare Anpassung von Gleichung 4.4 im Sinne einer Doppelsubstratkinetik
liefert die in Tabelle 4.4 angegebenen Parameter.
R4 = vmax4 ·
KM,BADO
[BA]
·
+[BA]
Parameter Wert Fehler Einheit
vmax4 = 0,013 ± 0,001 U mL −1
= 14,44 ± 0,40 U mg −1
KM,BADO = 2,23 ± 0,29 mM
KM,AA = 6,01 ± 1,02 mM
[AA]
KM,AA +[AA]
Tabelle 4.4.: Kinetische Parameter der HPP-Bildung ausgehend von
Benzaldehyd.
(4.4)
45

4. Kinetik
Bei Vergleich der für die Benzoinbildung bestimmten Daten (Kapitel 4.2.2) fällt auf,
dass die KM-Werte, die für Benzaldehyd bestimmt wurden, sich auch unter Berücksichtigung
der Fehlergrenzen deutlich unterscheiden. Dies scheint jedoch nur auf den
ersten Blick widersprüchlich, denn bei der Benzoinbildung (Reaktion 01) reagiert der
Benzaldehyd sowohl als Donor- als auch als Akzeptoraldehyd. Bei der HPP-Bildung
(Reaktion 04) dagegen fungiert der Benzaldehyd nur als Donor. Wenn man davon
ausgeht, dass Donor und Akzeptor an verschiedene Stellen im aktiven Zentrum des
Enzyms binden (mit verschiedener Affinität zur jeweiligen Bindungsstelle), so erscheinen
die daraus resultierenden unterschiedlichen KM-Werte für Donor und Akzeptor
durchaus plausibel, obwohl es sich um ein und dasselbe Molekül handelt. Im Vergleich
zu Kapitel 4.2.4 ist der in dieser Versuchsreihe bestimmte KM-Wert für Acetaldehyd
etwas kleiner. Jedoch ist unter Berücksichtigung der Fehlergrenzen der Unterschied
nicht signifikant.
Bei den kinetischen Untersuchungen zur HPP-Bildung (Reaktion 04) konnten Hinweise
auf eine Produktinhibierung durch HPP gefunden werden. Eine Quantifizierung
der Inhibierung scheiterte jedoch an experimetellen Schwierigkeiten. Da bei den Experimenten
zur Inhibierung schon von Beginn an hohe HPP-Konzentrationen eingestellt
werden, ist eine starke Verdünnung der Proben für die HPLC-Analytik nötig, was die
Messgenauigkeit stark herabsetzt.
Bei diesem Reaktionssystem ist nicht nur die Reaktion von Benzaldehyd mit Acetaldehyd
möglich, sondern auch die Selbstkondensation von Benzaldehyd. Demzufolge
ist neben der HPP-Bildung auch eine Benzoinbildung zu beobachten, wie in Abblidung
4.8 gezeigt ist.
BZ-Bildung / U mL −1
0,04
0,03
0,02
0,01
Experiment
Simulation
0,00
0 10 20 30 40 50
Benzaldehyd / mM
BZ-Bildung / U mL −1
0,12
0,08
0,04
Experiment
Simulation
0,00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Acetaldehyd / mM
Abbildung 4.8.: Rate der Benzoinbildung in Abhängigkeit der Benzaldehyd- und
Acetaldehydkonzentration (35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM
ThDP,0,35mMMgSO4, 30 % DMSO, T = 20 ◦ C; links: 60 mM
Acetaldehyd, rechts: 20 mM Benzaldehyd).
Im Falle der Selbstkondensation des Benzaldehyds reagiert der Benzaldehyd sowohl
als Donor als auch als Akzeptor. In Abbildung 4.8 links ist die auch schon bei
der Benzoinkondensation (Reaktion 01) beschriebene lineare Zunahme der Benzoin-
46

4.3. Zusammenfassung
bildungsrate zu erkennen. Abbildung 4.8 rechts zeigt nochmal deutlich den Einfluss
von Acetaldehyd auf die Benzoinbildung. Beide Graphen dieser Versuchsreihe können
mit Hilfe der für die Benzoinkondensation (Kapitel 4.2.2 ermittelten kinetischen
Parameter mathematisch beschrieben werden.
Bei einem Überschuss von Acetaldehyd kann ausgehend von HPP keine Bildung von
Benzaldehyd oder Benzoin (im Sinne der Rückreaktion der HPP-Bildung bzw. Racematspaltung)
beobachtet werden (20 mM HPP, 40 mM Acetaldehyd). Für die spätere
Simulation der HPP-Bildung kann also unter den gegebenen Reaktionsbedingungen
sowohl die HPP-Bildung (Reaktion 04), als auch die Racematspaltung (Reaktion 03)
als irreversibel angesehen werden.
4.3. Zusammenfassung
• Der kinetischen Beschreibung des Reaktionssystems der Benzaldehydlyase mit
den Substraten Benzaldehyd, Benzoin und Acetaldehyd wird der von Demir
et. al. postulierte Reaktionsmechanismus zugrunde gelegt. Es lassen sich für die
kinetische Untersuchung vier Einzelreaktionen ableiten.
1. Bildung von (R)-Benzoin aus Benzaldehyd (Benzoinkondensation).
2. Bildung von Benzaldehyd durch Spaltung von (R)-Benzoin (Benzoinspaltung).
3. Bildung von (R)-HPP durch Reaktion von (R)-Benzoin und Acetaldehyd
(Racematspaltung).
4. Bildung von (R)-HPP durch Reaktion von Benzaldehyd und Acetaldehyd
(HPP-Bildung).
• Die KM-Werte der beteiligten Substrate und die Maximalgeschwindigkeiten der
Einzelreaktionen wurden bestimmt.
• Für Benzaldehyd können zwei KM-Werte identifiziert werden, je nachdem ob der
Aldehyd als Donor oder Akzeptor fungiert.
• Steht ein Akzeptoraldehyd zu Verfügung so wird der Katalysezyklus bevorzugt
durch C-C Knüpfung geschlossen.
Im folgenden Kapitel wird die HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd
näher untersucht. Mit Hilfe der in diesem Kapitel bestimmten kinetischen
Parametern soll der zeitabhängige Konzentrationsverlauf der Reaktanden im Satzreaktorversuch
simuliert und mit den im Experiment erhaltenen Daten verglichen
werden.
47

4. Kinetik
48

5. Biotransformationen im
homogenen System
In diesem Kapitel werden die Untersuchungen zur Bildung von (R)-2-Hydroxy-1phenylpropanon
(HPP) ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd vorgestellt. Ziel
ist die Auswahl eines geeigneten Reaktorkonzepts, das sowohl hohe Umsätze als auch
eine gute Katalysatorausnutzung ermöglicht.
5.1. Diskontinuierliche Reaktionsführung
5.1.1. Satzreaktor (Batch)
Zur Charakterisierung des Reaktionssystems werden die Versuche zunächst im Satzreaktor
(Batch) als einfachsten Reaktortyp durchgeführt. Abbildung 5.1 zeigt den zeitabhängigen
Konzentrationsverlauf der beteiligten Reaktionspartner der HPP-Bildung.
Konzentration / mM
10
8
6
4
2
Benzaldehyd
Benzoin
2-HPP
0
0 1 2 3
Zeit / h
4 5
Abbildung 5.1.: Konzentrations - Zeit - Verlauf eines Satzreaktorversuchs zur HPP-
Bildung (10 mM Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd, 35 mM TEA,
pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30 vol% DMSO,
2UmL −1 BAL, T = 20 ◦ C, V = 3 mL). Die Datenpunkte sind
durch visuelle Hilfslinien miteinander verbunden.
49

5. Biotransformationen im homogenen System
Zu Beginn der Reaktion liegt eine hohe Benzaldehydkonzentration vor. Entsprechend
den im Kapitel 4 erhaltenen Ergebnissen wird zunächst (R)-Benzoin und (R)-
HPP gebildet. Das gebildete Benzoin stellt wiederum ein Substrat für das Enzym dar
und kann mit Acetaldehyd ebenfalls zu HPP reagieren. Wie in Kapitel 4.2.4 gezeigt
entsteht bei dieser Reaktion pro gebildetem Molekül HPP auch ein Molekül Benzaldehyd.
Die Abnahme der Benzaldehydkonzentration verlangsamt sich dadurch, was
auch in Abbildung 5.1 ab ca. 0, 25 h zu erkennen ist. Zum Ende der Reaktion sind
sowohl Benzaldehyd als auch Benzoin nahezu quantitativ in HPP überführt. Der ee
liegt im Batchversuch bei über 99 %.
Werden Batchreaktionen mit einer hohen Startkonzentration von Benzaldehyd durchgeführt
(> 20 mM), so kann die Konzentration des intermediär gebildeten Benzoins
die Grenzlöslichkeit (1,5 mM) im Reaktionssystem überschreiten. Es kommt im Laufe
der Batchreaktion zu einer Präzipitation von Benzoin. Da jedoch das in Lösung verbliebene
Benzoin weiter mit Acetaldehyd zu HPP reagiert, geht der Niederschlag nach
und nach wieder in Lösung.
Das vollständige Abreagieren von Benzaldehyd und Benzoin erleichtert die Produktaufarbeitung
erheblich. Um einen vollständigen Umsatz mit quantitativer Ausbeute
an HPP zu erreichen, kann Acetaldehyd im Überschuss eingesetzt werden. Die erhöhte
Konzentration des Akzeptoraldehyds wirkt als thermodynamische Triebkraft
auf das Reaktionssystem. Der Überschuss an Acetaldehyd kann nach der Reaktion
durch Anlegen eines Vakuums leicht vom Produkt entfernt werden. Um den Einfluss
der Acetaldehydkonzentration auf die Thermodynamik des Reaktionssystem zu untersuchen,
werden Batchversuche mit unterschiedlichen Acetaldehydkonzentrationen
durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abbildung 5.2 dargestellt.
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
30 mM
60 mM
120 mM
0,0
0 1 2 3
Zeit / h
4 5 6
1,0
0,9
0 1 2 3 4 5 6 0,8
30 mM
60 mM
120 mM
Zeit / h
Abbildung 5.2.: Einfluss der Acetaldehydkonzentration auf das thermodynamische
Gleichgewicht der HPP-Bildung (20 mM Benzaldehyd, 35 mM
TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30vol%DMSO,
3UmL −1 BAL, T = 20 ◦ C, V = 3 mL). Die Datenpunkte sind
durch visuelle Hilfslinien miteinander verbunden.
50
Schon bei einer leicht erhöhten Acetaldehydkonzentration (30 mM bei 20 mM Benz-
Umsatz / -

5.1. Diskontinuierliche Reaktionsführung
aldehyd) liegt das thermodynamische Gleichgewicht des Reaktionssystems weit auf
der Produktseite. Es wird ein maximaler Umsatz von 97 % erreicht. Ab einer Acetaldehydkonzentration
von 60 mM liegt der maximale Umsatz dann bei über 99 %.
Bei allen Versuchen wird am Ende der Reaktion kein Benzoin mehr detektiert. Auch
wenn ab einer Acetaldehydkonzentration von 60 mM die Thermodynamik des Reaktionssystems
nicht mehr signifikant beeinflusst wird, besteht wie in Kapitel 4.2.2
gezeigt dennoch eine kinetische Einflussnahme auf die Benzoinbildung. Dies spiegelt
sich auch im Verlauf der Benzoinkonzentration im Batchreaktor bei unterschiedlichen
Acetaldehydkonzentrationen wieder, wie Abbildung 5.3 zeigt.
Benzoin / mM
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Grenzlöslichkeit
30 mM AA
60 mM AA
120 mM AA
200 mM AA
0,0
0 1 2 3
Zeit / h
4 5
Abbildung 5.3.: Verlauf der Benzoinkonzentration im Batchreaktor in Abhängigkeit
der Acetaldehydkonzentration (20 mM Benzaldehyd, 35 mM
TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30vol%DMSO,
3UmL −1 BAL, T = 20 ◦ C, V = 3 mL). Die Datenpunkte sind
durch visuelle Hilfslinien verbunden.
Die Daten in Abbildung 5.3 zeigen noch einmal deutlich die Inhibierung der Benzoinbildung
durch Acetaldehyd. Bei einer Konzentration von 30 mM Acetaldehyd wird
unter den gegebenen Reaktionsbedingungen die Löslichkeitsgrenze für Benzoin sogar
überschritten und es kommt zu einer intermediären Präzipitation von Benzoin im Reaktionssystem.
Dabei fällt das Benzoin feinverteilt aus der Reaktionslösung aus und
wird durch das intensive Rühren gleichmäßig im gesamten Reaktionsvolumen verteilt.
Optisch ist dies durch eine Trübung der Lösung zu erkennen. Mit bloßem Auge sind
keine definierten Partikel erkennbar. Das Benzoin ist also weiterhin der Probenahme
zugänglich. Daher ist eine Bestimmung der Benzoinkonzentration auch jenseits
der Löslichkeitsgrenze möglich. Die angegebene Konzentration spiegelt die Summe
aus gelöstem und ausgefallenem Benzoin wider. In Abbildung 5.3 ist diese Situation
durch nicht ausgefüllte Symbole verdeutlicht. Ab einer Konzentration von 60 mM
Acetaldehyd ist eine homogene Reaktionsführung möglich. Steigende Acetaldehydkonzentrationen
bewirken zwar eine weitere Unterdrückung der Benzoinbildung, sind aber
aus ökonomischen Gesichtspunkten nicht sinnvoll.
51

5. Biotransformationen im homogenen System
5.1.2. Simulation des Satzreaktors
In diesem Kapitel sollen die Konzentrations-Zeit-Verläufe eines Batchreaktors auf Basis
der in Kapitel 4 bestimmten kinetischen Parametern simuliert werden. Um die
Simulation durchführen zu können ist es notwendig Stoffbilanzen für alle beteiligten
Reaktanden zu formulieren. Die Stoffbilanzen sämtlicher Edukte, Intermediate und
Produkte bilden dabei ein gekoppeltes System von Differentialgleichungen erster Ordnung.
Die Konzentrationsänderung eines Stoffes pro Zeiteinheit und Volumenelement
(= Akkumulation) setzt sich dabei aus Konvektion, Reaktion und Diffusion zusammen.
Akkumulation = Konvektion + Reaktion + Diffusion
In Abhängigkeit des verwendeten Reaktors lässt sich diese allgemeine Stoffbilanz
unter Annahme der idealen Durchmischung vereinfachen.
52
Satzreaktor
Diffusion = 0 Zu jedem Zeitpunkt tx ist die Konzentration in jedem
Volumenelement gleich.
Konvektion = 0 Dem einzelnen Volumenelement werden pro Zeiteinheit
keine Edukte oder Produkte zu- oder abgeführt.
Dementsprechend vereinfacht sich die Stoffbilanz zu:
− d[S]
dt = � νS (5.1)
Akkumulation = Reaktion
Kontinuierlich betriebener Rührkessel (CSTR)
Diffusion = 0 Zu jedem Zeitpunkt tx ist die Konzentration in jedem
Volumenelement gleich.
Akkumulation = 0 Der CSTR befindet sich im steady-state.
Dementsprechend vereinfacht sich die Stoffbilanz zu
0=− d[S]
dt = [S]0 − [S]
+
τ
� νS
Akkumulation = Konvektion + Reaktion
(5.2)

mit τ = Verweilzeit.
5.1. Diskontinuierliche Reaktionsführung
Für die im Experiment einzustellenden Reaktionsbedingungen ergeben sich einige
Bedingungen, damit eine Simulation des Experiments erfolgen kann. Das Erreichen
vollständiger Umsätze mit quantitativer Produktausbeute ist nicht nur für eine erleichterte
Produktaufarbeitung von großem Interesse. Es ist auch grundlegende Vorraussetzung
für den in Kapitel 4 gemachten kinetischen Ansatz, da dieser die Einstellung
eines Gleichgewichts nicht vorsieht. Reaktionsbedingungen, bei denen es im Experiment
zur Bildung eines Feststoffs kommt, sind für die Simulation ebenfalls ungeeignet,
da die ausgefallenen Stoffe dem Reaktionssystem entzogen werden, was im vorliegenden
Modell nicht berücksichtigt wird. Abbildung 5.4 zeigt das Reaktionsschema auf
dessen Grundlage die Simulation erfolgt.
O
H
O
O
H
Benzoinkondensation
H
O
OH
O
H
BAL
ThDP / Mg 2+
HPP-Bildung
Racematspaltung
Abbildung 5.4.: Modell für die Simulation der HPP-Bildung.
Ausgehend von Benzaldehyd ist sowohl die Benzoinkondensation als auch die direkte
Reaktion mit Acetaldehyd zu HPP möglich. Bei den kinetischen Untersuchungen
wurde für HPP-Bildung eine Produktinhibierung durch HPP beobachtet, die nicht
quantifiziert werden konnte. Um dieser Beobachtung Rechnung zu tragen, wird in die
Geschwindigkeitsgleichung dieser Reaktion ein Inhibierungsterm eingeführt, der der
Inhibierung der Benzionkondensation durch HPP entspricht. Das durch Kondensation
zweier Benzaldehyde gebildete Benzoin kann wiederum als Substrat fungieren und
mit Acetaldehyd unter Abspaltung eines Moleküls Benzaldehyd zu HPP reagieren.
Die Rückreaktion von Benzoin zu Benzaldehyd wurde bei Anwesenheit eines Akzeptors
nicht beobachtet und wird deshalb in diesem Modell nicht berücksichtigt (vgl.
Kapitel 4.2.4). Die für den Batchversuch eingesetzte Enzymaktivität wurde unter den
gleichen Bedingungen quantifiziert, wie die für die kinetischen Messungen verwendete
Enzymmenge (vgl. Kapitel 3.1.2).
O
H
O
OH
53

5. Biotransformationen im homogenen System
Für die mathematische Beschreibung der zeitabhängigen Konzentrationsverläufe
ergeben sich folgende Differentialgleichungen.
d[BA]
dt
= [EBAL] · (−2 · νBZ−Bdg. + νRac−Spal. − νHPP−Bdg.) (5.3)
d[AA]
dt
= [EBAL] · (−νRac−Spal. − νHPP−Bdg.) (5.4)
d[BZ]
dt
= [EBAL] · (νBZ−Bdg. − νRac−Spal.) (5.5)
d[HPP]
dt
= [EBAL] · (νRac−Spal. + νHPP−Bdg.) (5.6)
mit [EBAL] = Enzymkonzentration
Die Simulation wurde mit dem Programm Scientist c○ (Version 2.0, Micromath c○ ,
USA) durchgeführt. Das verwendete Modell ist im Anhang dieser Arbeit als ein für
Scientist lesbarer Text abgedruckt. Abbildung 5.5 zeigt den Vergleich zwischen gemessenen
(Punkte) und berechneten Konzentrationen (Linien).
Konzentration / mM
20
15
10
5
Benzaldehyd
Benzoin
HPP
Simulation
0
0 50 100 150 200 250
Zeit / min
Konzentration / mM
20
15
10
5
Benzaldehyd
Benzoin
HPP
Simulation
0
0 50 100 150 200 250
Zeit / min
Abbildung 5.5.: Vergleich der gemessenen und simulierten Konzentrationen im
Batchreaktor (20 mM Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd, 35 mM
TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30vol%DMSO,
3UmL −1 BAL, T = 20 ◦ C, V = 3 mL)
Im linken Graph von Abbildung 5.5 wurden zur Berechnung der Konzentrationen
die in Kapitel 4 gemessenen Parameter verwendet. Die Abnahme von Benzaldehyd
sowie die Bildung von HPP können durch das Modell gut beschrieben werden. Die
Benzoinkonzentration wird etwas niedriger berechnet als sie im Experiment gemessen
wurde. Im rechten Graph von Abbildung 5.5 wurden die Parameter innerhalb ihrer
Fehlergrenzen hinsichtlich einer besseren Übereinstimmung mit dem Experiment angepasst.
Auch hier war das Kriterium für die Anpassung die kleinste Quadratsumme
der Fehlerdifferenzen. Die Enzymkonzentration konnte dabei ebenfalls um ± 10 %
54

5.1. Diskontinuierliche Reaktionsführung
verändert werden. Dadurch sollten mögliche Inhomogenitäten im Lyophilisat berücksichtigt
werden. Für den Verlauf der Benzaldehyd- und HPP-Konzentration ergeben
sich keine signifikanten Änderungen. Die Benzoinbildung wird nun durch das Modell
stärker berücksichtigt. Tabelle 5.1.2 zeigt die für das Modell verwendeten Parameter
mit Fehlergrenzen und die durch die Anpassung erhaltenen Werte (fit). Für weitere
Simulationen werden im Folgenden aufgrund der besseren Übereinstimmung von
Simulation und Experiment die angepassten Werte verwendet.
Parameter Min Wert Wert Max Einheit
(fit)
KM,BAAcc 95,43 111,93 96,10 128,42 mM
KM,BADO 1,92 2,21 2,50 2,50 mM
KM,BZ 0,09 0,16 0,16 0,22 mM
KM,AA 4,99 6,02 7,04 7,04 mM
KI,HPP 6,67 7,18 7,68 7,68 mM
KI,AA 5,98 6,41 5,98 6,83 mM
vmax1 0,729 0,825 0,806 0,921 U mL −1
vmax3 0,016 0,0188 0,016 0,022 U mL −1
vmax4 0,013 0,013 0,013 0,013 U mL −1
Tabelle 5.1.: Übersicht über die im Modell verwendeten Parameter.
Die erfolgreiche Simulation der Konzentrationsverläufe kann als Bestätigung der
bei den kinetischen Untersuchungen erzielten Ergebnisse bewertet werden. Das Modell
in Abbildung 5.4 kann als eine Möglichkeit zur Beschreibung der HPP-Bildung
ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd gesehen werden. Der von Demir et. al.
vorgeschlagene Mechnismus wird durch diese Resultate gestützt. Die Benzoinbildung
wird in Abbildung 5.5 im Modell etwas niedriger beschrieben als im Experiment. Dies
könnte einerseits durch nicht vermeidbare Messfehler erklärt werden, da eine gute
Übereinstimmung zwischen Experiment und Simulation durch Variation der kinetischen
Parameter innerhalb ihrer Fehlergrenzen erzielt werden kann. Andererseits ist
aber auch durch eine mögliche Inhibierung der Racematspaltung (Reaktion 03) durch
HPP denkbar, die bei den experimentellen Untersuchungen evtl. nicht erkannt wurde.
Da das HPP die Benzoinkondensation (Reaktion 01) und die Bildung von HPP
(Reaktion 04) inhibiert, ist auch eine Inhibierung der Racematspaltung naheliegend.
5.1.3. Repetitive Batch
Der Batchreaktor ist ein Grundreaktortyp und kann für viele chemische Reaktionen
mit geringem technischen Aufwand verwendet werden. In der Regel wird der Katalysator
bei der Produktaufarbeitung verworfen. Die Ausnutzung des Katalysators ist also
im Falle des Batchreaktors beschränkt durch die Substratlöslichkeit. Ein Maß für die
55

5. Biotransformationen im homogenen System
Katalysatorausnutzung im Prozess ist die maximale Zyklenzahl (ttn) 1 . Sie berechnet
sich nach
gebildete Produktmenge
ttn =
(5.7)
eingesetzte Katalysatormenge
Zur Berechnung der ttn ist die Kenntnis des Molekulargewichts des Katalysators
notwendig. Eine vergleichende Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts ist die
denaturierende SDS-PAGE. Die BALHis wandert in SDS Gel als eine einzige Polypeptidkette.
Die Literaturangeban des Molekulargewichts einer Monomereneinheit liegen
bei 50 kDa (Gonzales & Vicuna, 1989) bzw. 60 kDa (Janzen, 2002). Das Molekulargewicht
des nativen Proteins wird anhand der DNS-Sequenz mit 216 kDa angegeben
(Janzen, 2002). Die Struktur des Enzym ist bislang unbekannt. Es ist jedoch aufgrund
von Sequenzvergleichen und Strukturvorhersagen sehr wahrscheinlich, dass die
BALHis der BFD und der PDC strukturell ähnelt. Bei beiden Enzymen handelt es
sich um Tetramere mit vier aktiven Zentren. Die tetramere native Struktur der BAL
wurde durch Größenausschlusschromatographie bestätigt (Janzen, 2002). Daher wird
im Rahmen dieser Arbeit für die Berechnung der ttn davon ausgegangen, dass jede
Monomereneinheit über ein aktives Zentrum verfügt und ein Molekulargewicht von
50 kDa aufweist. Für den in Kapitel 5.1.2 gezeigten Batchversuch berechnet sich die
maximale Zyklenzahl auf 7200.
Bei den in der Biokatalyse eingesetzten Katalysatoren handelt es sich fast ausschließlich
um Enzyme oder um ganze Zellen. Die Partikelgröße dieser Katalysatoren unterscheidet
sich von der Größe der anderen am Reaktionssystem beteiligten Komponenten
um mehrere Größenordnungen. So kann unter Ausnutzung des Größenunterschieds
der Katalysator vom Reaktionsmedium abgetrennt werden. Der wiederholte, satzweise
Einsatz eines Katalysators wird als Repetitive Batch bezeichnet. Abbildung 5.6 auf
der nächsten Seite zeigt schematisch die Vorgehensweise.
Das Reaktionsgefäß wird zunächst mit Substrat und Katalysator befüllt und die
Reaktion durchgeführt. Nach beendeter Reaktion wird der Katalysator vom Produkt,
nicht umgesetzten Reaktanden und dem restlichen Reaktionsmedium abgetrennt. Bei
Biokatalysatoren werden dazu vielfach Membranverfahren eingesetzt. Der abgetrennte
Katalysator kann nun für eine neue Batchreaktion wiederverwendet werden. Diese
Vorgehensweise ermöglicht nicht nur die wiederholte Verwendung des Katalysators,
sondern vereinfacht auch die Produktaufarbeitung, da insbesondere Biokatalysatoren
viele Aufarbeitungsschritte behindern. Abbildung 5.7 auf der nächsten Seite zeigt den
Einsatz der BAL in einem Repetitive Batch.
Die Reaktionen wurden in einer Amicon Ultrafiltrationszelle durchgeführt. Die Ausschlussgrenze
der verwendeten Membran betrug 10 kDa. Es wurden 7 Reaktionszyklen
ohne signifikanten Enzymverlust durchgeführt, wobei in jedem Zyklus vollständiger
Umsatz erreicht wurde. Der ee lagt bei jedem Zyclus bei > 99 %. Die BAL zeigt
also auch unter Reaktionsbedingungen eine hohe Stabilität. Durch den wiederholten
Einsatz des Enzyms kann die Katalysatorausnutzung gesteigert werden. Bei dem in
1 engl.: total turnover number (ttn)
56

Produkt
Ultrafiltration
=Enzym
Befüllen
Abbildung 5.6.: Prinzip des Repetitive Batch.
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
5.1. Diskontinuierliche Reaktionsführung
0,0
0 2 4 6
Zeit / h
8 10 12
Substrat
Umsatz
Abbildung 5.7.: Repetitive Batch: BAL-katalysierte HPP-Synthese (10 mM Benzaldehyd,
60 mM Acetaldehyd, 35 mM TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP,
0,35 mM MgSO4, 30vol%DMSO,7UmL −1 BAL, T = 20 ◦ C, V
=3mL).
57

5. Biotransformationen im homogenen System
Abbildung 5.6 gezeigten Repetitive Batch wurde eine maximale Zyklenzahl von 44000,
bezogen auf die eingesetzte Enzymmenge, erreicht. Aufgrund der hohen Stabilität der
BAL lässst sich der Enzymverbrauch während der Versuchsdauer nicht quantifizieren.
Ein weiteres wichtiges Versuchsergebnis ist die Kompatibilität des Enzyms und
insbesondere auch des Reaktionsmediums (DMSO, Benzaldehyd, Acetaldehyd) mit
Membranverfahren, bei denen Polymermembranen zum Einsatz kommen.
5.2. Kontinuierliche Reaktionsführung
Wie im vorhergehenden Kapitel gezeigt wurde, kann die Katalysatorausnutzung durch
die Wiedergewinnung und den erneuten Einsatz des Katalysators in einem Repetitive
Batch gesteigert werden. Ein Nachteil dieser Vorgehensweise sind die Stand- und
Rüstzeiten, die zwischen den einzelnen Batchreaktionen liegen. Eine alternative Möglichkeit
zur verbesserten Katalysatorausnutzung bieten kontinuierliche Verfahren, da
hier eine Entkopplung der Verweilzeiten von Katalysator und Substrat/Produkt möglich
ist. Durch die kontinuierliche Reaktionsführung entfallen die wiederholten Standund
Rüstzeiten.
5.2.1. Reaktorkonzept
Bei der Auswahl eines geeigneten Reaktorkonzenpts für die kontinuierliche Reaktionführung
müssen die Ergebnisse aus Kapitel 4 und 5.1.1 berücksichtigt werden. Dazu
sollen zunächst zwei grundlegende Reaktorkonzepte zur kontinuierlichen Reaktionsführung
mit dem Batchreaktor verglichen werden (Abbildung 5.8, (Hagen, 1992)).
Im Batchversuch wird eine zeitabhängige Veränderung der Konzentration von Substrat
und Produkt beobachtet. Bei idealer Durchmischung ist die Konzentration der
Reaktanden an jedem Ort im Reaktor zum gegebenen Zeitpunkt gleich. Wenn keine
thermodynamischen oder kinetischen Limitierungen vorliegen, kann der Umsatz
durch die Reaktionszeit bestimmt werden. Die Besonderheit des vorliegenden Reaktionssystems
ist die Bildung eines nur begrenzt löslichen Zwischenproduktes. Je nach
eingestellten Reaktionsbedingungen kann es zu einer zwischenzeitlichen Feststoffbildung
im System kommen (vgl. Kapitel 5.1.1).
Im Strömungsrohrreaktor durchläuft das Reaktionsgemisch das mit immobilisiertem
Katalysator gefüllte Reaktionsrohr in Form einer Pfropfenströmung. Der erreichte
Umsatz ist abhängig von der Verweilzeit, die sich aus dem freien Zwischenkornvolumen
und Durchflussgeschwindigkeit ergibt und der Reaktionszeit im Satzreaktor entspricht.
Eine ideale, laminare Strömung vorrausgesetzt, entspricht der Konzentrations-
Zeit-Verlauf des Satzreaktors dem Konzentrations-Ort-Verlauf im Strömungsrohr. Für
das bearbeitete Reaktionssystem bedeutet das, wenn es im Satzreaktor zu einem bestimmten
Zeitpunkt zur Feststoffbildung kommt, findet dies im Strömungsrohr an
einem bestimmten Ort statt. Es besteht die Gefahr, dass der Reaktor an dieser Stelle
durch den ausfallenden Feststoff verblockt. Daher ist dieser Reaktortyp für das vorliegende
Reaktionssystem ungeeignet. Darüberhinaus besteht für diesen Reaktortyp die
58

Satzreaktor (Batch)
Konzentration
Kontinuierlich betriebener
Rührkessel (CSTR)
Strömungsrohr
(Plug-Flow)
Konzentration
Konzentration
[S] 0
[S] 0
[S] 1
[S] e
5.2. Kontinuierliche Reaktionsführung
[P]
[S]
Konzentration
[S] 0
[S] 1
[S] e
Zeit Ort
[P]
[S]
Konzentration
[S] 0
Zeit Ort
Zeit
Abbildung 5.8.: Vergleich kontinuierlicher Verfahren mit dem Satzreaktor.
x 0
x 1
x e
Konzentration
Ort
t 0
t 1
t e
[P]
[S]
[P]
[S]
59

5. Biotransformationen im homogenen System
Notwendigkeit zur Immobilisierung des Biokatalysators.
Im kontinuierlich betriebenen Rührkessel (CSTR) 2 werden die Reaktanden kontinuierlich
einem Kessel mit intensiver Durchmischung zugeführt. Der Katalysator wird
im Reaktionsraum zurückgehalten. Ein kontinuierlicher Produktstrom mit der gleichen
Zusammensetzung wie der des gesamten Reaktorinhalts verlässt den Reaktor.
Es besteht weder eine Zeit- noch eine Ortsabhängigkeit für die Konzentration der
Reaktanden. Durch Variation von Verweilzeit und Katalysatorkonzentration können
unterschiedliche Betriebspunkte erreicht werden. Es sollte also für das vorliegende
Reaktionssystem möglich sein, einen Betriebspunkt mit hoher HPP- und niedriger
Benzaldehyd- und Benzoinkonzentration einzustellen und somit ein Ausfallen von Benzoin
zu vermeiden.
Ein Enzym-Membran-Reaktor (EMR) kann als kontinuierlich betriebener Rührkessel
betrieben werden. Eine Notwendigkeit zur Immobilisierung der BAL besteht nicht,
da wie auch schon in Kapitel 5.1.3 gezeigt, die Katalysatorrückhaltung an einer Polymermembran
gelingt.
5.2.2. Regelung des EMR
Eine exakte Dosierung ist von zentraler Bedeutung in der technischen Chemie und der
chemischen Reaktionstechnik. Über die Dosierung werden wichtige Prozessparameter
wie die Konzentration, das Verhältnis der Reaktanden oder die Verweilzeit eingestellt.
Für die Einstellung von Flüssen in Membranreaktoren haben sich in früheren Arbeiten
Wechselkolbenpumpen bewährt (Giffels, 1998; Laue, 2002; Laue et al., 2001). Durch
Ansteuerung der Pumpe mittels thermischer Massenflussmessung kann ein steter Gesamtfluss
auch beim Betrieb unter Gegendruck erreicht werden. Abbildung 5.9 zeigt
schematisch den Versuchsaufbau des EMR mit thermischer Massenflussmessung und
computergestützter Regelung des Gesamtflusses in einem geschlossenen Regelkreis.
6
MFM
1 2
P
3
4
Abbildung 5.9.: Schema des EMR (1 Dosierpumpe, 2 Massenflussmesser, 3 Druckaufnehmer,
4 Blasenfalle, 5 Reaktorraum mit Membran, 6 Prozessrechner)
2 engl. continuously operated stirred tank reaktor (CSTR)
60
5

5.2.3. Simulation des EMR
5.2. Kontinuierliche Reaktionsführung
In Kapitel 5.1.2 konnten die zeitabhängigen Konzentrationsverläufe unter Zugrundelegen
des entwickelten Modells und mit Hilfe der in Kapitel 4 bestimmten kinetischen
Parametern simuliert werden. Auch der Verlauf einer kontinuierlichen HPP-Synthese
ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd soll mit Hilfe des Modells simuliert
werden. Die Differentialgleichungen, die die Konzentrationsverläufe der Reaktanden
beschreiben, müssen für die Simulation an die Gegebenheiten im CSTR angepasst
werden. Zusätzlich wird im CSTR der zeitabhängige Rückgang der Katalysatorkonzentration
aufgrund der Enzymdesaktivierung berücksichtigt.
d[BA]
dt
d[AA]
dt
d[BZ]
dt
d[HPP]
dt
d[EBAL]
dt
� �
[BA]0 − [BA]
= [EBAL] ·
− 2 · νBZ−Bdg. + νBZ−Spal. − νHPP−Bdg. (5.8)
τ
� �
[AA]0 − [AA]
= [EBAL] ·
− νRac−Spal. − νHPP−Bdg.
(5.9)
τ
� �
[BZ]0 − [BZ]
= [EBAL] ·
+ νBZ−Bdg. − νRac−Spal.
(5.10)
τ
� �
[HPP]0 − [HPP]
= [EBAL] ·
+ νRac−Spal. + νHPP−Bdg. (5.11)
τ
= −kdes · [EBAL] (5.12)
mit [EBAL] = Enzymkonzentration
τ = Verweilzeit
= Desaktivierungskonstante
kdes
5.2.4. HPP-Synthese im EMR
Um das Verhalten der BAL unter den Bedingungen eines CSTR zu untersuchen, wird
eine kontinuierliche HPP-Synthese ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd im
EMR durchgeführt, wobei die Versuchsbedingungen zunächst über die gesamte Versuchsdauer
konstant gehalten werden. Abbildung 5.10 auf der nächsten Seite zeigt den
Umsatz im CSTR in Abhängigkeit der Versuchszeit.
Das Enzym zeigt unter den Bedingungen im CSTR eine hohe Stabilität. Der Reaktor
konnte über einen Zeitraum von 240 h mit einer konstanten Verweilzeit von
1h betrieben werden. Unter den gegebenen Versuchsbedingungen wird zu Beginn
ein Umsatz von 91 % erreicht, der aufgrund von Enzymdesaktivierung bis zum Ende
des Versuchs auf 70 % abnimmt. Die Simulation des Reaktors gelingt auf Basis des
in Kapitel 5.1.2 entwickelten Modells. Die Desaktivierungskonstante kdes wird durch
Anpassung von Gleichung 5.12 an die experimentellen Daten erhalten und beträgt
6, 83 · 10 −3 h −1 (16,4 % d −1 ). Die maximale Zyklenzahl bezogen auf die eingesetzte
Enzymmenge beträgt für den in Abbildung 5.10 gezeigten Reaktorlauf 150000. Nach
der Versuchsdauer von 240 h sind noch 20 % der eingesetzten Enzymaktivität vorhanden.
Die ttn bezogen auf die verbrauchte Enzymaktivität beträgt 188000. Durch die
61

5. Biotransformationen im homogenen System
kontinuierliche Reaktionsführung kann also die Katalysatorausnutzung im Vergleich
zur satzweisen Reaktionsführung deutlich gesteigert werden.
Bei dem verwendetem Reaktormaterial handelt es sich um Edelstahl, dessen Oberfläche
passiviert ist. Das Enzym zeigt unter diesen Bedingungen eine hohe Stabilität.
Edelstahl mit passivierter Oberfläche kann als Werkstoff in Kombination mit der BAL
verwendet werden, was für den Anlagenbau von großer Bedeutung ist.
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Umsatz
Simulation
0,0
τ = 1h
0 50 100 150 200 250
Zeit / h
Abbildung 5.10.: Kontinuierliche BAL-katalysierte HPP-Synthese im EMR (20 mM
Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd, 35 mM TEA, pH = 8, 0,35 mM
ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30 vol% DMSO, 30 U mL −1 BAL, T =
20 ◦ C, V = 10 mL).
Durch Variation der Durchflussgeschwindigkeit können im CSTR unterschiedliche
Verweilzeiten eingestellt werden. Abbildung 5.11 auf der nächsten Seite zeigt einen
weiteren Reaktorlauf zur kontinuierlichen HPP-Synthese. Bei einer Verweilzeit von
60 min wird ein Umsatz von 91 % erreicht (Abbildung 5.11 links). Durch Verkürzung
der Verweilzeit auf 30 min lässt sich ein neuer Betriebspunkt einstellen. Der Reaktor
erreicht den steady-state bei einem Umsatz von 80 %. Durch Zurücksetzen der
Verweilzeit auf 60 min kann der ursprüngliche Betriebspunkt wieder erreicht werden.
Die Einstellung eines weiteren Betriebspunktes mit einer Verweilzeit von 15 min bewirkt
einen erneuten Umsatzrückgang, diesmal auf 63 %. Auch von diesem Betriebspunkt
kann nach dem Erreichen des steady-state der ursprüngliche Betriebspunkt (τ
= 60 min) wieder erreicht werden.
Auch in der zeitabhängigen Auftragung der Konzentrationen in Abbildung 5.11
rechts spiegeln sich die unterschiedlichen Betriebspunkte wider. Die Benzoinkonzentration
bleibt selbst bei einer Verweilzeit von 15 min deutlich unterhalb der Löslichkeitsgrenze,
was die in Kapitel 5.2.1 gemachten Überlegungen bestätigt. Die HPP-Synthese
im EMR ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd ermöglicht also nicht nur das
Erreichen hohe Umsätze und eine gute Katalysatorausnutzung, sondern erweist sich
62

Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Umsatz
Simulation
τ = 1h
0,0
0 5 10
0,5h
15
1h 0,25h
20 25 30
1h
35
Zeit / h
Konzentration / mM
5.2. Kontinuierliche Reaktionsführung
20
16
12
8
4
HPP
Benzaldehyd
Benzoin
Simulation
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Zeit / h
Abbildung 5.11.: Kontinuierliche BAL-katalysierte HPP-Synthese im EMR mit unterschiedlichen
Betriebspunkten (20 mM Benzaldehyd, 60 mM
Acetaldehyd, 35 mM TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM
MgSO4, 30 vol% DMSO, 30 U mL −1 BAL, T = 20 ◦ C, V = 3 mL.)
auch als Methode der Wahl zur Vermeidung eines Bezoinniederschlags bei kontinuierlicher
Reaktionsführung. Der Betriebspunkt mit einer Verweilzeit von 15 min zeigt für
die Benzaldehyd- und Benzoinkonzentration eine leichte Abweichung zwischen Experiment
und Simulation. Im Vergleich zum Experiment errechnet das Modell eine
höhere Benzaldehyd- und eine niedrigere Benzoinkonzentration. Der reale Umsatz im
Reaktor liegt also höher als der errechnete Umsatz des Modells. Diese Abweichung
zeichnet sich in den vorhergehenden Betriebspunkten nicht ab. Möglicherweise ist die
Abweichung durch einen Fehler an der Pumpe, durch das Verlassen des linearen Bereiches
des Massenflussmessers oder durch einen falsch eingestellten Vorgabewert für
die Regelung des Flusses zu erklären.
Eine weitere Größe zur Charakterisierung eines Prozesses ist die Raum-Zeit-Ausbeute
(RZA). Im Gegensatz zur maximalen Zyklenzahl (ttn), die als Maß für die Katalysatorausnutzung
verstanden werden kann, stellt die Raum-Zeit-Ausbeute ein Maß
für die Ausnutzung des zur Verfügung stehenden Reaktorraumes dar und berechnet
sich nach Gleichung 5.13.
Menge Produkt
RZA =
(5.13)
Reaktorvolumen · Zeit
Abbildung 5.12 auf der nächsten Seite zeigt die Raum-Zeit-Ausbeuten an HPP
der Betriebspunkte des in Abbildung 5.11 dargestellten Reaktorlaufs. Bei einer Verweilzeit
von 60 min werden 61 g L −1 d −1 erreicht. Die Verkürzung der Verweilzeit auf
30 bzw. 15 min bewirkt eine Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute auf 112 g L −1 d −1
bzw. 173 g L −1 d −1 . Durch Verkürzung der Verweilzeit ist also eine Steigerung der
Raum-Zeit-Ausbeute möglich. Der damit einhergehende Umsatzrückgang kann durch
Steigerung der Katalysatorkonzentration kompensiert werden. Im Folgenden soll nun
eine weiterere kontinuierliche HPP-Synthese mit kurzen Verweilzeiten und hoher En-
63

5. Biotransformationen im homogenen System
zymkonzentration im Reaktor durchgeführt werden. Da zum Erreichen der kurzen
Verweilzeiten hohe Volumenströme eingestellt werden müssen, soll zuvor ein Enzym-
Membran-Reaktor mit geeigneter Geometrie ausgewählt werden.
-1 -1
RZA / g L d
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
τ = 60min 30min 15min
Abbildung 5.12.: Raum-Zeit-Ausbeuten der eingestellten Betriebspunkte (Bedingungen
siehe Abbildung 5.11.
5.2.5. Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute im EMR
Für die experimentellen Untersuchungen zur kontinuierlichen Reaktionsführung in dieser
Arbeit standen zwei Typen von Enzym-Membran-Reaktoren zur Verfügung, die
sich in Reaktorvolumen und Membranfläche unterscheiden. Eine Verkürzung der Verweilzeit
ist im CSTR durch eine Erhöhung der Durchflussgeschwindigkeit möglich.
Die Polymermembran im Reaktor stellt für das durch den Reaktor strömende Reaktionsgemisch
einen Widerstand dar. Wie bei allen Membranprozessen ist für den
transmembranen Stofftransport eine treibende Kraft nötig (Staude, 1992). Im Falle
des EMR handelt es sich dabei um den Druck im Reaktorraum, der durch die
Dosierpumpe beaufschlagt wird. Da der transmembrane Gesamtfluss bei einer gegebenen
Verweilzeit nicht nur vom Druck sondern auch von der zur Verfügung stehenden
Membranfläche abhängig ist, werden die beiden Reaktortypen in Tabelle 5.2 auf der
nächsten Seite hinsichtlich dem Verhältnis von Reaktorvolumen und Membranfläche
verglichen.
Um eine Verweilzeit von 1hzu erreichen, muss die Membran des 3mLEMR einen
Gesamtfluss von 1, 9kgh −1 m −2 ermöglichen. Dieselbe Verweilzeit im 10 mL EMR bedeutet
für die Membran in diesem Reaktor schon ein Gesamtfluss von 3, 2kgh −1 m −2 .
Der 3mLEMR ist also für Versuche mit kurzen Verweilzeiten besser geeignet, da er
ein günstigeres Verhältnis von Membranfläche zu Reaktorvolumen aufweist.
Abbildung 5.13 auf der nächsten Seite zeigt eine kontinuierliche HPP-Synthese im
EMR (3 mL) bei kurzen Verweilzeiten. Aufgetragen ist der Umsatz über die Anzahl der
Verweilzeiten. Es wurden zwei unterschiedliche Betriebspunkte eingestellt. Bei einer
64

5.2. Kontinuierliche Reaktionsführung
Reaktortyp Membran- Membran- Gesamtfluss bei
durchmesser fläche τ = 1h
3mLEMR 44, 5mm 0, 00156 m 2 1, 9kgh −1 m −2
10 mL EMR 63, 5mm 0, 00317 m 2 3, 2kgh −1 m −2
Tabelle 5.2.: Vergleich der beiden Reaktortypen.
Verweilzeit von 6minwurde ein Umsatz von 88 % erreicht. Im zweiten Betriebspunkt
wurde bei einer Verweilzeit von 3minein Umsatz und 75 % erreicht.
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
t = 6 min
0,0
0 20 40 60
3 min
80 100
6 min
120 140
Zeit als N (τ) /-
Abbildung 5.13.: Kontinuierliche BAL-katalysierte HPP-Synthese im EMR mit kurzen
Verweilzeiten (20 mM Benzaldehyd, 80 mM Acetaldehyd,
35 mM TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30vol%
DMSO, 285 U mL −1 BAL, T = 20 ◦ C, V = 3 mL)
Durch Verkürzung der Verweilzeit im EMR mit gleichzeitig gesteigerter Enzymkonzentration
ist es möglich, die auf das Reaktionsvolumen bezogene Leistung des
Reaktors deutlich zu steigern. Bei einer Verweilzeit von 6min wurde eine Raum-
Zeit-Ausbeute von 650 g L −1 d −1 (HPP) erreicht. Die Verweilzeit von 3minentspricht
einer Raum-Zeit-Ausbeute 1120 g L −1 d −1 (HPP). Abbildung 5.14 auf der nächsten
Seite fasst die Raum-Zeit-Ausbeuten der in diesem und dem vorhergehenden Kapitel
gezeigten Reaktorläufe zur kontinuierlichen HPP-Synthese nocheinmal vergleichend
zusammen.
Abbildung 5.15 auf Seite 67 zeigt die Prozessdaten des in Abbildung 5.13 gezeigten
65

5. Biotransformationen im homogenen System
-1 -1
RZA / g L d
1200
1000
800
600
400
200
0
τ = 60min 30min 15min 6min 3min
CSTR 1 CSTR 2
Abbildung 5.14.: Vergleich der bei der kontinuierlichen HPP-Synthese im EMR erreichten
Raum-Zeit-Ausbeuten.
Reaktorlaufs. Im linken Teil ist der eingestellte Fluss und im rechten Teil der daraus
resultierende Druck jeweils über die Zeit aufgetragen. Für eine Verweilzeit von 6min
(3 mL EMR) wurden etwas weniger als als die rechnerisch ermittelten 30 mL h −1 eingestellt,
da der verwendete Massenflussmesser für reines Wasser kalibriert war. Der
physikalische Fluss entsprach für das verwendete Reaktionsgemisch bei dem eingestellten
Wert genau 30 mL h −1 .
Um die Verweilzeit im Reaktor zu halbieren wurde der Fluss durch den Reaktor
verdoppelt. Dies bewirkte, wie in Abbildung 5.15 rechts gezeigt, einen Druckanstieg
um annähernd das Vierfache. Während der Fluss durch die Regelung der Pumpe
konstant gehalten wurde, stieg der Druck für den Betriebspunkt mit fortschreitender
Zeit leicht an. Dies könnte auf eine zunehmende Verblockung der Membran bei hohen
Flüssen hinweisen.
Die Daten in Abbildung 5.15 zeigen, dass durch die verwendete Regelung der Dosierpumpe
mittels thermischer Massenflussmessung die Einstellung und Konstanthaltung
unterschiedlicher Betriebspunkte für den EMR sehr gut gelingt. Durch die Einstellung
hoher Volumenströme lassen sich sehr kurze Verweilzeiten erzielen. Da das
Reaktionsgemisch die Ultrafiltrationsmembran passieren muss, resultieren bei hohen
Volumenströmen hohe Drücke im Reaktionsraum.
5.3. Kontinuierliche Synthese von
(R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon
Im nachfolgenden Kapitel soll abschießend die allgemeine Anwendbarkeit des zuvor
entwickelten Reaktorkonzepts überprüft werden. Statt des bislang verwendeten Modellsystems
wird als Substrat 3-Chlorbenzaldehyd eingesetzt. Das entsprechende HPP
Derivat, (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon, wird als Vorläufer für Brupopion
66

Fluss / mL h −1
60
50
40
30
20
10
5.3. Kontinuierliche Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon
Enzym
0
-2 0 2 4 6 8 10
Zeit / h
Druck / bar
8
6
4
2
Enzym
0
-2 0 2 4 6 8 10
Zeit / h
Abbildung 5.15.: Prozessdaten des in Abbildung 5.13 gezeigten Reaktorlaufs.
verwendet (Abbildung 1.1 auf Seite 5). Bei dieser Verbindung handelt es sich um
den aktiven Wirkstoff der Antidepressiva Wellburtin � und Zyban � der Firma Glaxo
Wellcome (Fang et al., 2000). Die Reaktion ist in Abbildung 5.3 dargestellt. Für die
Interpretation der Ergebnisse wird für dieses Reaktionssystems ein dem Modellsystem
analoger Reaktionsweg zugrunde gelegt. Ausgehend von 3-Chlorbenzaldehyd (7)
und Acetaldehyd (10) wird das Produkt (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon
(9) erhalten. Auch bei diesem Reaktionssystem wird intermediär die Bildung von
(R)-1,2-Bis(3-chlorphenyl-2-hydroxyethanon (8) beobachtet (Demir et al., 2002).
Cl
O
H
Cl
O
OH
7 8 9
Abbildung 5.16.: Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon ausgehend
von 3-Chlorbenzaldehyd.
Für die kontinuierliche Synthese von 1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon werden
die für das Modellsystem entwickelten Reaktionsbedingungen eingestellt. Der apparative
Aufbau wurde schon in Kapitel 5.2 behandelt und für diesen Versuch nicht modifiziert.
Die Konzentrationen wurden durch Probenahme am Auslauf des Reaktors mit
anschließender HPLC-Analytik bestimmt. Abbildung 5.17 auf der nächsten Seite zeigt
Cl
O
10
H
Cl
O
OH
67

5. Biotransformationen im homogenen System
den erreichten Umsatz (links) und die Konzentration von 3-Chlorbenzaldehyd und 1-
(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon (rechts) jeweils aufgetragen über die Anzahl der
Verweilzeiten.
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
τ = 6 min
20 40
3 min
60 80
6 min
100 120 140
Zeit als N (τ) /-
Konzentration / mM
20
15
10
5
3-Chlor-HPP
3-Chlorbenzaldehyd
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit als N (τ) /-
Abbildung 5.17.: BAL-katalysierte kontinuierliche Synthese von (R)-3-Chlor-2hydroxy-1-phenylpropanon
im EMR (20 mM 3-Chlorbenzaldehyd,
80mM Acetaldehyd, 35 mM TEA, pH = 8, 0,35 mM ThDP,
0,35 mM MgSO4, 30 vol% DMSO, T = 20 ◦ C,V=3mL)
Der Reaktor wurde über eine Dauer von 140 Verweilzeiten betrieben. Es wurden
zwei unterschiedliche Betriebspunkte eingestellt. Bei einer Verweilzeit von 6 min wurde
ein Umsatz von 90 % erreicht. Nachdem der Reaktor den steady state erreicht hatte,
wurde ein weiterer Betriebspunkt mit einer Verweilzeit von 3 min eingestellt. Der Umsatz
ging dadurch auf 70 % zurück. Auch in diesem Betriebspunkt konnte der Reaktor
über eine Dauer von 40 Verweilzeiten konstant betrieben werden. Durch Zurücksetzen
der Verweilzeit auf 6 min wird der ursprüngliche Betriebspunkt mit einem Umsatz
von 90 % wieder erreicht. Die zu den Betriebspunkten korrespondierenden Raum-
Zeit-Ausbeuten für R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon betragen 711 g L −1 d −1
(τ =6min)und1214gL −1 d −1 (τ =3min).
Da für das 1,2-Bis(3-chlorphenyl)-2-hydroxyethanon keine Kalibrierung erstellt wurde,
erfolgt eine Abschätzung der Konzentration anhand der Peakflächen im HPLC-
Chromatogramm erfolgen. Die Peakflächen im Chromatogramm korellieren linear mit
der Konzentration der Komponente. Auch bei diesem Reaktionssystem lag das Benzoinderivat
im EMR als Minderkomponente vor. Diese Beobachtungen stehen im Einklang
mit den Ergebnissen, die für das zuvor bearbeitete Modellsystem erhalten wurden.
Eine allgemeine Anwendbarkeit des in diesem Kapitel entwickelten Reaktorkonzepts
sollte daher gegeben sein.
5.4. Zusammenfassung
68
• Die BAL zeigt unter den gewählten Reaktionsbedingungen eine hohe Stabilität.

5.4. Zusammenfassung
• Im Satzreaktor gelingt die HPP-Synthese ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd
enantioselektiv (ee > 99 %), mit hohen Umsätzen (99 %) und quantitativer
HPP-Ausbeute.
• Intermediär kommt es im Satzreaktor zur Bildung von Benzoin, dessen Grenzlöslichkeit
im Reaktionssystem je nach eingestellten Reaktionsbedingungen überschritten
werden kann, so dass im Batchversuch eine intermediäre Präzipitation
von Benzoin möglich ist.
• Die Simulation der Konzentrationsverläufe im Satzreaktor gelingt unter Zugrundelegung
eines Modells, das die HPP-Bildung sowohl durch direkte Reaktion von
Benzaldehyd und Acetaldehyd als auch durch Reaktion von Benzoin und Acetaldehyd
zulässt.
• Die Katalysatorausnutzung kann durch den wiederholten, satzweisen Einsatz des
Katalysator erhöht werden. Im Repetitive Batch wird eine maximale Zyklenzahl
(ttn) von 44000 erreicht.
• Der Enzym-Membran-Reaktor (EMR) ist ein geeignetes Reaktorkonzept für die
kontinuierliche Reaktionsführung bei der BAL-katalysierten HPP-Synthese ausgehend
von Benzaldehyd und Acetaldehyd. Durch die Charakteristik des EMR
wird die intermediäre Benzoinbildung minimiert.
• Durch den EMR kann sowohl eine gute Katalysatorausnutzung (ttn = 188000)
als auch eine hohe volumenspezifische Leistung des Reaktors erzielt werden
(RZA = 1120 g L −1 d −1 ).
• Die für das Modellsystem erhaltenen Ergebisse können bei der kontinuierlichen
Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon reproduziert werden,
was auf eine allgemeine Anwendbarkeit des Reaktorkonzepts für die kontinuierliche
Synthese substituierter HPP-Derivate schließen lässt.
• Auch bei der BAL-katalysierten Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon
im EMR kann eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute erreicht werden
(1214 g L −1 d −1 ).
69

5. Biotransformationen im homogenen System
70

6. tert-Butylmethylether als
Cosolvent
6.1. Problemstellung
Bei den bisherigen Versuchen wurde DMSO als Cosolvent dem wässrigen Reaktionssystem
zugesetzt. Dadurch konnte nicht nur die Benzoinlöslichkeit im Reaktionsmedium
erhöht werden, sondern auch die Enzymstabilität um ein Vielfaches gesteigert
werden (vgl. Kapitel 3.4 auf Seite 26). Ein gravierender Nachteil bei der Verwendung
von DMSO als Cosolvent ist die erschwerte Produktaufarbeitung.
Nachdem ein vollständiger Umsatz erreicht ist, wird die wässrige Phase mit Diethylether
extrahiert. Dabei wird nicht nur das gewünschte Produkt, sondern auch das
als Cosolvent zugesetzte DMSO in die organische Phase überführt. An die Extraktion
schließen sich zwei Waschschritte an, um das extrahierte DMSO wieder zu entfernen.
Im nächsten Schritt wird die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und
das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Zurück bleibt in vielen Fällen ein gelblicher,
öliger Feststoff oder sogar nur ein gelbes Öl. Durch NMR Untersuchungen konnten im
Rohprodukt immer noch erhebliche Mengen an DMSO nachgwiesen werden, die auch
die weitere Aufreinigung durch Kristallisation behindern. Unter dem Gesichtspunkt
der Produktaufarbeitung ist daher eine Substitution des DMSO wünschenswert.
Wie im dritten Teil der vorliegenden Arbeit noch gezeigt werden wird, kann die Stabilität
der BAL in einem organisch / wässrigen Zweiphasensystem durch Verwendung
von tert-Butylmethylether (MTBE) als organische Phase im Vergleich zu Kontrollexperimenten
ohne organische Phase deutlich gesteigert werden. Obwohl MTBE zur
Klasse der mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln gezählt wird, beträgt seine
Löslichkeit in Wasser dennoch 5 vol% 1 . Im weiteren Verlauf des Kapitels soll nun die
Frage geklärt werden, ob MTBE in den Grenzen seiner Wasserlöslichkeit als Cosolvent
im homogenen Reaktionssystem zur Bildung von HPP ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd genutzt werden kann (siehe Abbildung 6.1).
6.2. Stabilität
Ein denkbares Reaktionsmedium ist eine Pufferlösung mit den in Kapitel 3 entwickelten
Eigenschaften, die statt des DMSO-Zusatzes mit MTBE gesättigt ist. Dabei stellt
sich eine MTBE Konzentration von 5 vol% ein. Die grundlegende Vorraussetzung für
1 National Center for Manufactoring Science, im Internet http://solvdb.ncms.org/solvdb.htm
71

6. tert-Butylmethylether als Cosolvent
O
H
BAL/ThDP
O
OH
MTBE
DMSO
Benzaldehyd (R)-Benzoin
(R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
O
X
BAL/ThDP
H
Acetaldehyd
Abbildung 6.1.: Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend von
Benzaldehyd und Acetaldehyd.
die Verwendung von MTBE als Cosolvent ist die Stabilität der BAL im geplanten
Reaktionsmedium. Dazu wird die Lagerstabilität des Enzyms in reiner Pufferlösung,
in mit MTBE gesättigtem Puffer und in Pufferlösung mit 30 vol% DMSO gemessen.
Bei allen drei Reaktionsmedien handelt es sich dabei um homogene Lösungen. Zur
Beschreibung der Stabilität wird der zeitabhängige Verlauf der Enzymaktivität dokumentiert,
woraus sich die Desaktivierungskonstanten berechnen lassen 2 .Diezuden
Desaktivierungskonstanten korrespondierenden Halbwertszeiten sind in Abbildung 6.2
wiedergegeben.
Halbwertszeit / h
2500
2000
1500
1000
500
0
x75
x2
Puffer Puffer/MTBEPuffer/DMSO
Abbildung 6.2.: Stabilität der Benzaldehydlyase in homogenen Reaktionsmedien.
Bedingungen: 35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM MgSO4,
0,35 mM ThDP, V = 2 mL, T = 4 ◦ C, 5 vol% MTBE bzw. 30
vol% DMSO.
2Die mathematische Beschreibung der Enzymdesaktivierung wird in Kapitel 8.1 auf Seite 89 behandelt.
72
O
OH

6.3. Satzreaktor
Sowohl MTBE als auch DMSO bewirken eine deutliche Steigerung der Enzymstabilität.
Die BAL zeigt mit einer Halbwertszeit von 2400 h in der DMSO-haltigen
Pufferlösung die höchste Stabilität. Aber auch in der MTBE-gesättigten Pufferlösung
zeigt das Enzym mit einer Halbwertszeit von 1150 h eine deutlich höhere Stabilität
als in Cosolvent-freier Lösung.
6.3. Satzreaktor
6.3.1. Vergleich der Reaktionsbedingungen
Abbildung 6.3 auf der nächsten Seite zeigt vergleichend die Konzentrationsverläufe
zweier Batchreaktionen zur HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd.
Links dargestellt ist die Reaktion im bislang verwendetem Puffer/DMSO-
Gemisch. Abbildung 6.3 rechts zeigt die HPP-Bildung mit MTBE als Cosolvent. Beide
Graphen zeigen einen ähnlichen Verlauf und es wird bei beiden Versuchen der eingesetzte
Benzaldehyd am Ende der Reaktion quantitativ in HPP überführt. Ein leichter
Unterschied zwischen beiden Reaktionsmedien ist im Verlauf der Benzoinkonzentration
zu erkennen. Die intermediäre Benzoinbildung ist bei Verwendung von MTBE als
Cosolvent stärker ausgeprägt als im DMSO-haltigen Reaktionsmedium. Dies könnte
auf eine geringere Steigerung der Benzoinlöslichkeit durch MTBE zurückgeführt werden.
Dadurch kommt es zu einem stärkeren Ausfallen von Benzoin, was das Gleichgewicht
zwischen Benzaldehyd und Benzoin nach dem Prinzip von Le Chatelier in
Richtung der Benzoinbildung beeinflusst. Allerdings scheint die Konzentration an gelöstem
Benzoin noch ausreichend hoch zu sein, sodass eine rasche Abreaktion des
intermediär gebildeten Benzoins zum HPP möglich ist. Da das Benzoin fein verteilt
in der Lösung ausfällt und durch den Rührer gleichmäßig suspendiert wird, spiegeln
die in Abbildung 6.3 gezeigten Benzoinkonzentrationen die Summe aus gelöstem und
als Feststoff vorliegenden Benzoins wieder. Die Substitution von DMSO durch MTBE
hat keinen negativen Einfluss auf die Enantioselektivität der BAL.
Besonders vorteilhaft macht sich die Verwendung von MTBE als Cosolvent bei
der Produktaufarbeitung bemerkbar. Da es sich bei MTBE im Gegensatz zu DMSO
um ein leichtflüchtiges Lösungsmittel handelt, kann die Produktaufarbeitung erheblich
vereinfacht werden. Das mit dem Produkt aus der wässrigen Phase extrahierte
MTBE kann in einem Schritt gemeinsam mit dem Extraktionsmittel im Vakuum entfernt
werden. Die bei dem System Puffer/DMSO notwendigen Waschschritte entfallen.
Das bedeutet nicht nur eine Verringerung der Arbeitsschritte, sondern es werden auch
die durch das Waschen der organischen Phase mit Wasser hervorgerufenen Verluste
an Produkt vermieden. Als Rohprodukt wird ein weisser Feststoff erhalten, der sich
gut in Isohexan umkristallisieren lässt. Abbildung 6.4 auf der nächsten Seite zeigt
vergleichend die bei beiden Reaktionsmedien notwendigen Schritte zur Produktaufarbeitung.
73

6. tert-Butylmethylether als Cosolvent
Konzentration / mM
20
15
10
5
Benzaldehyd
Benzoin
2-HPP
0
0 1 2
Zeit / h
3 4
Konzentration / mM
20
15
10
5
Benzaldehyd
Benzoin
2-HPP
0
0 1 2
Zeit / h
3 4
Abbildung 6.3.: Batchversuche zur BAL-katalysierten HPP-Bildung. Bedingungen:
20 mM Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd, 35 mM TEA-Puffer, pH
=8,0,35mMMgSO4, 0,35mMThDP,V=3mL,E0 =7UmL −1 ,
T=20 ◦ C, 30 vol% DMSO (links) bzw. 5 vol% MTBE (rechts). Die
Datenpunkte sind durch visuelle Hilfslinien miteinander verbunden.
Puffer/DMSO
Vollständiger
Umsatz
Puffer/MTBE
Vollständiger
Umsatz
Extraktion
mit
Ether
Extraktion
mit
Ether
Waschen
mit
Wasser
Waschen
mit
NaCl
Trocknen
über
MgSO 4
Trocknen
über
MgSO 4
Vakuum
Vakuum
Abbildung 6.4.: Vergleich der Produktaufarbeitung beider Reaktionssysteme.
74
Gelblicher
Feststoff
gelbes Öl
Weißer
Feststoff

6.3.2. Präparativer Batchversuch
6.3. Satzreaktor
Eine einfache, effiziente Produktaufarbeitung ist insbesondere in der präparativen,
chemoenzymatischen Synthese von großer Bedeutung, da hier nicht die Charakterisierung
von Reaktionssystemen im Mittelpunkt steht, sondern die Qualität und Quantität
der herzustellenden Produkte. Dies macht das MTBE-haltige Reaktionsmedium
für Biotransformationen im präparativen Maßstab besonders interessant.
Zur Überprüfung der präparativen Anwendbarkeit des MTBE-haltigen Reaktionsmediums
wurde ein Batchversuch mit einer Ansatzgröße von 0,15 mol in einem Reaktionsvolumen
von 5 L durchgeführt. Es konnte ein Umsatz von 98 % erreicht werden.
Nach der Produktaufarbeitung lagen 18,2 g (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
vor, was einer isolierten Ausbeute von 80 % entspricht. Der Enantiomerenüberschuss
(ee) betrug über 99 % 3 . Das erhaltene Rohprodukt wurde in einem letzten Aufreinigungsschritt
in Isohexan umkristallisiert. Abbildung 6.5 zeigt das Produkt nach der
Kristallisation.
Abbildung 6.5.: (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon nach dem Umkristallisieren.
Der geringeren Enzymstabilität bei Verwendung von MTBE als Cosolvent steht eine
deutlich vereinfachte und darüber hinaus mit geringeren Verlusten behaftete Produktaufarbeitung
gegenüber. Das erhaltene Rohprodukt weist eine wesentlich höhere Reinheit
auf, als das aus DMSO-haltiger Lösung isolierte Rohprodukt. Die durch DMSO
hervorgerufene Behinderung der weiteren Aufreinigung des Rohproduktes (Kristallisation)
entfällt. Daher ist die eingangs gestellt Frage, ob MTBE statt DMSO als
3 Das (S)-Enantiomer konnte nicht detektiert werden.
75

6. tert-Butylmethylether als Cosolvent
Cosolvent bei der HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd verwendet
werden kann, unbedingt positiv zu beantworten. Der vermutlich etwas geringer
ausfallenden Steigerung der Benzoinlöslichkeit durch MTBE kann mit einem
reaktionstechnischem Ansatz begegnet werden, wie das folgende Unterkapitel zeigt.
6.4. Enzym-Membran-Reaktor
Abbildung 6.3 auf Seite 74 zeigt, dass unter den gegebenen Reaktionsbedingungen
bei der Bildung von HPP ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd die Grenzlöslichkeit
von Benzoin intermediär überschritten wird. Dies hat eine zwischenzeitliche
Bildung von festem Benzoin im Reaktionssystem zur Folge. Für das Reaktionsmedium
Puffer/DMSO kann durch die Auswahl eines geeigneten Reaktorkonzenpts dieses
Problem vermieden werden (vergleiche Abbildung 5.8 auf Seite 59). Im kontinuierlich
betriebenen Rührkessel (CSTR) ist es möglich, einen konstanten Betriebspunkt mit
niedriger Benzoinkonzentration einzustellen, da bei diesem Reaktortyp die Konzentrationen
der beteiligten Reaktionspartner unabhängig von Ort und Zeit sind (vergleiche
Abbildung 5.11 auf Seite 63).
Abbildung 6.6 zeigt die Synthese von HPP im kontinuierlich betriebenen Rührkessel
unter Verwendung von MTBE als Cosolvent. Abbildung 6.6 links zeigt den zeitabhängigen
Verlauf des Umsatzes, der rechte Graph gibt den Konzentrationsverlauf der
beteiligten Reaktanden über die gesamte Versuchsdauer wieder.
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Umsatz
Anpassung
0,0
0 20 40 60 80 100
Zeit / h
Konzentration / mM
20
16
12
8
4
HPP
Benzaldehyd
Benzoin
0
0 20 40 60 80 100
Zeit / h
Abbildung 6.6.: BAL-katalysierte Synthese von HPP mit MTBE als Cosolvent im
EMR: 19,5 mM Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd, 35 mM TEA-
Puffer, pH = 8, 0,35 mM Mg 2+ , 0,35 mM ThDP, V = 10 mL, 5 vol%
MTBE, τ =1h,T=20 ◦ C.
Der Reaktor wurde über einen Zeitraum von ca. 100 h mit einer konstanten Verweilzeit
von 1 h betrieben. Dabei wurde ein Umsatz von anfänglich 93 % erreicht,
der im Laufe der Versuchsdauer aufgrund der Enzymdesaktivierung auf 76% (nach
76

6.5. Zusammenfassung
100 h) zurück ging. Wie schon für das Reaktionsmedium Puffer/DMSO beobachtet
wurde, blieb auch bei diesem Reaktionsmedium die Benzoinkonzentration während der
gesamten Reaktionszeit auf einem niedrigen Niveau (

6. tert-Butylmethylether als Cosolvent
78
DMSO als Cosolvent für die Synthese von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon im
homogenen Reaktionsmedium verwendet werden.
• Durch Verwendung von MTBE anstelle von DMSO wird die Produktaufarbeitung
und -aufreinigung erheblich vereinfacht, wobei darüber hinaus Verluste an
Produkt minimiert werden. Dies ist von besonderem Interesse für die präparative,
chemoenzymatische Synthese.
• Die bei Verwendung von MTBE als Cosolvent etwas gringere Benzoinlöslichkeit
kann durch einen reaktionstechnischen Ansatz kompensiert werden. Im
EMR wird bei der kontinuierlichen HPP-Synthese im Reaktionsmedium Puffer
/ MTBE nur eine sehr geringe Benzoinbildung beobachtet.

Teil III.
Nicht-konventionelle
Reaktionsmedien
79

7. Einleitung
In den letzten Jahren gewinnt der Einsatz von Biokatalysatoren zunehmend an Bedeutung.
Die Möglichkeit hohe Chemo-, Regio- und Enantioselektivität mit milden
Reaktionsbedingungen zu verknüpfen bildet eine Alternative zu den klassischen chemischen
Verfahren (Wong & Whitesides, 1994). Dabei beschränkt sich der Einsatz
der Biokatalyse nicht auf den Labormaßstab, sondern kommt auch in der industriellen
Produktion weitverbreitet zur Anwendung (Liese et al., 2000). Die diesen Prozessen
zugrundeliegenden Reaktionsbedingungen werden oft den natürlichen Reaktionsbedingungen
der Biokatalysatoren in der lebenden Zelle nachempfunden, wobei
Wasser das dominierende Lösungsmittel darstellt. Ein Nachteil der milden, wässrigen
Reaktionsbedingungen ist die geringe Löslichkeit hydrophober Substrate, was dazu
führt, dass die Konzentrationen der Reaktionspartner bei biokatalytischen Prozessen
geringer sind als bei klassisch chemischen Verfahren. Dieser Nachteil führt zu schlechteren
Raum-Zeit-Ausbeuten, begrenzt die maximale Zyklenzahl und erschwert die
Produktaufarbeitung.
Eine Alternative zum wässrigen Lösungsmittelsystem stellt der Einsatz nicht-konventioneller
Reaktionsmedien dar. Als nicht-konventionelle Reaktionsmedien werden Systeme
bezeichnet, die entweder hauptsächlich aus organischen Verbindungen (Lösungsmittel,
Substrate, Produkte) oder aus superkritischen Flüssigkeiten bestehen. Auch
gasförmige Reaktionssysteme werden zu den nicht-konventionellen Reaktionsmedien
gezählt. Gemeinsam ist diesen Systemen ein im Vergleich zu den konventionellen Reaktionsmedien
reduzierter Wasseranteil. Ein weiterer wichtiger Vorteil vieler nichtkonventioneller
Reaktionsmedien ist ein gutes Lösungsvermögen für hydrophobe, in
Wasser schwerlösliche Verbindungen (Adlercreutz, 2000).
7.1. Einsatz von organischen Lösungungsmitteln
Unter den nicht-konventionellen Reaktionsmedien, die zur Erhöhung der Löslichkeit
der beteiligten Reaktionspartner verwendet werden, ist der Einsatz organischer Lösumgsmittel
am weitesten verbreitet. Eine systematische Einteilung erfolgt in der Literatur
vielfach aufgrund unterschiedlicher Volumenverhältnisse von organischer und
wässriger Phase. Für organisch / wässrige Systeme werden folgende Fälle unterschieden
(Halling, 1987; Carrea & Riva, 2000).
81

7. Einleitung
• rein organische Systeme (Abb. 7.1a)
• invers micellare Systeme (Abb. 7.1b)
• Zweiphasensystem (Abb. 7.1c)
• wassermischbare Cosolventien (Abb. 7.1d)
a) b) c) d)
Abbildung 7.1.: Systeme für die Biokatalyse in organisch / wässrigen Medien.
Im Folgenden werden die einzelnen Systeme mit ihren Vor- und Nachteilen vorgestellt.
7.1.1. Rein organische Systeme
Bei diesem Reaktionssystem wird das Enzym (als Lyophilisat oder auf einem Träger
immobilisiert) in der organischen Phase suspendiert. Die wässrige Phase ist bei
solchen Systemen reduziert auf das „Strukturwasser“, das auf der Enzymoberfläche
gebunden vorliegt und auch durch Lyophilisation nicht entfernt werden kann (Faber,
2000). Und obwohl bei diesen Systemen in der Literatur von „low water media“ bzw.
„anhydrous solvents“ gesprochen wird, ist die Wasseraktivität in solchen Systemen
von entscheidender Bedeutung für die Enzymaktivität. Es stellte sich heraus, dass die
Enzymaktivität in vielen Fällen in hydrophoben Solventien höher ist als in hydrophilen.
Die Autoren schrieben dieses Ergebnis der unterschiedlichen Fähigkeit organischer
Lösungsmittel zu, die für die Enzymaktivität essentielle Wasserschicht zu verdrängen.
Zaks und Klibanov konnten mit den drei nicht verwandten Enzymen Alkoholoxidase
aus Hefe, Polyphenoloxidase aus Pilzen und Alkoholdehydrogenase aus Pferdeleber
zeigen, dass die Enzymaktivität in den verschiedenen Lösungsmitteln mehr oder weniger
konstant war, solange die Menge des an das Enzym gebundenen Wassers gleich
blieb (Zaks & Klibanov, 1988). Entscheidend für die Enzymaktivität in solchen Systemen
ist also nicht der Wassergehalt des Lösungsmittels, sondern der Wassergehalt
des Enzyms. Für eine gute Enzymaktivität muss in jedem Lösungsmittel eine andere
Wasseraktivität eingestellt werden, die dann wiederum eine optimale Hydratisierung
des Enzyms bewirkt. Allgemein gilt, dass hydrophobe Lösungsmittel eine geringere
Tendenz haben Wassermoleküle aus der essentiellen Wasserschicht um das Enzym
82

7.1. Einsatz von organischen Lösungungsmitteln
zu entziehen, wodurch die höhere Aktivität in diesen Lösungsmitteln erklärt wird.
Auch die einzelnen Enzyme benötigen eine unterschiedliche starkte Hydratisierung.
Chymotrypsin benötigt für den Erhalt der katalytischen Aktivität nur ca. 50 Wassermoleküle
pro Molekül Enzym (Zaks & Klibanov, 1986). Polyphenoloxidase hingegen
benötigt mit ca. 3.5 · 10 7 Molekülen Wasser pro Enzymmolekül eine deutlich höhere
Hydratisierung (Kazandjian & Klibanov, 1985).
Die geringe Solvatisierung der Enzyme in einem rein organischen Lösungsmittelsystem
führt zu einer starren Konformation der Proteinmoleküle. Klibanov et. al.
konnten für die Enzyme PPL, Ribonuclease und α-Chymotrypsin bei 100 ◦ C ein Halbwertszeit
von mehreren Stunden beobachten, wo hingegen in wässriger Lösung die
Enzyme bei dieser Temperatur schon nach wenigen Sekunden desaktiviert werden
(Zaks & Klibanov, 1984; Zaks & Klibanov, 1988; Volkin et al., 1991). Die Autoren
führen die Steigerung der Stabilität der Enzyme auf eine Einschränkung der konformativen
Proteinbeweglichkeit zurück sowie auf das Ausbleiben von Reaktionen der
Proteinmoleküle mit Wasser, wie z.B. die Hydrolyse von Petidbindungen, die zu einer
irreversiblen Desaktivierung der Enzyme führen.
Nachteile des Systems:
• Für jede Kombination Enzym / Lösungsmittel muss die optimale Wasseraktivität
ermittelt werden.
• Das Einstellen der Wasseraktivität im Lösungsmittel (und damit auch am Enzym)
ist nur über Umwege möglich, was zu weiteren Additiven im System und
zu zusätzlichem apparativem Aufwand führt.
In einem reinen organischen Lösungsmittel hängt der Zustand des Enzyms von
seiner Vorbehandlung ab. Es hat in der Regel immer noch die Konformation, in der
es zur Zeit der Lyophilisierung vorlag (sog. Molecular Memory Effekt) (Griebenow &
Klibanov, 1996; Klibanov, 2001).
7.1.2. Mikroemulsionen
Mikroemulsionen sind aus makroskopischer Sicht homogene Mischungen aus einer
wässrigen Komponente, einer organischen Komponente sowie einem Tensid. Die Emulsionen
sind thermodynamisch stabil, transparent und lassen sich durch Mischen der
Komponenten herstellen (Orlich & Schomaecker, 1999). In Abhängigkeit von Zusammensetzung
und Verhältnis der beteiligten Komponenten bestehen zwei Möglichkeiten
der Verteilung. Ist Wasser die äußere und Öl die innere Phase, liegt eine O/W-
Emulsion vor, deren Grundcharakter durch das Wasser geprägt ist. Ist Öl die äußere
u. Wasser die innere Phase, liegt eine W/O-Emulsion vor (reverse Micellen), wobei
hier der Grundcharakter vom Öl bestimmt wird. Biokatalysatoren können in der wässrigen
Umgebung der reversen Micellen gelöst sein und stellen so Mikroreaktoren dar,
in denen auch eine gute Rückhaltung der hydrophilen Cofaktoren gelingt (Hilhorst
et al., 1983). Die Substrate sind in der kontinuierlichen organischen Phase gelöst und
83

7. Einleitung
die große Phasengrenzfläche der nur auf mikroskopischer Sicht heterogenen Mikroemulsionen
minimiert eine Phasentransferlimitierung.
Nachteile der Mikroemulsionen sind: (Kragl, 1997; Adlercreutz, 2000)
• Die eingesetzten Tenside können sich nachteilig auf die Enzymstabilität auswirken.
• Produktaufarbeitung und Enzymwiedergewinnung werden durch die Tenside
ebenfalls behindert.
• Das geringe Volumen der wässrigen Phase erschwert die pH-Kontrolle.
• Die makroskopische Homogenität erschwert die Entwicklung eines kontinuierlichen
Verfahrens.
7.1.3. Zweiphasensystem
Der Ausdruck Zweiphasensystem wird im Rahmen dieser Arbeit für Systeme benutzt,
die aus einer wässrigen oder wasserreichen Phase und einer mit Wasser nicht mischbaren
Phase bestehen. Bei der zweiten Phase kann es sich zum Beispiel um ein organisches
Lösungsmittel oder um das Substrat selbst handeln, das über seine Löslichkeit
hinaus der wässrigen Phase zugesetzt wird. In einem Zweiphasensystem befinden sich
in aller Regel der Biokatalysator und die hydrophilen Cofaktoren in der wässrigen
Phase, in der auch die Reaktion stattfindet. Die hydrophoben Substrate und Produkte
sind in der organischen Phase gelöst. Der Schwerpunkt der Arbeiten zur Biokatalyse
im Zweiphasensystem liegt im Bereich der Lipasen, da diese Enzyme grenzflächenaktiv
sind und eine hohe Stabilität in solchen organisch-wässrigen Systemen aufweisen
(Faber, 2000). In aktuellen Arbeiten kommen aber auch Lyasen, Decarboxylasen und
Alkoholdehydrogenasen zum Einsatz (Bauer et al., 2002; Rosche et al., 2002; Villela,
2003).
Abbildung 7.2 auf der nächsten Seite zeigt schematisch die Vorgänge in einem Zweiphasensystem.
Der Biokatalysator und die hydrophilen Cofaktoren sind in der wässrigen
Phase gelöst. Die hydrophoben Substrate befinden sich zum größten Teil in
der organischen Phase. Durch intensives Vermischen beider Phasen ist ein Stoffaustausch
zwischen beiden Phasen möglich. Entsprechend dem Verteilungskoeffizienten 1
kann das Substrat in die wässrige Phase diffundieren. Dort wird es durch das Enzym
zum Produkt umgesetzt, das wieder in die organische Phase diffundieren kann. Abbildung
7.3 auf der nächsten Seite zeigt die Vorgänge im Zweiphasensystem in einer
abstrakteren Form.
Da die meisten Biokatalysatoren und hydrophilen Cofaktoren in organischen Lösungsmitteln
unlöslich sind, ist im Zweiphasensystem eine Katalysator- und Cofaktorrückhaltung
leicht möglich. Im Gegensatz zu den reversen Micellen ist die Katalysatorund
Cofaktorwiedergewinnung durch Phasentrennung möglich.
1 Der Verteilungskoeffizient gibt das Verhältnis der Konzentrationen eines Stoffes in zwei nicht miteinander
mischbaren Lösungsmitteln an.
84

7.1. Einsatz von organischen Lösungungsmitteln
organische Phase
Substrat Produkt
ENZYM
Substrat Produkt
wässrige Phase
Abbildung 7.2.: Prinzip eines organisch / wässrigen Zweiphasensystems.
Abbildung 7.3.: Darstellung eines Zweiphasensystems (Carrea, 1984).
85

7. Einleitung
Aufgrund der Ähnlichkeit beider Systeme liegt ein Vergleich des Zweiphasensystems
mit der Anwendung wassermischbarer Lösungsvermittlern nahe. Der Einsatz eines mit
Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels bringt einige Vorteile (Carrea, 1984):
• Die Konzentration des organischen Solvents in der wässrigen Phase ist geringer.
• Eine mögliche Inhibierung durch Substrate und Produkte wird verringert.
• Durch gezielte Extraktion können thermodynamische Limitierungen überwunden
werden.
• Die Solventkonzentration in der wässrigen Phase ist unabhängig vom Volumenverhältnis
beider Phasen.
Aufgrund der genannten Vorteile und der leichten Katalysatorrückhaltung und -
rückgewinnung werden die weiteren Untersuchungen zu den nicht-konventionellen Lösungsmittel
im Zweiphasensystem durchgeführt.
7.1.4. Wassermischbare Cosolventien
Das Prinzip der wassermischbaren Cosolventien wurde schon im ersten Teil der vorliegenden
Arbeit vorgestellt und wird hier nur der Vollständigkeit halber erwähnt.
7.2. Wahl des Lösungsmittels für
Multiphasensysteme
Brink & Tramper führten systematische Untersuchungen zur Stabilität von Biokatalysatoren
in Multiphasensystemen durch. Ziel war es, einen Parameter zu identifizieren,
der es erlaubt Vorhersagen zu treffen ob, ein bestimmtes Lösungsmittel geeignet
ist für die Verwendung als organische Phase in einem Zweiphasenprozess (Brink &
Tramper, 1985). Sie benutzten den Hildebrand Parameter σ, der ein Mass für die Polarität
eines Lösungsmittels darstellt. Die verwendeten Biokatalysatoren zeigten hohe
Stabilitäten in Kombination mit Lösungsmitteln mit niedrieger Polarität und hohem
Molekulargewicht. Aufbauend auf diese Ergebnisse schlugen Laane et. al. den log P-
Wert 2 als Schlüsselparameter bei der Optimierung von Zweiphasensystemen vor (Laane
et al., 1985). Im Gegensatz zum Hildebrand Parameter reflektiert der log P-Wert
die Polarität des Lösungsmittels deutlicher. Nach Laane sind Lösungsmittel mit einem
log P-Wert unter 2 nicht geeignet, mit einem log P-Wert zwischen 2 und 4 eventuell geeignet
und Lösungsmittel mit einem log P-Wert über 4 geeignet für die Verwendung
in einem biokatalystischen Zweiphasensystem (Laane et al., 1987). Mozahev et. al.
führten die hohe Stabilität von Biokatalysatoren in Kombination mit hydrophoben
2 Der log P-Wert bezeichnet den Verteilungskoeffizienten einer gegebenen Verbindung in einem n-
Oktanol / Wasser Zweiphasensystem
86

7.2. Wahl des Lösungsmittels für Multiphasensysteme
Lösungsmitteln auf die geringe Restkonzentration dieser Lösungsmittel in der wässrigen
Phase zurück (Mozhaev et al., 1989; Khmelnitsky et al., 1991). Für das System
Wasser / wassermischbares Lösungsmittel konnten Mozhaev et al. zeigen, dass die
Desaktivierung von Enzymen durch organische Lösungsmittel erst ab einer bestimmten
Grenzkonzentration eintritt. Diese Grenzkonzentration wird in der Wasserphase
eines Zweiphasensystems mit einem hydrophoben Lösungsmittel nicht erreicht. Obwohl
in der Literatur einige Ausnahmen dokumentiert sind 3 hat das log P-Konzept
eine große Akzeptanz gefunden (Faber, 1994; Drauz & Waldmann, 2002).
Neben den Wechselwirkungen zwischen den Lösungsmittelmolekülen in der wässrigen
Phase und den Enzymen können noch weitere Faktoren im Zweiphasensystem
die Stabilität des Biokatalysators beeinflussen. Insbesondere an der Phasengrenzfläche
können physikalische Effekte zu Enzymdesaktivierungen und zu Aggregation von
Biomasse führen (Hickel et al., 1998).
3Für einige Beispiele zu Ausnahmen vom log P-Konzept siehe: (Vermue & Tramper, 1995; Bauer
et al., 1999; Rosche et al., 2002)
87

7. Einleitung
88

8. Untersuchungen zur Stabilität
der Benzaldehydlyase im
Zweiphasensystem
Eine grundlegende Voraussetzung für den Einsatz eines Enzyms in einem bestimmten
Reaktionssystem ist die Stabilität des Katalysators unter den gegebenen Reaktionsbedingungen.
Um die Verwendbarkeit der BAL in einem organisch / wässrigen
Zweiphasensystem zu überprüfen wurde zunächst die Stabilität des Enzyms in Kombination
mit verschiedenen Lösungsmitteln untersucht.
8.1. Beschreibung der Enzymdesaktivierung
Vielen Arbeiten zur Untersuchung der Stabilität von Biokatalysatoren in Gegenwart
von organischen Lösungsmitteln liegt das Prinzip einer Zweipunktmessung zugrunde.
Dabei wird zu Beginn des Experiments die Startaktivität und nach Ablauf einer bestimmten
Zeitspanne die verbleibende Aktivität gemessen. Je nach Differenz zwischen
beiden Aktivitäten wird auf eine gute oder schlechte Stabilität geschlossen. Bei diesem
Ansatz wird nicht berücksichtigt, dass die Aktivität eines Enzyms in einem wässrig
/ organischen Zweiphasensystem sowohl durch Inhibierung als auch durch Desaktivierung
beeinflusst werden kann. Eine Inhibierung des Enzyms durch eine Restkonzentration
an organischem Lösungsmittel in der wässrigen Phase macht sich durch
einen sprunghaften Rückgang der Aktivität gleich zu Beginn des Experiments, also
nach Zugabe des Lösungsmittels zur wässrigen Phase, bemerkbar. Die Desaktivierung
des Enzyms, unabängig ob durch Wärme, physikalische Effekte an der Phasengrenzfläche
oder Lösungsmittel in der Wasserphase hervorgerufen, führt zu einem stetigen
Rückgang der Aktivität während der gesamten Dauer des Experiments.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen bei den Versuchen zur Lösungsmittelstabilität der
BAL beide Effekte berücksichtigt werden. Der zeitabhängige Verlauf der Aktivität
wird durch Gleichung 8.1 beschrieben. Die Enzymdesaktivierung kann als exponentielle
Abnahme der Aktivität erster Ordnung beschrieben werden. Der Inhibierung wird
durch Einführen eines konstanten Faktors (I) Rechnung getragen. Dabei bleibt die Art
(kompetitiv, unkompetitiv oder nicht kompetitiv) der Inhibierung unberücksichtigt.
A = A0 · I · e −kdes · t
(8.1)
Anhand der für jedes Lösungsmittel erhaltenen Desaktivierungskonstante kdes lässt
89

8. Untersuchungen zur Stabilität der Benzaldehydlyase im Zweiphasensystem
sich die Halbwertszeit 1 berechnen (Gleichung 8.2 und 8.3)
A ln A0 t = − (8.2)
kdes
bei der Auftragung relativer Aktivitäten und zum Zeitpunkt t = t1/2 gilt A =0, 5 und
A0 =1wodurch sich Gleichung 8.1 vereinfacht zu
ln 0, 5
t1/2 = − (8.3)
kdes
Abbildung 8.1 zeigt beispielsweise zwei Experimente aus der Versuchsreihe zur Untersuchung
der Stabilität der BAL im wässrig / organischen Zweiphasensystem. Links
dargestellt ist ein Lösungsmittel, das nahezu keine Enzyminhibierung zeigt (tert-
Butylmethylether). Der rechte Graph zeigt deutlich eine sprunghafte Abnahme der
Aktivität zu Beginn des Experiments (Diethylether). Nur durch die Berücksichtigung
der Inhibierung in Gleichung 8.1 gelingt in diesem Fall die Anpassung der Gleichung
(gezeigt als durchgezogene Linie) an die Messwerte (gezeigt als Punkte) mit guter
Übereinstimmung.
relative Aktivität / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0 200 400 600 800 1000
Zeit / h
relative Aktivität / -
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Inhibierung
0.0
0 200 400 600 800 1000
Zeit / h
Abbildung 8.1.: Beispiel einer Stabilitätsmessung mit und ohne Inhibierung.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wird die Halbwertszeit (t1/2) als Maß für die Stabilität
der BAL in einem Zweiphasensystem verwendet und mit Hilfe von Gleichung
8.3 berechnet. Die dafür benötigte Desaktivierungskonstante (kdes) wird durch nichtlineare
Anpassung von Gleichung 8.1 auf der vorherigen Seite an die experimentell
bestimmten Aktivitäts - Zeit - Verläufe erhalten.
8.2. Lösungsmittelscreening
Wie in Kapitel 7.2 beschrieben, hat das log P-Konzept bei der Entwicklung von Lösungsmittelsystemen
für die Biokatalyse eine breite Akzeptanz gefunden. Jedoch wurden
in den letzten Jahren in der Literatur auch Ausnahmen dokumentiert (Vermue
1 Zeit, nach der die Aktivität auf die Hälfte der ursprünglichen Aktivität zurückgegangen ist.
90

8.2. Lösungsmittelscreening
& Tramper, 1995; Bauer et al., 1999; Rosche et al., 2002). Weiterhin ist in vielen
Fällen nicht nur die Natur des verwendeten Lösungsmittels verantwortlich für die Enzymdesaktivierung
in organisch / wässrigen Zweiphasensystemen. Viele Mechanismen,
wie z.B. physikalische Kräfte an der Phasengrenzfläche, können die Enzymaktivität
ebenfalls beeinflussen (Halling, 1987). Um bei der Suche nach einem geeigneten Lösungsmittel
für die BAL möglichst viele Einflüsse zu berücksichtigen, wird das Screening
in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten Schritt des Lösungsmittelscreenings
wird die Stabilität der BAL in Kombination mit Vertretern verschiedener Lösungsmittelklassen
untersucht. Hier kommen auch Lösungsmittel zum Einsatz, die nach
dem log P-Konzept für die Verwendung mit Biokatalysatoren nicht geeignet scheinen.
Ziel des ersten Screening ist es, eine für die BAL geeignete Lösungsmittelklasse
zu finden. In einem zweiten Lösungsmittelscreening werden anschließend verschiedene
Lösungsmittel aus der zuvor bestimmten Lösungsmittelklasse getestet. Das im zweiten
Screening gefundene Lösungsmittel wird dann für die Biotransformationen im
organisch / wässrigen Zweiphasensystem eingesetzt.
8.2.1. Lösungsmittelklassen
Im ersten Lösungsmittelscreening werden Ethylacetat, Diethylether und die halogenierten
Kohlenwasserstoffe Di- und Trichlormethan verwendet. Cyclohexan kommt als
Vertreter cyclischer Kohlenwasserstoffe zum Einsatz. Die aromatischen Lösungsmittel
werden durch Toluol und p-Xylol vertreten. 1-Oktanol kommt als primärer Alkohol
zum Einsatz. Weiterhin sind die verzweigten Kohlenwasserstoffe Isohexan und Isoheptan
sowie n-Heptan als unverzweigter Kohlenwasserstoff beteiligt. Tabelle 8.1 auf der
nächsten Seite zeigt die verwendeten Lösungsmittel und ihre Strukturformeln nach
aufsteigendem log P-Wert sortiert 2 .
Das Vorgehen bei den Stabilitätsmessungen war für jedes Lösungsmittel gleich. Dazu
wurde das Enzym zunächst in Kaliumphosphatpuffer gelöst, der auch den Cofaktor
Thiamindiphosphat und Magnesiumionen enthielt. Nachdem die Startaktivität des
Enzyms bestimmt wurde, wurde das gleiche Volumen des zu testenden Lösungsmittels
zugesetzt. Um Volumenänderungen der Phasen zu vermeiden, wurde das Lösungsmittel
vor der Zugabe mit Wasser gesättigt. Durch intensives Rühren (700 U/min) wurde
eine Emulsion beider Phasen erzeugt. Nach fünf Minuten wurde die erste Probe aus
des wässrigen Phase entnommen und die Enzymaktivität unter Standardbedingungen
bestimmt 3 . Die Differenz zwischen Startaktivität und der Enzymaktivität nach
fünf Minuten gibt Aufschluss über eine mögliche Inhibierung des Enzyms durch eine
Restkonzentration des organische Lösungsmittels in der wässrigen Phase. Die Abnahme
der Enzymaktivität im weiteren Verlauf des Versuchs wurde durch regelmäßige
Beprobung der wässigen Phase dokumentiert. Um die thermische Desaktivierung des
Enzyms zu minimieren wurden alle Versuch zur Lagerstabilität der BAL im organisch
/ wässrigen Zweiphasensystem bei 4 ◦ C durchgeführt. Im Kontrollexperiment wurde
2Die log P-Werte wurden nach der Crippenschen Fragmantierungsmethode berechnet (Ghose &
Crippen, 1987).
3Vergleiche hierzu Kapitel 3.1 auf Seite 21.
91

8. Untersuchungen zur Stabilität der Benzaldehydlyase im Zweiphasensystem
Log P Bezeichnung
0,29 Ethylacetat
OEt
0,76 Diethylether O
1,01 Dichlormethan H2CCl2 1,67 Trichlormethan HCCl3 2,50 Cyclohexan
2,52 Toluol
2,64 1-Oktanol OH
2,91 Isohexan
3,01 p-Xylol
3,33 Isoheptan
3,42 n-Heptan
Tabelle 8.1.: Vertreter verschieder Verbindungsklassen, die im ersten Lösungsmittelscreening
eingesetzt wurden.
92
O

8.2. Lösungsmittelscreening
unter gleichen Bedingungen aber ohne organische Phase eine Halbwertszeit von 15 h
beobachtet. Abbildung 8.2 zeigt die Halbwertszeiten der BAL in Kombination mit
Vertretern verschiedener Lösungsmittelklassen. Die Lösungsmittel sind nach ansteigendem
log P-Wert sortiert.
Halbwertszeit / h
log P
250
200
150
100
50
0
12h
0,7 0,8 1,0 1,7 2,5 2,5 2,6 2,9 3,0 3,3 3,4
O
OEt
238h
O
1h 2h 8h 1h
H 2CCl 2
HCCl 3
62h
( ) 6 OH
Abbildung 8.2.: Screening nach Lösungsmittelklassen.
Die halogenierten und aromatischen Lösungsmittel zeigen eine rasche Enzymdesaktivierung.
In Gegenwart von Ethylacetat, Cyclohexan und dem unverzweigten Kohlenwasserstoff
n-Heptan zeigt die BAL eine Stabilität, die in der Größenordnung des
Kontrollexperiments liegt. Durch den Einsatz verzweigter Kohlenwasserstoffe (Isohexan
und Isoheptan) und 1-Oktanol als organsiche Phasen kann die Enzymstabiltät
gesteigert werden. Das Enzym wird durch diese Lösungsmittel im Vergleich zum Kontrollexperiment
stabilisiert. Die mit 238 Stunden längste Halbwertszeit und damit die
höchste Stabilität zeigt das Enzym in Kombination mit Diethylether.
Ein Zusammenhang zwischen den gemessenen Enzymstabilitäten und dem log P-
Wert der verwendeten Lösungsmittel ist nicht erkennbar. Das mit Hinblick auf die
Enzymstabilität günstigste Lösungsmittel (Diethylether) hat einen log P-Wert von
kleiner als 1.
23h
1h
46h
( ) 2
6h
( ) 3
93

8. Untersuchungen zur Stabilität der Benzaldehydlyase im Zweiphasensystem
8.2.2. Ether
Die BAL zeigt in einem organisch / wässrigen Zweiphasensystem mit Diethylether als
organische Phase eine hohe Lagerstabilität. Daher wird in einem zweiten Screening
die Lagerstabilität des Enzyms in Kombination mit weiteren Ethern getestet. Schon
im ersten Screening haben chemisch ähnliche Lösungsmittel je nach Molekülstruktur
einen unterschiedlichen Einfluss auf die Enzymstabilität gezeigt. Darum kommen im
zweiten Screening Ether mit unterschiedlich strukturierten Seitenketten zur Anwendung
(Tabelle 8.2).
Log P Bezeichnung
0,40 Tetrahydrofuran
0,76 Diethylether O
0,96
tert-Butylmethylether
(MTBE)
1,40 Diisopropylether (DIPE)
2,57 Di-n-butylether O
Tabelle 8.2.: Verschiedene Ether, die im zweiten Lösungsmittelscreening eingesetzt
werden.
Neben Diethylether wird Di-n-butylether als weiterer Ether mit unverzweigten Seitenketten
verwendet. Diisopropylether (DIPE) und tert-Butylmethylether (MTBE) repräsentieren
Ether mit verzweigten aliphatischen Seitenketten. Tetrahydrofuran kommt
als cyclischer Ether zum Einsatz. Abbildung 8.3 auf der nächsten Seite zeigt die Stabilität
des Enzyms in Kombination mit den verschiedenen Ethern. Die Durchführung
der Versuche wurde schon in Kapitel 8.2.1 beschrieben.
Mit Ausnahme von Tetrahydrofuran bewirken alle Ether eine Stabilisierung der
BAL im Vergleich zu dem Kontrollexperiment (t1/2 = 15 h). Auch bei dieser Versuchsreihe
ist eine Einteilung der Lösungsmittel basierend auf ihrer Molekülstruktur
möglich, was die schon in Kapitel 8.2.1 auf Seite 91 gemachten Beobachtungen bestätigt.
Ether mit verzweigter Seitenkette (tert-Butylmethylether und Diisopropylether)
bewirken eine höhere Enzymstabilität als Ether mit unverzweigter Seitenkette (Diethylether
und Di-n-butylether). Im Gegensatz zu den Arbeiten von Mozhaev et. al.
besteht auch innerhalb der Verbindugsklasse der Ether keine Korrelation der beobachteten
Enzymstabilität und dem log P-Wert des verwendeten Lösungsmittels 4 .
Aufgrund der hohen Lagerstabilität die die BAL in einem organisch / wässrigen
4 Vergleiche hierzu (Mozhaev et al., 1989)
94
O
O
O

Halbwertszeit / h
log P
800
700
600
500
400
300
200
100
0
1h
0,4 0,8 1,0 1,4 2,6
O
238h
O
815h
O
666h
O
8.2. Lösungsmittelscreening
41h
O
( ) 3 ( ) 3
Abbildung 8.3.: Enzymstabilität der BAL in Gegenwart verschiedener Ether.
95

8. Untersuchungen zur Stabilität der Benzaldehydlyase im Zweiphasensystem
Zweiphasensystem mit tert-Butylmethylether oder Diisopropylether als organische
Phase zeigt, bietet sich die Verwendung dieser beiden Lösungsmittel an. Da MTBE
keine Peroxide bildet, wird aus Sicherheitsgründen bei den weiteren Arbeiten dieses
Lösungsmittel bevorzugt eingesetzt.
8.3. Zusammenfassung
96
• Die Benzaldehydlyase zeigt eine hohe Lagerstabilität in einem organisch / wässrigen
Zweiphasensystem, wenn offenkettige Ether, insbesondere mit verzweigten
aliphatischen Seitenketten, als organische Phase eingesetzt werden.
• Mit tert-Butylmethylether kann eine Halbwertszeit von 815 h erreicht werden.
• Es kann keine Korrelation, auch nicht innerhalb einer Verbindungsklasse, zwischen
der Enzymstabilität und dem log P-Wert des eingesetzten Lösungsmittels
beobachtet werden.
• Eine Einteilung der Lösungsmittel hinsichtlich einer hohen Enzymstabilität gelingt
basierend auf der chemischen Funktionalität.

9. Biotransformationen im
Zweiphasensystem
In diesem Kapitel werden die Biotransformationen im Zweiphasensystem vorgestellt.
Zunächst werden die Verteilungskoeffizienten der beteiligten Reaktionspartner bestimmt,
da diese Stoffkonstanten wichtige Parameter im Zweiphasensystem darstellen.
9.1. Verteilungskoeffizienten
In der Chemie wird unter Verteilung die Einstellung eines chemischen Gleichgewichts
(Verteilungsgleichgewicht) unterschiedlicher Konzentrationen eines Stoffes in zwei aneinander
grenzenden Phasen verstanden. Im Falle des Zweiphasensystems ist es die
Verteilung eines Stoffes zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmitteln mit stark unterschiedlichem
Lösungsvermögen für diesen Stoff. Bei einer bestimmten Temperatur
ist das Verhältnis der Konzentrationen (bzw. Aktivitäten) in den beiden Phasen konstant
(Nernstscher Verteilungssatz) und durch den Verteilungskoeffizienten K, eine
Stoffkonstante, bestimmt (Römpp, 1995). Die Verteilungskoeffizienten der beteiligten
Stoffe sind wichtige Parameter eines Zweiphasensystems, da sie unabängig vom
Volumenverhältnis beider Phasen die Konzentrationsverhältnisse in den Phasen vorgeben.
Die Verteilungskoeffizienten für 2-Hydroxy-1-phenylpropanon, Benzaldehyd und Benzoin
in einem Zweiphasensystem bestehend aus tert-Butylmethylether bzw. Diisopropylether
und Pufferlösung wurden nach Gleichung 9.1 berechnet und sind in Abbildung
9.1 wiedergegeben.
K = corg. P hase
cwässr. P hase
(9.1)
Benzoin zeigt aufgrund seiner beiden Phenylgruppen in beiden Lösungsmitteln die
höchste Hydrophobizität, gefolgt von Benzaldehyd. 2-Hydroxy-1-phenylpropanon hat
aufgrund seines geringsten Verteilungskoeffizienten von allen beteiligten Verbindungen
die höchste Konzentration in der wässrigen Phase. Alle untersuchten Verbindungen
sind in beiden Lösungsmittel überwiegend in der organischen Phase gelöst.
9.2. Synthese von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
Für die Biotransformationen im Zweiphasensystem wird zunächst die BAL-katalysierte
HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd verwendet (Abbildung
97

9. Biotransformationen im Zweiphasensystem
Konzentration / mM
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
c (MTBE)
c (Puffer)
2-HPP Benzaldehyd Benzoin
K 10,0 34,0 135,2
log(K) 1,0 1,5 2,1
Konzentration / mM
20,00
15,00
10,00
5,00
c (DIPE)
c (Puffer)
0,00
2-HPP Benzaldehyd Benzoin
K 4,7 28,8 67,0
log(K) 0,7 1,5 1,8
Abbildung 9.1.: Verteilungskoeffizienten von HPP, BA und BZ in MTBE / Puffer
(links) und DIPE / Puffer (rechts). (Pufferlösung: 50 mM TEA, pH
= 8; 0,5 mM ThDP, 0,5 mM MgSO4, T=20 ◦ C).
9.2), da für dieses Reaktionssystem schon auf die Ergebnisse aus Teil II dieser Arbeit
zurückgegriffen werden kann.
O
H
O
BAL/ThDP BAL/ThDP
OH
Benzaldehyd (R)-Benzoin
(R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
O
ee > 99%
H
Acetaldehyd
Abbildung 9.2.: Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ausgehend von
Benzaldehyd und Acetaldehyd.
9.2.1. Emulsions-Batchreaktor
Die HPP-Bildung im Zweiphasensystem wird im Satzreaktor durchgeführt. Die Substrate
Benzaldehyd und Acetaldehyd werden in der organischen Phase gelöst. Das Enzym
und die Cofaktoren befinden sich in der wässrigen Phase. Um den Stoffaustausch
zu gewährleisten werden beide Phasen während der gesamten Reaktionszeit durch intensives
Rühren miteinander vermischt. Der zeitabhängige Konzentrationsverlauf der
Reaktanden in der organischen Phase ist in Abbildung 9.3 auf der nächsten Seite
wiedergegeben.
98
O
OH

Konzentration / mM
30
25
20
15
10
5
9.2. Synthese von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
organische Phase
2-HPP
Benzaldehyd
Benzoin
0
0 5 10 15
Zeit / h
20 25
Abbildung 9.3.: Batch zur BAL-katalysierten HPP-Bildung im Zweiphasensystem.
Wässrige Phase: 50 mM TEA-Puffer, pH = 8,0, 0,5 mM Mg 2+ ,
0,5mM ThDP, E0 =10UmL −1 ,V=2mL,T=20 ◦ C. MTBE-
Phase: 30 mM Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd, V = 2 mL. Die
Datenpunkte sind durch visuelle Hilfslinien verbunden.
Der Verlauf der HPP- und Benzaldehydkonzentration in Abbildung 9.3 entspricht
grundsätzlich dem Verlauf, der bei Reaktionsführung im wässrigen, einphasigen System
beobachtet wird. Ein deutlicher Unterschied ist im Verlauf der Benzoinkonzentration
zu erkennen. Zu keinem Zeitpunkt der Reaktion ist eine signifikante Bildung
von Benzoin zu beobachten. Zur Erklärung dieser Beobachtung muss berücksichtigt
werden, dass die enzymatische Umsetzung nicht in der organischen, sondern in der
wässrigen Phase stattfindet, wo sich auch das Enzym befindet. Es können zwei Hypothesen
entwickelt werden, die sich darin unterscheiden, ob eine Phasentransferlimitierung
vorliegt oder nicht.
Die erste Hypothese geht davon aus, dass keine Phasentransferlimitierung vorliegt.
Die in der wässrigen Phase vorherrschenden Konzentrationen werden durch die Verteilungskoeffizienten
der beteiligten Reaktanden beeinflusst, d.h. sie sind im Falle des
vorliegenden Reaktionssystems in der wässrigen Phase deutlich niedriger als in der
organischen Phase. So entspricht die Konzentration an Benzaldehyd bei 30 mM in
der organischen Phase nur ca. 1 mM in der wässrigen. Bei Ausschluss einer Phasentransferlimitierung
kann die verminderte Benzoinbildung im Zweiphasenbatch unter
kinetischen Gesichtspunkten erklärt werden (vgl. Kapitel 4). Abbildung 9.4 auf der
nächsten Seite zeigt zusammenfassend die für die Erklärung relevanten Ergebnisse der
kinetischen Charakterisierung im homogenen Reaktionssystem. Links dargestellt ist
der Verlauf der Aktivitäten der HPP-Bildung (durchgezogene Linie) und der Benzoinbildung
(gestrichelte Linie) ausgehend von Benzaldehyd. Abbildung 9.4 rechts zeigt
die Aktivität der HPP-Bildung ausgehend von Benzoin.
99

9. Biotransformationen im Zweiphasensystem
Aktivität / U mL −1
0,025
0,020
0,015
0,010
wässrige Phase im
Zweiphasensystem
BA -> BZ
BA -> HPP
0,005
Startkonzentration
homogenes System
0,000
0 5 10 15 20
Benzaldehyd / mM
Aktivität / U mL −1
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
BZ -> HPP
0,000
0 5 10 15 20
(R)-Benzoin / mM
Abbildung 9.4.: Kinetik der BAL im homogenen Reaktionsmedium (Kapitel 4.
Links die Aktivität der Benzoin- und HPP-Bildung bei variierter
Benzaldehydkonzentration. Rechts die Aktivität der HPP-Bildung
bei variierter Benzoinkonzentration.
Bei einer Benzaldehydkonzentration von beispielsweise 20 mM, wie sie standardmäßig
bei der HPP-Bildung im homogenen Reaktionssystem (vgl. Teil II) verwendet
wurde, läuft die Benzoinbildung wesentlich schneller ab als die HPP-Bildung (Abbildung
9.4 links). Es kommt intermediär zu einer Anreicherung von Benzoin. In
der wässrigen Phase des Zeiphasensystems herrscht eine wesentlich geringere Benzaldehydkonzentration
(im Bereich von 1 mM). Unter diesen Umständen verläuft die
Benzoinbildung wesentlich langsamer. Ein Blick auf Abbildung 9.4 rechts, macht deutlich,
dass schon bei geringen Benzoinkonzentrationen die Aktivität der HPP-Bildung
ausgehend von Benzoin nahezu die Sättigungsgeschwindigkeit erreicht. Anschaulich
formuliert läßt sich für die wässrige Phase im Zweiphasensystem sagen, dass das wenige
(langsam) gebildete Benzoin sofort weiter zu HPP umgesetzt wird und deshalb
kein Ansteigen der Benzoinkonzentration zu beobachten ist.
An dieser Stelle sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die in Abbildung 9.4
gezeigten Funktionen das kinetische Verhalten der Benzaldehydlyase im Reaktionsmedium
TEA-Pufferlösung/DMSO wiedergeben. Bei dem in Abbildung 9.3 gezeigten
Batchversuch handelt es sich um ein Zweiphasensystem, in dem es sich bei der wässrigem
Phase um eine mit MTBE-gesättigte TEA-Pufferlösung handelt. Es ist zwar
nicht mit einer prinzipiellen Änderung des kinetischen Verhaltens zu rechnen (linearer/hyperbolischer
Kurvenverlauf), jedoch ist eine leichte Variation der kinetischen
Parameter nicht auszuschließen.
Die zweite Hypothese geht von dem Vorliegen einer Phasentransferlimitierung aus.
In diesem Fall ist also die Diffusion der Komponenten zwischen den Phasen geschwindigkeitsbestimmend
und nicht der Umsatz der Komponenten durch das Enzym.
Die Reaktion läuft also nicht mehr unter kinetischer, sondern unter thermodynamischer
Kontrolle ab. Wie in Kaptiel 5.1.1 gezeigt liegt das thermodynamische Gleichgewicht
der HPP-Bildung aufgrund der erhöhten Acetaldehydkonzentration weit auf
100

9.2. Synthese von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon
der Produktseite. Auch in diesem Fall sollte keine signifikante Benzoinkonzentration
zu beobachten sein. Eine endgültige Aussage kann erst nach weiteren Untersuchungen
getroffen werden, die jedoch den Rahmen dieser Arbeit sprengen würden.
Unabhängig welche Hypothese die realen Gegebenheiten widerspiegelt, handelt es
sich hier um ein Beispiel für die gezielte Diskriminierung einer (Neben)-Reaktion (Benzoinbildung)
durch den Einsatz eines Zweiphasensystems.
9.2.2. Repetitive Batch
Zur Untersuchung der Stabilität der Benzaldehydlyase bei den Biotransformationen
im Zweiphasensystem wird die HPP-Bildung im „Repetitive Batch”-Modus durchgeführt.
Das Prinzip des Repetitive Batch wurde schon in Kapitel 5.1.3 erläutert. Im
Falle des Zweiphasensystem gelingt die Katalysatorrückgewinnung jedoch wesentlich
einfacher durch Phasentrennung, da das Enzym und die Cofaktoren in der wässrigen
Phase immobilisiert sind. Für den nachfolgenden Reaktionszyklus wird die wässrige
Phase wieder mit frischer, organischer Substratlösung beaufschlagt. Abbildung 9.5
zeigt die Umsatz - Zeit - Verläufe der einzelnen Batch-Reaktionen zur HPP-Bildung
mit den Lösungsmitteln tert-Butylmethylether (links) und Diisopropylether (rechts)
als organische Phase.
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
MTBE
0,0
0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit / h
Umsatz / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
DIPE
0,0
0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit / h
Abbildung 9.5.: Repetitive Batch zur BAL-katalysierten HPP-Bildung im Zweiphasensystem
mit MTBE (links) und DIPE (rechts). Wässrige Phase:
50 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,5 mM MgSO4, 0,5mMThDP,
E0 =37UmL −1 ,V=2mL,T=20 ◦ C. Organische Phase: 30 mM
Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd, V = 2 mL.
Die Graphen zeigen für beide Lösungsmittel einen sehr ähnlichen Verlauf. Es können
mit beiden Lösungsmitteln innerhalb von 70 Stunden vier Reaktionszyklen mit einem
Umsatz von jeweils über 80 % durchgeführt werden (davon drei Zyklen über 90 %). Im
darauffolgenden Zyklus wird bei MTBE nur noch 70 % und bei DIPE nur noch 60 %
Umsatz erreicht. Nach ca. 140 Stunden scheint das Enzym bei beiden Lösungsmitteln
101

9. Biotransformationen im Zweiphasensystem
vollständig desaktiviert zu sein. Zur Quantifizierung der Desaktivierung kann bei einer
zeitabhängigen Auftragung des Umsatzes der lineare Teil des Graphen herangezogen
werden. Die Steigung in diesem Teil kann als Mass für die Enzymaktivität betrachtet
werden. Da für den ersten Batch andere Vorraussetzungen gelten als für die darauffolgenden
Versuche 1 werden die Graphen ab dem zweiten Batch zur Berechnung der
Enzymdesaktivierung heran gezogen. Die aus Abbildung 9.5 erhaltenen Aktivitäten
sind in Abbildung 9.6 für beide Lösungsmittel dargestellt. Die Enzymdesaktivierung
kann als exponentielle Abnahme der Aktivität erster Ordnung beschrieben werden
(vgl Kapitel 8.1 auf Seite 89). Für MTBE ergibt sich eine Desaktivierungskonstante
(kdes) von 0,0389 ± 0,0031 h −1 , woraus sich eine Halbwertszeit von 18 h berechnen
lässt. Die Desaktivierungskonstante für DIPE beträgt 0,0316 ± 0,0017 h −1 , was einer
Halbwertszeit von 22 h entspricht.
rel. Aktivität / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
MTBE
0,0
0 10 20 30 40 50 60 70
Zeit / h
rel. Aktivität / -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
DIPE
0,0
0 10 20 30 40 50 60 70
Zeit / h
Abbildung 9.6.: Desaktivierung der BAL im Repetitive Batch. Bedingungen siehe
Abbildung 9.5.
Die im Repetitive Batch ermittelten Halbwertszeiten liegen deutlich unter den Halbwertszeiten,
die aus der Lagerstabilität ermittelt wurde. Dies kann hauptsächlich auf
zwei Faktoren zurückgeführt werden. Im Gegensatz zu den Experimenten zur Lagerstabilität
(4 ◦ C) wurden die Biotransformationen bei einer deutlich höheren Temperatur
durchgeführt (20 ◦ C). Daraus resultiert eine wesentlich stärkere thermische Desaktivierung
des Enzyms aber auch die physikalischen Verhältnisse in der Emulsion
können sich durch Temperaturänderungen verändern. Zudem sind bei den Biotransformationen
die Reaktionspartner zugegen. 2-HPP, Benzoin und Benzaldehyd haben
in ihrer Molekülstruktur sowohl hydrophobe als auch hydrophile Domänen. D.h. sie
können als Amphiphile ebenfalls die physikalischen Gegebenheiten in einer Emulsion
beeinflussen. Eine Alternative zum Emulsionsreaktor wird im folgenden Kapitel
dargestellt.
1 Hier sei insbesondere auf die Einstellung verschiedener Verteilungsgleichgewichte für Lösungsmittel
und Reaktanden im Verlaufe des ersten Batch hingewiesen.
102

9.3. Batchreaktor mit membranunterstütztem Phasenkontakt
9.3. Batchreaktor mit membranunterstütztem
Phasenkontakt
Die vorhergehenden Kapitel haben gezeigt, dass die Benzaldehydlyase grundsätzlich
in einem Zweiphasensystem einsetzbar ist. Der für den Stofftransport nötige Phasenkontakt
wurde dabei durch Bildung einer Emulsion, d.h. durch direktes, intensives
Mischen beider Phasen hergestellt. Diese Vorgehensweise brachte jedoch auch einige
Probleme mit sich.
• Mangelnde Reproduzierbarkeit
• Bildung einer stabilen Emulsion
• Hohe Enzymdesaktivierung bei Maßstabsvergrößerung (upscaling)
Beim Versuch der Maßstabsvergößerung des Emulsionsreaktors (> 50 mL) wurde eine
rasche Enzymdesaktivierung beobachtet. Die Halbwertszeit der BAL lag bei diesen
Versuchen in der Größenordnung von 30 min. Die Hauptursache der bei den Emulsionen
entstehenden Probleme dürfte mit den unvorhersagbaren und mit der Zeit veränderlichen
Grenzflächenverhältnissen sowie mit den unterschiedlichen Durchmischungsgraden
zusammenhängen. In der Technik stehen verschiedene Lösungen zur Trennung
von Emulsionen zu Verfügung, wie z. B. der Mixer-Settler oder die Kontifuge. Eine
Möglichkeit, den Stofftransport zwischen den Phasen zu ermöglichen und dabei eine
Emulsionsbildung zu vermeiden, ist ein membranunterstützter Phasenkontakt. Dabei
werden die Phasen durch eine mikroporöse Membran von einander getrennt. Die Porengöße
der Membranen wird dabei so gewählt, dass die Phasen zwar innerhalb der
Poren in Kontakt treten können, sich aber nicht miteinander vermischen. Auf diese
Weise werden die Scherkräfte auf ein Minimum reduziert und eine Phasentrennung
ist nicht mehr nötig. Abbildung 9.7 auf der nächsten Seite zeigt den schematischen
Aufbau des Reaktors zur Maßstabsvergrößerung im Zweiphasensystem.
Für den Aufbau des Reaktors wird ein Celgard X50 Hohlfasermodul (Liquicel Minimodul)
verwendet. Die mikroporöse Membran aus Polypropylen weist eine Porengrösse
von 300 µm auf. Die Anordnng der Membran in einem Hohlfasermodul hat
den Vorteil eine große Membranfläche in begrenztem Volumen unterzubringen. Das
verwendete Modul weist eine Membranfläche von 50 cm 2 pro cm 3 auf. Durch die modulare
Bauweise gelingt eine Maßstanbsvergößerung leicht durch das Parallelschalten
mehrerer Module. Die wässrige und organische Phase werden im Gegenstrom durch
das Modul geführt. Dabei passiert die wässrige Phase die Lumen-Seite 2 des Moduls,
da hier eine laminare Strömung möglich ist, was die physikalische Belastung des Enzyms
minimiert. Eine Druckkontrolle auf beiden Seiten des Moduls ist wichtig, da
Druckdifferenzen zu einem Phasendurchbruch im Modul führen. Der Reaktor wird als
Satzreaktor betrieben, wobei die Strömungsgeschwindigkeiten beider Phasen gleich
sind. Abbildung 9.8 auf der nächsten Seite zeigt den zeitabhängigen Verlauf der Konzentrationen
in der organischen Phase (links) und des Umsatzes (rechts).
2 Innere Kanäle der Hohlfasern.
103

9. Biotransformationen im Zweiphasensystem
Konzentration / mM
wässrige Phase
P
P
org. Phase
Abbildung 9.7.: Prinzip eines Reaktors mit membranunterstütztem Phasenkontakt.
25
20
15
10
5
Benzaldehyd
Benzoin
2-HPP
organische Phase
0
0 5 10 15
Zeit / h
20 25 30
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Umsatz
0,0
0 5 10 15
Zeit / h
20 25 30
Abbildung 9.8.: Batchreaktor zur BAL-katalysierten HPP-Bildung im Zweiphasensystem.
Wässige Phase: 50 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,5 mM
MgSO4,0,5mMThDP,E0 =8UmL −1 ,V=50mL,F=50mLh −1 ,
T=20 ◦ C. Organische Phase: 20 mM Benzaldehyd, 60 mM Acetaldehyd,
V = 50 mL, F = 50 mL h −1 , Lösungsmittel: MTBE.
104
Umsatz / -
wäss. Phase
org. Phase
Enzym
Membran

9.4. Racematspaltung von Benzoin
Der grundsätzliche Verlauf der Konzentrationen entspricht dem im Emulsionsreaktor
(vgl. Abbildung 9.3). Auch im Falle des membranunterstützten Phasenkontakts
bleibt die Benzoinkonzentration während der gesamten Versuchsdauer auf niedrigem
Niveau. Bei einem Umsatz von 75 % wird die organische Phase durch eine frische Substratlösung
ausgetauscht, was der Vorgehensweise beim Repetitive Batch entspricht.
Die wässrige Phase, die auch das Enzym und die Cofaktoren enthält, verbleibt im
Reaktor. Die im zweiten Batch erneut einsetzende HPP-Bildung zeigt an, dass das
Enzym auch nach 24 h im Reaktor noch aktiv ist. Dies entspricht einer deutlichen
Steigerung der Enzymstabilität im Vergleich zum Emulsionsreaktor im gleichen Maßstab.
Die Stabilität des Moduls gegenüber MTBE stellte sich als limitierender Parameter
für den in Abbildung 9.8 gezeigten Versuch heraus. Nach einer Versuchsdauer von
ca. 30 h beendet eine Leckage am Modul den Versuch. Wie sich nach Rücksprache
mit dem Hersteller herausstellte, weisen die verwendeten Klebstoffe eine mangelnde
Stabilität gegenüber MTBE auf. Dennoch kann dieser Versuch als Bestätigung für
den membranunterstützten Phasenkontakt als Methode der Wahl bei Maßstabsvergrößerung
von Biotranformationen im Zweiphasensystem bewertet werden. Bei der
Herstellung größer dimensionierter Module werden keine Klebstoffe sondern physikalische
Methoden (z.B. Schweißen, Pressen) verwendet, wodurch das bei den kleinen
Modulen beobachtete Problem vermieden wird 3 .
9.4. Racematspaltung von Benzoin
Im Gegensatz zur HPP-Bildung ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd, bei
der das Benzoin nur als Intermediat in kleinen Konzentrationen vorkommt, wird es
bei der Racematspaltung als Substrat eingesetzt (Abbildung 9.9).
O
OH
rac-Benzoin
O
O BAL
+ 2 + 2
H
OH
Acetaldehyd
(S)-Benzoin
ee > 99%
O
OH
(R)-2-HPP
ee > 99%
Abbildung 9.9.: BAL-katalysierte kinetische Racematspaltung von Benzoin.
Wie in Kapitel 3.4.2 auf Seite 27 gezeigt wurde, ist bei einem DMSO Gehalt von
30 vol% eine maximale Benzoinkonzentration von 1,5 mM erreichbar. Zur Vermeidung
grosser Reaktionsvolumina und geringer Raum-Zeit-Ausbeuten sind jedoch höhere
Substratkonzentrationen wünschenswert. Daher stellt die BAL-katalysierte Ra-
3 Dr. Schneider, Firma Celgard (2003), Persönliche Mitteilung.
105

9. Biotransformationen im Zweiphasensystem
cematspaltung von Benzoin ein interessantes Reaktionssystem für die Anwendung des
organisch-wässrigen Zweiphasensystems dar.
9.4.1. Charakterisierung der Racematspaltung
Da über die BAL-katalysierte Racematspaltung bislang nur sehr wenig bekannt ist,
soll diese Reaktion zunächst für das homogene Reaktionssystem charakterisiert werden.
Dazu werden die in Kapitel 3 entwickelten Reaktionsbedingungen eingestellt.
Abbildung 9.10 links zeigt den zeitabhängigen Konzentrationsverlauf der beteiligten
Reaktionspartner. In Abbildung 9.10 rechts ist der ee für (S)-Benzoin und (R)-2-
Hydroxy-1-phenylpropanon als Funktion des Umsatzes aufgetragen.
Konzentration / mM
1,6
1,4
1,2
Benzaldehyd
2-HPP
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Benzoin
Simulation
0,0
0 2 4 6 8 20 25 30
Zeit / h
ee/ -
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
(S)-Benzoin
(R)-2-HPP
0,0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Umsatz / -
Abbildung 9.10.: Kinetische Racematspaltung von Benzoin. Bedingungen: 1,5 mM
Benzoin, 60 mM Acetaldehyd, 35 mM TEA-Puffer, pH = 8,
0,35 mM Mg 2+ , 0,35 mM ThDP, 30 vol% DMSO, E0 =
1,5 U mL −1 ,V=2mL,T=20 ◦ C.
Der Verlauf der Konzentrationen kann unter Zugrundelegung des in Kapitel 5.1.2
entwickelten Modells erklärt werden. Zu Beginn der Reaktion reagiert das (R)-Benzoin
mit Acetaldehyd unter Abspaltung von Benzaldehyd zu 2-HPP. Der Anstieg der Konzentrationen
von HPP und Benzaldehyd ist zu Beginn der Reaktion nahezu identisch.
Dies zeigt, dass auch in diesem Fall bei hoher Akzeptorkonzentration (Acetaldehyd)
keine Abreaktion des Benzoins im Sinne der Benzoinspaltung erfolgt, was ein schnelleres
Ansteigen der Benzaldehydkonzentration zur Folge hätte. Der gebildete Benzaldehyd
stellt wiederum ein Substrat für die BAL dar und reagiert mit Acetaldehyd
ebenfalls zu 2-HPP. Am Ende der Reaktion ist das eingesetzte (R)-Benzoin nahezu
vollständig in 2-HPP überführt. Da das Enzym nur das (R)-Enantiomer des Benzoins
umsetzen kann, wird die Benzoinkonzentration im Laufe der Reaktion halbiert. Die
HPP-Konzentration entspricht aufgrund der Stöchiometrie dann der Anfangskonzentration
von Benzoin. Eine Simulation der Konzentrationsverläufe gelingt anhand der
in Kapitel 4 bestimmten kinetischen Parametern.
106

9.4. Racematspaltung von Benzoin
Da das Benzoin bei dieser Reaktion als Racemat eingesetzt wird, liegt der ee für
das (S)-Benzoin zu Beginn der Reaktion bei null (Abbildung 9.10 rechts). Mit fortschreitender
Reaktion wird das (R)-Benzoin nach und nach zu 2-HPP umgesetzt. Das
bedeutet, dass im Laufe der Reaktion der Enantiomerenüberschuss für (S)-Benzoin
ansteigt. Bei einem Umsatz von 50 % ist nahezu alles (R)-Benzoin abreagiert und der
ee für (S)-Benzoin erreicht 99 %. Bemerkenswert ist, dass der maximale ee von > 99 %
ziemlich genau bei einem Umsatz von 50 % erreicht wird. Dies ist ein Zeichen für die
ausgesprochen hohe Enantioselektivität der BAL. Der Enantiomerenüberschuss der
(R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon liegt von Beginn an bei > 99 % da das HPP ausschließlich
durch die enzymatische Reaktion mit hoher Enantioselektivität gebildet
wird.
9.4.2. Racematspaltung im Zweiphasensystem
Um die Anwendbarkeit des Zweiphasensystems für die enzymatische Racematspaltung
von Benzoin zu überprüfen, wird eine Batchreaktion im Emulsionsreaktor durchgeführt,
da dieser Reaktortyp einen wesentlich geringeren apparativen Aufwand erfordert.
Abbildung 9.11 zeigt den zeitabhängigen Konzentrationsverlauf der beteiligten
Reaktionspartner in der organischen Phase.
Konzentration / mM
10
8
6
4
2
Benzoin
Benzaldehyd
2-HPP
0
0 2 4
Zeit / h
6 20 22
Abbildung 9.11.: BAL-katalysierte Racematspaltung von Benzoin im Zweiphasensystem.
Wässrige Phase: 35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM
Mg 2+ ,0,35mMThDP,30vol%DMSO,E0 =10UmL −1 ,V=
2mL,T=20 ◦ C. MTBE Phase: 10 mM Benzoin, 60 mM Acetaldehyd,
V = 2 mL. Die Datenpunkte sind durch visuelle Hilfslinien
verbunden.
Der prinzipielle Verlauf der Konzentrationen gleicht dem im homogenen System.
Es ist jedoch möglich, im Zweiphasensystem eine deutlich höhere Benzoinkonzentra-
107

9. Biotransformationen im Zweiphasensystem
tion einzusetzen. Die Grenzlöslichkeit von Benzoin in MTBE liegt bei etwa 30 mM.
Im Verlauf der Untersuchungen hat sich gezeigt, dass eine signifikante Reaktionsgeschwindigkeit
erst durch Zusatz von DMSO zur Wasserphase erreicht wird. Dies kann
dadurch erklärt werden, dass aufgrund des hohen log P Wertes für Benzoin die in
der Wasserphase resultierende Restkonzentration an Benzoin zu niedrig ist 4 .Durch
DMSO-Zusatz zur Wasserphase wird deren Hydrophobizität gesteigert, was eine höhere
Benzoinkonzentration in der Wasserphase bewirkt. Inwieweit das DMSO durch
die organische Phase aus der wässrigen Phase extrahiert wird, wurde nicht untersucht,
ist aber zu einem gewissen Grad zu erwarten. Für die Steigerung der Hydrophobizität
der wässrigen Phase sind daher hydrophilere Lösungsvermittler zu empfehlen, wie z.B.
Cyclodextrine (Zelinski & Kula, 1997; Janzen, 2002).
Die im homogenen System gemessenen maximalen Enantiomerenüberschüsse können
für das Zweiphasensystem bestätigt werden. Das in Abbildung 9.11 gezeigte Ergebnis
bestätigt die Anwendbarkeit des organisch-wässrigen Zweiphasensystems für
die enzymatische Racematspaltung von Benzoin. Eine Optimierung des Systems hinsichtlich
der Parameter Enzymkonzentration, Enzymverbrauch und Stoffübergang ist
wünschenswert, würde jedoch den Rahmen dieser Arbeit sprengen.
9.4.3. Zusammenfassung
• Die Verteilungskoeffizienten für 2-HPP, Benzoin und Benzaldehyd in einem
organisch-wässrigen Zweiphasensystem mit tert-Butylmethylether bzw. Diisopropylether
als organische Phase wurden bestimmt.
• Im Verlaufe eines Batchversuchs zur HPP-Bildung im Zweiphasensystem
wird nahezu kein Benzoin gebildet.
• Die Benzaldehydlyase zeigt beim Repetitive Batch zur HPP-Bildung im
Emulsionsreaktor eine Halbwertszeit von 18 h (MTBE) bzw. 22 h (DIPE).
• Durch ein Reaktorkonzept mit membranunterstütztem Phasenkontakt
können die durch die Emulsion sowie bei der Maßstabsvergrößerung auftretenden
Probleme minimiert werden. Durch den modularen Aufbau der Membranen ist
ein scale-up über den gezeigten Maßstab von 50 mL möglich.
• Das Zweiphasenssystem ist ein geeignetes Reaktionsmedium für die enzymatische
Racematspaltung von Benzoin.
4 Im vorliegenden Fall liegt bei einer Konzentration von 10 mM Benzoin in der MTBE-Phase die
Benzoinkonzentration in der wäßrigen Phase bei 0,075 mM.
108

Teil IV.
Diskussion und Ausblick
109

10. Diskussion und Ausblick
10.1. Homogene Reaktionsmedien
Ein Schwerpunkt bei der Charakterisierung des Reaktionssystems lag auf den Untersuchungen
zum Einfluss von DMSO. Es zeigte sich, dass ein DMSO Anteil von 20
- 30 vol% im Reaktionsmedium die Enzymstabilität signifikant erhöht. Von Demir
et. al. wurde eine Begünstigung der Bildung von Acyloinen durch Zusatz von DMSO
beschrieben (Demir et al., 2002). Janzen konnte in ihrer Dissertation allerdings keine
Steigerung der Ligaseaktivität der Benzaldehydlyase durch DMSO feststellen (Janzen,
2002). Die Beobachtung von Demir könnte durch eine gesteigerte Enzymstabilität erklärt
werden. Darüber hinaus ist zu berücksichtigen, dass sich der pH-Wert des von
Demir et. al. verwendeten Phosphatpuffers (pH = 7) bei DMSO Zusatz erhöht, was
eine Steigerung der Enzymaktivität zur Folge hat.
Für die kinetische Untersuchung wurde das Reaktionssystem in Einzelreaktionen
aufgeteilt. Mit Hilfe der Einzelreaktionen und auf Basis der erhaltenen Ergebnisse
wurde das in Abbildung 10.1 gezeigte Modell für die HPP-Bildung ausgehend von
Benzaldehyd und Acetaldehyd entwickelt. Anhand des Modells und der im Experiment
bestimmten kinetischen Parameter kann sowohl die HPP-Bildung als auch die
Racematspaltung von Benzoin im Batchreaktor simuliert werden. Die Frage, ob bei
der HPP-Bildung Benzoin als Intermediat auftritt oder ob eine direkte Reaktion von
Benzaldehyd und Acetaldehyd stattfindet, kann aus kinetischer Sicht und nach derzeitiger
Ergebnislage dahingehend beantwortet werden, dass beide Wege möglich sind.
Es handelt sich hierbei trotz der Aufteilung des Reaktionssystems in Einzelreaktionen
um einen makrokinetischen Ansatz, denn aus mikroskopischer Sicht sind die
Reaktionen nicht voneinander entkoppelt. Soll zum Beispiel die Bildung von HPP
ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd untersucht werden, ist die gleichzeitige
Bildung von Benzoin durch Selbstkondensation des Benzaldehyds nicht vermeidbar.
Die erfolgreiche Simulation des Batchreaktors zeigt zwar, dass das entwickelte Modell
eine Möglichkeit zur Beschreibung des System darstellt, was aus reaktionstechnischer
Sicht auch vollkommen befriedigend ist, jedoch bleibt der Beweis für die Richtigkeit
des zugrundegelegten Mechanismus weiter offen. Für weitererführende Arbeiten in
denen der Mechnismus aufgeklärt werden soll sind zwei Ansätze denkbar. Einmal die
direkte Untersuchung der Intermediate, die aus der Reaktion der Substrate mit dem
Cofaktor Thiamindiphosphat entstehen (vergleiche Abbildung 4.1 auf Seite 36, 1 -
4). Denkbar sind hier spektroskopische Methoden, wie z. B. die Infrarospektroskopie.
Alternativ dazu ist für weitere kinetische Untersuchungen die Anwendung spezieller
Substrate denkbar. Beipielsweise könnten bei den Untersuchungen selektive Donoren
111

10. Diskussion und Ausblick
O
H
O
O
H
Benzoinkondensation
H
O
OH
O
H
BAL
ThDP / Mg 2+
HPP-Bildung
Racematspaltung
Abbildung 10.1.: Modell für die Simulation der HPP-Bildung.
und Akzeptoren eingesetzt werden, die keine Selbstkondensation zulassen. Dünkelmann
konnte zeigen, dass bei der Benzoinbildung durch Verwendung selektiver Donoren
und Akzeptoren gemischte Benzoine selektiv zugänglich sind (Dünkelmann et al.,
2002).
Durch Einsatz der BAL im kontinuierlich betriebenen Enzym-Membran-Reaktor
kann eine sehr gute Ausnutzung des Katalysators und des zur Verfügung stehenden
Reaktorraumes erzielt werden. Dem Enzym-Membran-Reaktor liegt das Prinzip des
CSTR zugrunde. Durch die Charakteristik dieses Reaktortyps ist es möglich, die Synthese
von HPP ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd durchzuführen, ohne
dass eine Präzipitation von Benzoin im Reaktor befürchtet werden muss. Wie die kinetischen
Untersuchungen gezeigt haben, kann die HPP-Bildung auch über Benzoin
als Intermediat laufen. Dies kann als Folgereaktion betrachtet werden, wobei es sich
bei dem Endprodukt um das gewünschte Produkt handelt. Auch für diesen Fall ist
der CSTR der geeignete Reaktortyp. Nachteilig wirkt sich im CSTR die Produktinhibierung
durch HPP aus.
Hinweis auf die allgemeine Anwendbarkeit dieses Reaktorkonzepts gibt die erfolgreiche
kontinuierliche Synthese von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon im EMR.
Für folgende Arbeiten ist die Ausdehnung dieses Konzepts auf weitere Produkte denkbar.
Von besonderem Interesse ist hier die Verwendung von MTBE als Cosolvent an
Stelle von DMSO, da die Produktaufarbeitung dadurch erheblich vereinfacht ist. Dabei
muss die Synthese nicht auf der Stufe des Hydroxyketons enden. Im gleichen
Zeitraum, in dem diese Arbeit entstand, konnte Villela zeigen, dass Alkoholdehydrogenasen
(ADHs) ebenfalls eine hohe Stabilität in Gegenwart von MTBE aufweisen
(Villela et al., 2003). Diese Kompatibilität der Reaktionsmedien kann in einer kontinuierlichen,
mehrstufigen Synthese ausgenutzt werden, denn die durch die BAL-Katalyse
112
O
H
O
OH

10.2. Reaktionen im Zweiphasensystem
erhaltenen 2-Hydroxyketone stellen wiederum Substrate für Alkoholdehydrogenasen
dar. Diese Enzyme sind in der Lage die Carbonylfunktion enantioselektiv zur Hydroxyfunktion
zu reduzieren, wodurch 1,2-Diole diastereoselektiv zugänglich werden.
Die Durchführbarkeit dieses Konzepts wurde bereits von Kihumbu gezeigt (Kihumbu
et al., 2002). In den Arbeiten von Kihumbu wird im ersten Schritt die Benzoylformiatdecarboxylase
(BFD) eingesetzt, die die Bildung von (S)-HPP ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd katalysiert. Die BFD benötigt hohe Acetaldehydkonzentrationen
(>300 mM) um eine ausreichende Carboligaseaktivität zu entwickeln (Iding et al.,
2000). Der im großen Überschuss eingesetzte Acetaldehyd muss vor der enzymatischen
Reduktion im zweiten Schritt aus dem Reaktionsmedium entfernt werden, was einen
nicht unerheblichen apparativen Aufwand erfordert. Für die BAL ist weder aus kinetischer
noch aus thermodynamischer Sicht ein hoher Überschuss an Acetaldehyd
notwendig. Eine aufwendige Trennstufe kann vor der enzymatischen Reduktion des
durch Carboligation gebildeten 2-Hydroxyketons entfallen, was den Einsatz der BAL
in diesem System besonders interessant macht. Die komplementäre Enantioselektivität
von BAL und BFD ermöglichen darüber hinaus eine Steuerung der Konfiguration am
betreffenden Chriralitätszentrum. Das Prinzip der Diolsynthese ist in Abbildung 10.2
dargestellt.
O
H
O
H +
BAL ADH
O
H
BAL
O
O
OH
OH OH
ThDP OH
OH NAD(P)H
OH
O
ADH
Abbildung 10.2.: Zweistufige, kontinuierliche Synthese von Diolen ausgehend von
Benzaldehyd und Acetaldehyd in wässriger Lösung.
10.2. Reaktionen im Zweiphasensystem
Im dritten Teil der Arbeit wird der Einsatz der BAL in nichtkonventionellen Reaktionsmedien
untersucht. Aufgrund der geschilderten Vorteile kommt das organisch /
wässrige Zweiphasensystem zur Anwendung. Der Schwerpunkt der Arbeiten lag auf
der Suche nach einem geeignetem Lösungsmittel. Ein weitverbreitetes und allgemein
akzeptiertes Konzept für die Beurteilung von Lösungsmitteln mit Hinblick auf deren
Kompatibilität in Kombination mit Biokatalysatoren ist das so genannte „log P-
OH
113

10. Diskussion und Ausblick
Konzept”. Der dabei entscheidende Parameter ist die Polarität des Lösungsmittels,
die durch den log P-Wert des Solvents quantifiziert wird. Das Konzept besagt, dass je
niedriger die Polarität ist, desto geeigneter ist das Lösungsmittel für den Einsatz bei
der Biokatalyse. Dieses Konzept konnte bei den Untersuchungen zur Benzaldehydlyase
nicht bestätigt werden. Es zeigte sich, dass eine gute Enzymstabilität in Kombination
mit offenkettigen Ethern erreicht wird, die kurzkettige, aliphatische Seitenketten
tragen.
Parallel zur BAL wurde im Rahmen dieser Arbeit ein weiteres thiamindiphosphat
abhängiges Enzym, die Pyruvatdecarboxylase (PDC), im Lösungsmittelscreening eingesetzt.
Die Ergebnisse sollen im folgenden gezeigt und diskutiert werden. Die experimentelle
Vorgehensweise wird in Kapitel 12 beschrieben. Die Auswertung erfolgte
analog zur Stabilitätsmessungen der BAL 1 . Abbildung 10.3 zeigt die Halbwertszeiten
der PDC in Kombination verschiedener Lösungsmittel. Die Lösungsmittel sind nach
steigendem log P-Wert sortiert.
Halbwertszeit / h −1
2000
1500
1000
500
log P
0
0h 5h
0,4
O
0,7 0,8
O
OEt
912h
O
300h 379h
1,0 1,4
O
O
1h 63h 4h 8h
1,7
HCCl 3
2,5 2,5 2,6
2166h
2,6
( ) 6 OH
O
( ) 3 ( ) 3
22h
2,9
660h
Abbildung 10.3.: Halbwertszeiten der PDC im organisch / wässrigen Zweiphasensystem.
Auch bei der PDC bewirken Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran, Essigsäureethyles-
1 Vgl. Kapitel 8.1 auf Seite 89.
114
3,4
( ) 3

10.3. Vergleich zwischen einphasiger und zweiphasiger Reaktionsführung
ter, Chloroform, die Aliphaten Cyclohexan und Isohexan sowie das aromatische Toluol
eine rasche Enzymdesaktivierung. In Analogie zur BAL kann für die PDC durch
Verwendung von tert-Butylmethylether, Diisopropylether und Dieethylether als organische
Phase eine höhere Enzymstabilität erreicht werden. Darüber hinaus zeigt das
Enzym auch in Gegenwart von 1-Oktanol und n-Heptan eine hohe Stabilität. Auch
diese beiden Verbindungen zeichnen sich durch ein gemeinsames Strukturmerkmal
aus. Beide Moleküle verfügen über eine lange, unverzweigte Kohlenwasserstoffkette.
Die gemessenen Enzymstabilitäten der PDC können nicht als Funktion des log P-
Wertes beschrieben werden. Im Kontrollexperiment zeigt die PDC eine Halbwertszeit
von 1330 h. Die bei der BAL für viele Lösungsmittel beobachtete Stabilisierung durch
Anwesenheit organischer Lösungsmittel kann bei der PDC nur für 1-Oktanol beobachtet
werden.
Villela konnte für die Alkoholdehydrogenasen aus Pferdeleber (HLADH), aus Thermoanaerobium
brockii (TBADH) und aus Lactobacillus brevis (LBADH) ein analoges
Verhalten beobachten (Villela, 2003). Diese drei Enzyme zeigen in einem wässrig /
organischen Zweiphasensystem mit Diethyleter, tert-Butylmethylether und Diisopropylether
als organische Phase die höchste Stabilität, wo hingegen aromatische und
aliphatische Kohlenwasserstoffe sowie halogenierte Lösungsmittel sich als ungeeignet
erwiesen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen zur BAL konnte auch Villela keine
Korrelation zwischen dem log P-Wert des getesteten Lösungsmittels und der Stabilität
der Alkoholdehydrogenasen herstellen. Vielmehr kann auch in diesem Fall die Eignung
eines Lösungsmittels anhand der Funktionalität, in diesem Falle ebenfalls offenkettige
Ether mit kurzen, aliphatischen Seitenketten, festgemacht werden.
Auf Basis dieser Ergebnisse ist ein Paradigmenwechsel vorzuschlagen. Ein einzelner
physikalisch-chemischer Parameter scheint für eine Quantifizierung der komplexen
Verhältnisse, die zur Enzymdesaktivierung im Zweiphasensystem führen, nicht auszureichen.
Daher scheitern Vorhersagen über die Biokompatibilität eines Lösungsmittels,
wenn sie anhand des log P-Wertes des Solvents getroffen werden. Vielmehr sollten solche
Vorhersagen auf einer breiteren Basis mehrerer Parameter getroffen werden. Nach
den derzeitigen Ergebnissen scheint die Funktionalität eine geeignete Zusammenfassung
wichtiger Parameter darzustellen und sollte daher als Schlüsselparameter bei der
Suche nach biokompatiblen Lösungmitteln dienen.
10.3. Vergleich zwischen einphasiger und
zweiphasiger Reaktionsführung
Zum Abschluss dieses Kapitels werden die beiden in dieser Arbeit untersuchten Reaktionssysteme
verglichen. Dabei muss berücksichtigt werden, dass die Untersuchungen
zum Zweiphasensystem einen mehr grundlegenden Charakter haben und eine Optimierung
des Systems noch aussteht. Tabelle 10.1 auf der nächsten Seite gibt einen
Überblick über die bei den Untersuchungen deutlich gewordenen Unterschiede zwischen
dem homogenen Reaktionsmedium und dem Zweiphasensystem.
115

10. Diskussion und Ausblick
Parameter homogenes System Zweiphasensystem
Reaktionsgeschwindigkeit + –
Katalysatorimmobilisierung – +
Katalysatorretention ◦ +
Enzymstabilität + –
scale up + ◦
Produktaufarbeitung ◦ +
schwerlösliche Substrate – +
+ = vorteilhaft, – = nachteilig, ◦ = aufwändig2 Tabelle 10.1.: Vergleich zwischen homogenem Reaktionssystem und
Zweiphasensystem.
In einem Zweiphasensystem werden die Konzentrationsverhältnisse der beteiligten
Reaktionspartner durch ihre Verteilungskoeffizienten bestimmt. Bei den in dieser Arbeit
eingesetzten Substraten handelt es sich um hydrophobe Verbindungen, die sich
bevorzugt in der organischen Phase aufhalten. Die geringere Substratkonzentration in
der wässrigen Phase führt zu einer erniedrigten Reaktionsgeschwindigkeit, so dass die
Substratkonzentration niedriger als das zweifache des KM-Werts ist. In weiterführenden
Arbeiten sollte daher die höhere Löslichkeitsgrenze dieser Verbindungen in organischen
Lösungsmitteln ausgenutzt und mit stark gesteigerten Substratkonzentrationen
gearbeitet werden. Dadurch resultiert auch in der wässrigen Phase eine höhere Substratkonzentration,
wodurch sich die Reaktionsgeschwindigkeit steigern lässt. Dabei ist
nicht nur die Grenzlöslichkeit der Komponenten in der organischen Phase von Bedeutung,
sondern auch die Charakterisierung des Stoffübergangs zwischen wässriger und
organischer Phase. Eine Phasentransferlimitierung kann die Reaktionsgeschwindigkeit
im Zweiphasesystem beeinträchtigen. Auch dies sollte bei weiterführenden Arbeiten
berücksichtigt werden.
Für eine Immobilisierung im homogenen Reaktionssystem ist das Anbinden des
Katalysators an einen Träger oder zumindest die Absorption auf eine geeignete Oberfläche
nötig. Dies kann im Zweiphasensystem entfallen, da hier der Katalysator in der
wässrigen Phase immobilisiert ist. Wie in Teil 2 dieser Arbeit gezeigt wurde, gelingt
im homogenen System die Katalysatorretention durch den Einsatz von Membrantechnik.
Für das Zweiphasensystem ist ein kontinuierlicher Prozess denkbar, in dem nur
2 Diese Einschätzung wurde durch Vergleich der Methoden für den Einsatz im Labormaßstab getroffen.
Für den Pilot- oder Produktionsmaßstab sollte aufgrund der dann geänderten Bedingungen
und Vorraussetzungen eine neue Einschätzung erfolgen.
116

10.3. Vergleich zwischen einphasiger und zweiphasiger Reaktionsführung
die organische Phase kontinuierlich geführt wird. Die wässrige Phase und der darin
immobilisierte Katalysator kann stationär gehalten werden. Interessant ist diese Vorgehensweise
für mehrstufige enzymatische Synthesen, bei denen die organische Phase
als „kontinuierliches Band” nacheinander mit wässrigen Phasen in Kontakt gebracht
wird, in denen die für den jeweiligen Syntheseschritt nötigen Enzyme immobilisiert
sind. Ein interessantes Beispiel für eine solche Synthese im Zweiphasensystem ist die
BAL-katalysierte Carboligation in Kombination mit ADH katalysierten Reduktion
der gebildeten Ketone. Der zweite Schritt dieser Synthese wurde von Villela im Rahmen
seiner Dissertation untersucht. Abbildung 10.4 zeigt schematisch den Ablauf der
zweistufigen Diolsynthese im Zweiphasensystem.
organische Phase
O
H
O
H
BAL
ThDP
O
OH
LBADH
NADPH
wässrige Phase wässrige Phase
Abbildung 10.4.: Zweistufige, kontinuierliche Synthese von Diolen ausgehend von
Benzaldehyd und Acetaldehyd im Zweiphasensystem.
Tabelle 10.2 auf der nächsten Seite zeigt die Stabilitäten der BAL in den untersuchten
Reaktionsmedien. Interessant ist ein Vergleich der Prozesstabilität im Reaktionsmedium
Puffer/MTBE (homogen) und im Zweiphasensystem. In beiden Systemen
ist die Wasserphase bis zur Sättigung mit MTBE angereichert. Die Stabilitäten unterscheiden
sich aber um annähernd Faktor drei. Es muss also im Zweiphasensystem
ein zusätzlicher Parameter existieren, der die stärkere Enzymdesaktivierung bewirkt.
Für weiterführende Arbeiten sind daher Untersuchungen in diese Richtung zu empfehlen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein membranunterstützter
Phasenkontakt viele Probleme, die im Emulsionsreaktor entstehen, minimiert, was als
Hinweis für nachfolgende Arbeiten dienen kann.
In Teil 2 dieser Arbeit wurden für die HPP-Synthese ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd im homogenen Reaktionssystem Enzym-Membran-Reaktoren mit 3
und 10 mL Reaktorvolumen verwendet. Ein Einfluss des verwendeten Reaktorvolumens
auf das Enzym oder das Reaktionssystem wurde nicht beobachtet. Daher sollte
ein weiteres scale up durch Vergrößerung des Reaktorraums im homogenen System
möglich sein. Im Zweiphasensystem bewirkte eine Maßstabsvergrößerung im Emul-
OH
OH
117

10. Diskussion und Ausblick
Lagerstabilität (4 ◦ C) Prozeßstabilität (20 ◦ C)
Puffer/DMSO (homogen) 2475 h 101 h
Puffer/MTBE (homogen) 1117 h 51 h
Puffer/MTBE (Zweiphasensystem) 815 h 17 h
Tabelle 10.2.: Übersicht über die Halbwertszeiten der BAL in den untersuchten Reaktionsmedien.
sionsreaktor eine rasche Enzymdesaktivierung. Auch hier gelang es durch den Einsatz
von Membrantechnik einen Zweiphasenreaktor zur HPP-Bildung im vergrößerten
Maßstab über einen Zeitraum von 30 h zu betreiben. Limitiert wurde die Versuchsdauer
durch mangelnde Stabilität der verwendeten Membranmodule gegenüber dem
Reaktionsmedium. Für weiterführende Arbeiten ist daher die Suche nach neuen Materialien
zu empfehlen. Der Vorteil einer modularen Bauweise liegt in der Möglichkeit
zur Maßstabsvergrösserung durch Parallelschalten mehrerer Module. Eine ausgesprochene
Stärke des Zweiphasensystem liegt in der erleichterten Produktaufarbeitung,
die lediglich eine Phasentrennung erfordert.
Eine endgültige Entscheidung über die Wahl eines Reaktionsmediums sollte anhand
der Substratlöslichkeit in Wasser festgemacht werden. Für leichtlösliche Substrate bietet
sich das homogene Reaktionsmedium an. In Wasser schwerlösliche Substrate werden
durch den Einsatz eines Zweiphasensystem der Biokatalyse zugänglich.
118

11. Zusammenfassung
Die enantioselektive Knüpfung von Kohlenstoff - Kohlenstoff Bindungen in wässriger
Lösung stellt eine zentrale Herausforderung in der chemischen Synthese dar. Durch den
Einsatz Thiamindiphosphat-abhängiger Enzyme lässt sich die elegante, konvergente
Syntheseroute über die C-C Bindungsbildung zu chiralen 2-Hydroxyketonen mit den
für die Enzymkatalyse charakteristischen milden Reaktionsbedingungen kombinieren.
Das divergente Reaktionssystem der Benzaldehydlyase (BAL) aus Pseudomonas fluorescens
Biovar I stellt ein attraktives Ziel für eine reaktionstechnische Arbeit dar.
Ausgehend von den Substraten Benzaldehyd und Acetaldehyd sind folgende Reaktionen
möglich.
Bildung von (R)-Benzoin aus Benzaldehyd.
O
H
+
O
H
BAL/ThDP
Benzaldehyd Benzaldehyd (R)-Benzoin
ee > 99%
Spaltung von (R)-Benzoin in Benzaldehyd.
O
OH
(R)-Benzoin
BAL/ThDP
O
H
+
O
O
H
OH
Benzaldehyd Benzaldehyd
Bildung von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon ((R)-HPP) ausgehend von Benzaldehyd
und Acetaldehyd, wobei intermediär die Bildung von (R)-Benzoin beobachtet
wird 1 .
O
H
+
O
H
Benzaldehyd Acetaldehyd
(R)-Benzoin
(R)-HPP
ee > 99%
O
BAL/ThDP BAL/ThDP
OH
O
OH
119

11. Zusammenfassung
Kinetische Racematspaltung von Benzoin. Nur das (R)-Enantiomer wird durch die
BAL zu HPP umgesetzt 1 .
O
OH
rac-Benzoin
+
O
H
Acetaldehyd
BAL/ThDP
O
OH
(S)-Benzoin
ee > 99%
Bei den Untersuchungen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt.
+
O
OH
(R)-HPP
ee > 99%
• Für die BAL-katalysierte Carboligation wurden Reaktionsbedingungen entwickelt,
die sowohl eine hohe Enzymaktivität als auch eine hohe Enzymstabilität
gewährleisten (Kapitel 3).
• Für die kinetische Charakterisierung der BAL wurde das Reaktionssystem
ausgehend von den Substraten Benzaldehyd, Benzoin und Acetaldehyd in Einzelreaktionen
aufgeteilt. Die kinetischen Parameter der Reaktionen wurden bestimmt
(Kapitel 4).
• Basierend auf den Ergebnissen der kinetischen Charaterisierung konnte ein Modell
entwickelt werden, das die Simulation der Bildung von (R)-HPP ausgehend
von Benzaldehyd und Acetaldehyd in verschiedenen Reaktortypen erlaubt
(Kapitel 5).
• Der kontinuierlich betriebene Rührkessel (CSTR) erwies sich als vorteilhafter
Reaktortyp für die enzymatische (R)-HPP-Synthese. In einem Enzym-Membran-Reaktor
konnte eine maximale Zyklenzahl (ttn) von 188000 und eine
Raum-Zeit-Ausbeute von 1120 g L −1 d −1 erreicht werden (Kapitel 5).
• Das etablierte Reaktorkonzept konnte erfolgreich auf die kontinuierliche Synthese
von (R)-1-(3-Chlorphenyl)-2-hydroxypropanon ausgeweitet werden.
Für dieses Produkt wurde eine Raum-Zeit-Ausbeute von 1214 g L −1 d −1 erreicht
(Kapitel 5).
• Für begrenzt wasserlösliche Substrate der BAL bietet sich die Verwendung eines
organisch / wässrigen Zweiphasensystems an (Kapitel 7).
• In einem breit angelegten Lösungsmittelscreening zeigte die BAL eine hohe Lagerstabilität
im Zweiphasensystem, wenn offenkettige Ether mit verzweigten,
aliphatischen Seitenketten als organische Phase verwendet werden (Kapitel
8).
1 Durch einen Überschuss an Acetaldehyd kann ein vollständiger Umsatz mit quantitativer HPP-
Ausbeute erzielt werden. Eine Rückreaktion im Sinne einer HPP-Spaltung wird unter diesen
Bedingungen nicht beobachtet (vgl. Kapitel 3)
120

• Für Biotransformationen im Zweiphasensystem erwies sich ein Reaktorkonzept
mit membranunterstütztem Phasenkontakt als vorteilhaft (Kapitel
9).
121

11. Zusammenfassung
122

12. Material und Methoden
12.1. Geräte
Bruker Analytische Meßtechnik,
Rheinstetten
NMR spectrometer AMX-300
Bronkhorst B.V (Niederlande) Massenflussmesser
Büchi, Constanz, Schweiz Membranpumpen
vacubrand, Wertheim Membranpumpen
IKA Laboratoriumstechnik, Staufen Magnetrührer
Millipore YM10 Ultrafiltrationsmembranen
Verder, Düsseldorf
Hamilton (via
Zahnradpumpen
Chromatographie Service, Langerwehe) Spritzen
Werkstätten des Forschungszentrums diverse Glasgeräte
JASCO, Groß-Umstadt HPLC-Anlage
Sycam, Gauting HPLC-Anlage
Agilent Technologies, Heilbronn Gaschomatograph 6890
Amersham Pharmacia Biotech P500 Wechselkolbenpumpe
Swagelock (B.E.S.T., Köln) Klemmringverschraubung und Ventile
Celgard, Norderstedt Celgard X50 (Liquicel Minimodule)
Pharmacia LBK, Freiburg Säulen
Amicon, Düsseldorf Ultrafiltrationszelle
CS Chomatigraphieservice, Langerwehe diverse Glassgeräte
Branson, via Gerhard Heinemann
Laboratoriums-
Ausrüstung, Schwäbisch-Gemünd
Sornifiert
Beckman Coulter Zentrifuge GS15-R
Shimadzu, Duisburg Spektrophotometer UV160
Satorius, Göttingen Analysenwaage BP 211-D
Metrohm, Herisau (Schweiz) pH-Meter 691; pH-Elektrode InLab 421
Labsystems, Frankfurt Finnpipette
Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5415 D
Merck, Darmstadt LiChrosphere
250x4 mm
100 RP-8 HPLC-Säule,
Dacielle Chiracel OD-H HPLC Säule
123

12. Material und Methoden
12.2. Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien waren mindestens von analytischer Qualität (p.a.) und
wurden soweit nicht anders angegeben von Fluka, Sigma oder Merck bezogen. Die
verwendeten Aldehyde wurden als Redestillate eingesetzt und mittels Schlenk-Technik
unter Argon aufbewahrt.
Thiamindiphosphat Merck, Darmstadt
Ni-Nitrilo-tri-Essigsäure (NTA) Qiagen GmbH, Hilden
Coomassie Brilliant Blue G250 Bio-Rad, München
NAD + , NADH Jülich Fine Chemical, Jülich
12.3. Aufreinigung der Benzaldehydlyase
Bei der in dieser Arbeit verwendeten Benzaldehydlyase handelt es sich um ein rekombinantes
Protein, das als Hexahistidinfusionsprotein in E.coli überexpremiert wurde.
Die genaue Bezeichnung des Stamms lautet E.coli SG13009 / BALHIS.
Aufschlusspuffer (2 L) Waschpuffer (1 L)
50 mM KPi, pH = 7 50 mM KPi, pH = 7
2mMMgSO4
2mMMgSO4
0,1mMThDP 0,1mMThDP
50 mM Imidazol
Elutionspuffer (1 L) Entsalzungspuffer (1 L)
50 mM KPi-Puffer, pH = 7 10 mM KPi-Puffer, pH = 6,5
2mMMgSO4
2mMMgSO4
0,1mMThDP 0,1mMThDP
250 mM Imidazol
Alle Lösungen müssen vor Verwendung mit Helium entgast werden. Durch die Zugabe
von Imidazol in die Pufferlösung steigt der pH-Wert an. Im Laufe der Arbeiten
hat sich herausgestellt, dass sich nur dann befriedigende Proteinausbeuten erzielen
lassen, wenn der pH-Wert nicht wieder auf den ursprünglichen Wert gebracht wird.
Dabei ist jedoch zu beachten, dass das Enzym bei einem höheren pH-Wert eine geringere
Stabilität aufweist. Die Exposition des Enzyms in diesen Löungen sollte daher
möglichst kurz sein.
Zellaufschluss Für den Zellaufschluss werden ca. 20 g E.coli Zellenin80mLAufschlusspuffer
und einer Spatelspitze Lysozym durch vorsichtiges Rühren 40 Minuten
suspendiert. Der Aufschluss erfolgt unter Eiskühlung durch gepulsten Ultraschall (Sornifier).
Es werden 3 - 4 Intervalle (5 min) mit dazwischen liegenden Kühlintervallen
(5 min) durchgeführt. Anschließend werden die Zellfragmente durch Zentrifugation
abgetrennt (30 min, Rotor CO650, 4 ◦C, 10000 UpM).
Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) Die immobilisierte
Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) stellt einen besonderen Fall
124

12.4. Arbeitsvorschriften für das homogene Reaktionssystem
der Affinitätschromatographie dar, einer effektiven Feinreinigungsmethode, der das
Prinzip der spezifischen Wechselwirkung zwischen der Zielsubstanz und dem auf der
Matrix kovalent gebundenen Liganden zugrunde liegt. IMAC beruht auf der Fähigkeit
bestimmter Aminosäuren (insbes. Histidin) bei neutralem pH-Wert einen Chelatkomplex
mit den bivalenten Metallionen Cu 2+ ,Zn 2+ ,Ni 2+ ,Co 2+ zu bilden. Diese Methode
ermöglicht eine effektive Aufreinigung natürlicher Proteine mit hohem Histidingehalt,
wie auch von Fusionsproteinen, denen ein His-Tag angefügt wurde. Für die präparative
Reinigung wurde eine Agarosematrix mit Nitrilo-tri-Essigsäure (NTA)-Liganden
und zweiwertiges Nickel als Metallion verwendet. Durch vier chelatisierende Gruppen
gewährleistet der NTA-Ligand sehr feste Bindung mit Ni 2+ -Ionen. Die zwei freibleibenden
Koordinationsstellen der Ni 2+ -Ion werden für die Wechselwirkung mit den
Histidin-Resten benutzt.
Der Zell-Rohextrakt wird im Aufschlusspuffer auf die Säule gebracht (2 mL/min).
Die nicht bindenden Proteine werden mit Aufschlusspuffer im Durchbruch eluiert
(4 mL/min). Die unspezifische gebundenen Proteine werden mit Waschpuffer von der
Säule entfernt. Das Fusionsprotein wird mit Elutionspuffer eluiert.
Gelmatrix Ni-NTA-Agarose [Qiagen]
Flussrate 2 ml/min
Probe Rohextrakt (bis 5 mg BALHis/ml Säulenmaterial)
Gelpermeationschromatographie Die für die Gelpermeationschromatographie
verwendete Matrix Sephadex G-25 ist stark vernetzt und besitzt für den Molekulargewichtsbereich
von 1 - 5000 Dalton ein lineares Trennvermögen. Aufgrund ihrer
niedrigen oberen Ausschlussgrenze, die die Abtrennung niedermolekularer Substanzen
von Proteinen erlaubt, diente die Gelfiltration an G-25 Sephadex der Entsalzung
und Umstellung des Puffers nach der IMAC. Das Volumen der Proteinprobe ist bei
der Gelfiltration durch den Säulendurchmesser und das Volumen der Matrix limitiert.
Nach der Probenaufgabe wird das Protein mit Entsalzungspuffer eluiert. Das proteinhaltige
Eluat wird lyophylisiert und die erhaltene Proteinpräparation wird bei -20 ◦ C
gelagert.
Gelbettvolumen 950 ml (5 cm)
Probenvolumen max. 100 ml
Flussrate max. 20 ml/min
12.4. Arbeitsvorschriften für das homogene
Reaktionssystem
Für alle präparativen Ansätze sowie bei den kontinuierlichen Versuchen wurden die
verwendeten Pufferlösungen vor Gebrauch mit Helium entgast. Darüber hinaus wurde
bei den präparativen Batchreaktionen unter einer Argonatmosphäre gearbeitet.
125

12. Material und Methoden
12.4.1. Aktivitätsbestimmung (Standardassay)
Die Entwicklung des Assays zur Bestimmung der Carboligaseaktivität der Benzaldehydlyase
wurde bereits in Kapitel 3.1 auf Seite 21 behandelt. Die Substratlösung für den
Standardassay setzte sich wie folgt zusammen.
35 mM TEA-Puffer, pH = 8
0,35 mM ThDP
0,35 mM MgSO4
30 vol% DMSO
20 mM Benzaldehyd
20 ◦C Durchgeführt wurden die Assays in 4 mL Schraubdeckelgläsern (CS-Chromatographieservice).
Während der gesamten Versuchsdauer wird das Reaktionsmedium durch
einen magnetischen Rührer intensiv vermischt (700 UpM). 3 mL Substratlösung werden
vorgelegt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 mL Enzymlösung gestartet.
Es werden 3 Proben im Abstand von 2 min entnommen. Die enzymatische Reaktion
kann durch Verdünnen der Proben mit Acetonitril gestoppt werden (1:1). Die Konzentration
der Reaktionspartner wird durch HPLC-Analytik ermittelt. Um die Benzoinkonzentration
möglichst genau betimmen zu können ist darauf zu achten, dass die
Grenzlöslichkeit von Benzoin während der Versuchsdauer nicht überschritten wird.
Für die kinetischen Messungen wurde das gleiche Prinzip zugrunde gelegt. Die beteiligten
Reaktionspartner und deren Konzentrationen wurden je nach Fragestellung
variiert. Auch hier wurden alle Konzentrationen per HPLC-Analytik ermittelt.
12.4.2. Analytische Batchversuche
Die Vorgehensweise bei analytischen Batchversuchen im homogenen Reaktionssystem
wird am Beispiel der HPP-Bildung erläutert. Die Versuche wurden in 4 mL Schraubdeckelgläsern
(CS-Chromatographieservice) durchgeführt. Die Substrate Benzaldehyd
(20 mM) und Acetaldehyd (60 mM) werden in 3 mL Triethanolaminpuffer (35 mM,
pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30 vol% DMSO) bei 20 ◦ C gelöst. Die Reaktion
wird durch Zugabe von 2 U Benzaldehydlyase gestartet. Dem Reaktionssystem
werden periodisch Proben entnommen und die Konzentrationen der Reaktionspartner
sowie der Enantiomerenüberschuss werden per HPLC Analytik bestimmt. Zum
Abstoppen der enzymatischen Reaktion in den Proben werden diese mit Acetonitril
verdünnt (1:1).
12.4.3. Repetitive Batch
Der repetitive Batch wird in einer Ultrafiltrationszelle (Nennvolumen 6 mL, Flüssigkeitsvolumen
3 mL, Amicon) mit hängend angeordnetem magnetischen Rüherer
durchgeführt. Die Zelle wurde dahingehend modifiziert, dass die Gaszuleitung über
ein Dreiwegeventil erfolgt und in den Auslass ein Absperrventil (Upchurch, GAT)
126

12.4. Arbeitsvorschriften für das homogene Reaktionssystem
integriert wurde. Die Zelle mit eingelegter Ultrafiltrationsmembran wird mit Reaktionslösung
befüllt und die Reaktion durch Zugabe von Enzym gestartet. Während
der Reaktion wird die Zelle mit Druck (Argon) beaufschlagt. Dadurch ist eine Probenahme
durch periodisches Öffnen des Ventils möglich. Die Zelle wird nach Abschluss
der Reaktion bis auf ein Restvolumen (ca. 0,2 mL) entleert. Dabei ist darauf zu achten,
dass die Zelle nicht bis zur völligen Trockenheit entleert wird, um ein Verblocken
der Membran durch das Enzym zu vermeiden. Der nachfolgende Zyklus wird durch
Zugabe vom 3 mL frischer Substratlösung gestartet.
12.4.4. Präparative Batchversuche
Synthese von (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon 15,9 g (0,15 mol) Benzaldehyd
und 17,6 g Acetaldehyd (0,4 mol) werden in 5 L Pufferlösung (50 mM TEA-Puffer,
pH = 8, 0,5 mM MgSO4, 0,5 mM ThDP) gelöst. Die entgaste Pufferlösung wurde
zuvor mit MTBE gesättigt. Dabei stellt sich eine MTBE-Konzentration von ca.
5 vol% ein. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2,35 kU Benzaldehydlyase (E0 =
0,5 U/mL) gestartet und per HPLC-Analytik verfolgt. Bei einem Umsatz von 98 %
wird die wässrige Reaktionslösung dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Es konnten 18,2 g (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon als weißer
Feststoff erhalten werden. Dies entspricht einer isolierten Ausbeute von 80 %. Das Ergebnis
einer NMR-Untersuchung entspricht den Literaturwerten (Demir et al., 2002).
Der Enantiomerenüberschuss liegt bei über 99 %. Das erhaltene Rohprodukt wird in
einem letzten Aufreinigungsschritt in Isohexan umkristallisiert. Dazu wird das Rohprodukt
bei Raumtemperatur bis zur Sättigung in Isohexan gelöst und bei -20 ◦ C
auskristallisiert.
Synthese von (R)-Benzoin 3,2 g (0,03 mol) Benzaldehyd wurden in 1 L Pufferlösung
(35 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,35 mM MgSO4, 0,35 mM ThDP, 30 vol%
DMSO) gelöst. Die Reaktion wird duch Zugabe von 1 kU Benzaldehydlyase (E0 =
1 U/mL) gestartet und per HPLC-Analytik verfolgt. Bei einem Umsatz von 95 %
wird das ausgefallene Produkt durch Filtration von der Reaktionslösung abgetrennt,
mit Wasser gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 2,86 g eines weißen
Feststoffs erhalten, was einer Ausbeute von 90 % entspricht. Das Ergebnis einer
NMR-Untersuchung entspricht den Literaturwerten (Demir et al., 2002). Der Enantiomerenüberschuss
liegt bei über 99 %. Das erhaltene Rohprodukt wurde in Isohexan/Diethylether
(1:1) umkristallisiert.
Synthese von (S)-Benzoin 4,2 g (0,01 mol) rac-Benzoin und 1,7 g (0,04 mol)
Acetaldehyd werden in 0,5 L Pufferlösung (50 mM TEA-Puffer, pH = 8, 0,5 mM
MgSO4, 0,5 mM ThDP, 30 vol% DMSO) gelöst bzw. suspendiert. Die Reaktion wird
durch Zugabe von 1 kU Benzaldehydlyase (E0 = 2 U/mL) gestartet und per HPLC-
Analytik verfolgt. Bei einem Umsatz von 50 % wird das nicht umgesetzte (S)-Benzoin
durch Filtration von der Reaktionslösung abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im
Hochvakuum getrocknet. Es wurden 1,7 g eines weißen Feststoffs erhalten, was einer
Ausbeute von 83 % bezogen auf das eingesetzte (S)-Benzoin und 40 % bezo-
127

12. Material und Methoden
gen auf die eingesetzte Menge racemischen Benzoins entspricht. Das Ergebnis einer
NMR-Untersuchung entspricht den Literaturwerten (Demir et al., 2002). Der Enantiomerenüberschuss
liegt bei über 99 %. Das erhaltene Rohprodukt wurde in Isohexan/Diethylether
(1:1) umkristallisiert.
12.4.5. Kontinuierliche Versuche
Ein Fließbild des Enzym-Membran-Reaktor ist in Abbildung 5.9 auf Seite 60 gezeigt.
Die Substratlösung wird unter Argon aufbewahrt. Nach dem Einlegen der Membran
und dem Verschließen des Reaktorraums wird der Reaktor zunächst solange mit Substratlösung
gespült, bis die am Auslauf gemessene Substratkonzentration der eingestellten
Konzentration entspricht. Die Membran wird durch Zugabe von Rinder Serum
Albumin (BSA, 1 mg/mL) belegt. Die Enzymlösung wird mit Hilfe einer Spritze über
das Septum der Blasenfalle in den Reaktor eingespült. Die gewünschte Verweilzeit
wird über den Fluss eingestellt. Die Probenahme erfolgt am Auslauf des Reaktors.
Die Konzentrationen der Reaktionspartner und der Enantiomerenüberschuß werden
per HPLC-Analytik bestimmt.
12.5. Arbeitsvorschriften für das Zweiphasensystem
12.5.1. Stabilitätsuntersuchungen
Die Untersuchungen zur Stabilität der BAL im Zweiphasensystem wurden in 4 mL
Schraubdeckelgläser (CS-Chromatographieservice) durchgeführt. 5 U BAL werden in
2 mL Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH = 7, 0,5 mM ThDP, 0,5 mM MgSO4) gelöst.
Die Startaktivität wird vor der Zugabe des Lösungsmittels mittels des in Kapitel
12.4.1 auf Seite 126 beschriebenen Standardassays bestimmt. Nach der Zugabe des
wassergesättigten Lösungsmittels (2 mL) wird der zeitabhängige Verlauf der Enzymaktivität
verfolgt. Dazu werden der wässrigen Phase periodisch Proben entnommen
(0,1 mL) und unter Standardbedingungen hinsichtlich der Enzymaktivität analysiert
(Kapitel 12.4.1). Um eine kontinuierliche Emulsion zu gewährleisten werden die Lösungen
mit Hilfe eines magnetischen Rührers über die gesamte Versuchsdauer intensiv
durchmischt (700 UpM). Zur Minimierung der thermischen Enzymdesaktivierung wird
die Versuchstemperatur auf 4 ◦ C eingestellt.
12.5.2. Analytischer Batchversuch
Die Vorgehensweise bei den analytischen Batchversuchen im Zweiphasensystem wird
am Beispiel der Racematspaltung von Benzoin erläutert. 20 U BAL werden in 2 mL
Triethanolaminpuffer (35 mM, pH = 8, 0,35 mM ThDP, 0,35 mM MgSO4, 30vol%
DMSO) bei 20 ◦ C gelöst. Die Substrate (rac)-Benzoin (10 mM) und Acetaldehyd
(60 mM) werden in 2 mL wassergesättigtem tert-Butylmethylether gelöst. Die Reaktion
wird durch Zugabe der organischen Phase zur wässrigen Phase gestartet. Um eine
128

12.6. Analytik
kontinuierliche Emulsion zu gewährleisten werden die Lösungen mit Hilfe eines magnetischen
Rührers über die gesamte Versuchsdauer intensiv durchmischt (700 UpM).
Zur Dokumentaion des Reaktionsverlaufs werden der organischen Phase periodisch
Proben entnommen und per HPLC-Analytik untersucht.
12.5.3. Repetivitve Batch im Emulsionsreaktor
80 U BAL werden in 2 mL Triethanolaminpuffer (50 mM, pH = 8, 0,5 mM ThDP,
0,5 mM MgSO4) bei20 ◦ C gelöst. Die Substrate Benzaldehyd (30 mM) und Acetaldehyd
(60 mM) werden in 2 mL wassergesättigtem tert-Butylmethylether gelöst. Die
Reaktion wird durch Zugabe der organischen Phase zur wässrigen Phase gestartet.
Um eine kontinuierliche Emulsion zu gewährleisten, werden die Lösungen mit Hilfe
eines magnetischen Rührers über die gesamte Versuchsdauer intensiv durchmischt
(700 UpM). Zur Dokumentation des Reaktionsverlaufs werden der organischen Phase
periodisch Proben entnommen und per HPLC-Analytik untersucht. Ist der gewünschte
Umsatz erreicht, werden die Phasen getrennt. Der nachfolgende Reaktionszyklus wird
durch Zugabe von frischer organischer Substratlösung zur wässrigen Phase gestartet.
12.5.4. Repetitive Batch mit membranunterstütztem
Phasenkontakt
Ein Fließbild des Reaktoraufbaus ist in Abbildung 9.7 auf Seite 104 gezeigt. 400 U
BAL werden in 50 mL Triethanolaminpuffer (50 mM, pH = 8, 0,5 mM ThDP, 0,5 mM
MgSO4) gelöst. Die wässrige Phase wird in der Lumen-Seite des Moduls mit 50 mL h −1
rezykliert. Die Substrate Benzaldehyd (20 mM) und Acetaldehyd (60 mM) werden in
50 mL wassergesättigtem MTBE gelöst und im Gegenstrom zur wässrigen Phase mit
50 mL h −1 rezykliert. Der organischen Phasen werden periodisch Proben entnommen
und die Konzentration der Reaktionspartner per HPLC-Analytik betimmt. Bei einem
Umsatz von 75 % wird der organische Kreislauf entleert, mit wassergesättigtem MTBE
gespült und für den nachfolgenden Reaktionszyklus mit frischer Substratlösung befüllt.
12.6. Analytik
12.6.1. Proteinbestimmung
Die Proteinkonzentration wurde durch Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blue G250
bestimmt (Sedmark & Grossberg, 1977). Die Kalibrierung erfolgte mit BSA als Standard.
Die Absorption wird bei λ=620 nm gemessen.
12.6.2. Thermische Massenflussmessung
Das Prinzip der thermischen Massenflussmessung beruht darauf, dass sich die Temperaturdifferenz
∆T eines Fluids bei Zuführung einer Wärmemenge Q proportional
129

12. Material und Methoden
zur Masse m und der Wärmekapazität cp verhält:
∆T = cp mQ (12.1)
Zur Messung werden drei aufeinander folgende Widerstände verwendet. Zwischen
dem letzten und dem ersten wird die Temperaturdifferenz bestimmt, während der
mittlere eine Wärmemenge Q an das strömende Fluid abgibt. Alternativ kann auch die
Temperaturdifferenz konstant gehalten werden, indem die Wärmemenge variiert wird.
Durch Serienschaltung vieler Messungen kann mit geringer Wärmemenge und mit
Temperaturdifferenzen von insgesamt etwa 1Keine hohe Genauigkeit und zeitliche
Auflösung erzielt werden.
Der Zusammenhang nach (12.1) ist nur unter bestimmten Voraussetzungen erfüllt.
Es wird ein idealer Wärmeübergang angenommen. Damit zumindest ein linearer Zusammenhang
gegeben ist, wird ein laminarer Fluss durch Strömungslaminatoren erzwungen
(Baureihe L1). Dies schränkt den effektiven Messbereich ein, da für höhere
Flüsse ein Strömungsteiler eingesetzt werden muss, und nur ein definierter Anteil des
Fluids durch das Messrohr gelangt. Dies ist in der Baureihe L2 realisiert. Weiterhin ist
die Wärmekapazität cp eine Funktion von Druck, Temperatur und der Konzentration
gelöster Stoffe. In der Praxis geht man daher so vor, dass eine Kalibrierung mit dem
geförderten Fluid durchgeführt wird.
Die Geräte sind kommerziell von verschiedenen Anbietern erhältlich, für diese Arbeiten
wurden die Geräte der Firma Bronkhorst verwendet.
12.6.3. HPLC-Analytik
RP-HPLC
130
LiChrosphere 100 RP-8 HPLC-Säule, 250x4 mm
TEA-Puffer (0,2 %, pH = 3) : Acetonitril 60:40 (25 min)
Fluss 1,0 mL min −1 , 200 bar, 20 ◦ C
chirale HPLC
Chiracel OD-H HPLC-Säule
i-Hexan : i-Propanol 98:2 (120 min)
Fluss 0,5 mL min −1 ,25bar,40 ◦ C

Teil V.
Anhang
131

A. Modelle für die Simulation
A.1. Modell HPP-Bildung im Batch
// MicroMath Scientist Modell (R)-2-HPP-Synthese (Modell 05)
// Modell für Batchreaktor
IndVars: T
DepVars: BA,BZ,HPP,AL,U
Params:KMBADO,KMBAACC,KIPHPP,KIPAL,KMBZ,KMAL,VM1,VM3,VM4,E
R1=VM1* E*BA/(KMBAACC*(1+HPP/KIPHPP)*(1+AL/KIPAL)+BA)
R3=VM3*E*BZ/(KMBZ*(1+HPP/KIPHPP)+BZ)*AL/(KMAL+AL)
R4=VM4*E*BA/(KMBADO*(1+HPP/KIPHPP)+BA)*AL/(KMAL+AL)
Equations:
BA’=-2*R1+R3-R4
BZ’=R1-R3
HPP’=R3+R4
AL’=-R3-R4
U=(BA0-BA)/BA0
// Initial conditions
T=0
BA=21.5
BZ=0
AL=60
HPP=0
// Parameter values
VM1=0.80626
VM3=0.01616
VM4=0.01254
KMBADO=2.49506
KMBAACC=96.09738
KIPHPP=7.68405
KIPAL=6.83315
KMBZ=0.2234
KMAL=7.03884
E=20
// Constants
BA0=21.5
***
133

A. Modelle für die Simulation
A.2. Modell HPP-Bildung im CSTR
// MicroMath Scientist Modell (R)-2-HPP-Synthese (Modell 05)
// Modell für CSTR mit Enzymdesaktivierung
IndVars: T
DepVars: BA,BZ,HPP,AL,U
Params:KMBADO,KMBAACC,KIPHPP,KIPAL,KMBZ,KMAL,VM1,VM3,VM4,E,Tau,kdes
R1=VM1* E*BA/(KMBAACC*(1+HPP/KIPHPP)*(1+AL/KIPAL)+BA)
R3=VM3*E*BZ/(KMBZ+BZ)*AL/(KMAL+AL)
R4=VM4*E*BA/(KMBADO*(1+HPP/KIPHPP)+BA)*AL/(KMAL+AL)
Equations:
BA’=(BA0-BA)/Tau-2*R1+R3-R4
BZ’=(BZ0-BZ)/Tau+R1-R3
HPP’=(HPP0-HPP)/Tau+R3+R4
AL’=(AL0-AL)/Tau-R3-R4
U=(BA0-BA)/BA0
//Enzymdesaktivierung
E’=-E*kdes
// Initial conditions
T=0
BA=21.5
BZ=0
AL=60
HPP=0
// Parameter values
VM1=0.80626
VM3=0.01616
VM4=0.01254
KMBADO=2.49506
KMBAACC=96.09738
KIPHPP=7.68405
KIPAL=6.83315
KMBZ=0.2234
KMAL=7.03884
E=125
Tau=60
kdes=0.00011386
// Constants
BA0=21.5
BZ0=0
HPP0=0
AL0=60
***
134

Literaturverzeichnis
Adam, W., Fell, R. T., Mock-Knoblauch, C. & Saha-Möller, C. R. 1996.
Synthesis of opically active α-hydroxycarbonyl compounds by (salen)Mn(III)catalyzed
oxidation of Silyl enol ethers and ketene acetals. Tetrahedron Letters,
37 (36), 6531 – 6534.
Adam, W., Fell, R. T., Stegmann, V. R. & Saha-Möller, C. H. 1998a.
Synthesis of opically active α-hydroxy carbonyl compounds by the catalytic,
enantioselective oxidation of silyl enol ethers and ketene acetals with (salen)manganese(III)
complexes. Journal of the American Chemical Society, 120,
708 – 714.
Adam, W., Fell, R. T., Saha-Möller, C. H. & Zhao, C.-G. 1998b. Synthesis
of opically active α-hydroxy ketones by enantioselective oxidation of silyl enol
ethers with a fructosederived dioxirane. Tetrahedron: Asymmetry, 9, 397 – 401.
Adam, W., Lazarus, M., Saha-Möller, C. R. & Schreier, P. 1999. Biocatalytic
synthesis of optical active α-oxyfuncionalized carbonyl compound. Accounts
of Chemical Reseach, 32, 837 – 845.
Adlercreutz, Patrick. 2000. Biocatalysis in non-conventional media. Pages 295–
316 of: Straathof, A. J. J. & Adlercreutz, Patrick (eds), Applied biocatalysis,
2nd edn. Amsterdam: Harwood Academic Press.
Arnold, F. H. 1998. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research,
31, 125 – 131.
Barrowman, M. M. & Fewson, C. A. 1985. Phenylglyoxylate decarboxylase and
phenylpyruvate decarboxylase from Acinetobacter calcoaceticus. Current Microbiology,
12, 235 – 240.
Barrowman, M. M., Harnett, W., Scott, A. J., Fewson, C. A. & Kusel,
J. R. 1986. Immunological comparison fo microbial TPP-dependent non-oxidative
α-keto acid decarboxylases. FEMS Microbiology Letters, 34, 57 – 60.
Batra, R. & Gupta, M. N. 1994. Enhancement of enzyme activity in aqueous -
organic solvent mixtures. Biotechnology Letters, 16, 1059 – 1064.
135

Literaturverzeichnis
Bauer, M., Griengl, H. & Steiner, W. 1999. Parameters influencing stability
and activity of a (S)-hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis in two-phase
systems. Enzyme and Microbial Technology, 24, 514 – 522.
Bauer, M., Geyer, R., Griengl, H. & Steiner, W. 2002. The use of lewis
cell to investigate the enzyme kinetics of an (S)-hydroxynitril lyase in two-phase
systems. Food Technology and Biotechnology, 40 (1), 9 – 19.
Blanco, R. M., Halling, P. J., Bastida, A., Cuesta, C. & Guisan, J. M. 1992.
Effect of immiscible organic solvents on activity / stability of native chymotrypsin
and immobilized - stabilized derivatives. Biotechnology and Bioengeneering, 39,
75 – 84.
Breslow, R. 1958. On the mechanism of thiamine action. 4. Evidence from studies
on model systems. Journal of the American Chemical Society, 80 (14), 3719 –
3726.
Briggs,G.E.&Haldane,J.B.S.1925. A note on the kinetics of enzyme action.
Biochemical Journal, 19, 338 – 339.
Brink, L. E. S. & Tramper, J. 1985. Optimization of organic solvent in multiphase
biocatalysys. Biotechnology and Bioengineering, 27, 1258 – 1269.
Buchholz, K. & Kasche, V. 1997. Biokatalysatoren und Enzymtechnologie. Weinheim:
VCH Verlagsgesellschaft mbH.
Buchner, E. 1897. Alkoholische Gärung ohne Hefezellen. Berichte der Deutschen
Chemischen Gesellschaft, 30 (117), 1110 – 1113.
Butler, L.G. 1979. Enzymes in non-aqueous solvents. Enzyme and Microbial Technology,
1, 253 – 259.
Carrea, G. 1984. Biocatalysis in water-organic solvent two-phase systems. Trends
in Biotechnology, 2 (4), 102 – 106.
Carrea, G. & Riva, S. 2000. Enzyme in organischen Lösungsmitteln: Eigenschaften
und Einsatz in der Synthese. Angewandte Chemie, 112, 2312 – 2341.
Cornish-Bowden, A. 1995. Fundamentals of Enzyme Kinetics. London: Portland
Press Ltd.
Costacurta, A., Keijers, V. & Vanderleyden, J. 1994. Molecular cloning and
sequence analysis of an Azospirillum brasiliense indole-3-pyruvate decarboxylase.
Molecular Genetics and Genomics, 243, 463 – 472.
Curci, R., D’Accolti, L, Dinio, A., Fusco, C. & Rosa, A. 1996. Selective
oxidation of O-isopropylidene derivatives of diols to 2-hydroxy ketones employing
dioxiranes. Tetrahedron Letters, 37 (1), 115 – 118.
136

Literaturverzeichnis
Davis, F. A. & Chen, B.-C. 1992. Asymmertic hydroxylation of enolates with
N -sulfonyloxaziridines. Chemical Reviews, 92, 919 – 934.
Demir, A. S., Dünnwald, T., Iding, H., Pohl, M. & Müller, M. 1999. Asymmetric
benzoin reaction catalyzed by benzoylformate decarboxylase. Tetrahedron:
Asymmetry, 10, 4769 – 4774.
Demir, A. S., Pohl, M. & Müller, M. 2000. Nukletidsequenz kodierend für
eine Benzaldehyd-Lyase und Verfahren zur stereoselektiven Synthese von 2-
Hydroxyketonen, Deutsche Patentanmeldung DE 100 32 254.9, 30.6.2000.
Demir, A. S., Pohl, M, Janzen, E. & Müller, M. 2001. Enantioselective synthesis
of hydroxy ketones through cleavage and formation of acyloin linkage. Enzymatic
kinetic resolution via C-C bond cleavage. Journal of the Chemical Society:
Perkin Transactions 1, 633 – 635.
Demir, A. S., Sesenoglu, Ö., Eren, E., Hosrik, B., Pohl, M, Janzen, E.,
Kolter, D., Feldmann, R., Dünkelmann, P. & Müller, M. 2002. Enantioselective
systhesis of α-hydroxy ketones via Benzaldehyde lyase catalyzed C-C
bond formation reaction. Advanced Synthesis and Catalysis, 344 (1), 96 – 103.
Dünkelmann, P., Kolter, D., Nitsche, A., Demir, A. S., Siegert, P., Lingen,
B., Baumann, M., Pohl, M. & Müller, M. 2002. Development of a
donor-acceptor concept for enzymatic cross-coupling reactions of aldehydes: The
first asymmetric cross-benzoin condensation. Journal of the American Chemical
Society, 124, 12084 – 12085.
Dünnwald, T., Demir, A. S., Siegert, P., Pohl, M. & Müller, M. 2000. Enantioselective
synthesis of (S)-2-hydroxypropanone derivates by benzoylformate
decarboxylase catalyzed C-C-bond formation. European Journal of Organic Chemistry,
11, 2161 – 2170.
Drauz, K. & Waldmann, H. 2002. Enzyme catalysis in organic synthesis. Weinheim:
VCH.
Effenberger, F., Null, V. & Ziegler, T. 1992. Preparation of optically pure l-
2-hydroxyaldehydes with yeast transketolase. Tetrahedron Letters, 33 (36), 5157
– 5160.
Enders, D. & Kallfass, U. 2002. Ein effizienter nucleophiler Carben-Katalysator
für die asymmetrische Benzoinkondensation. Angewandte Chemie, 114 (10), 1822
– 1824.
Enders, D., Breuer, K., Raabe, G., Runsink, J., Teles, J. H., Melder, J.-P.,
Ebel, K. & Brode, S. 1996. The chemistry of stable carbenes. 2. Benzoin-type
condensations of formaldehyde catalyzed by stable carbenes. Helvetica Chimica
Acta, 79, 61 – 83.
137

Literaturverzeichnis
Faber, K. 1994. Biotransformations in organic chemistry. 2 edn. Berlin: Springer
Verlag.
Faber, K. 2000. Biotransformations in organic chemistry. 4 edn. Berlin: Springer
Verlag.
Faber,K&Patel,R.N.2000. Chemical biotechnology. A happy marriage between
chemistry and biotechnology: Asymmetric synthesis via green chemistry. Current
Opinion in Biotechnology, 11 (6), 517 – 519.
Fang, Q. K., Han, Z., Grover, P, Kesser, D., Seneneyake, C. H. & A.,
Wald; S. 2000. Rapid acess to enantiopure bupropion and its major metabolite
by stereospecific nucleophilic substitution on an α-ketotriflate. Tetrahedron:
Asymmetry, 11, 3659 – 3663.
Gala, D. & DiBebedetto, D. J. 1997. Metal salts induced improved αhydroxylation
of ketones for the preparation of the key chiral intermediate of
azole antifungals. Tetrahedron: Asymmetry, 8 (18), 3047 – 3050.
Gala, D., DiBebedetto, D. J., Clark, J. E., Murphy, B. L., Schumacher,
D. P. & Steinmann, M. 1996a. Preparations of antifungal Sch 42427/SM
9164: Preparative chromatographic resolution, and total asymmetric synthesis
via enzymatic preparation of chiral α-hydroxy arylketones. Tetrahedron Letters,
37, 611 – 614.
Gala, D., DiBenedetto, D. J., Mergelsberg, I. & Kugelmann, M. 1996b.
Total chiral synthesis of azole antifungals via α-hydroxylation of ketones. Tetrahedron
Letters, 37 (45), 8117 – 8120.
Ghose, A. K. & Crippen, G. M. 1987. Atomic physicochemical parameters
for three-dimensional-structure-directed quantitative structure-activity relationships.
2. Modeling dispersive and hydrophobic interactions. Journal of Chemical
Information and Computer Sciences, 27, 21 – 35.
Giffels, G. 1998. Enantioselektive Homogenkatalyse mit polymergebundenen Katalysatoren
im Membranreaktor. Dissertation, Universität Bonn.
Gonzales, B. & Vicuna, R. 1989. Benzaldehyde lyase, a novel thiamine PPirequiring
enzyme, from Pseudomonas fluorescens Biovar I. Journal of Bacteriology,
171, 2401 – 2405.
Gonzales, B., Merino, A., Almeida, M. & Vicuna, R. 1986. Comparative
growth of natural bacterial isolates on various lignin-related compounds. Applied
Mircrobiology and Biotechnology, 52, 1428 – 1432.
Goossens, M., Mittelbach, F. & Samarin, A. 2000. Der L ATEXBlgleiter.
Addison-Wesley Verlag, München. ISBN 3-8273-7044-2.
138

Literaturverzeichnis
Griebenow, K. & Klibanov, A. M. 1996. On protein denaturation in aqueousorganic
mixtures but not in pure organic system. Journal of the American Chemical
Society, 118 (47), 11695 – 11700.
Gupta, M. N. 1993. Thermostability of enzymes. Berlin: Springer Verlag.
Gupta, M. N., Batra, R., Tyagi, R. & Sharma, Aparna. 1997. Polarity index:
The guiding solvent parameter for enzyme stability in aqueous-organic cosolvent
mixtures. Biotechnology progress, 13, 284 – 288.
Hagen, J. 1992. Chemische Reaktionstechnik. Weinheim: VCH.
Halling, P. J. 1987. Biocatalysis in multi-phase reaction mixtures containing organic
liquids. Biotechnology Advances, 5, 47–84.
Hashiyama, T., Morikawa, K. & Sharpless, K. B. 1992. α-Hydroxy ketones in
high enantiomeric purity from asymmetric dihydroxylation of enol ethers. Journal
of Organic Chemistry, 57, 5067 – 5068.
Hecquet, L., Bolte, J. & Demuynck, C. 1996. Enzymatic synthesis of “natural
labeled” 6-deoxy-l-sorbose precursor of an impotant food flavor. Tetrahedron, 52
(24), 8223 – 8232.
Hegeman, G. D. 1966a. Synthesis of the enzymes of the madelate pathway by Pseudomonas
putida III. Isolation and Properties of constitutive mutants. Journal of
Bacteriology, 91, 1161 – 1167.
Hegeman, G. D. 1966b. Synthesis of the enzymes of the mandelate pathway by
Pseudomonas putida I. Synthesis of the enzymes by the wild type. Journal of
Bacteriology, 91 (3), 1140 – 1154.
Hegeman, G. D. 1970. Benzoylformiate decarboxylase (Pseudomonas putida). Pages
674 – 678 of: Methods in enzymology, vol. 17. Academic Press, New York.
Hickel, A., Radke, C. J. & Blanch, H. W. 1998. Hydroxynitrile lyase adsorption
at liquid/liquid interfaces. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 5, 349
– 354.
Hilhorst, R., Laane, C. & Veeger, C. 1983. Enzymatic conversion of apolar
compounds in organic media using an NADH-regenerating system and dihydrogen
as reductant. Federation of European Biochemical Societies, 1, 225 – 228.
Hodgson, J. 1994. The changing bulk biocatalyst marke. Bio Technology, 12, 789
– 790.
Iding, H., Dünnwald, T., Greiner, L., Liese, A., Müller, M., Siegert, P.,
Grötzinger, J., Demir, A. S. & Pohl, M. 2000. Benzoylformate decarboxylase
from Pseudomonas putida as a stable catalyst for the systhesis of chiral
2-hydroxy ketones. Chemistry - a European Journal, 6 (8), 1483 – 1495.
139

Literaturverzeichnis
Janzen, E. 2002. Die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluoreszens. Dissertation,
Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf.
Jordan, F. 2003. Current mechanistic understanding of thiamine diphosphatedependent
enzymatic reactions. Natural Product Reports, 20 (2), 184 – 201.
Kakeya, H., Morishita, M., Koshino, H., Morita, T.-i., Kobayashi, K. &
Osada, H. 1999. Cytoxazone: A novel cytokine modulator containing a 2oxazolidone
ring produced by Streptomyces sp. Journal of Organic Chemistry,
64 (3), 1052 – 1053.
Kazandjian, R. Z. & Klibanov, A. M. 1985. Regioselective oxidation of phenols
catalyzed by polyphenol oxidase in chloroform. Journal of the American Chemical
Society, 107, 5448 – 5450.
Kern, D., Kern, G., Neef, H., Tittmann, K., Killenberg-Jabs, M., Winker,
C., Schneider, G. & Hübner, G. 1997. How thiamine diphosphate is activated
in enzymes. Science, 275, 67 – 70.
Khmelnitsky, Y. L., Mozhaev, V. V., Belova, A. B., Sergeeva, M. V. &
Martinek, K. 1991. Denaturation capacity: A new quantitative citerion for
selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis. European Journal
of Biochemistry, 198, 31 – 41.
Kihumbu, D., Stillger, T., Hummel, W. & Liese, A. 2002. Enymatic synthesis
of all stereoisomers of 1-phenylpropane-1,2-diol. Tetrahedron: Asymmetry, 13,
1069 – 1072.
Kirk, O., Borchert, T. V. & C., Fuglsang C. 2002. Industrial enzyme applications.
Current Opinion in Biotechnology, 13, 345 – 351.
Kitazaki, T., Tasaka, A., Hosono, H., Matsushita, Y. & Itoh, K.
1999. Optically active antifungal azoles. VIII. Synthesis and antifungal activity
of 1-[(1R,2R)-2-(2,4-difluoro- and 2-fluorophenyl)-2-hydroxy-1-methyl-3-(1H-
1,2,4-triazol-1-yl)propyl]-3-(4-substituted phenyl)-2(1H,3H)-imidazolones and 2imidazolidinones.
Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 47 (3), 351 – 359.
Klibanov, A. M. 2001. Improving enzymes by using them in organic solvents.
Nature, 409, 241 – 246.
Kluger, R. 1997. Lessons from thiamin-watching. Pure and Applied Chemistry, 69,
1957 – 1967.
Kluger,R.,Lam,J.F.,Pezacki,J.P.&Yang,C.M.1995. Diverting thiamin
from to catalysis to destruction. Mechanism of fregmentation of N(1’)-Methyl-
2-(1-hydroxybenzyl)thiamin. Journal of the American Chemical Society, 117,
11383 – 11389.
140

Literaturverzeichnis
Knight, R. L. & Leeper, F. J. 1997. Synthesis of and asymmetric induction by
chiral bicyclic thiazolium salts. Tetrahedron Letters, 38 (20), 3611 – 3614.
Knight, R. L. & Leeper, F. J. 1998. Comparison of chiral thiazolium and triazolium
salts as asymmetric catalysts for the benzoin condensation. Journal of the
Chemical Society: Perkin Transactions 1, 12, 1891 – 1893.
Kobori,Y.,Myles,D.C.&Whitesides,G.M.1992. Substrate specificity and
carbohydrate synthesis using transketolase. Journal of Organic Chemistry, 57,
5899 – 5907.
Koike, T., Murata, K. & Ikariya, T. 2000. Stereoselective synthesis of optically
active α-hydroxy ketones and anti-1,2-diols via asymmetric transfer hydrogenation
of unsymmetrically substituted 1,2-diketones. Organic Letters, 2 (24), 3833
– 3836.
Kopka, H. 2000. L ATEX- Einführung Band 1. Addison-Wesley Verlag, München.
ISBN 3-8273-1557-3.
Kragl, U. 1997. Reaktionstechnik der asymmetrischen Synthese mit Homogen- und
Biokatalysatoren. Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia Legendi, Rheinische
Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Laane, C., Boeren, S. & Vos, K. 1985. On optimizing organic solvents in multiliquid-phase
biocatalysis. Trends in Biotechnology, 3 (10), 251 – 252.
Laane, C., Boeren, S., Vos, K. & Veeger, C. 1987. Rules for optimization of
biocatalysis in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering, 30, 81 – 87.
Laue, S. 2002. Asymmetrische Transferhydrierung im chemischen Membranreaktor.
Dissertation, Universität Bonn.
Laue, S., Greiner, L., Wöltinger, J. & Liese, A. 2001. Continuous application
of chemzymes in a membrane reactor: asymmetric transfer hydrogenation of
acetophenone. Advanced Synthesis and Catalysis, 343 (6 - 7), 711 – 720.
Lee, L. G. & Whitesides, G. M. 1986. Preparation of optically active 1,2-diols and
α-hydroxy ketones using glycerol dehydrogenase as catalysts: Limits to enzymecatalyzed
synthesis due to noncompetetive and mixed inhibition by product.
Journal of Organic Chemistry, 51, 25 – 36.
Lehninger, A. L. 1987. Biochemie. Weinheim: VCH.
Leuenberger, H. G., Matzinger, P. K. & Wirz, B. 1999. Synthesis and metabolism
of drugs by means of enzyme-catalysed reactions. CHIMIA, 53 (11), 536
– 540.
141

Literaturverzeichnis
Liese, A., Seelbach, K. & Wandrey, C. 2000. Industrial Biotransformations.
Weinheim: Wiley-VCH.
Michaelis, L. & Menten, M. 1913. Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische
Zeitschrift, 49, 333 – 369.
Montheit, M. J. 1999. Speciality Chemicals, 19, 276 – 278.
Morazzoni,P.&Bombardelli,E.1995. Silybum marianum (Carduus marianus).
Fitoterapia, 66 (1), 3 – 42.
Mozhaev, V. V., Khmelnitsky, Y. L., Sergeeva, M. V., Belova, A. B.,
Klyachko,N.L.,Levashov,A.V.&Martinek,K.1989. Catalytic activity
and denaturation of enzymes on water / organic cosolvent mixtures. European
Journal of Biochemistry, 184, 597 – 602.
Myles, D. C., Andrulis, P. J. & Whitesides, G. M. 1991. A transketolase based
synthesis of (+)-Exo-brevicomin. Tetrahedron Letters, 32 (37), 4835 – 4838.
Nakamura, K., Kondo, S., Kawai, Y., Hida, K., Kitano, K. & A., Ohno;.
1996. Enantio- and regioselektive reduction of α-diketones by bakers’s yeast.
Tetrahedron: Asymmetry, 7 (2), 409 – 412.
Neuberg, C. & Hirsch, J. 1921. Über ein kohlenstoffknüpfendes Ferment (Carboligase).
Biochemische Zeitschrift, 115, 282 – 310.
Oh, K. J., Park, E. J., Yoon, M. Y., Han, T. R. & Choi, J. D. 2001. Roles of
histidine redidues in tobaco acetolactate synthase. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 282 (5), 1237 – 1243.
Orlich,B.&Schomaecker,R.1999. Enzymatic reduction of a less water-soluble
ketone in reverse micelles with NADH regeneration. Biotechnology and Bioengeneering,
65 (3), 357 – 362.
Pasteur, L. 1858. Mémoire sur la fermentation de l’acide tartrique. Comptes rendus
mathematique / Académie des Sciences Paris, 46, 615 – 618.
Patel, R. N. 2000. Stereoselective biocatalysis. New York: Marcel Dekker.
Pohl, M, Lingen, B. & Müller, M. 2002. Thiamin disphosphate-dependent enzymes:
New Aspects of asymmetric C-C bond formation. Chemistry - a European
Journal, 8 (23), 5288 – 5295.
Prosen,E.&Ward,O.P.1994. Optimisation of rection conditions for production
of (S)-(-)-2-hydroxypropiophenone by Acinetobacter calcoaceticus. Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology, 13, 287 – 291.
Römpp (ed). 1995. Römpp Chemie Lexikon. Stuttgart: Thieme Verlag.
142

Literaturverzeichnis
Robinson, B. H. & Chun, K. 1993. The relationship between transketolase, yeast
pyruvate decarboxylase and pyruvate dehydrogenase of the pyruvate dehydrogenase
complex. Federation of European Biochemical Societies Letters, 328 (1 - 2),
99 – 102.
Rosche, B., Sandford, V., Breuer, M., Hauer, B. & Rogers, P.L. 2002.
Enhanced production of (R)-Phenylacetylcarbinol (R-PAC) through enzymatic
biotransformation. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 19 - 20, 109 –
115.
Schellenberger, A. 1998. Sixty years of thiamin diphosphate biochemistry. Biochimica
et Biophysica Acta, 1385, 177 – 186.
Schenk, G., Duggleby, R. G. & Nixon, P. F. 1998. Properties and functions of
the thiamin diphosphate dependent enzyme transketolase. International Journal
of Biochemistry and Cell Biology, 30 (12), 1297 – 1318.
Schloss, J. V. 1984. Chemistry and plant production: Herbicides inhibiting branches
chain amino acids biosynthesis - recent developments. Springer-Verlag, Berlin.
Schörken,U.&Sprenger,A.1998. Thiamin-dependent enzymes as catalyst in
chemoenzymatic synthesis. Biochimica et Biophysica Acta, 1385, 229 – 243.
Schubert, T., Hummel, W. & Müller, M. 2002. Highly enantioselective preparation
of multifunctionlized propargylic building blocks. Angewandte Chemie,
International Edition English, 41 (4), 634–637.
Sedmark, J. J. & Grossberg, S. E. 1977. A rapid, sensitive, and versatile assay
for protein using Coomassie Brilliant Blue G250. Analytical Biochemistry, 79,
544–552.
Sheehan, J. & Hunneman, D. H. 1966. Synthetic petide models of enzyme active
sides. 3. Stereoselective esterase models. Journal of the American Chemical
Society, 88 (14), 3666 – 3667.
Sheldon, R. A. 1993. Chirotechnology. New York: Marcel Dekker.
Sprenger, G. A., Schörken, U., Wiegert, T., Grolle, S., de Graaf, A. A.,
Taylor, S. V., Begley, T. P., Bringer-Meyer, S. & Sahm, H. 1997.
Identification of a thiamin-dependent synthase in Escherichia coli required for
the formation of the 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate precursor to isoprenoids,
thiamin and pyridoxol. Proceedings of the National Academy of Science of the
United States of America, 94 (24), 12857 – 12862.
Stanier,R.Y.&Ornston,L.N.1973. The β-ketoadipate pathway. Advances in
Microbial Physiology, 9, 89 – 151.
Staude, E. 1992. Membranen und Membranprozesse. Weinheim: VCH. Praktikum.
143

Literaturverzeichnis
Stermitz, F. R., Lorenz, P., Tawarna, J. N., Zenewicz, L. A. & Lewis, K.
2000. Synergy in a medical plant: Antimicrobial action of berberine potentiated by
5’-methoxyhydnocarpin, a multidrug pump inhibitor. Proceedings of the National
Academy of Science of the United States of America, 97 (4), 1433 – 1437.
Stillger, T., Villela, M. & Liese, A. 2002. Überwindung von thermodynamischen
Limitierungen in substratgekoppelten Cofaktorregenerierungverfahren.
Chemie Ingenieur Technik, 74 (7), 1035 – 1039.
Stinson, S. C. 1998. Counting on chiral drugs. Chemical and Engineering News,
21.9, 84 – 104.
Stinson, S. C. 1999. Chiral drug interactions. Drug delivery systems, threats from
generics, and FDA requirements all intersect the issue of chirality. Chemical and
Engineering News, 101 – 120.
Straathof, A. J. J., Panke, S. & Schmid, A. 2002. The production of fine
chemicals by biotransformations. Current Opinion in Biotechnology, 13, 548 –
556.
Strauss, U. T., Felfer, U. & Faber, K. 1999. Biocatalytic transformations of racemates
into chiral building blocks in 100% chemical yield and 100% enantiomeric
exess. Tetrahedron: Asymmetry, 10 (1), 107 – 117.
Summer, J. B. 1926. The isolation and crystallization of the enzyme urease. Journal
of Biological Chemistry, 69, 435 – 441.
Theil, F. 1997. Enzyme in der organischen Synthese. Heidelberg: Spektrum Akademischer
Verlag.
Toukoniitty, E., Mäki-Arvela, P., Kuzma, M., Villela, A., Neyestanaki,
A. K., Salmi, T., Sjöholm, R., Leino, R., Laine, E. & Murzin, D. Y.
2001. Enantioselective hydrogenation of 1-phenyl-1,2-propanedione. Journal of
Catalysis, 204, 281 – 291.
Ugai, T., Tanaka, S. & Dokawa, S. 1943. A new catalyst for acyloin condensation.
Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 63, 269 – 300.
Vermue, M. H. & Tramper, J. 1995. Biocatalysis in non-conventional media:
Medium engineering aspects. Pure and Applied Chemistry, 67 (2), 345 – 373.
Villela, M. 2003. Persönliche Mitteilung.
Villela, M., Stillger, T., Müller, M., Liese, A. & Wandrey, C. 2003. Is
log P a convenient criterion to guide the choice of solvents for biphasic enzymatic
reactions? Angewandte Chemie International Edition, 42 (26), 2993 – 2996.
144

Literaturverzeichnis
Volkin, D. B., Staubli, A., Langer, R. & Klibanov, A. M. 1991. Enzyme thermoinactivation
in anhydrous organic solvents. Biotechnology and Bioengineering,
37, 843 – 853.
Watson, J. D. & Crick, F. H. C. 1953. Molecular structure of nucleic acids.
Nature, 171, 737–738.
Wilcocks, R., Ward, O. P., Collins, S., Dewdney, N. J., Hong, Y. & Prosen,
E. 1992a. Acyloin formation by benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas
putida. Applied and Environmental Microbiology, 58, 1699 – 1704.
Wilcocks, R., Ward, O. P., Collins, S., Dewdney, N. J., Hong, Y. & Prosen,
E. 1992b. Acyloin formation by Benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas
putida. Applied and Environmental Microbiology, 58 (5), 1699 – 1704.
Wong, C.-H. & Whitesides, G. M. 1994. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry.
New York: Elsevier Science Inc.
Wrede, P. & Schneider, G. 1994. Concepts in Protein Engineering and Design.
Berlin, New York: Walter de Gryter.
Yanase, H., Okuda, M., Kita, K., Sato, Y., Shibata, K., Sakai, Y. & Kato,
N. 1995. Enzymatic preparation of [1,3- 13 C] Dihydroxyacetone Phosphate
from [ 13 C] Methanol and Hydroxypyruvate using methanol-assimilating system
of methylotropic yeasts. Applied Mircrobiology and Biotechnology, 43 (2), 228 –
234.
Yang, H., Jönsson, Å, Wehtje, E, Adlercreutz, P. & Mattiasson, B. 1997.
The enantiomeric purity of alcohols formed by enzymatic reduction of ketones can
be improved by optimisation of the temperature and by using a high co-substrate
concentration. Biochimica et Biophysica Acta, 1336 (1), 51 – 58.
Zaks, A. & Klibanov, A. M. 1984. Enzymatic catalysis in organic media at 100 ◦ C.
Science, 224, 1249 – 1251.
Zaks, A. & Klibanov, A. M. 1986. Substrate specificity of enzymes in organic
solvents vs. water is reversed. Journal of the American Chemical Society, 108,
2767 – 2768.
Zaks, A. & Klibanov, A. M. 1988. The effect of water on enzyme action in organic
media. Journal of Biological Chemistry, 263, 8017 – 8021.
Zelinski, T. & Kula, M.-R. 1997. Asymmetric enzamatic reduction of lipophilic
ketones in aqueous solution containing cyclodextrin. Biocatalysis and Biotransformation,
15, 57 – 74.
145

Literaturverzeichnis
Zelinski, T., Liese, A., Wandrey, C. & Kula, M.-R. 1999. Asymmetric reductions
in aqueous media: Enzymatic synthesis in cyclodextrin containing buffer.
Tetrahedron: Asymmetry, 10, 1681 – 1687.
146

Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Lebenswissenschaften / Life Sciences
1. Toxizitätsprüfungen in Zellkulturen für eine Vorhersage der akuten Toxizität
(LD50) zur Einsparung von Tierversuchen
von W. Halle (1998), 92 Seiten
ISBN: 3-89336-221-5
2. Die Rolle der Reaktionstechnik in der mikrobiellen Verfahrensentwicklung
von D. Weuster-Botz (1999), II, 320 Seiten
ISBN: 3-89336-245-2
3. Cell Culture Models as Alternatives to Animal Experimentation for the
Testing of Neuroprotective Compounds in Stroke Research
Practical Handbook of Methods
edited by A. J. Carter, H. Kettenmann (1999), 144 pages
ISBN: 3-89336-250-9
4. Action and Visuo-Spatial Attention
Neurobiological Bases and Disorders
Book of Abstracts
collected by P. H. Weiss (2000), XIV, 56 pages
ISBN: 3-89336-272-X
5. Genomweite Genexpressionsanalysen mit DNA-Chips zur Charakterisierung
des Glucose-Überflussmetabolismus von Escherichia coli
von T. Polen (2003), 100 Seiten
ISBN: 3-89336-337-8
6. Auslegung des Detektorsystems für einen hochauflösenden Positronen-
Emissions-Tomographen mit hoher Sensitivität
von U. Heinrichs (2003), IV, 238 Seiten
ISBN: 3-89336-340-8
7. Biological Principles Applied to Technical Asymmetric Catalysis
by A. Liese (2003), VI, 206 pages
ISBN: 3-89336-344-0
8. Designstudie eines µCT-Zusatzes für einen hochauflösenden Positronen-
Emissions-Tomographen: Beispiel für ein multimodales bildgebendes
System
von M. Khodaverdi (2004), III, 162 Seiten
ISBN: 3-89336-360-2
9. Bioprocess Development for the Generation of Monocyte-Derived Dendritic
Cells: Applicability in Breast Cancer Immunotherapy
by H.R. Bohnenkamp (2004), XLII, 128 pages
ISBN: 3-89336-364-5

Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Lebenswissenschaften / Life Sciences
10. Regulation der clp-Genexpression durch ClgR und Definition des ClgR-
Regulons aus Corynebacterium glutamicum
von S. Engels (2004), V, 125 Seiten
ISBN: 3-89336-379-3
11. Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im
Aromatenbiosyntheseweg in L–Phenylalanin Produzenten von Escherichia
coli
von M. Oldiges (2005), XVI, 181 Seiten
ISBN: 3-89336-380-7
12. Identifizierung und Charakterisierung eines Transkriptionsregulators der
Aconitase von Corynebacterium glutamicum
von A. Krug (2005), VI, 122 Seiten
ISBN: 3-89336-382-3
13. Prozessentwicklung der elektroenzymatischen Sulfoxidation mit
Chloroperoxidase
von S. Lütz (2005), XIV, 178 Seiten
ISBN: 3-89336-387-4
14. Export von Proteinen mit Zwillingsarginin-Signalsequenzen über den
Tat-Weg in Escherichia coli
von P. J. Kreutzenbeck (2005), 118 Seiten
ISBN: 3-89336-388-2
15. Untersuchungen zur Fettsäure- und Zellwandsynthese sowie zur
Glutamatbildung mit Corynebacterium glutamicum
von E. Radmacher (2005), 130 Seiten
ISBN: 3-89336-389-0
16. Monomodale und multimodale Registrierung von autoradiographischen
und histologischen Bilddaten
von A. Vieten (2005), 116 Seiten
ISBN: 3-89336-390-4
17. Biosynthese von Phosphonaten: Charakterisierung des rekombinanten
Enzyms Phosphonopyruvat-Decarboxylase aus Streptomyces
viridochromogenes Tü494
von S. Johnen (2005), 128 Seiten
ISBN: 3-89336-400-5
18. Ex-vivo Generierung von neutrophilen Zellen zur Prävention und Therapie
der Sepsis
von R. Herbold (2005), 202 Seiten
ISBN: 3-89336-407-2

Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Lebenswissenschaften / Life Sciences
19. Entwicklung eines Donor/Akzeptor-Konzeptes für die asymmetrische
Synthese unsymmetrischer Benzoine mit Hilfe ThDP-abhängiger Enzyme
von P. Dünkelmann (2005), 222 Seiten
ISBN: 3-89336-408-0
20. Analyse der Bindungsspezifität der humanen Lck-SH3-Domäne anhand
artifizieller und physiologischer Peptid-Liganden und strukturelle
Charakterisierung dieser Peptide im Komplex mit SH3-Domänen
von T. T. Tran (2005), 155 Seiten
ISBN: 3-89336-412-9
21. Modeling Based Process Development of Fed-Batch Bioprocesses:
L-Valine Production by Corynebacterium glutamicum
by M. Brik Ternbach (2005), 202 pages
ISBN: 3-89336-413-7
22. Charakterisierung der Ausscheidung von L-Glutamat bei Corynebacterium
glutamicum
von K. C. Stansen (2005), 151 Seiten
ISBN: 3-89336-416-1
23. Metabolic and Bioprocess Engineering – a Fruitful Symbiosis
by R.Takors (2005), 399 pages
ISBN: 3-89336-420-X
24. Reaktionstechnische Untersuchungen zur enzymatischen de novo
Synthese von GDP-�-L-Fucose und der in situ Fucosylierung von
Oligosacchariden
von C. Hoh (2005), 240 Seiten
ISBN: 3-89336-423-4
25. Humane Primärzellen als Feederzellen für die Kokultur mit
hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut
von A. S. Magin (2006), 206 Seiten
ISBN: 3-89336-424-2
26. Vergleichende Analyse der Sec- und Tat-abhängigen sekretorischen
Proteingewinnung mit Gram-positiven Bakterien als Wirtsorganismen
von D. Meißner (2006), 140 Seiten
ISBN: 3-89336-427-7
27. Energie- und Redoxstoffwechsel von Corynebacterium glutamicum
von A. Kabus (2006), VI, 115 Seiten
ISBN: 3-89336-439-0
28. NMR-Lösungsstruktur der humanen Hck SH3-Domäne im Komplex mit
einem artifiziellen, hochaffinen Peptid-Liganden
von H. Schmidt (2006), XII, 115 Seiten
ISBN: 3-89336-441-2

Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Lebenswissenschaften / Life Sciences
29. Entwicklung und Untersuchung eines Verfahrens zur integrierten
Aufreinigung von Plasmid DNA mittels wässriger Zweiphasenextraktion
von A. Frerix (2006), VII, 127 Seiten
ISBN: 3-89336-442-0
30. Advanced Methods in Multiplexing Multi-Pinhole Imaging
Design and Implementation of a High-Resolution and High-Sensitivity Small-
Animal SPECT Imaging System
by C. Lackas (2006), XX, 176 Seiten
ISBN: 3-89336-451-X
31. Enantioselektive C-C Knüpfung mit Enzymen
Charakterisierung und reaktionstechnische Bearbeitung der Benzaldehydlyase
aus Pseudomonas fluorescens Biovar I
von T. Stillger (2006), XIV, 146 Seiten
ISBN: 3-89336-457-9

Band / Volume 31
ISBN 3-89336-457-9
Lebenswissenschaften
Life Sciences