Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der ...

Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors 

hinsichtlich der Bedeutung von 

CD14 für die intestinalen 

Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek 

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen 

Nationalbibliografie; 

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar. 

1. Auflage 2012 

© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, 

Gießen 

Printed in Germany 

ISBN 978-3-86345-094-6 

Verlag: DVG Service GmbH 

Friedrichstraße 17 

35392 Gießen 

0641/24466 

geschaeftsstelle@dvg.net 

www.dvg.net

Tierärztliche Hochschule Hannover 

Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der Bedeutung von 

CD14 für die intestinalen Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm 

INAUGURAL-DISSERTATION 

zur Erlangung des Grades einer Doktorin 

der Veterinärmedizin 

- Doctor medicinae veterinariae - 

( Dr. med. vet. ) 

vorgelegt von 

Anne-Sophie Heitkamp 

Bielefeld 

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich 

Univ.-Prof. A. Bleich, Ph. D. 

Inst. für Versuchstierkunde (MHH) 

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich 

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl 

Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2012 

Diese Arbeit wurde durch Sachmittelbeihilfen der Deutschen 

Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des DFG-Projektes „Bedeutung von 

CD14 für intestinale Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm“ gefördert.

Meiner Familie.

1 Inhalt 

2 Tabellenverzeichnis ............................................................................................. 6 

3 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... 7 

4 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 8 

5 Literaturteil ......................................................................................................... 17 

5.1 Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) .................................... 17 

5.2 Genetik der CED ......................................................................................... 18 

5.2.1 Kopplungsanalysen ............................................................................... 18 

5.2.2 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) ........................................... 19 

5.3 Tiermodelle CED ......................................................................................... 20 

5.4 Vorarbeiten .................................................................................................. 23 

5.5 Cd14 ............................................................................................................ 24 

5.6 Ziele dieser Arbeit........................................................................................ 26 

6 Material und Methoden ...................................................................................... 27 

6.1 Geräte ......................................................................................................... 27 

6.2 Verbrauchsmaterialien ................................................................................. 28 

6.3 DNS ............................................................................................................. 29 

6.3.1 Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) .............. 29 

6.3.2 Mutagenese .......................................................................................... 32 

6.3.3 Agarosegelelektrophorese .................................................................... 32 

6.3.4 Sequenzierung ...................................................................................... 34 

6.3.5 Aufreinigung und Fällung von Nukleinsäuren ....................................... 34 

6.3.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren .......... 35 

6.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) .............................................. 35 

6.4 RNS ............................................................................................................. 36 

6.4.1 Isolierung von RNS aus Zellen.............................................................. 36 

6.4.2 Reverse Transkription (RT) und RT-PCR ............................................. 36 

6.5 Plasmide ...................................................................................................... 37 

6.5.1 Verwendete Plasmide ........................................................................... 37 

6.5.2 Analytische Plasmidpräparation ............................................................ 38 

6.5.3 Präparation hochreiner Plasmid-DNS ................................................... 39

6.5.4 Maxi-Präparation ................................................................................... 39 

6.6 Ligation/Klonierung/Restriktion .................................................................... 40 

6.6.1 Ligation von DNS .................................................................................. 40 

6.6.2 T/A-Klonierung ...................................................................................... 40 

6.6.3 Spaltung von DNS durch Restriktionsendonukleasen ........................... 41 

6.7 Bakterien ..................................................................................................... 41 

6.7.1 Verwendete Bakterienstämme .............................................................. 41 

6.7.2 Transformation von Plasmiden in E. coli ............................................... 42 

6.7.3 Blau-Weiß-Selektion ............................................................................. 43 

6.7.4 Kultivierung von E. coli .......................................................................... 43 

6.8 Zellkultur ...................................................................................................... 44 

6.8.1 Verwendete Zelllinien ............................................................................ 44 

6.8.2 Allgemeine Zellkulturverfahren .............................................................. 44 

6.8.3 Kryokonservierung von Zellen............................................................... 45 

6.8.4 Auftauen von Zellen .............................................................................. 46 

6.8.5 Transfektion .......................................................................................... 46 

6.8.5.1 Transfektion der murinen Embryonalen Fibroblasten NIH3T3 mit 

PolyFect Transfection Reagent ....................................................................... 46 

6.8.5.2 Transfektion der murinen Makrophagenzellen RAW264.7 ............. 47 

6.8.5.2.1 Transfektion mit Fugene® HD Transfection Reagent .................. 47 

6.8.5.2.2 Transfektion mit XtremeGene® HP DNA Transfection Reagent . 47 

6.8.5.2.3 Transfektion mit XtremeGene® 9 DNA Transfection Reagent .... 47 

6.8.5.2.4 Transfektion mit Superfect® Transfection Reagent ..................... 47 

6.8.5.2.5 Transfektion mit Targefect® RAW und Virofect® ........................ 48 

6.8.6 Etablierung stabil transfizierter Zellen ................................................... 48 

6.8.7 Luziferase-Analyse ............................................................................... 49 

6.8.8 β-Galaktosidase-Analyse ...................................................................... 50 

6.8.9 LPS-Stimulation der Zellen ................................................................... 51 

6.9 Proteine ....................................................................................................... 52 

6.9.1 Isolierung von Proteinen aus Zellen ...................................................... 52 

6.9.2 Proteinbestimmung nach Bradford (BRADFORD et al., 1976) ............. 53

6.9.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE ) 53 

6.9.4 Coomassie Brilliant Blau Färbung ......................................................... 55 

6.9.5 Western Blot ......................................................................................... 55 

6.9.6 Verwendete Antikörper für Western Blot ............................................... 57 

6.9.7 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) ........................................ 57 

6.9.8 Verwendete Antikörper für EMSA ......................................................... 58 

7 Ergebnisse ......................................................................................................... 59 

7.1 Etablierung des Modells für die Promotoranalysen ..................................... 59 

7.1.1 Cd14-Expression in murinen Zelllinien in vitro ...................................... 59 

7.1.2 Vergleich chemischer Transfektionsmethoden ..................................... 60 

7.1.3 Optimierte Cd14-Promotoranalysen in vitro .......................................... 62 

7.2 Vergleichende Datenbankanalyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen im 

Cd14-Promotor von B6 und C3Bir ......................................................................... 62 

7.3 Aktivität der Cd14-Promotoren von C3Bir und B6 ....................................... 64 

7.3.1 Bestimmung der Basalaktivität durch Trunkierung der Cd14-Promotoren 

64 

7.3.1.1 Luziferase-Analyse des C3Bir-Cd14-Promotors ............................. 64 

7.3.1.2 Luziferase-Analyse des B6-Cd14-Promotors ................................. 66 

7.3.2 Inaktivierung potentieller Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen ............ 68 

7.3.2.1 Deletion durch Promotorverkürzungen ........................................... 68 

7.3.2.1.1 Luziferase-Analyse des C3Bir-Cd14-Promotors .......................... 68 

7.3.2.1.2 Luziferase-Analyse des B6-Cd14-Promotors .............................. 70 

7.3.2.2 Mutagenisierung der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen ............ 72 

7.3.2.2.1 Luziferase-Analyse des mutagenisierten C3Bir-Cd14-Promotors 72 

7.3.2.2.2 Luziferase-Analyse des mutagenisierten B6-Cd14-Promotors .... 75 

7.4 Physikalische Interaktion von Transkriptionsfaktoren mit den Cd14- 

Promotoren von B6 und C3Bir .............................................................................. 77 

7.4.1 EMSA der PPARG-, SP2- und OCT1-Bindungsstellen von C3Bir ........ 78 

7.4.2 EMSA der OCT1-Bindungsstelle von B6 .............................................. 80 

8 Diskussion .......................................................................................................... 82 

8.1 Vorarbeiten zur Etablierung des Modells für die Promotoranalysen ............ 82 

8.2 Aktivitäten der Cd14-Promotoren von C3Bir-Il10 -/- und B6-Il10 -/- ................. 83

8.3 Ausblick ....................................................................................................... 87 

9 Zusammenfassung............................................................................................. 89 

10 Summary ........................................................................................................ 91 

11 Anhang 1: Literaturteil ..................................................................................... 92 

11.1 Kandidatengene für CED ............................................................................. 92 

Tabelle 5: Kandidatengene für CED (modifiziert nach BÜCHLER, 2010) ............. 92 

11.2 CED Suszeptibilitätsloci und Genassoziationen .......................................... 93 

Tabelle 6: In GAWS detektierte, mehrfach replizierte CED Suszeptibilitätsloci und 

Genassoziationen.................................................................................................. 93 

12 Anhang 2: Material und Methoden ................................................................ 107 

12.1 Promotorsequenzen und Primer ................................................................ 107 

12.2 Oligokukleotide .......................................................................................... 110 

12.2.1 Verwendete Oligonukleotide ............................................................... 110 

Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide ............................................................... 110 

12.2.2 Oligonukleotide für EMSA ................................................................... 113 

Tabelle 8: Oligonukleotide für EMSA ................................................................... 113 

13 Anhang 3: Ergebnisse .................................................................................. 116 

13.1 Vergleich chemischer Transfektionsmethoden .......................................... 116 

13.1.1 Polyfect® (NIH3T3) ............................................................................. 116 

13.1.2 Fugene® (RAW264.7) ........................................................................ 116 

13.1.3 Targefect® (RAW264.7) ..................................................................... 116 

13.1.4 Superfect® (RAW264.7) ..................................................................... 117 

13.1.5 Xtreme Gene 9 DNA® (RAW264.7) .................................................... 117 

13.1.6 Xtreme Gene HP DNA® (RAW264.7) ................................................. 118 

13.2 Aktivität der Cd14-Promotoren von C3Bir und B6 ..................................... 119 


119 

13.2.2 Inaktivierung potentieller Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen .......... 121 

13.2.2.1 Deletion durch Promotorverkürzungen ......................................... 121 

13.2.2.2 Mutagenisierung der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen .......... 125 

14 Literaturverzeichnis ....................................................................................... 127 

15 Erklärung ...................................................................................................... 154

16 Danksagung.................................................................................................. 155

2 Tabellenverzeichnis 

Tabelle 1: Beispiele für die Einflüsse der Darmflora auf CED-Modelle (modifiziert 

nach BÜCHLER, 2006) ............................................................................................ 21 

Tabelle 2: Ausrichtung der Colitis bei Il10 -/- Mäusen verschiedener 

Hintergrundstämme (modifiziert nach BÜCHLER, 2006) .......................................... 22 

Tabelle 3: Vergleich chemischer Transfektionsmethoden ........................................ 61 

Tabelle 4: Stammspezifische Polymorphismen, Transkriptionsfaktorbindungsstellen 

und deren Lage (modifiziert nach DE BUHR et al., 2006) ........................................ 63 

Tabelle 5: Kandidatengene für CED (modifiziert nach BÜCHLER, 2010) ................. 92 


Genassoziationen ..................................................................................................... 93 

Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide .................................................................. 110 

Tabelle 8: Oligonukleotide für EMSA ...................................................................... 113

3 Abbildungsverzeichnis 

Abbildung 1: Hauptweg der Beeinflussung von CED durch CD14 ............................ 25 

Abbildung 2: Murine Embryonale Firboblasten der Zellinie NIH3T3 ......................... 59 

Abbildung 3: Murine Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 ..................................... 59 

Abbildung 4: Western Blot Untersuchung der basalen und stimulierten Cd14- 

Expression an NIH3T3- und RAW264.7-Zellen ........................................................ 60 

Abbildung 5 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des C3Bir-Cd14- 

Promotors ................................................................................................................. 65 

Abbildung 6 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors 67 

Abbildung 7 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors ... 69 

Abbildung 8 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors ........ 71 

Abbildung 9 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des C3Bir-Cd14-Promotors ...... 74 

Abbildung 10 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des B6-Cd14-Promotors ......... 76 

Abbildung 11: EMSA der Bindungsstelle für PPARG (C3Bir) ................................... 78 

Abbildung 12: EMSA der Bindungsstelle für SP2 (C3Bir) ......................................... 79 

Abbildung 13: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (C3Bir) ...................................... 80 

Abbildung 14: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (B6) ........................................... 81 

Abbildung 15: Transfektion von NIH3T3-Zellen mit Polyfect® ................................ 116 

Abbildung 16: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Fugene HD® ..................... 116 

Abbildung 17: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Targefect® ......................... 116 

Abbildung 18: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Superfect® ........................ 117 

Abbildung 19: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene 9 DNA® ....... 117 

Abbildung 20: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene HP DNA® .... 118 

Abbildung 21: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des B6-Cd14-Promotors 

nach Trunkierung .................................................................................................... 119 

Abbildung 22: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des C3Bir-Cd14- 

Promotors nach Trunkierung .................................................................................. 120 

Abbildung 23: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten Trunkierungen 

des B6-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ....................... 121 


nach Deletion durch Promotorverkürzung .............................................................. 122 

Abbildung 25: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten Trunkierungen 

des C3Bir-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung .................. 123 


Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ............................................. 124 


nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen ............................. 125 


Promotors nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen ........... 126

4 Abkürzungsverzeichnis 

°C Grad Celsius 

% Prozent 

ABCB1 ATP-Binding Cassette, Subfamily B, Member 1 

adap. Adaptive 

AP1 Anionic Peroxidase 1 

APS Ammoniumpersulfat 

Areg Amphiregulin 

ARPC2 Actin-Related Protein 2 

ATF Activating Transcription Factor 2 

ATG16L1 Autophagy Related 16-Like 1 

β-Gal β-Galaktosidase 

B6 C57/BL6J(B6)-Il10 -/- 

BACH2 BTB and CNC homology 1 Basic Leucine Zipper Transcription 

Factor 2 

BCL6 B-Cell Leukemia/Lymphoma 6 

Bp Basenpaar 

BSA Bovines Serum Albumin 

BSN Basonuclein 

BTNL2 Butyrophilin-Like 2 

bzw. beziehungsweise 

C11orf30 Chromosome 11 Open Reading Frame 30 

C3Bir C3H/HeJBir-Il10 -/- 

CARD Caspase Activated Recruitment Domain 

CCDC122 Coiled-Coil Domain Containing 122

CCL Chemokine (C-C motif) Ligand 

CCNY Cycline Y 

CCR 6 Chemokine(C-C motif) receptor 6 

CD Cluster of differentiation 

Cdcs Cytokine deficiency induced colitis susceptibility 

CDH1 Cadherin 1 Type 1 

CDKAL 1 Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 

1-like 1 

cDNS zirkuläre Ribonukleinsäure 

CED Chronisch Entzündliche Darmerkrankung 

CEP72 Centrosomal Protein 72kDa 

cfu colony forming untis 

CIITA Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator 

CLN Ceroid-Lipofuscinosis Neuronal 3 

cm Zentimeter 

CMV Cytomegalievirus 

CPEB Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding Protein 

CREM cAMP-Response Element Modulator 

CU Colitis Ulcerosa 

CUL2 Cullin 2 

DENND1B Differentially Expressed in Normal and Neoplastic Cells/ MAPkinase 

Activating Death Domain Containing 1B 

DLG 5 Disks Large Homolog 5 

DMSO Dimethylsulfoxid 

DNMT3A DNA Methyltransferase 3 Alpha 

DNS Desoxyribonukleinsäure

DSS Dextran Sodium Sulfat 

DTT Dithiothreitol 

E2F E2F Transcription Factor 

ECM Extracellular Matrix Protein 1 

E. coli Escherichia coli 

EDTA Ethylendiamintetraacetat 

EIF3C Eukaryotic Translation Initiation Factor 3 Subunit C 

ELISA Enzyme Linked Immunosorbant Assay 

ENOX 1 Ecto-NOX Disulfide-Thiol Exchanger 1 

ERAP Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 

ESRRA Estrogen-related Receptor Alpha 

Fa. Firma 

FADS Fatty Acid Desaturase 

FAM92B Family with Sequence Similarity 92, member B 

FCGR2A Fc Fragment of IgG Low Affinity IIa Receptor 

FMO4 Flavin-containing Monooxygenase 4 

FUT2 Fucosyltransferase 2 

g Gramm 

g g-Beschleunigung 

G418 Geneticin 

GALC Galactosylceramidase 

GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 

Gbp Guanylate binding protein 

GCKR Glucokinase Regulator 

GFP grün floureszierendes Protein

Gnb1 Guanine Nucleotide Binding Protein 1 

GPI Glykosylphoshpatidolinositol 

GPR65 G Protein-coupled Receptor 65 

GPX1 Glutathione Peroxidase 1 

GWAS Genomweite Assoziationsstudien 

HERC2 Hect Domain and Rolled Leaf 2 

HLA Human Leukocyte Antigen 

HNF4A Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha 

HORMAD2 HORMA domain containing 2 

HPLC High-Performance Liquid Chromatography 

HRP Horseradichperoxidase 

HSP Heat Shock Protein 

IBD Inflammatory Bowel Disease 

ICAM Intercellular Adhesion Molecule 

ICOSLG Inducible T-cell Costimulator Ligand Gen 

Il Interleukin 

Il10RA Interleukin 10 Receptor α 

Il1Rl1 Interleukin 1 Receptor-like 1 

Il10RB Interleukin 10 Receptor β 

Il17REL Interleukin 17 Receptor E-like 

Il18RAP Interleukin 18 Receptor Accessory Protein 

Il23R Interleukin 23 Receptor 

INPP5E Inositol Polyphosphate-5-phosphatase 

INSL Insulin-Like 

IRF Interferon Regulatory Factor

IRGM Immunity-Related GTPase Family M Protein 

JAK 2 Janus Kinase 2 

KB Kilobase 

kDa kilo Dalton 

KIF21B Kinesin Family Member 21B 

KPNA7 Karyopherin Alpha 7 

L Liter 

LB Luria Bertani 

LIF Leukemia Inhibitory Factor 

LPS Lipopolysaccharid 

LRRK2 leucine-rich repeat kinase 2 

Ly6g6c Lymphocyte Antigen 6 Complex, Locus G6C 

mA Milliampere 

MAP3K7IP1 TGF-beta Activated Kinase 1/MAP3K7 Binding Protein 1 

MC Morbus Crohn 

mCD membrangebundenes Cluster of differentiation 

MDR1 Multi Drug Resistance 1 

MEF Murine Embryonale Fibroblasten 

MEM Modified Eagle’s Medium 

MHC Major Histocompatibility Complex 

MST1 Macrophage-Stimulating 1 

MTMR3 Myotubularin Related Protein 3 

µg Mikrogramm 

mg Milligramm 

µL Mikroliter

mL Milliliter 

mMol Millimol 

MOPS 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure 

mRNS messenger Ribonukleinsäure 

MUC Mucin 

MYO9B Myosin IXB 

NDFIP1 Neural Precursor Cell Expressed developmentally Downregulated 

4 Family Interacting Protein 1 

NKX2-3 Natural Killer Cell-associated Antigen 2 Transcription Factor 

Related, Locus 3 

nm Nanometer 

NUPR1 Nuclear Protein Transcriptional Regulator 1 

NOD nucleotide-binding oligomerization domain 

NR Nitrat Reductase 

OCT Organic Cation Transporter 

OD Optische Dichte 

ORMDL3 Orosomucoid 1 Like 3 

P53 Transformation Related Protein 53 

PAX2 Paired Box Gene 2 

PBS Phosphate Buffered Saline 

PCR Polymerase Chain Reaction 

Pla2g2a Phospholipase A2 group IIA 

PLCL1 Phospholipase C-like 1 

PPARG Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma 

PRDX Peroxiredoxin 

PSMG1 Proteasome (Prosome, Macropain) Assembly Chaperone 1

PTGER4 Prostaglandin E Receptor Subtype EP4 

PTPN1 Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 1 

PTPN 2 Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 2 

PTPN22 Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 22 (lymphoid) 

pMol Picomol 

PTPN22 Protein Thyrosin Phosphatase 22 

PUS10 Pseudouridylate Synthase 10 

qRT Quantitative Real-Time 

QTL Quantitative Trait Loci 

® Registrierte Warenmarke 

RASIP Ras Interacting Protein 

REL Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog 

RNASE2 Ribonuclease A Family 2 

RNS Ribonukleinsäure 

rpm revolutionso per minute 

rRNS ribosomale Ribonukleinsäure 

RT Reverse Transkription 

RTEL1 Regulator of Telomere Elongation Helicase 1 

SATB2 Special AT-rich Sequence Binding Protein Homebox 2 

SCAMP Secretory Carrier Membrane Protein 

sCD soluble Cluster of Differentiantion 

SDCCAG3 Serologically Defined Colon Cancer Antigen 3 

SDS Sodium Dodecyl Sulfat 

SEC16A Putative UDP-N-Acetylglucosamine-Peptide N- 

Acetylglucosaminyltransferase Homolog 16 A 

SLC Single Level Cell

SMAD3 Mothers Against Decapentaplegic Homolog 3 

SMURF1 SMAD-specific E3 Ubiquitin-protein Ligase 1 

SNAP4 Small Nuclear RNA Activating Complex Polypeptide 4 

SNP single nukleotide polymorphism 

SP1 Specificity Protein 1 

SP140 SP140 Nuclear Body Protein 

SP2 Transkriptionsfaktor SP2 

SPF Specified Pathogen Free 

ssp. Subspezies 

STAT Signal Transducer and Activator of Transcription 

SULT1A1 Sulfotransferase Family Cytosolic 1A Phenol-Preferring Member 

T/A Thymin/Adenin 

TAGAP T-cell Activation RhoGTPase Activating Protein 

TFBS Transkriptionsfaktorbindunsstelle 

Th T-Helfer 

THADA Thyroid Adenoma Associated 

TL1A TNF-like ligand 1 A 

TLR Toll Like Receptor 

TNF Tumor-Nekrose-Faktor 

TNFRSF6B Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily 6B 

TNFSF15 Tumor Necrosis Factor Superfamily Member 15 

TPPP Tubulin Polymerization Promoting Protein 

TR2 Nuclear Receptor Subfamily 2 Group C Member 1 

TRAF Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-α assoziierter Faktor 

TRIF Toll-Like Receptor Adaptor Molecule 2

tRNS transfer Ribonukleinsäure 

TYK Tyrosinkinase 

u.a. unter anderem 

UBE2D1 Ubiquitin-conjugating Enzyme E2D 1 

USP12 Ubiquitin Specific Peptidase 12 

UV Ultraviolett 

V Volt 

VAMP Vesicle-associated Membrane Protein 

Vol. Volumen 

z.B. zum Beispiel 

ZFP36L1 Zinc Finger Protein 36 C3H Type-like 1 

ZMIZ1 Zinc Finger MIZ-type Containing 1 

ZNF 365 Zinc Finger 365 

ZPBP Zona Pellucida Binding Protein

5 Literaturteil 

17 

5.1 Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) 

Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind schubweise verlaufende 

Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes. Sie untergliedern sich in die beiden 

Haupterscheinungsformen Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn, die bei den 

betroffenen Patienten in der Regel das erste Mal im Alter zwischen 20 und 40 Jahren 

auftreten (PICCO et al., 2009). Bei Colitis Ulcerosa beschränkt sich die Entzündung 

auf die Mukosa und die oberflächliche Submukosa des Dickdarms. Sie beginnt distal, 

schreitet kontinuierlich nach proximal fort und führt neben Ulzerationen langfristig zu 

einem erhöhten Darmkrebsrisiko (BERNSTEIN et al., 2001). Morbus Crohn ist durch 

eine diskontinuierliche transmurale Entzündung des gesamten 

Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet, wobei Abszesse, Strikturen und Fisteln in 

den Bauchraum oder zu anderen Abdominalorganen entstehen können. 

Symptomatisch sind beide Krankheitskomplexe durch abdominale Algesie, Meläna, 

Diarrhoe, Anorexie und Maldigestion gekennzeichnet. Außerdem zeigen sich 

vielfältige extraintestinale Symptome, wie z.B. Pyrexie, Anämie, Arthralgien, Uveitis 

oder Erythema nodosum (TRAVIS u. STANGE et al., 2007). Ätiopathogenetisch sind 

CED noch nicht vollständig geklärt, aber es steht fest, dass es sich um ein 

multifaktorielles Geschehen handelt (FORABOSCO et al., 2000). Demnach können 

sowohl Umweltfaktoren als auch die Mikroflora des Darmes und genetische 

Komponenten ausschlaggebend für die Entstehung und den Verlauf von CED sein 

(LAKATOS et al. 2003; HUGOT et al., 2004; CARIO et al., 2005), während Stress 

und andere sozioökonomische Faktoren ebenfalls Einfluss auf den Ausbruch und 

den Hergang der Erkrankung nehmen. Außerdem scheint eine erhöhte Permeabilität 

der Darmwand für Bakterien eine entscheidende Rolle zu spielen (MUNKHOLM et al., 

1994). Seit dem Ende des Zweiten Weltkrieges steigt die Inzidenz beider 

Erkrankungserscheinungen sowohl in den Westlichen Industrienationen als auch in 

den verhältnismäßig weniger oft betroffenen Entwicklungsländern an (BERNSTEIN 

et al., 2010). Mittlerweile tritt in den Industrienationen eine Stagnation der 

Krankheitshäufigkeit ein, während sie in Entwicklungsländern weiter steigt. In 

Mitteleuropa erkranken jährlich zwischen 4 und 7 von 100.000 Einwohnern neu an 

Morbus Crohn, während Colitis Ulcerosa mit einer Häufigkeit von 9 bis 12 neuen 

Krankheitsfällen pro 100.000 Einwohner deutlich öfter auftritt (LOFTUS et al., 2004).

5.2 Genetik der CED 

18 

Obwohl die genaue Ätiopathogenese der CED noch nicht vollständig geklärt ist, 

stellte sich schon früh heraus, dass eine genetische Komponente eine Rolle spielen 

muss. So wurde bereits 1932 eine familiäre Häufung von CED festgestellt (CROHN 

et al., 1932), der ein polygenetischer Erbgang zu Grunde zu liegen schien 

(FORABOSCO et al., 2000). Heute zeigt sich, dass in Familien mit einem CED- 

Patienten die Häufigkeit für weitere innerfamiliäre Krankheitsfälle im Vergleich zur 

allgemeinen Bevölkerung 15-fach erhöht ist und so bis zu 20% der Verwandten von 

Betroffenen ebenfalls unter CED leiden (ORHOLM et al., 1991; VERMEIRE u. 

PEETERS et al., 1996). In Zwillingsstudien wurde untersucht, inwieweit die 

Vererbung von CED genetisch bedingt ist. Die Übereinstimmungsraten bei eineiigen 

Zwillingen bezüglich der Krankheitsbetroffenheit von Morbus Crohn lag zwischen 

20% und 50% (HALFVARSON et al., 2003), während sie bei zweieiigen Zwillingen 

zwischen 0% und 7% lag (ORHOLM et al, 2000; HALFVARSON et al., 2007). Eine 

weitere Studie zeigte, dass bei MC sogar der Ausprägungstyp der Erkrankung 

genetisch determiniert sein könnte. Bei Zwillingen mit Colitis Ulcerosa liegt ebenfalls 

eine genetische Komponente vor, die aber nicht so stark ausgeprägt ist, wie bei MC 

(HALFVARSON et al., 2003). Den Studien zufolge wird klar, dass Erbgut-Einflüsse 

eine große Rolle spielen, CED aber auch von weiteren Faktoren bestimmt wird. 

5.2.1 Kopplungsanalysen 

Bei Kopplungsanalysen werden genetische Merkmale, die in der Bevölkerung 

variabel verteilt sind, in einer Gruppe verwandter Personen untersucht, zu der 

sowohl von einer Krankheit betroffene als auch nicht betroffene Familienmitglieder 

gehören. So können bei Erkrankten genetische Variationen identifiziert werden, die 

bei Gesunden nicht zu finden sind (siehe 11.1). Das Nucleotide-binding 

Oligomerization Domain containing 2 Gen (NOD2 oder Caspase Activated 

Recruitment Domain protein 15, CARD15) befindet sich im Inflammatory Bowel 

Disease (IBD) 1 Lokus auf Chromosom 16. Es wird vor allem in Panethzellen sowie 

peripheren Blutmonozyten exprimiert und war das erste Gen, das mit einer erhöhten 

Suszeptibilität für Morbus Crohn in Verbindung gebracht werden konnte. Durch das 

Binden von Bakterienzellwandbestandteilen (Muramyldipeptid) an das C-terminale 

Ende des Proteins wird eine Nuclear Factor Kappa B (NF-κB) Kaskade in Gang 

gesetzt, die zur Ausschüttung von Entzündungsmediatoren führt. Mehrere seltene 

Polymorphismen, die oft in Zusammenhang mit Morbus Crohn auftreten, wurden in 

diesem Gen gefunden (OGURA et al., 2001; LESAGE et al., 2002; HUGOT et al.,

19 

2008). Die Human Leukocyte Antigen (HLA) Klasse II Region und der Inflammatory 

Bowel Disease (IBD) 5 Lokus konnten bisher noch nicht unabhängig voneinander als 

Suszeptibilitätslokus für CED identifiziert werden, da sie in unmittelbarer Nähe 

zueinander liegen. Zu den Allelen, die mit dem Krankheitskomplex in Verbindung 

gebracht werden, gehören außerdem u.a. HLA-DRB1*1502 (ASAKURA et al., 1982; 

SUGINMURA et al., 1993), HLA-DRB1*0701 (FERNANDEZ et al., 2004; NEWMAN 

et al., 2004; AHMAD et al., 2002) und HLA-DRB1*0103 (SATSANGI et al., 1996; 

SILVERBERG et al., 2003; ORCHARD et al., 2002). Noch konnte aber nicht 

festgestellt werden, ob die Kopplungsergebnisse auf die einzelnen Allele selbst oder 

ihre Kopplung miteinander zurückzuführen sind. In der Promotorregion des Tumor 

Nekrose Faktor (TNF) Genes, das auch in der IBD 3 Region liegt, wurden mit CED 

assoziierte Single Nukleotide Polymorphisms (SNPs) gefunden (ORCHARD et al., 

2002; VAN HEEL et al., 2002; TREMELLING et al., 2006). Funktionelle 

Abweichungen von organischen Kationentransportern (Organic Cation Transporter, 

OCT) der Gene Single Level Cell (SLC) 22A4 und SLC22A5 im IBD5-Lokus werden 

als kausal für deren Rolle bei CED betrachtet (PELTEKOVA et al., 2004). Letztere 

Gene agieren eng mit Interferon Regulatory Factor (IRF) 1, Interleukin (IL) 3-5 und 

IL13, weshalb diese ebenfalls als Kandidatengene in Betracht gezogen werden. Es 

wurden weitere Kandidatengene gefunden, deren Assoziation zu CED allerdings 

nicht eindeutig reproduziert werden konnte, wie z.B. NOD1/CARD4 (MCGOVERN et 

al., 2005), TLR4 (FRANCHIMONT et al., 2004; DE JAGER et al., 2007), Myosin IXB 

(MYO9B; VAN BODEGRAVEN et al., 2006) und NFκB1 (KARBAN et al., 2004). 

5.2.2 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) 

Um ein bestimmtes Merkmal mit dem genetischen Hintergrund des Merkmalträgers 

in Verbindung zu bringen, werden sogenannte genomweite Assoziationsstudien 

(GWAS) durchgeführt. Innerhalb einer Population werden zu diesem Zweck 

Assoziationen von Polymorphismen mit Krankheitsmerkmalen untersucht. Während 

Kandidatengenassoziationsstudien zur Verifizierung bereits bestehender 

Verdachtsmomente genutzt werden, können GWAS nach statistischer Auswertung 

von SNP-Verteilungen lediglich Hinweise auf mögliche genetische Zusammenhänge 

geben. SNPs, die nur bei Merkmalsträgern zu finden sind, können so nach weiterer 

Überprüfung als genetische Marker eingesetzt werden, z.B. für die Diagnostik von 

Krankheiten (siehe 11.2). 

Obwohl die genauen Pathomechansimen, über die die durch GWAS ermittelten 

Kandidatengene wirken, meist noch nicht bekannt sind, können die Gene dem 

innaten bzw. dem adaptiven Immunsystem zugeordnet werden. Zu der erworbenen

20 

Abwehr gehören einige Faktoren der T-Zell-Immunantwort; Interleukin 10 (IL10), 

Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 1 (PTPN2) sowie Protein 

Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 22 lymphoid (PTPN22) verringern die 

Aktivität von T-Zellen, während eine Anregung der T-Helfer (Th) 1- und Th2-Zytokin- 

Produktion durch das Inducible T-cell Costimulator Ligand Gen (ICOSLG) stattfindet. 

Die Gene IL23R und IL12b kodieren für Proteine, die an der Entwicklung 

beziehungsweise Funktion von Th-Zellen der Typen 1 und 17 beteiligt sind, während 

viele weitere Gene ebenfalls Einfluss auf das adaptive Immunsystem nehmen (siehe 

11.2). Sie regulieren z.B. die Apoptose (CDKAL1, TNFRSF6B, TNFS15) oder 

Transkriptionsfaktorexpressionen (C11orf3, CREM, JAK2, LRRK2). Im Bereich der 

angeborenen Abwehrmechanismen spielen MUC19 für die Protektion der 

Darmbarriere und ATGL16L- sowie IRGM- regulierte Autophagieantigene eine Rolle. 

Des Weiteren steuert MST1 die Chemotaxis von Makrophagen und NOD2 die 

Immunantwort auf Bakterien. 

5.3 Tiermodelle CED 

Tiermodelle dienen der Erforschung menschlicher Erkrankungen, um durch 

Untersuchungen an diesem Modell neue Erkenntnisse bezüglich der Ursache, des 

Verlaufs oder der Therapie des jeweiligen Leidens zu finden. Für Chronisch 

Entzündliche Darmerkrankungen (CED) gibt es zahlreiche Tiermodelle, die entweder 

eine spontane Colitis entwickeln (SAMP1/Yit-Maus, MATSUMOTO et al., 1998) oder 

artifiziell beeinflusst werden müssen, um die gewünschte Symptomatik zu zeigen, 

wie z.B. bei der durch Natriumdextransulfat (Dextran Sodium Sulfat, DSS) 

induzierten Colitis. Außerdem werden verschiedene Mausstämme eingesetzt, die 

aufgrund genetischer Modifikationen Entzündungen des Gastrointestinaltraktes 

entwickeln (PIZARRO et al., 2003). Bei CED handelt es sich um eine multifaktorielle 

Erkrankung, auf deren Entstehung neben der Genetik des Patienten auch Umwelt 

und Darmflora Einfluss nehmen. Daher ist es wichtig, dass diese Faktoren bei 

genetisch determinierten Mäusen genau definiert und reguliert werden können. Die 

Bakterien im Darm eines gesunden Tieres erfüllen diverse essentielle Funktionen; 

sie versorgen den Wirtsorganismus mit verschiedenen Vitaminen und kurzkettigen 

Fettsäuren, regen die Peristaltik an, entgiften Xenobiotika (NICHOLSON et al., 2005), 

unterdrücken das Wachstum von pathogenen Bakterien durch die Produktion von 

Antimikrobiotika und sind an der Immunmodulation beteiligt (RAKOFF-NAHOUM et 

al., 2004). Des Weiteren stabilisieren sie die Darmbarriere durch die Produktion von 

Butyrat, das von den Darmepithelzellen zur Energiegewinnung verstoffwechselt wird. 

All diese Funktionen beeinflussen die Entstehung von Colitis im Mausmodell, sodass 

einige Stämme, die mit einer konventionellen Darmflora eine Darmentzündung

21 

entwickeln, unter keimfreien Haltungsbedingungen nicht vom Ausbruch der 

Erkrankung betroffen sind. Außerdem gibt es Bakterien, die nachweislich 

entzündungshemmende (z.B. Lactobacillus ssp.) oder -fördernde (z.B. Helicobacter 

ssp.) Eigenschaften besitzen. 

Tabelle 1: Beispiele für die Einflüsse der Darmflora auf CED-Modelle (modifiziert 

nach BÜCHLER, 2006) 

Ausprägung Mausstamm/ Modell Referenz 

Keine Kolitis bei 

keimfreier 

Haltung 

Reduzierte 

Kolitis bei 

strikter SPF- 

Haltung 

Reduzierte 

Kolitis trotz 

kolitogener 

Flora 

IL2-defizient 

IL10-defizient 

SAMP1/Yit 

IL2-defizient 

IL10-defizient 

Mdr1α-defizient 

CD4+/CD45RBhigh-Transfer 

IL10-defiziente Mäuse: Lactobacillus spp. 

DSS Kolitis: Lactobacillus ssp., Bifidobacterium 

infantis, Escherichia coli (E. coli) Nissle 

CD4+/CD26L+- Prkdc scid -Transfer: 

Bifidobacterium infantis, Lactobacillus reuteri und 

E. coli Nissle 

SADLACK et 

al., 1993; 

SELLON et 

al., 1998; 

MATSUMOTO 

et al., 1998; 

KÜHN et al., 

1993; 

SADLACK et 

al., 1993; 

MORRISSEY 

et al., 1994; 

PANWALA et 

al., 1998; 

HANS et al., 

2000; 

MADSEN et 

al., 2000; 

MADSEN et 

al., 2000; 

SCHULTZ et 

al., 2000; 

JIJON et al., 

2004; 

SCHULTZ et 

al., 2004; 

GEIER et al., 

2007; 

FITZPATRICK 

et al., 2007; 

VAN DER 

KLEIJ et al.,

Forcierte Kolitis 

bei kolitogener 

Flora 

22 

Enterococcus faecalis bei IL10-defizienten 

Mäusen 

E. coli bei IL10-defizienten Mäusen 

Helicobacter spp. bei verschiedenen 

Mausmodellen 

2008; 

CAHILL et al., 

1997; 

KULLBERG et 

al., 1998; 

CHIN et al., 

2000; 

BURICH et 

al., 2001; 

BALISH et al., 

2002; KIM et 

al., 2005 

Auch die Genetik der Mäuse spielt bei einigen Modellen eine bedeutende Rolle, z.B. 

im Modell der Il10-defizienten (Il10 tm1Cgn ) Maus. Je nach Stamm zeigen die Mäuse 

verschiedene Schweregrade und Verlaufsformen der Colitis. Als Ausgangspunkt für 

die vorliegende Arbeit dienen hierbei die Stammesunterschiede zwischen Mäusen 

der Stämme C57BL/6J.129P2-Il10 tm1Cgn /JZtm (B6-I10 -/- ) und C3H/HeJBir.129P2- 

Il10 tm1Cgn /JZtm (C3Bir-Il10 -/- ). 

Tabelle 2: Ausrichtung der Colitis bei Il10 -/- Mäusen verschiedener 

Hintergrundstämme (modifiziert nach BÜCHLER, 2006) 

Hintergrundstamm Schwere und Verlauf 

der Kolitis 

Referenz 

C57BL/6J Mild, protrahiert BERG et al., 1996; TAKEDA et al., 

1999; BRISTOL et al., 2000 

BALB/c Intermediär, progressiv TAKEDA et al., 1999 

NOD/Lt Intermediär, progressiv MÄHLER et al., 2002 

NOD.NON-H2 nb1 Intermediär, progressiv MÄHLER et al., 2002 

129/SvEv Schwer, progressiv TAKEDA et al., 1999 

C3H/HeJBir Schwer, beginnt sehr früh BRISTOL et al., 2000 

C3H.SW Schwer, beginnt sehr früh MÄHLER et al., 2002

5.4 Vorarbeiten 

23 

1993 wurde am Institut für Genetik der Universität Köln die Interleukin10 (Il10)defiziente 

(Il10 tm1Cgn ; Il10 -/- ) Maus entwickelt. IL10 dient der Regulation des 

Immunsystems und schützt den Organismus, indem es überschießende 

Abwehrreaktionen vermeidet (GRÜTZ, 2005). Die Nullmutation von Il10 im oben 

genannten Mausstamm verursachte eine überschießende Immunreaktion auf 

luminale Xenoantigene des Darmes, die verschiedene Merkmale der Colitis Ulcerosa 

und Morbus Crohn aufwiesen (KÜHN et al., 1993); die Tiere entwickelten eine meist 

letal verlaufende, chronische Enterocolitis, die vornehmlich Zäkum sowie Kolon 

betraf und histologisch durch mukosale Entzündungszellinfiltrate in Verbindung mit 

intraluminalen fibrinoiden Ablagerungen gekennzeichnet war. Bei der Untersuchung 

verschiedener Il10 -/- -Stämme zeigte sich in Zusammenarbeit mit Dr. Leiter (The 

Jaxon Laboratory, USA), dass die Nullmutanten des C3Bir-Stammes eine deutlich 

schwerere Form der Colitis entwickelten als B6-Il10 -/- -Mäuse, was verdeutlicht, dass 

die Krankheitsausprägung von der Genetik des Hintergrundstammes beeinflusst wird. 

Sich anschließende genomweite Kopplungsanalysen an segregierenden 

Kreuzungspopulationen dieser Stämme zeigten, dass die 10 gefundenen CED- 

Suszeptibilitäzsloki (Quantitative Trait Loci, QTL), die auch als Cytokine deficiency 

induced colitis susceptibility (Cdcs) 1 bis 10 bezeichnet werden, einer sehr 

umfassenden genetischen Kontrolle unterliegen (BLEICH et al., 2004). Wie schon bei 

anderen QTL beobachtet, findet man diese Allele nicht nur im suszeptiblen Stamm 

C3Bir, sondern teilweise (Cdcs4, Cdcs6, Cdcs8) auch bei den eigentlich resistenten 

B6-Mäusen. Innerhalb der 10 QTL konnten durch weitere genetische 

Untersuchungen und Microarray-Analysen 8 Kandidatengene identifiziert werden (DE 

BUHR et al., 2006): Guanylate Binding Protein 1 (Gbp1) im Cdcs1; Heat Shock 

Protein (Hsp) 1a, Hsp1b und Lymphocyte Antigen 6 Complex Locus G6C (Ly6g6c) 

im Cdcs5; Cluster of differentiation (Cd14) im Cdcs6; Phospholipase A2 group IIA 

(Pla2g2a) und Guanine Nucleotide Binding Protein 1 (Gnb1) im Cdcs9; Amphiregulin 

(Areg) im Cdcs10. Nach einem Vergleich der Gen-Expressionen zwischen Il10 -/- 

Mäusen beider Hintergrundstämme und Wildtypvarianten kristallisierten sich 3 

Kandidatengene heraus, die in allen Stämmen einen hohen Einfluss auf das 

Expressionsniveau hatten: Gbp1 (Cdcs1, Chromosom 3), Cd14 (Cdcs6, Chromosom 

18) und Pla2g2a (Cdcs9, Chromosom 4). Bezüglich C3Bir zeigten sowohl Mäuse in 

konventioneller als auch in keimfreier Haltung eine deutlich höhere CD14-Produktion 

als B6 (DE BUHR et al., 2006), wobei CD14 im Darm in löslicher Form vorlag 

(soluble CD14, sCD14) und einen protektiven Effekt gegen die Colitisentwicklung 

hatte. Die insgesamt geringere CD14-Produktion in keimfreien Tieren zeigte, dass 

die Mikroflora über verschiedene Rückkopplungsmechanismen einen Einfluss auf die 

Expressionshöhe des Proteins hatte. Es konnte nachgewiesen werden, dass es bei

24 

Mäusen parallel zum Menschen eine Gewebespezifität der Cd14-Expression gab 

(DE BUHR et al., 2009) und die stammabhängige Expressionshöhe nicht durch einen 

defekten Toll Like Receptor (TLR) 4 hervorgerufen wurden (DE BUHR et al., 2006). 

Durch verschiedene Untersuchungen konnten u.a. 11 Polymorphismen identifiziert 

werden, die verschiedene mögliche Transkriptionsfaktorbindungsstellen verändern, 

z.B. STAT1 (nur bei C3Bir an Position -823), BCL6 (nur bei B6 an -244), SP2 (nur bei 

C3Bir an-244) und PPARG (nur bei B6 an -360). Der Einfluss beider Promotoren auf 

die CD14-Produktion wurde mittels Kotransfektion des jeweiligen 

Ausgangspromotors in einem Luziferasreporterplasmid mit einem β-Galaktosidase 

kodierenden Plasmid in RAW264.7-Zellen (murine Makrophagen) untersucht. Die 

vorher bereits in vivo beobachtete höhere Basalaktivität von Cd14 im C3Bir-Stamm 

wurde in vitro sowohl basal als auch nach Lipopolysaccharid-Stimulation verifiziert. 

5.5 Cd14 

Cluster of differentiation 14 (Cd14) ist ein 356 Aminosäuren langes und 55 kDa 

großes Glykoprotein, das in einem Suszeptibilitätslocus für Chronisch Entzündliche 

Darmerkrankungen auf Chromosom 5q 23-31 kodiert ist (CED; VAN HEEL et al., 

2004). Es ist über eine Glykosylphoshpatidolinositol(GPI)-Verbindung in der 

Zellmembran verankert (SIMMONS et al., 1989) und bildet dort zusammen mit dem 

Lymphozyten-Antigen 96 sowie dem Toll Like Receptor 4 (TLR4) einen Rezeptor für 

Lipopolysaccharide (LPS), die einen Bestandteil der Zellwand gramnegativer 

Bakterien darstellen. Cd14 wird auf reifen Monozyten exprimiert und die auf den 

Monozyten verbleibende Form wird als membrangebundenes CD14 (membrane 

bound CD14, mCD14) bezeichnet. Durch die Bindung von LPS an mCD14 wird das 

Myeloid differentiation primary response Gen 88 (Myd88) aktiviert, was zu einer 

Rekrutierung der Interleukin-1-Rezeptor assoziierten Kinase führt. Daraus resultiert 

eine Initialisierung des Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)-Rezeptor-α assoziierten Faktors 

6 (TRAF6). TRAF6 verursacht die Phosphorylierung der Inhibitor of κ B (IκB) Kinase 

und die Freisetzung von NF-κB sowie das Einschlagen des Mitogen aktivierten 

Proteinkinase-Weges. Neben Myd88 wird durch das Binden von LPS an mCD14 und 

TLR4 auch der Toll-Like Receptor Adaptor Molecule 2 (TRIF) Weg aktiviert, der zur 

Rekrutierung von IRF3 führt. Die Triggerung von NF-κB und IRF3 führt zur 

Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine und in einigen Zellen zur Apoptose 

(FUKATA et al., 2008). Zudem nimmt mCD14 an der Integrin abhängigen Fibrinogen- 

Adhäsion und der Komplement unabhängigen Phagozytose gramnegativer Bakterien 

teil (LANDMANN et al., 2000). Lösliches CD14 (soluble CD14, sCD14) zirkuliert als 

Plasmaprotein ohne Verankerung in der Zellwand (DZIARSKI et al., 2000) und 

entsteht, indem entweder keine GPI-Verankerung synthetisiert oder die Verankerung

25 

in der Zellmembran durch Serinproteinasen gelöst wird (BUFLER et al., 1995). Es 

konkurriert mit mCD14 um die Bindung von LPS und zeigt einen hemmenden 

Einfluss auf die Aktivierung des Komplementsystems (HAZIOT et al., 1994). TLR4, 

der von den Epithelzellen des Darms nur spärlich exprimiert wird, sowie CD14 

werden bei Patienten mit Chronisch Entzündlicher Darmerkrankung (CED) vermehrt 

synthetisiert, was zu einer erhöhten Sensibilität und Reaktivität gegenüber der 

Mikroflora des Darmes führt (ABREU et al., 2001; SUZUKI et al., 2003). Es bleibt zu 

klären, ob die erhöhte Expression von CD14 tatsächlich die Ursache der Entzündung 

ist oder durch sie ausgelöst wird. Gleiches gilt für die gesteigerte TLR4-CD14- 

Expression in Makrophagen der Lamina Propria (FUKATA et al., 2008). 

Abbildung 1: Hauptweg der Beeinflussung von CED durch CD14

5.6 Ziele dieser Arbeit 

26 

Der deutlich schwerere Verlauf der Colitis bei C3Bir-Il10 -/- -Mäusen im Vergleich zu 

Tieren des Stammes B6-Il10 -/- konnte auf deren genetischen Hintergrund 

zurückgeführt werden. Durch anschließende Kopplungs- und Microarrayanalysen 

wurden verschiedene Kandidatengene identifiziert, zu denen unter anderem auch 

Cd14 gehörte; es wurde im C3Bir-Stamm signifikant höher exprimiert als bei B6 und 

hatte einen protektiven Einfluss auf die Entstehung einer Colitis. Reportergenassays 

zeigten auch in vitro eine signifikant höhere Aktivität des C3Bir-Cd14-Promotors und 

es stellte sich heraus, dass in beiden Stämmen eine Reihe von 

Promotorpolymorphismen vorlagen. Das führte zu dem Ziel dieser Arbeit, die zur 

unterschiedlich hohen Cd14-Expression zu Grunde liegenden 

Promotorpolymorphismen zu identifizieren. Beide Promotoren wurden trunkiert 

(1300bp-, 900bp-, 600bp-, 300bp-, 130bp-Fragmente), anschließend transient in 

murine Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 transfiziert und durch 

Luciferaseanalysen ausgewertet, um die Promotorabschnitte einzugrenzen, die für 

die divergierende Aktivität der Stämme verantwortlich waren. Bereiche, die einen 

entscheidenden Einfluss auf die Expression von Cd14 zu haben schienen, sollten 

weiter verkürzt werden, um die Zahl der in Frage kommenden Promotorelemente zu 

dezimieren. Die so identifizierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen sollten durch 

gezielte Mutagenese inaktiviert werden, um ihre Funktion anschließend in 

Reportergenanalysen zu überprüfen. Abschließend sollten zum Nachweis der 

physikalischen Bindung zwischen DNS und spezifischen Proteinen Electrophoretic 

Mobility Shift und Supershift Analysen durchgeführt werden.

6 Material und Methoden 

6.1 Geräte 

CO2-Inkubatoren INC108 (Fa. Memmert®) 

27 

ELISA-Reader 2030 Multilabel Reader Victor X3 (Fa. 

Perkin Elmer®) 

Feinwaage LA230S (Fa. Sartorius®) 

TE1502S (Fa. Sartorius®) 

Gelelektrophoresekammer Forschungswerkstätten MHH 

Kapillarsequenzierer 310 Genetic Analyzer (Fa. ABI 

PRISM®) 

Kühleinrichtungen 4°C Comfort 111714 (Fa. Liebherr®) 

1111724 (Fa. Liebherr®) 

-20°C 361414 (Fa. Liebherr®) 

-80°C 6483 (Fa. GFL®) 

Laborwaage MC1 Laboratory CC2200S (Fa. 

Sartorius®) 

Magnetrührer RH-KT/C (Fa. IKA®) 

Mehrkanalpipetten Transferpette-8 10-100 µL (Fa. 

Brand®) 

Mikroskop Axiovert 135 (Fa. Zeiss®) 

Mikrowelle R-2V16 700W (Fa. Sharp®) 

Photometer Biotechnologie Nanodrop 

Spectrophotometer ND-1000 (Fa. 

Peqlab®)

28 

Pipetten Research 2,5 µL/10 µL/100 µL/200 

µL/1000 µL/10 mL (Fa. Eppendorff®), 

Serological Pipette, sterile, nonpyrogenic, 

Größe 25 mL/10 mL/5 mL 

(Fa. Sarstedt®) 

Pipettierhilfe Pipetboy acu (Integra Biosciences®) 

Reaktionsgefäßschüttler Mixing Block MB-102 (Fa. BIOER®) 

Realtime-PCR-Gerät StepOnePlus Real-Time PCR System, 

StepOne/StepOnePlus-Version 2.0 

(Fa. Applied Biosystems®) 

Schüttelinkubator 3033 (Fa. GFL®) 

Semi-Dry Blotter Maxi V20-SDB (Fa. Carl Roth®) 

Stromquelle MBP 300 EP 3000 Volt Programmable 

Power Supply (Fa. MBP®) 

Power Pack P25 (Fa. Biometra®) 

Thermocycler PTC-200 Peltier Thermal cycler (Fa. 

MJ Research®) 

Thermoschüttler Mixing Block MB-102 (Fa. BIOER®) 

Tischzentrifuge Biofuge fresco (Fa. Heraeus®) 

Vertikaldoppelelektrophoresekammer MINI-Vertikal Doppel- 

Elektrophoresekammer kühlbar (Fa. 

Carl Roth®) 

Vortexer MS3 digital (Fa. IKA®) 

6.2 Verbrauchsmaterialien 

Abdeckung Optical Adhesive Covers (Fa. Applied 

Biosystems®) 

Einfriergefäß Kryoröhrchen (Fa.Greiner®)

29 

Nylon-Membran Immobilon-P Transfer Membrane (Fa. 

Millipore®) 

Pipettenspitzen 1000 µL/200 µL/10 µL (Fa. Sarstedt®) 

Reaktionsgefäße 96-Well Reaction Plate 0,1 mL (Fa. 

Applied Biosystems®) in transparent 

und weiß 

PCR Softtubes 0,2 mL (Fa. Biozym®) 

0,5 mL EASY CAP (Fa. Sarstedt®) 

1,5 mL EASY CAP (Fa. Sarstedt®) 

Röntgenfilm Röntgenfilm (Fa. GE Healthcare®) 

Zellkulturplatten 6-Well mit Flachboden (Fa. Greiner®) 

Zellkulturflaschen 75 cm2, Filterdeckel (Fa. Corning®) 

Zellkulturschalen 6 cm Durchmesser (Fa. Sarstedt®) 

10 cm Durchmesser (Fa. Sarstedt®) 

Zellschaber Cellscraper (Fa. Greiner BioOne®) 

Zellzählkammer Neubauer Zählkammer (Fa. 

Marienfeld-Neubauer®) 

6.3 DNS 

6.3.1 Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 

Das grundlegende Prinzip der PCR-Methode ist die vielfache Wiederholung eines 

Teilschrittes des Zellzyklus‘, bei der eine Kopie der beiden ursprünglichen DNS- 

Einzelstränge synthetisiert wird. Da jeder Reaktionsschritt neue identische Matrizen- 

DNS erzeugt, steigt die Kopienzahl entsprechend einer Kettenreaktion exponentiell 

an (SAIKI et al., 1988). 

Die in einzelnen Versuchsteilen verwendeten Oligonukleotide sind im Anhang (siehe 

12.2.1) aufgeführt. Standardisiert wurde jeweils 1 pg bis 10 ng genomischer DNS als 

Matrize eingesetzt.

Folgender Reaktionsansatz wurde für Mutagenese-PCRs hergestellt: 

Reaktionslösung 

30 

0,2 µL Phusion Hot Start DNA Polymerase (2 U/µL, Fa.NEB®) 

1 µL Forward Primer (10 pmol) 

1 µL Reverse Primer (10 pmol) 

4 µL 5 x HF-Puffer (Fa. NEB®) 

1 pg - 10 ng MatrizenDNS 

0,4 µL dNTPs 100 mM (Fa. Fermentas®) 

ad 20 µL H2O 

Gesamtvolumen: 20 µL 

Folgendes Standardprogramm wurde für die verschiedenen Primerkonstellationen 

und DNS-Matrizen eingesetzt: 

Vorgang Temperatur Dauer Sprung Zyklen 

1. Denaturierung 98°C 3 Minuten 

2. Denaturierung 98°C 10 Sekunden 

3. Annealing 65 bis 72°C 30 Sekunden 

4. Elongation 72°C 90 Sekunden 2. 30 

5. Elongation 72°C 5 Minuten 

6. Konservierung 15°C Pause 

Bei 72°C Elongationstemperatur erzeugt die Phusion® Hot Start DNA Polymerase 

(Fa. Finnzymes®) 1-4 KB DNS pro Minute. Die PCR-Produkte wurden durch 

Agarosegelelektrophorese identifiziert.

Folgender Reaktionsansatz wurde für Trunkierung-PCRs hergestellt: 


0,5 µL Easy-A® High-Fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene®) 

1 µL Forward Primer (10 pmol) 

1 µL PKrela (10pmol) 

31 

5 µL Easy-A® Reaction Buffer (Fa. Stratagene®) 

1 µL MatrizenDNS 

0,4 µL dNTPs 100 mM (Fa. Fermentas®) 

ad 50 µL dest. H2O 


Folgendes Standardprogramm wurde für die verschiedenen Primerkonstellationen 

und DNS-Matrizen eingesetzt: 




3. Annealing 60°C 30 Sekunden 


5. Elongation 72°C 7 Minuten 

6. Konservierung 4°C Pause 

Bei 72°C Elongationstemperatur erzeugte das Easy-A®High Fidelity PCR Cloning 

Enzyme (Fa. Agilent Technologies®) bis zu 1 KB DNS pro Minute. Die PCR- 

Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese identifiziert.

6.3.2 Mutagenese 

32 

Zur Mutagenese der verschiedenen Promotorelemente wurde in dieser Arbeit das 

Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit (Fa. Finnzymes®) eingesetzt. Die 

verwendeten Primer sind unter Oligonukleotide aufgeführt (siehe 12.2.1). 

Mutagenisiert wurde der full-length-Promotor beider Stämme. Abweichend von der 

Gebrauchsanweisung des Herstellers wurden bei der PCR-Reaktion zusätzlich 4% 

DMSO (Dimethylsulfoxid) eingesetzt. Alle anderen Schritte wurden nach 

Gebrauchsanleitung durchgeführt. Die zu mutagenisierenden Transkriptionsfaktor- 

Bindungsstellen wurden in Restriktionsenzymschnittstellen umgeschrieben. So 

konnte der putative Erfolg der Mutagenese schnell mittels Restriktionsenzymverdau 

überprüft werden, bevor eine Sequenzierung zur Verifizierung der ersten Tests folgte. 

Das PCR-Produkt wurde über Nacht mit dem Restriktionsenzym DpnI (Fa. NEB®) 

verdaut, um parentale DNS zu eliminieren. 

6.3.3 Agarosegelelektrophorese 

Die Agarosegelelektrophorese dient der Auftrennung von Nukleinsäuren. Da sich 

diese aufgrund ihrer negativen Ladung im elektrischen Feld gerichtet bewegen, 

lassen sie sich mit Hilfe einer an eine Agarose-Gelmatrix angelegten Spannung ihrer 

Größe nach auftrennen. Durch Ethidiumbromidfärbung können diese 

Nukleinsäurefragmente visualisiert werden, da Ethidiumbromid die DNS interkaliert. 

Bei Betrachtung unter UV-Licht (254 nm) fluoresziert das Ethidiumbromid intensiv 

orange. 

DNS: Für die analytischen Agarosegelelektrophoresen wurden 0,8%ige bis 3,0%ige 

Gele in TBE-Puffer mit 0,0001 Vol. Ethidiumbromidlösung (1%ig, Fa. Serva®) 

eingesetzt. Zur Herstellung der Gele wurde LE Agarose (Fa. Biozym®) verwendet. 

Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit 0,1 Volumen 10 x Ladepuffer 

versetzt. Die Auftrennung erfolgte mit einer konstanten Spannung von 5 V/cm mit 

TBE als Laufpuffer. Als DNS-Größenstandard wurde die Generuler 1 kb Plus DNA 

Ladder (Fa. Fermentas®) eingesetzt. 

RNS: Für die analytischen Agarosegelelektrophoresen wurden 0,8%ige bis 2%ige 

Gele in 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure-Puffer (MOPS-Puffer, Fa. Sigma- 

Aldrich®) mit 0,0001 Vol. Ethidiumbromidlösung (1%ig, Fa. Serva®) eingesetzt. Zur 

Herstellung der Gele wurde LE Agarose (Fa. Biozym®) verwendet. Die Proben 

wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit 0,1 Volumen 10 x Ladepuffer versetzt. Die 

Auftrennung erfolgte mit einer konstanten Spannung von 5 V/cm mit 1 x MOPS als

33 

Laufpuffer. Als RNS-Größenstandard wurde die RiboRulerRNA Ladder (Fa. 

Fermentas®) eingesetzt. 

10 x MOPS 

83,7 g 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure (Fa.Sigma-Aldrich®) 

13,6 g Sodium Acetat trihydrat (Fa. Merck®) 

800 mL HPLC Wasser (Fa. J.T. Baker®) 

3,7 g EDTA (Fa. Carl Roth®) 

ad 1 L H2O 

Gesamtvolumen: 1 L 

10x RNS-Ladepuffer 

9,5 mL Formamid (Fa. Carl Roth®) 

0,1 mL 0,5 M EDTA (Fa. Carl Roth®) 

12,5 µL 20% SDS (Fa. Carl Roth®) 

2,5 mg Bromphenolblau (Fa. Merck®) 

2,5 mg Xylencyanol (Fa. Merck®) 

ad 10 mL H2O 

Gesamtvolumen: 10 mL 

10x TBE 

121 g Tris (Fa. Carl Roth®) 

55,5 g Borsäure (Fa. Merck®) 

9,3 g EDTA (Fa. Carl Roth®) 

ad 1 L H2O 

Gesamtvolumen: 1 L

5x DNS-Ladepuffer 

2 g Ficoll 400 (Fa. Sigma-Aldrich®) 

2 mL 0,5 M EDTA, pH 8,0 (Fa. Carl Roth®) 

100 mg SDS (Fa. Carl Roth®) 

34 

1 Spatelspitze Bromphenolblau (Fa. Merck®) 

1 Spatelspitze Cylenxyanol (Fa. Merck®) 


6.3.4 Sequenzierung 

Die zu sequenzierenden Proben wurden mit dem jeweils zugehörigen 

Sequenzierungsprimer (siehe 12.2.1) und dem Big Dye® Terminator v1.1 Cycle 

Sequencing Kit (Fa. Invitrogen®) nach Angaben des Herstellers bearbeitet. Die 

Aufreinigung der Proben erfolgte mit dem innu-PREP®-DYEpure-Kit (Fa. Analytic 

Jena®) nach Herstellerangaben. Die sich anschließende Sequenzierung wurde mit 

dem ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Fa. Applied Biosystems®) durchgeführt. 

Alternativ wurden Proben extern mit den vorgegebenen Primern (siehe 12.2.1) 

sequenziert (Fa. MWG Eurofins Operon®). 

6.3.5 Aufreinigung und Fällung von Nukleinsäuren 

Natriumacetat-Ethanol-Fällung: Die DNS wurde aus wässrigen Lösungen durch 

Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (Fa. Merck®), pH 5,2 sowie 2 Volumina 

100%igem Ethanol (Fa. Büfa®) gefällt. Nach einer Zentrifugation bei 13000 x g und 

4°C für 20 Minuten wurde der Überstand abgesaugt, die pelletierte DNS 2 Mal mit 

500 µl 70%igem Ethanol gewaschen und erneut unter gleichen Bedingungen 

zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Pellet 10 bis 15 Minuten 

getrocknet und in destilliertem Wasser aufgenommen.

6.3.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 

35 

Zur photometrischen Konzentrationsbestimmung von DNS und RNS wurde die 

Extinktion der DNS- bzw. RNS-Lösung mit dem Spectrophotometer gemessen. Dazu 

wurden 2 µL der Lösung auf das Gerät gegeben und bei 260 nm gemessen. Hierbei 

entspricht eine Extinktion von 1,0 ca. 50 µg/mL doppelsträginger DNS oder 40 µg/mL 

RNS. Aussagen über die Reinheit der Nukleinsäuren konnten bei zusätzlicher 

Messung der Extinktion bei 280 nm getroffen werden. Der Quotient E260/E280 liegt bei 

geringen Verunreinigungen für DNS bei 1,7-1,9 und für RNS zwischen 1,9-2,1. 

6.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) 

Die quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (quantitative realtime 

polymerase chain reaction, qRT-PCR) diente der Vervielfältigung von Nukleinsäuren. 

Das Prinzip der qRT-PCR beruhte auf dem der herkömmlichen PCR. Durch 

Fluoreszenzmessungen, die während der PCR-Zyklen vorgenommen wurden, war es 

möglich, die Nukleinsäuren auch quantitativ nachzuweisen, da die Intensität der 

Fluoreszenz in der exponentiellen Phase der Vermehrung proportional zu der 

erzeugten Nukleinsäuremenge war. Die Floureszenz entstand durch den Einbau 

Floureszenz-gekoppelter Basen in den amplifizierten DNS-Strang. Alle für den PCR- 

Ansatz benötigten Labormaterialien, die mit der verwendeten RNS in Kontakt kamen, 

waren laut Hersteller RNAse-frei oder wurden vor Gebrauch autoklaviert und mit UV- 

Licht bestrahlt. Für einen qRT-PCR-Ansatz wurde folgende Menge an Reagenzien 

verwendet: 

qRT-Ansatz 

10 µL SYBR-Green-PCR-Mastermix (Fa. Applied Biosystems®) 

1 µL MatrizenDNS 

1 µL Forward-Primer (300 nm) 

6 µL Revers-Primer (300 nm) 

7 µL HPLC-Wasser (Fa. J.T. Baker®) 

ad 20 µL H2O 

Gesamtvolumen: 20 µL

36 

Die Reaktionsansätze wurden in eine 96-Well Platte überführt und mit Optical 

Adhesive Covers abgedeckt. 

Folgendes Programm wurde für die verschiedenen Primerkonstellationen für die qRT 

eingesetzt: 




3. Annealing 60°C 20 Sekunden 


6.4 RNS 

6.4.1 Isolierung von RNS aus Zellen 

Die Gewinnung von Gesamt-RNS (rRNS, tRNS und mRNS) aus RAW264.7-Zellen 

erfolgte mit Hilfe des RNeasy® Mini Kits (Fa. Qiagen®). Unter RNAse-freien 

Bedingungen wurden 5 x 106 RAW264.7-Zellen mit 0,25% Trypsin in PBS aus der 

Zellkulturflasche gelöst und 5 Minuten bei 300 x g in einem Zentrifugationstube 

zentrifugiert. Anschließend wurde vorsichtig der Überstand abgenommen. Die 

Isolierung der RNS erfolgte nach Herstellerangaben. Die gewonnene RNS wurde bei 

-20°C gelagert und war so 1 Jahr haltbar. 

6.4.2 Reverse Transkription (RT) und RT-PCR 

In vitro kann reife mRNS als Matrize für die Herstellung einer genauen DNS-Kopie 

(copy-DNS oder cDNS) dienen. An einem DNS-Primer beginnend synthetisierte das 

Enzym Reverse Transkriptase (Fa. Qiagen®), eine in Retroviren identifizierte RNSabhängige 

DNS-Polymerase, eine identische DNS-Kopie der RNS (TAYLOR, 

ILLMENSEE u. SUMMERS, 1976; BERCHTOLD, 1989). Dieses Verfahren der 

Reversen Transkription kann in Verbindung mit der PCR zur Analyse der 

Expressionsmuster bestimmter Gene eingesetzt werden. cDNS dient zudem der 

Erzeugung rekombinanter Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Omniscript 

Reverse Transcriptase (Fa. QIAgen®) mit Oligo-dT 15 Primern (Fa. Fermentas®)

37 

benutzt. Durch die Verwendung von Oligo-dT-Primern, die sich an die 3‘ terminale 

Poly(A)-Sequenz der reifen mRNS anlagern, wurde die Kopierung der vollständigen 

mRNS gewährleistet. Pro Reaktionsansatz hat sich der Einsatz von 2 µg Gesamt- 

RNS bewährt. Folgendes Reakionsgemisch wurde hergestellt: 

Reaktionslösung: 

1 µL Omniscript Reverse Transcriptase (Fa. Qiagen®) 

5 µL 10 x Puffer RT 

0,5 µL Oligo-dT 15 Primer (0,5 µg/µl, Fa. Fermentas®) 

0,5 µL Random-Hexamere-Primer (0,5 µg/µL, Fa. Fermentas®) 

4 µL dNTP-Mix (jeweils 2,5 mM, Fa. Qiagen®) 

x µL Gesamt-RNS 

ad 20 µL DEPC-Wasser (Fa. J.T. Baker®) 

Gesamtvolumen 20 µL 

Die DNS-Synthese fand in 1 Stunde bei 37°C im Thermocycler statt, woran sich die 

Denaturierung der Reversen Transkriptase bei 73°C für 10 Minuten und die 

Konservierung bei 4°C anschlossen. Folgte außerdem eine PCR-Reaktion mit der 

synthetisierten cDNS als Matrize, so sprach man von einer Zweischritt-RT-PCR. 

Durch PCR mit spezifischen Primern für die cDNS des übiquitär exprimierten 

Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Gens aus der Glykolyse 

wurde zuerst die Integrität des cDNS-Gemisches bewiesen (Housekeeping-Gen). 

Zugleich diente das GAPDH-Signal zur Bestätigung des Einsatzes gleicher Gesamt- 

RNS-Mengen in der RT-Reaktion und somit als Abgleich für die folgenden PCR- 

Experimente. 

6.5 Plasmide 

6.5.1 Verwendete Plasmide 

pGL4.17[luc2/Neo] Vector (Fa. Promega®): T/A-Cloning Vektor. Der Vektor enthält 

ein Luziferasereportergen und ein Selektionsmarkergen für Neomycin, die 

Neomycinphosphotransferase.

38 

StrataClone PCR Cloning Vector pSC-A-amp/kan (Fa. Strata Clone®): Basisvektor 

ohne Promotor zur Klonierung eines ausgewählten Promotors. Der Backbonevektor 

enthält Selektionsmarkergene für Kanamycin und Ampicillin sowie eine β- 

Galactosidase-α-Fragment-kodierende Sequenz (lacZ´). 

pAd-Track-CMV (über Addgene®): Rekombinantes Adenovirus mit enthaltenem grün 

floureszierendem Protein (GFP) für die Transfektion von Transgenen. Der 

Backbonevector enthält einen Selektionsmarker für Kanamycin. 

6.5.2 Analytische Plasmidpräparation 

Plasmide wurden aus kleinen Bakterienkulturen (4 mL) isoliert, um schnell einzelne 

transformierte Bakterienklone durch einen nachfolgenden Restriktionsenzymverdau 

der präparierten Plasmid-DNS überprüfen zu können. 

In ein Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 1,5 mL einer Escherichia-coli (E. coli)- 

Übernachtkultur überführt und 1 Minute bei 13000 x g zentrifugiert, um die Bakterien 

zu sedimentieren. Bis auf einen geringen Rest von 50 bis 100 µL, in dem das 

Bakterienpellet resuspendiert wurde, wurde der Überstandverworfen. Nach Zugabe 

von 300 µL TENS-Puffer wurde die Suspension 5 Sekunden geschüttelt sowie 5 

Minuten bei Raumtemperatur zur alkalischen Lyse der Bakterien inkubiert 

(BIRNBOIM u. DOLY, 1979). Es folgte die Zugabe von 150 µL 3 M 

Natriumacetatlösung, pH 5,2, woraufhin die Proben 5 Minuten geschüttelt und zur 

Fällung der Proteine und chromosomaler DNS 20 Minuten bei -20°C gekühlt wurden. 

Durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 13000 x g und Raumtemperatur wurden die 

milchig-weißlichen Präzipitate pelletiert. In einem frischen Eppendorf-Reaktionsgefäß 

wurden 450 µL des Überstandes rasch mit 900 µL auf -20°C vorgekühltem 

100%igem Ethanol vermischt um die Plasmid-DNS zu fällen. Die präzipitierte 

Plasmid-DNS wurde durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 13000 x g und 4°C 

pelletiert und anschließend 2 Mal mit 70%igem Ethanol gewaschen. Nach einer 

weiteren Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde der Überstand 

abgenommen, das Plasmid-Pellet ca. 20 Minuten luftgetrocknet und anschließend in 

50 µL RNAse/TE-Puffer, pH 8,0, aufgenommen. Die erhaltene DNS wurde bei -20°C 

gelagert.

TENS-Puffer 

5 mL 1 M Tris-HCl, pH 8,0 (Fa. Carl Roth) 

1mL 0,5 M EDTA, pH 8,0 (Fa. Carl Roth) 

5 mL 10N NaOH (Fa. Merck) 

12,5 mL 20% SDS (Fa. Carl Roth) 

ad 500 mL H2O 


39 

6.5.3 Präparation hochreiner Plasmid-DNS 

Um hochreine Plasmid-DNS für Sequenzanalysen zu erhalten wurde DNS aus 

Bakterienkulturen (4 mL) mit Hilfe des QIAprep® Spin Miniprep Kit (Fa. QIAgen®) 

isoliert, wobei die Herstellerangaben strikt befolgt wurden. Eine Analyse von 

Integrität und gegebenenfalls Insertgröße des Plasmids fand durch 

Restriktionsenzymspaltung und Agarosegelelektrophorese sowie anschließende 

Sequenzierung statt. Die DNS-Konzentration wurde photometrisch bestimmt. Die 

Plasmide wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. 

6.5.4 Maxi-Präparation 

Präparative Plasmidpräparationen wurden mit dem NucleoBond® Extra Maxi EF Kit 

(Fa. Macherey & Nagel®) nach dem Protokoll des Herstellers zur endotoxinfreien 

DNS-Präparation durchgeführt. Die Verwendung endotoxinfreier DNS erhöht bei 

Transfektionsexperimenten erheblich die Effizienz des Transfers. Die Ausbeute an 

Plasmid-DNS aus einer 250-mL-Übernachtkultur liegt bei dieser 

Aufarbeitungsmethode zwischen 100 und 1500 µg. Eine Analyse von Integrität und 

gegebenenfalls Insertgröße des Plasmids fand durch Restriktionsenzymverdau und 

Agarosegelelektrophorese statt. Die DNS-Konzentration wurde spektrophotometrisch 

bestimmt. Die Plasmide wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

6.6 Ligation/Klonierung/Restriktion 

6.6.1 Ligation von DNS 

40 

Die Ligationstechnik dient der Verknüpfung homolog-kohäsiver Enden (sticky ends) 

von DNS-Fragmenten. In eukaryotischen Zellen ist die hier verwendete DNS-Ligase 

für die Reparatur aufgebrochener Phosphodiesterbindungen zuständig. Sie ligiert die 

5‘-Phosphat-Gruppe mit der 3‘-Hydroxy-Gruppe komplementärer Basenpaarstränge. 

Sie ist somit ein wichtiges Reparaturenzym. Bei Klonierungsexperimenten wird diese 

Eigenschaft dazu genutzt, DNS-Moleküle in vitro miteinander zu verknüpfen. Die 

Ligation kohäsiver Enden erfolgte mit dem Quick Ligation Kit (Fa. Finnzymes®) nach 

Herstellerangaben oder über Nacht bei 16°C nach folgendem Ansatz: 


0,5 µg linearisiertes Plasmid 

5 µg Insert 

1 µL T4-DNA-Ligase (20.000 U/mL, Fa. NEB®) 

2 µL T4-DNA-Ligase-Puffer (10x, Fa. NEB®) 

ad 20 µL H2O 


Die Lagerung fand bis zur weiteren Verwendung bei -20°C statt. 

6.6.2 T/A-Klonierung 

PCR-Produkte weisen 3’-Adenosin-Überhänge auf, die direkt mit modifizierten 

Thymin-Überhängen linearisierter Vektoren durch die Topoisomerase II verknüpft 

werden können (T/A-Klonierung). In dieser Arbeit wurde dazu das StrataClone PCR 

Cloning Kit (Fa. Stratagene®) eingesetzt, unter Verwendung von SoloPack 

Competent Cells und des Vektors pSC-A-amp/kan. Es wurde nach 

Herstellerangaben verfahren.

6.6.3 Spaltung von DNS durch Restriktionsendonukleasen 

41 

Zur Kontrolle der gewonnenen Plasmid-DNS wurde das jeweilige Plasmid mit 

spezifischen Restriktionsenzymen verdaut und die entstandenen Fragmente mittels 

Agarosegelelektrophorese aufgetrennt um ihre Größen zu bestimmen. Für den 

Verdau wurden alle Reaktionsreagenzien für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die 

Auftrennung der Plasmidfragmente mittels Agarosegelektrophorese erfolgte wie oben 

beschrieben. 

Verwendete Restriktionsenzyme (alle Fa. NEB®): 

BglII, DpnI, EcoRI, EcoRV, FseI, KpnI, PacI, SmaI, XhoI 

Reaktionslösung: 

2 µg Plasmid-DNS 

0,25 µL je Restriktionsenzym 

1,2 µL NEB-X-Puffer (Fa. NEB®) 

1,2 µL 10 x BSA (Fa. NEB®) 

ad 20 µL H2O 


6.7 Bakterien 

6.7.1 Verwendete Bakterienstämme 

Chemisch kompetente JM109 (JM109 Competent Cells, Fa. Stratagene®), die eine 

Transformationseffizienz von mehr als 1 x 10 9 Transformanden pro µg pUC18 DNS 

aufwiesen, dienten der Transformation von Ligationsansätzen bzw. der 

Retransformation. Ultrakompetente Zellen des Stammes DH5α (BP5α Competent 

Cells, Fa. BioPioneer Inc®) wurden zur chemischen Transformation von Plasmiden 

verwendet. Sie bilden mehr als 1 x 10 9 Transformanden pro µg pUC19 DNS. 

Ultrakompetente Zellen des Stammes SoloPack (SoloPack Competent Cells, Fa. 

Stratagene®), die eine Transformationseffizienz von mehr als 1 × 10 8 

Transformanden pro µg pUC18 DNS aufwiesen, wurden zur Transformation von 

Ligationsansätzen aus dem StrataClone PCR Cloning Kit (Fa. Stratagene®) 

verwendet. Ultrakompetente Zellen des E.-Coli-Stammes XL10-Gold Kan(R) (Fa.

42 

Stratagene®) mit einer Transformationseffizienz von 5 × 10 9 cfu/mg pUC18 DNS 

wurden zur chemischen Transformation von Plasmiden verwendet. Diese Zellen 

enthalten ein F‘-Episom, das ein Kanamycinresistenzgen trägt. 

Endotypen der benutzten Bakterienstämme: 

JM109 e14-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 relA1 

∆(lac-proAB) [F´ traD36 proAB lacIqZ∆M15] 

BP5α F’/endA1 hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 

D(laclZYA-argF)U169 deoR (F80dlacD(lacZ)M15) 

SoloPack Tetr ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 

gyrA96 relA1 lac Hte [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr] 

XL10-Gold Tetr∆ (mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 

gyrA96 relA1 lac Hte[F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr] 

6.7.2 Transformation von Plasmiden in E. coli 

Auf Eis wurden 50 µL chemisch-kompetenter Bakterien aufgetaut. Nur die XL10- 

Gold-Zellen wurden mit 4 µL β-Mercaptoethanol (BME) gemischt und 10 Minuten auf 

Eis inkubiert. Nach einer Studie von BANNAI (1992) verbessert BME das 

Zellwachstum, da es sich um ein stark reduzierendes Agenz handelt, das die 

Oxidation von Cystein zu Cystin verhindert, sodass diese Aminosäure besser von 

den Zellen aufgenommen werden kann. Anschließend erfolgte bei allen Zelltypen die 

Zugabe von 10 bis 20 ng zirkulärer Plasmid-DNS oder der Hälfte eines 

Ligationsansatzes und eine 30-minütige Inkubation auf Eis, während der sich die 

DNS an die Zellen anlagerte. Daraufhin wurden die Bakterien für 30 Sekunden einem 

Hitzeschock von 42°C ausgesetzt, um durch eine Ausdehnung der Zellwände die 

Einschleusung von DNS in die Zelle zu ermöglichen. Es folgte ein Abschrecken auf 

Eis für 2 Minuten, sodass sich die erweiterten Zellwände wieder in ihren 

Ausgangszustand zusammenziehen konnten. Der Ansatz wurde mit 200 µL 

vorgewärmten SOC-Medium (Fa. Invitrogen®) versetzt und eine Stunde bei 37°C 

und 225 rpm im Thermoschüttler inkubiert. So konnten sich die Zellen regenerieren 

und beginnen, das eingeschleuste Resistenzgen zu exprimieren. Jeweils 25 µL, 75 

µL und 150 µL des Transformationsansatzes wurden auf einer Agarplatte, welche 2 

µg/mL Carbenicellin (Fa. Applichem®) als Selektionsmarker enthielt, ausgestrichen. 

Die Agarplatten wurden über Nacht im Brutschrank bei 37°C bebrütet. Nur

43 

selektionsmarkerhaltige Zellen konnten auf dem antibiotikahaltigen Nährmedium 

wachsen. 

6.7.3 Blau-Weiß-Selektion 

Um nach der T/A-Ligationsreaktion und der Transformation in kompetente Zellen 

Bakterienkolonien mit Insertion im Plasmid zu detektieren, war ein weiteres 

Selektionsverfahren nötig. Die Bakterien konnten die vom Plasmid kodierte β- 

Galaktosidase erzeugen, durch die X-Gal in ein blaues Indigoderivat umgesetzt 

wurde. Bei Bakterienkolonien mit Insertion fand keine Transkription des β- 

Galaktosidasegens statt, sodass nur solche Bakterienkolonien weiß blieben, in die 

ein Plasmid mit Insert transformiert wurde. Hierzu wurde die Blau-Weiß-Selektion 

angewendet, zu der folgende Lösung benötigt wurde: 

40 mg/mL X-Gal-Lösung: 400 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid 

(X-Gal, Fa. Sigma-Aldrich®) wurden in 10 mL Dimethylformamid (Fa. ICN 

Biomedicals®) gelöst und bei -20°C gelagert. 

Die Lösung wurde auf Carbenicillin-haltige Luria-Bertani-Broth-Agarose-Platten 

aufgetragen und die zu kontrollierenden Zellen darauf ausgestrichen. 

6.7.4 Kultivierung von E. coli 

Zur Vermehrung von E. coli wurden Luria-Bertani-Broth-Medium (LB-Medium Lennox, 

Fa. Carl Roth®) als flüssige Nährlösung und LB-Agarplatten (je versetzt mit 0,2 

µg/mL Carbenicillin-Natrium) verwendet. Die über Nacht auf den bebrüteten Platten 

gewachsenen – bei der blau-weiß-Selektion weißen – Bakterienkolonien wurden mit 

Hilfe einer Pipettenspitze von der Platte in Flüssigmedium überführt und über Nacht 

bei 37°C und 225 rpm im Schüttelinkubator angezüchtet. Die Plasmidaufreinigung 

aus diesen Bakterienzellkulturen erfolgte wie beschrieben. 

LB-Medium: 20 g LB-Medium wurden in 1000 mL destilliertem Wasser aufgelöst und 

autoklaviert. Unmittelbar vor Inkulturnahme der Bakterien erfolgte die Zugabe von 0,2 

µg Carbenicellin/mL LB (100 mg Carbenicellin-Natrium/mL, Fa. Serva®). 

LB-Agarplatten: 1 L LB-Medium wurde mit 100 mg Agar-Agar (Fa. Carl Roth®) 

versehen und autoklaviert. Zur Selektion plasmidpositiver Klone wurde 2 mL 

Carbenicellin-Lösung (100 mg Carbenicellin-Natrium/mL, Fa. Serva®) nach

44 

Abkühlung auf unter 60°C zugefügt, sodass eine Endkonzentration von 0,2 mg 

Antibiotikum/mL LB entstand. Nach dem Ausgießen in Petrischalen und dem 

Auskühlen wurden die Platten bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. 

6.8 Zellkultur 

6.8.1 Verwendete Zelllinien 

NIH3T3: Der Herstellung transient transfizierter Zellen dienten murine embryonale 

Fibroblasten (MEF) der Zelllinie NIH3T3 (ATCC: CRL-1658), die mit ausreichender 

Effizienz transfiziert werden konnten. Die Fibroblasten wurden aus Embryonen des 

Mausstammes NIH/Swiss gewonnen. Laut Hersteller wurden die Zellen negativ auf 

Ectromelieviren getestet und reagierten sehr sensitiv auf Leukämie- und 

Sarkomavirusinfektionen. 

RAW264.7: Zur Herstellung stabil und transient transfizierter Zellen wurden murine 

Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 (ATCC: TIB-71) verwendet. Auch sie konnten 

mit ausreichender Effizienz transfiziert werden. Diese Makrophagenzellinie wurde 

aus einem Tumor des BALB/c-Maus-Stammes gewonnen, der durch das Murine 

Leukämievirus hervorgerufen wurde. Sie war laut Hersteller negativ auf die 

Oberflächenimmunglobuline Ia und Thy-1.2 getestet. Außerdem sezernierten sie 

keine nachweisbaren Viruspartikel. 

6.8.2 Allgemeine Zellkulturverfahren 

Folgende Medien, Puffer und Zusätze wurden für die Zellkultur verwendet: 

Dulbecco´s MEM (Modified Eagles Medium, Fa. Invitrogen®) 

Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I (enthält L-Alanyl-L-Glutamine, Natriumpyruvat, 4,5 

g/L Glukose und Pyridoxine, Fa. Invitrogen®) 

PBS (w/o Calcium und Magnesium, Fa. Invitrogen®) 

Penicillin/ Streptomycin 10000 µg/mL (Fa. Biochrom®) 

Dimethylsulfoxid (DMSO, Fa. Sigma-Aldrich®) 

Endotoxinfreies Fetales Kälberserum (FCS EF, Fa. PAA®)

Trypsin/EDTA-Lösung (in PBS w/o Ca2+, Mg2+, Fa. Biochrom®) 

Zellkullturmedium NIH3T3-Zellen: 

500 mL Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I 

50 mL FCS EF (Fa. PAA®) 

45 

10 mL Penicillin/Streptomycin (Fa. Biochrom®) 

Zellkulturmedium RAW264.7-Zellen: 

500 mL Dulbecco’s MEM 

50 mL FCS EF (Fa. PAA®) 

10 mL Penicillin/Streptomycin (Fa. Biochrom®) 

NIH3T3-Zellen wurden in 250 mL Zellkulturflaschen mit 20 mL Zellkulturmedium bei 

37°C und 5% CO2 kultiviert. Konfluenz war strikt zu vermeiden, da die Zellen sonst 

unerwünschte Differenzierungsprozesse begannen. Alle 3 Tage oder bei Erreichen 

einer Konfluenz des Zellrasens von maximal 50% wurde das Medium abgesaugt, die 

Zellen mit PBS gewaschen, anschließend trypsiniert und im Verhältnis 1:10 in 250 

mL Zellkulturflaschen ausgesäht. 

RAW264.7-Zellen wurden in 250 mL Zellkulturflaschen mit 20 mL Zellkulturmedium 

bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Alle 2 Tag oder bei einer Konfluenz von 70% wurde 

das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit einem 

Zellschaber vom Flaschenboden gelöst. Die Zellen wurden in Zellkulturmedium 

resuspendiert und im Verhältnis 1:3 bis 1:6 in 250 mL Zellkulturflaschen ausgesäht. 

6.8.3 Kryokonservierung von Zellen 

Einfriermedium wurde durch die Zugabe von 10% FCS EF und 10% Dimethyl 

Sulfoxid (DMSO, Fa. Sigma-Aldrich®) zum Zellkulturmedium hergestellt. Das 

Zellkulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und die Zellen mit 5 mL PBS 

gewaschen. Anschließend wurden sie mit Trypsin/EDTA (0,25%, Fa. Invitrogen®) 

von den Zellkulturflaschen gelöst und durch Zentrifugation bei 1000 rpm für 6 

Minuten bei 4°C sedimentiert. Das Zellpellet wurde im Einfriermedium resuspendiert,

46 

in Kryoröhrchen überführt und bei -80°C langsam vorgefroren. Nach etwa 48 

Stunden wurden die Zellen zur langfristigen Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt. 

6.8.4 Auftauen von Zellen 

Die dem Stickstofftank entnommenen Zellen wurden rasch bei 37°C im Wasserbad 

aufgetaut. Die Zellen wurden umgehend mit 50 mL Zellkulturmedium verdünnt und 

bei 4°C 6 Minuten bei 1000 rpm sedimentiert, um das bei höheren Temperaturen 

zytotoxische Frostschutzmittel DMSO aus den Zellen auszuwaschen. Der Überstand 

wurde verworfen und die Zellen in 20 mL Kulturmedium resuspendiert. Anschließend 

wurden sie in Zellkulturflaschen überführt und bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. 

6.8.5 Transfektion 

Die Transfektionen der Zellen erfolgten mit verschiedenen Reagenzien. Je 

Transfektionsansatz wurden 4,5 µg Reporter-Plasmid-DNS und 0,5 µg CMV-β- 

Galaktosidasevektor kotransfiziert. 

6.8.5.1 Transfektion der murinen Embryonalen Fibroblasten NIH3T3 mit 

PolyFect Transfection Reagent 

Für die Einschleusung von Plasmid-DNS in murine Zellen bedarf es eines speziellen 

Reagenz’. In dieser Arbeit wurde das Polyfect® Transfection Reagent zur stabilen 

Transfektion von NIH3T3-Zellen verwendet. Durch rezeptorvermittelte Endozytose 

(transmembrane Asialoglykoproteine) gelangte der Polyfect-DNS-Komplex als 

Endosom in die Zelle und wurden in den Kern transportiert. 

Die NIH3T3-Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in 6-cm-Durchmesser- 

Schalen in einer Konzentration von 4 x 10 5 Zellen pro Schale ausgesäht, mit 5 mL 

Zellkulturmedium versehen und bei 37°C sowie 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden 

30 Minuten vor Transfektionsbeginn mit 4 mL PBS gewaschen und mit frischem 

Zellkulturmedium versorgt. Zur Transfektion wurden pro Flasche 5 µg linearisierte 

DNS mit 150 µL Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I verdünnt und anschließend mit 15 

µL Polyfect versetzt und gemischt. Zur Bildung der Polyfect-DNS-Komplexe folgte 

eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, an deren Ende 1 mL 

Zellkulturmedium mit den Polyfect-DNS-Komplexen vermischt wurde. Das 

Zellkulturmedium der NIH3T3-Zellen wurde mit dieser Suspension supplementiert. 

Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde mit der Antibiotikaselektion 

begonnen, um nicht transfizierte Zellen zu eliminieren.

47 

6.8.5.2 Transfektion der murinen Makrophagenzellen RAW264.7 

Für die Einschleusung von Plasmid-DNS in murine Makrophagenzellen sind spezielle 

Transfektionsreagenzien notwendig. In dieser Arbeit kamen verschiedene 

Reagenzien zur Anwendung. Die Versuche wurden letztendlich mit dem 

XtremeGene® HP DNA Transfection Reagent (Fa. Roche®) durchgeführt. 

Die RAW264.7-Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in 6-cm-Durchmesser- 

Schalen in einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen pro Schale in 5 mL 

Zellkulturmedium bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden 30 Minuten vor 

Transfektionsbeginn mit 4 mL PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium 

versehen. Die Transfektionsreagenzien XtremeGene® HP DNA Transfection 

Reagent, XtremeGene® 9 DNA Transfection Reagent und Fugene® HD Transfection 

Reagent (alle Fa. Roche®) funktionieren nach dem gleichen Prinzip. Die Reagenzien 

setzten sich aus Lipiden, Ethanol und anderen Komponenten zusammen. Der 

Lipidkomplex band die zugefügte DNS neutral und der entstandene Komplex lagerte 

sich an die Zellwand an, sodass die Zelle ihn mittels Endozytose als Endosom 

aufnehmen konnte. Das Endosom wurde in den Zellkern transportiert, wo es zur 

Freisetzung der DNS kam. Die Transfektionen mit den verschiedenen Reagenzien 

verliefen wie folgt: 

6.8.5.2.1 Transfektion mit Fugene® HD Transfection Reagent 

Mit 10 µL Plasmid-DNS wurden 25 µL Transfektionsreagenz und 465 µL Wasser 

gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde 

anschließend auf die Zellen gegeben und diese vor dem Ernten 24 Stunden inkubiert. 

6.8.5.2.2 Transfektion mit XtremeGene® HP DNA Transfection Reagent 

Mit 5 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 500 µL DMEM gemischt, 20 

µL Transfektionsreagenz versehen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 

Anschließend wurde die Mischung vor der 48-stündigen Inkubation zu den Zellen 

gegeben und die Schale 30 Sekunden geschwenkt. Es folgte das Ernten der Zellen. 

6.8.5.2.3 Transfektion mit XtremeGene® 9 DNA Transfection Reagent 

Mit 5 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 500 µL DMEM gemischt, 30 

µL Transfektionsreagenz versehen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 

Die Mischung wurde zu den Zellen gegeben und die Schale 30 Sekunden 

geschwenkt. Nach 48 Stunden Inkubationszeit folgte das Ernten der Zellen. 

6.8.5.2.4 Transfektion mit Superfect® Transfection Reagent 

Das Transfektionsreagenz bestand aus einem aktiven Dendrimermolekül, von 

dessen zentraler Bindungsstelle aus positiv geladene Aminogruppen hervorragten, 

die mit den negativ geladenen Phosphatgruppen von Aminosäuren interagierten und 

Komplexe bildeten. Diese neutralen Komplexe lagerten sich an die Zellwand an und 

wurden von der Zelle mittels Endozytose aufgenommen. Die daraus resultierenden

48 

Endosomen wurden in den Zellkern transportiert, wo die enthaltene DNS freigesetzt 

wurde. 

Mit 5 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 145 µL DMEM gemischt, mit 

30 µL Transfektionsreagenz versehen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 

Zu dem Komplex wurde 1 mL Vollmedium gegeben, gemischt und das Gemisch 

sofort auf die Zellen appliziert. Die Schale wurde 3 Stunden im Brutschrank inkubiert, 

bevor der Überstand abgenommen und die Zellen einmal mit 4 mL PBS gewaschen 

wurden. Anschließend wurden die Zellen mit frischem Vollmedium versorgt und 

weitere 48 Stunden unter Zellkulturbedingungen inkubiert bevor sie geerntet wurden. 

6.8.5.2.5 Transfektion mit Targefect® RAW und Virofect® 

Targefect® war ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz, bei dem ein neutraler DNS- 

Lipid-Komplex entstand, der sich an die Zellwand anlagerte und mittels Endozytose 

von der Zelle als Endosom aufgenommen wurde. Das Endosom gelangte in den 

Zellkern, wo die enthaltene DNS freigesetzt wurde. Bei Virofect® handelte es sich 

um ein replikationsdefizientes Adenovirus, das in Verbindung mit Targefect® 

unterstützend eingesetzt wurde. Das Virus band an die Adenovirusrezeptoren der 

Zelloberfläche und verstärkte so die Endozytose von Transfektionsreagenz-DNS- 

Komplexen durch die Zelle. Außerdem wurde die lysosomale Degradation der 

Komplexe verhindert. 

Mit 30 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 60 µL Targefect® und 120 µL 

Virofect® sowie 3 mL DMEM Glutamax gemischt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. 

Die Mischung wurde auf die zu transfizierenden Zellen gegeben und diese 

anschließend 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Es folgte das Ernten 

der Zellen. 

6.8.6 Etablierung stabil transfizierter Zellen 

Stabil transfizierte Zelllinien zeichnen sich durch die dauerhafte Integration eines 

Plasmids in das Genom der Zellen aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch 

Transfektion linearisierte Plasmide, die eine zusätzliche Resistenz gegen das 

Antibiotikum Geneticin (G418, Fa. Sigma-Aldrich®) vermitteln, in RAW264.7-Zellen 

eingeschleust. Es schloss sich eine Antibiotikabehandlung für 10 Tage an, die nichtrekombinante 

Zellen eliminierte. In dieser Arbeit wurde 1 Tag nach der Transfektion 

mit der Selektion begonnen und die Zellen mit 400 µg G418/mL Zellkulturmedium 

versehen. Alle 2 Tage wurde das Medium abgenommen und die Zellen mit PBS (Fa. 

Invitrogen®) gewaschen, um abgestorbene Zellen zu eliminieren. Anschließend 

wurde neues Medium mit G418 supplementiert und auf die Zellen gegeben. Die

49 

überlebenden Zellen, die durch Integration des Plasmids resistent gegen das 

Antibiotikum waren, wurden mittels PCR und Reverse Transcription PCR (RT-PCR) 

analysiert. Den Zellkulturmedien wurde ständig das entsprechende Antibiotikum 

zugefügt, sodass der fortgesetzte Selektionsdruck eine Deletion des integrierten 

Plasmid verhinderte. 

6.8.7 Luziferase-Analyse 

Von dem wie bei der β-Galaktosidase-Analyse beschrieben geernteten Zellextrakt 

wurden 20 µL in einer weißen 96-well-Platte vorgelegt. Das Extrakt wurde zunächst 

mit 120 µL Messpuffer versehen und geschüttelt. Direkt vor der Messung wurden 40 

µL D-Luziferin-Natriumsalz-Lösung (Fa. Applichem®) zugegeben und erneut 

geschüttelt. Infolge der Transfektion des Luziferase-Reporterplasmids pGL4.17 in die 

Zellen produzierten sie das Enzym Luziferase. Diese Luziferase sorgte unter 

Anwesenheit von Sauerstoff für die Umsetzung von Luziferin in instabile Dioxetane. 

Die Dioxetane oxidierten, was zur Lichtemission führte. Diese Biolumineszenz war 

bei 450 nm im ELISA-Reader messbar. Sowohl die Zugabe des Messpuffers als 

auch des D-Luziferin-Natriumsalzes sowie das anschließende Schwenken erfolgten 

durch 2 Injektoreinheiten des ELISA-Readers sowie den ELISA-Reader selbst. 

Luziferase-Messpuffer: 

1,65 g Glycylglycin (Fa. Carl Roth®) 

15 mL von 1 M Magnesiumsulfat (Fa. Merck®) 

ad 500 mL H2O 

frisch zugeben: 

25 mL von 100 mM ATP (Fa.Carl Roth®)-Stock 


ATP (Adenosintriphosphat) Stock: 100 mM ATP (Fa. Carl Roth®) in 200 mM Tris- 

Base, 1g/18,14 mL; die Lösung wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20°C 

gelagert.

6.8.8 β-Galaktosidase-Analyse 

50 

Die Kotransfektion des β-Galaktosidase-Expressionsvektors diente aufgrund der 

starken, vom Cytomegalievirus (CMV) Promotor abhängigen Expression des β- 

Galaktosidase-Gens als Kontrolle der Transfektionseffizienz und somit als 

Korrekturgröße für durch Transfektionsexperimente gewonnene Ergebnisse. Die 

Aktivität der β-Galaktosidase konnte in Zellextrakten mit geeigneten Substraten in 

einer Farbreaktion spektrophotometrisch schnell und einfach nachgewiesen sowie 

quantifiziert werden. 

Pro Transfektionsansatz wurde 4,5 µg Reporter-Plasmid-DNS und 0,5 µg CMV-β- 

Galaktosidasevektor zugesetzt. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion 

zweimal mit PBS gewaschen, anschließend mit 350 µL 1 x Extraktionspuffer für 10 

Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurde das Zelllysat abgeschabt 

und 5 Minuten in der Tischzentrifuge bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand 

wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zur Messung seiner Aktivität 

auf Eis gelagert. 10 µL der Zellextrakte wurden mit 100 µL Assaypuffer in einer 

transparenten 96-well-Platte bis zu einer leichten Gelbfärbung bei 37°C im Dunkeln 

inkubiert. Nach dem Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 50 µL 1 M 

Natriumhydrogencarbonat, was zur Intensivierung der Gelbfärbung führte, wurde die 

Färbung mit 405 nm im Photometer gegen einen Leerwert (pGL4.17-transfizierte 

Kontrolle) gemessen. Der lineare Bereich reichte von 0,2 bis 0,8 OD405. 

5 x Extraktionspuffer: 

12,5 mL 1 M Tris/Phosphat (pH 7,8 mit H3PO4, Fa. Merck®) 

2 mL 0,5 M Ethylendiamintetraacetat (EDTA), pH 8,0 (Fa. Carl Roth®) 

50 mL 100% Glycerol (Fa. Merck®) 

5 mL Triton X-100 (Fa. Sigma-Aldrich®) 

ad 100 mL H20 

frisch zufügen: 

2 µL/mL 1 M Dithiotreitol(DTT)-Lösung (Fa. Carl Roth®) 

Gesamtvolumen: 100 mL

Analysepuffer: 

10,7 g Na2PO4 x 2 H2O (Fa. Merck®) 

5,4 g NaH2PO4 x H2O (Fa. Merck®) 

10 mL 1 M KCl-Lösung (Fa. Merck®) 

1 mL 1 M MgSO4-Lösung (Fa. Merck®) 

ad 1 L H2O 

frisch zugeben: 

2 µL/mL 1 M DTT-Lösung (Fa. Carl Roth®) 

1 mg/mL ONPG (Fa. Sigma-Aldrich®) 


1 M KCl-Lösung: 7,65 g KCL (Fa. Merck®) in 100 mL dest. H2O 

1 M MgSO4-Lösung: 24,7 g MgSO4 x 5 H2O (Fa. Merck®) in 100 mL dest. H2O 

1 M Natriumcarbonat-Lösung: 106 g Na2CO3 (Fa. Merck®) in 1 L dest. H2O 

51 

D-Luziferin-Natriumsalz (Fa. Applichem®) 

6.8.9 LPS-Stimulation der Zellen 

Für die LPS-Stimulation (LPS, Fa. Sigma-Aldrich®) wurden 4 x 10 5 NIH3T3-Zellen 

und 4 x 10 6 RAW264.7-Zellen in Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser ausgesäht. 

Mit einer wässrigen LPS-Lösung (2 mg/mL) wurden sie 24 Stunden später versehen, 

sodass die Endkonzentration von 0,1 ng/mL Zellkulturmedium erreicht wurde. Die 

Proteine wurden 12 Stunden nach Beginn der Stimulation wie oben beschrieben 

geerntet.

6.9 Proteine 

52 

6.9.1 Isolierung von Proteinen aus Zellen 

Um vergleichbare Bedingungen für Proteinassays zu schaffen, wurden 5 x 10 5 Zellen 

in 6-cm-Zellkulturschalen ausgesäht und mit 3 ml Vollmedium supplementiert. Alle 

folgenden Schritte zur Ernte und Präparation von Gesamtzellextrakten fanden auf Eis 

bzw. gekühlt statt, um die Degradation der Proteine zu minimieren. Das 

Zellkulturmedium wurde abgesaugt und die Zellen zweimal mit 3 mL eisgekühltem 

PBS gewaschen. In 200 µl NP-40-Puffer fand die Lyse der Zellen bei 4°C für 10 

Minuten unter ständigem Schütteln statt. Anschließend wurden die Zellen auf Eis mit 

einem Zellschaber vom Schalenboden gelöst und in ein vorgekühltes Eppendorf- 

Reaktionsgefäße überführt, in dem Zelldebris durch 5-minütige Zentrifugation bei 4°C 

pelletiert wurde. Nach Überführung der Überstände in frische Eppendorf- 

Reaktionsgefäße folgte die Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford 

(BRADFORD et al., 1976). Es schloss sich die Vorbereitung der Proben für die 

Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (siehe 6.9.3) an. Die 

Proteinlysate wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. 

NP-40-Puffer: 

25 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5 (Fa. Carl Roth®) 

15 ml 5 M NaCl (Fa. J.T. Baker®) 

2,5 ml Nonidet P-40 (NP-40, Fa, Sigma-Aldrich®) 

1,05 g Natriumfluorid (Fa.Merck®) 

ad 500 mL H20 


frisch zuzufügen (zu 10 mL des NP-40-Puffers): 

100 µl 100 mM Natriumvanadat (Fa. Sigma-Aldrich®) 

10 µl 1 M DTT (Fa. Carl Roth®) 

100 µl 100 mM PMSF-Lösung (Fa. Carl Roth®) 

1 Complete Mini Tablette (Protease-Inhibitor-Cocktail, Fa. Roche®) 

Gesamtvolumen: 10 mL

1 M DTT-Lösung: 1,54 g DTT (Fa. Sigma-Aldrich®) in 10 mL dest. H2O, in 1-mL- 

Aliquots bei -20°C lagern 

53 

100 mM PMSF-Lösung: 174 mg PMSF (Fa. Sigma-Aldrich®), in 10 mL 100%igem 

Isopropanol, in 1-mL-Aliquots bei -20°C lagern 

100 mM Natriumvanadat-Lösung: 122 mg NaV03 (Fa. Merck®) in 10 mL dest. H2O, 

bei 4°C lagern 

6.9.2 Proteinbestimmung nach Bradford (BRADFORD et al., 1976) 

Die Proteinanalyse basierte auf der Veränderung der Farbabsorption des Farbstoffes 

Coomassie Brilliant Blue G-250, die nach Bindung an Proteine erfolgte. Die 

Proteinkonzentrationen der Extrakte aus der Zellkultur wurden durch dieses 

Verfahren ermittelt. 3 µl der Extrakte wurden mit 797 µl Wasser vermischt und mit 

200 µl Biorad-Dye-Reagent-Concentrate (Fa. Biorad®) versetzt. Die Proben wurden 

mit dem Vortexer gut durchmischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die 

Blaufärbung der Probe wurde bei 595 nm im Spektralphotometer gemessen und die 

Proteinkonzentration über eine Bovines-Serum-Albumin (BSA, Fa. NEB®)-Eichreihe 

(1 bis 20 µg) berechnet. 

6.9.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE ) 

Die Proteine wurden in SDS-Probenpuffer denaturiert und in Polyanionen überführt. 

Die Auftrennung der Proteine erfolgte durch Elektrophorese in denaturierenden SDS- 

Gelen aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekulargewichte (LAEMMLI, 1970). Sie 

wurden durch Coomassie-Färbung als Proteinbanden dargestellt. Die Größe der 

Proteine wurde im Vergleich mit einem definierten Molekulargewichtsstandard 

bestimmt. 

Mit Wasser wurden 10 µg Proteinlösung auf ein einheitliches Volumen aufgefüllt, mit 

5 x Probenauftragspuffer versetzt und bei 95°C 10 Minuten aufgekocht. Die Ansätze 

sowie 10 µl eines Molekulargewichtstandards (Prestained SDS-PAGE Standards, 

Low Range, Fa. Biorad®) wurden auf ein 12,5%iges SDS-Gel aufgetragen. Die 

Auftrennung erfolgte bei 30 mA solange, bis die blaue Bromphenolblau-Lauffront die 

untere Gelkante erreicht hatte. Folgende Verbindungen und Lösungen wurden 

benötigt: 

TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin, Fa. Sigma-Aldrich®)

Rotiphorese Gel 30 (Fa. Carl Roth®): 30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid 

54 

1,5 M Tris-HCl, pH 8,8: 90,8 g Tris (Fa. Carl Roth®) in 0,5 mL dest. H2O, pH 8,8 mit 

1 N HCl einstellen 

0,5 M Tris-HCl, pH 6,8: 30,3 g Tris (Fa. Carl Roth®) in 0,5 mL dest. H2O lösen, pH 

6,8 mit 1 N HCl einstellen 

10% (w/v) Ammoniumpersulfat(APS)-Lösung: 1g APS (Fa. Merck®) in 9 mL dest. 

H2O, bei 4°C lagern 

10% (w/v) SDS-Lösung: 10 g SDS (Fa. Carl Roth®) in 90 mL dest. H2O 

12,5%iges Trenngel: 3%iges Sammelgel : 

4,06 mL Rotiphorese Gel 30 (Fa. Carl Roth®) 0,5 mL Rotiphorese Gel 30 

2,5 mL 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (Fa.Carl Roth®) 1,25 mL 1 M Tris-HCl, pH 6,8 

3,28 mL dest. H2O 3,1 mL dest. H2O 

100 µL 10%ige SDS-Lösung (Fa. Carl Roth®) 50 µL 10%ige SDS-Lösung 

50 µL 10%ige APS-Lösung (Fa. Carl Roth®) 25 µL 10%ige APS-Lösung 

7,5 µL TEMED (Fa. Sigma-Aldrich®) 7,5 µL TEMED 

ad 10 mL H2O ad 10 mL H2O 

Gesamtvolumen: 10 mL Gesamtvolumen: 10 mL 

10 x SDS-Laufpuffer: 

30 g Tris (Fa. Carl Roth®) 

144 g Glycine (Fa. AppliChem®) 

10 g SDS (Fa. Carl Roth®) 

ad 1 L H2O 

Gesamtvolumen: 1 L

5x Probenauftragspuffer: 

15 mL 100% Glycerol (Fa. Serva®) 

3 g SDS (Fa. Carl Roth®) 

55 

7,5 mL 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (fa. Carl Roth®) 

1 Spatelspitze Bromphenolblau 

ad 30 mL H2O 


Der Probenauftragspuffer wurde in 1-mL-Portionen aliquotiert und bei -20°C gelagert. 

Vor Gebrauch wurden 50 µL β-Mercaptoethanol/mL Probenauftragspuffer zugefügt. 

6.9.4 Coomassie Brilliant Blau Färbung 

Die im Polyacrylamidgel durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine konnten mit dem 

Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blue dargestellt werden. Die Nachweisgrenze dieses 

Verfahrens lag bei 0,1 bis 2 µg pro Proteinbande. Die geladenen Proteinmengen 

ließen sich auf diese Weise optisch abschätzen, sodass Coomassie-gefärbte Gele 

als Beladungskontrolle für nachfolgende spezifische Nachweisverfahren wie z. B. 

Western Blot dienten. Es wurde eine fertige kolloidale Coomassie-Suspension (Fa. 

Carl Roth®) gemäß der Vorschrift des Herstellers verwendet. 

6.9.5 Western Blot 

Der Western Blot diente dem Nachweis spezifischer Proteine. Die durch SDS-PAGE 

aufgetrennten Proteine wurden mittels Semi-Dry Blotter auf eine Nylonmembran 

(Optitran BA-S 85, Fa. Whatman®) transferiert. Der Proteintransfer wurde mit 

Transferpuffer bei Raumtemperatur und 30 Volt bzw. 300 mA in 25 bis 30 Minuten 

durchgeführt. Um zu überprüfen, ob die Proteine auf die Membran übertragen 

wurden, schloss sich dem Blotten eine Poinceau-Färbung an. Dazu wurde die 

Membran 5 Minuten in dem Azofarbstoff Poinceau S (Fa. Sigma-Aldrich®) inkubiert. 

Der Farbstoff band reversibel an die positiv geladenen Aminogruppen der Proteine. 

Nach einmaligem kurzem Abspülen mit Wasser waren die Proteinbanden deutlich rot

56 

sichtbar. Anschließend wurde die Membran so oft gründlich mit Wasser abgespült, 

bis das Poinceau S makroskopisch nicht mehr sichtbar war. Anschließend wurde die 

Membran durch eine 1-stündige Inkubation in 5%iger Magermilchblockinglösung (Fa. 

Merck®) mit 2,5% BSA (Fa. Carl Roth®) in einer TBS-Tween-Lösung (Fa. Sigma- 

Aldrich®) abgesättigt, um den Anteil an unspezifischer Proteinbindungen zu 

verringern. Es folgte nach kurzem Waschen in TBS-Tween-Lösung die Inkubation mit 

dem spezifischen primären Antikörper, der nach den Angaben der jeweiligen 

Hersteller in Blocking-Lösung verdünnt wurde, über Nacht bei 4°C. Nach 3 

Waschvorgängen in TBS-Tween-Lösung wurde die Membran über einen Zeitraum 

von einer Stunde mit einer 1:10000 Verdünnung des sekundären Peroxidasegekoppelten 

Antikörpers inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in TBS-Tween- 

Lösung wurde der Blot abschließend mit dem Substratansatz gemäß den Angaben 

des Herstellers (Roti®-Lumin 1 und 2, Fa. Carl Roth®) entwickelt. Bei der 

Chemilumineszenz wird Luminol als Ausgangsstoff in Natronlauge gelöst und bildet 

Mesomere. Die an die sekundären Antikörper gebundene Meerrettichperoxidase 

(Horseradichperoxidase, HRP) bildet daraus ein instabiles Zwischenprodukt, das 

Phthalat, das sich in einem energetisch hoch angeregten Zustand befindet. Wenn 

diese hochenergetische Form durch Rücksprung eines Elektrons von der äußersten 

auf eine weiter innen gelegene Bahn eines Atoms dieses Moleküls in ihren 

Ruhezustand übergeht, wird ein Photon emittiert. In der Summe bilden die emittierten 

Photone Biolumineszenz. Die durch die Peroxidase-Reaktion emittierte 

Chemilumineszenz wurde auf einem Röntgenfilm dargestellt. 

Transferpuffer, pH 8,3: 

14,5 g Glycine (Fa. Carl Roth®) 

1,85 g SDS (Fa. Carl Roth®) 

29,0 g Tris (Fa. Carl Roth®) 

1 L Methanol (Fa. J. T. Baker®) 

ad 5 L H2O 


Der pH 8,3 wurde mit HCl (Fa. Merck®) eingestellt.

Waschpuffer (TBS-Tween) pH 7,6: 

12,1 g Tris (Fa. Carl Roth®) 

19 mL 1 N HCl (Fa. Merck®) 

40,0 g NaCl (Fa. J.T. Baker®) 

5,0 mL Tween 20 (Fa. Sigma-Aldrich®) 

ad 5 L H2O 


57 

6.9.6 Verwendete Antikörper für Western Blot 

IGG, GT X RT, HRP-2mL (goat anti rabbit, Fa. Millipore®) 

Rat monoclonal (Sa14-2) to CD14 (FITC) (Fa. Abcam®) 

Mouse monoclonal (mAbcam 8226) to beta Actin (Fa. Abcam®) 

F(ab’) 2 RABBIT ANTI MOUSE IgG:HRP (Fa. AbD serotec®) 

6.9.7 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 

Bei einem EMSA handelt es sich um eine Bindungsreaktion zwischen DNS bzw. 

RNS und Proteinen, die sichtbar gemacht wird. In dieser Arbeit wurde mit DNS 

verfahren. 

Dazu wurden Proteine mit Hilfe des Lightshift® Chemiluminescent EMSA Kits (Fa. 

Piercenet®) aus dem Zellkern isoliert und mit biotinylierter Ziel-DNS inkubiert. Die 

Proteine banden spezifisch an die DNS und das entstandene Produkt wurde 

gelelektrophoretisch durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die so separierten Banden 

wurden anschließend mit Hilfe eines Semy-Dry Blotters auf eine positive Nylon- 

Membran übertragen und für 3 Minuten mit UV-Licht quervernetzt. Darauf folgte eine 

Inkubation mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase. Die Detektion der Banden erfolgte 

mittels Exposition eines Röntgenfilms. Diese sogenannten Shift-Analysen zeigten, 

dass ein Protein spezifisch an die Ziel-DNS band. Um zu beweisen, dass es sich um 

das gesuchte Protein handelte, wurden Supershift-Analysen durchgeführt. Dazu

58 

wurde die Protein-DNS-Verbindung mit einem für das erwartete bindende Protein 

spezifischen Antikörper inkubiert. Das weitere Vorgehen erfolgte wie bei den Shift- 

Assays. Alle übrigen Schritte wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. 

6.9.8 Verwendete Antikörper für EMSA 

Oct1 antibody (Fa. Abcam®), 3 µL je Reaktionsansatz 

Anti-PPAR gamma 1+2 antibody (A3409A) (Fa. Abcam®), 3 µL je Reaktionsansatz 

Sp2 (H-9): sc-166575 (Fa. Santa Cruz), 3 µL je Reaktionsansatz

7 Ergebnisse 

59 

7.1 Etablierung des Modells für die Promotoranalysen 

7.1.1 Cd14-Expression in murinen Zelllinien in vitro 

Um zu eruieren, welche Zelllinie am besten für die Untersuchung des murinen Cd14- 

Promotors geeignet war, wurden sowohl murine Makrophagen der Linie RAW264.7 

als auch murine embryonale Fibroblasten (MEF) der Linie NIH3T3 untersucht. 

Abbildung 2: Murine Embryonale Firboblasten der Zellinie NIH3T3 

Abbildung 3: Murine Makrophagen der Zelllinie RAW264.7

60 

Die ideale allogene Zellinine zur Analyse des Promotors sollte eine endogene Cd14- 

Transkription aufweisen, um sicherzustellen, dass alle für die Transkription dieses 

Gens benötigten Faktoren in den Zellen vorhanden waren. Neben der 

Stimulierbarkeit der Cd14-Transkription war außerdem eine stabile, reproduzierbare 

Transfizierbarkeit mit vertretbarem Zeit- und Kostenaufwand eine essentielle 

Voraussetzung für die Durchführung von Luziferase-Analysen. In Western Blot 

Untersuchungen (siehe 6.9.5) konnte basal eine deutlich höhere Cd14-Expression in 

Zellen der Linie RAW264.7 als in solchen der Linie NIH3T3 nachgewiesen werden; 

nach LPS-Stimulation stieg die Expression in den Makrophagen deutlich an, während 

sie in den Fibroblasten keinen sichtbaren Einfluss hatte. 

Abbildung 4: Western Blot Untersuchung der basalen und stimulierten Cd14- 

Expression an NIH3T3- und RAW264.7-Zellen 

Der Abgleich mit Glycerinaldehyd-3-Phosphodehydrogenase (GAPDH) zeigte 

deutlich, dass Cd14 in den Fibroblasten weniger stark exprimiert wurde als in den 

Makrophagen. Mit dem Abgleich über β-Aktin als Housekeeping-Gen konnte 

nachgewiesen werden, dass in allen Zelllinien vergleichbare Proteinkonzentrationen 

vorlagen. 

7.1.2 Vergleich chemischer Transfektionsmethoden 

Die Transfektion muriner Makrophagen ist nach Erfahrungen der 

Arbeitsgemeinschaft schwierig und lässt selten die Entstehung kontinuierlich hoher, 

reproduzierbarer Transfektionseffizienzen zu. Daher wurden sowohl an murinen 

Makrophagen der Linie RAW264.7 als auch an murinen embryonalen Fibroblasten 

(MEF) der Linie NIH3T3 unterschiedliche Transfektionsreagenzien und -Methoden 

zur transienten Transfektion getestet. Die Transfektionseffizienzen wurden anhand

61 

der Anzahl GFP-positiver Zellen nach Transfektion mit dem Plasmid pAd-Track-CMV 

bestimmt. 

Der Anteil GFP-positiver NIH3T3-Zellen lag 24 und 48 Stunden nach transienter 

Transfektion mit dem Polyfect®-Reagenz (siehe 6.8.5.1) bei ca. 25% (siehe 

Abbildung 15 und Tabelle 3). Die transiente Transfektion von RAW264.7-Zellen wies 

hingegen überwiegend deutlich niedrigere Effizienzen auf (siehe Tabelle 3): Das 

Fugene® HD Transfection Reagent (siehe 6.8.5.2.1) führte zur Fluoreszenz jeder 

hundertsten Zelle (siehe Abbildung 16), während durch die Kombination aus 

Targefect® RAW und Virofect® (siehe 6.8.5.2.1) bis zu 5% der Zellen transfiziert 

werden konnten (siehe Abbildung 17). Das Superfect®-System bedingte nach 1 Tag 

Inkubationszeit einen Anteil an GFP-positiven Zellen von ca. 5%, was sich nach 2 

Tagen auf etwa 7% erhöhte (siehe Abbildung 18). Das Xtreme Gene® 9 DNA 

Transfektionsreagenz (siehe 6.8.5.2.3) erbrachte keine weitere Steigerung der 

Transfektionseffizienz mit 1% nach 24 Stunden und 5% nach 48 Stunden 

Bebrütungszeit (siehe Abbildung 19). Die höchste reproduzierbare Transfektionsrate 

wurde mit dem Reagenz XtremeGene® HP DNA erzielt (siehe 6.8.5.2.2); schon nach 

1 Tag fluoreszierten ca. 20% der Zellen und nach 2 Tagen stieg der Wert auf ca. 

25% bei adhärenten Zellen an. Im Vergleich dazu war die Transfektionseffizienz von 

RAW264.7-Zellen in Suspension mit ca. 5% deutlich schlechter (siehe Abbildung 20). 

Tabelle 3: Vergleich chemischer Transfektionsmethoden 

Zelllinie Transfektions-reagenz Inkubationszeit 

(Stunden) 

NIH3T3 Polyfect® (Fa. QIAgen®) 24 

RAW264.7 Fugene® HD Transfection Reagent 

(Fa. Roche®) 

RAW264.7 Targefect® RAW und Virofect® 

(Fa. Targeting Systems® 

RAW264.7 Superfect® (Fa. QIAgen®) 24 

RAW264.7 Xtreme Gene® 9 DNA (Fa. 

Roche®) 

48 

24 1 

24 5 

48 

24 

48 

Transfektionseffizienz 

(%) 

25 

25 

5 

7 

1 

5

62 

RAW264.7 XtremeGene® HP DNA (Fa. 

Roche® 

RAW264.7 in 

Suspension 

XtremeGene® HP DNA (Fa. 

Roche®) 

7.1.3 Optimierte Cd14-Promotoranalysen in vitro 

24 

48 

48 5 

Sowohl bei Zellen der Linie NIH3T3 als auch bei RAW264.7 konnte eine 

reproduzierbare Transfektionseffizienz von ca. 25% erreicht werden. Da das zum 

untersuchten Promotor gehörende Protein CD14 in vivo vor allem auf der Oberfläche 

von Monozyten exprimiert wird (NASU et al., 1991), wurden die Promotorstudien 

mittels transienter Transfektionen durch das XtremeGene® HP DNA Reagenz unter 

einer Inkubationszeit von 48 Stunden an Makrophagen der Linie RAW264.7 

durchgeführt. 

7.2 Vergleichende Datenbankanalyse der 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen im Cd14-Promotor von B6 und C3Bir 

Es wurde bereits gezeigt, dass der vollständige Cd14-Promotor des Stammes C3Bir 

in Luziferase-Analysen eine höhere Basalaktivität aufwies als der des B6-Stammes. 

Diese divergierenden Promotoraktivitäten könnten auf stammspezifische 

Polymorphismen, die einer unterschiedlichen Formierung von 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen resultierte, zurückzuführen sein (DE BUHR et al., 

2010). Durch eine erneute Datenbankanalyse konnten neben den bisher für den 

C3Bir-Cd14-Promotor bekannten Bindungsstellen ATF, PPARG, OCT1, PPARG, 

E2F und SP1 die Zielsequenzen für P53 sowie SP2 festgestellt werden, die bei B6 

nicht zu finden sind. Die für B6 definierten Cd14-Promotorelemente OCT1, E2F, 

BCL6, PAX2 und SP1 wurden um die für den Stamm spezifischen STAT1 sowie 

PPARG ergänzt. 

20 

25

63 

Tabelle 4: Stammspezifische Polymorphismen, Transkriptionsfaktorbindungsstellen 

und deren Lage (modifiziert nach DE BUHR et al., 2006) 

Position 

(bp) 

Sequenz (B6>C3Bir) Transkriptionsfaktor 

27 ...gat>cga� B6: POU2F1 (human synonym: OCT1) 

C3Bir: CREB/ATF 

34 ...atg>aat... B6: OCT1 

C3Bir: POU3F4 (BRN4); GSX1 (GSH1); CUT1 

(CDP); LMX1B; BARX2 

...tgc>tag... B6: NMP4/CIZ 

192 

C3Bir: PPAR/PPARG*, IR3 sites 

232 ...tgt>cct... B6: - 

C3Bir: TST1 

245 ...cta>gga... B6: LHX3 

C3Bir: POU3F1 (OCT6); STAT1** (+); STATs 

(-); MSX1 and MSX2 

472 ...gac>tgg... B6: E2F; Nuclear respiratory factor 2; ZFP105 

(human homolg: ZNF35) 

C3Bir: POU2F1 (OCT1); EVI-1 zinc finger 

protein 

707 ...acc>tct... B6: PPARG*, IR3 sites; binding sites for 

NR2C1 (TR2) homodimers or 

NR2C1/NR2C2 (TR4) heterodimers; 

ETS2; 

C3Bir: P53; AP1 

741 ...gcg>tca... B6: POU6F1 (BRN5) 

C3Bir: - 

808 ...ctt>ccc... B6: STATs; BCL6 

C3Bir: PAX3; SP2 

824 ...tcg>ctt... B6: CDX1; BCL6* 

C3Bir: PAX1; SP2; ELF2 (NERF1a) 

947 ...cca>gaa... B6: - 

C3Bir: - 

993 �cac>tcg� B6: PAX2 

C3Bir: - 

1019 ...gcc>ttt... B6: PAX2 

C3Bir: E2F 

1082- ...ac----ag> 

B6: AP1 

1086 

...acagactg� 

C3Bir: AP1

64 

Die in dieser Studie untersuchten Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind in der 

Tabelle 4 fett geschrieben. 

7.3 Aktivität der Cd14-Promotoren von C3Bir und B6 


Zur Lokalisierung von Promotorelementen, die für die Unterschiede in der 

stammesspezifischen Cd14-Expression verantwortlich waren, wurden beide 

Promotoren zunächst in annähernd 300 Basenpaare (bp) großen Schritten verkürzt. 

Die Luziferase-Analyse-Ergebnisse der Trunkierungen der Cd14-Promotoren sind in 

Abbildung 21 und Abbildung 22 dargestellt. 

7.3.1.1 Luziferase-Analyse des C3Bir-Cd14-Promotors 

Die Ergebnisse der Luziferase-Analysen des C3Bir-Cd14-Promotors sind 

übersichtlich in Abbildung 5 dargestellt. Nach transienter Transfektion in Zellen der 

Linie RAW264.7 führte die Verkürzung des Cd14-Promotors aus C3Bir von - 

1067/+203 bp auf eine Länge von -722/+203 bp zu einem leichten Anstieg der 

Reporter-Aktivität in der Luziferase-Analyse auf 123,01% des Ausgangswertes. Das 

legte die Vermutung nahe, dass in diesem Abschnitt, der im Unterschied zu B6 unter 

anderem eine Bindungsstelle für den Activating Transcription Factor (ATF) und 

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma (PPARG) enthielt, ein 

hemmender Transkriptionsfaktor lag. Eine weitere Reduktion auf -474/+203 bp leitete 

eine deutliche Zunahme der Luziferase-Expression auf 186,23% ein, weshalb sich in 

dem Bereich von -474/+203 bis -722/+203 bp wahrscheinlich ein inhibitorisches 

Promotorelement befand; dort lag bei C3Bir die Zielsequenz für den Organic Cation 

Transporter 1 (OCT1). Aus der sich anschließenden Trunkierung des Promotors auf - 

181/+203 bp ergab sich ein signifikanter Abfall der Reporteraktivität auf 11,5%. 

Voraussichtlich umfasste dieses Gebiet ein Promotorelement für ein stark förderndes 

Protein, z.B. den für C3Bir spezifischen PPARG. Das kürzeste Promotorfragment mit 

einer Länge von +85/+203 bp zeigte eine Aktivität von 93,7% und damit einen 

deutlichen Anstieg im Vergleich zum nächst längeren. Das implizierte, dass die in 

dem Abschnitt von -181/+203 bp zu +85/+203 bp liegende Erkennungssequenz für 

den E2F Transkriptionsfaktor (E2F) ein aktivierendes Element war. Weiterhin enthielt 

der kürzeste Bereich (+85/+203) unter anderem eine Bindungsstelle für das 

Specificity Protein 1 (SP1), das für die Hintergrundaktivität des Promotors 

verantwortlich gewesen sein könnte.

65 

Abbildung 5 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors

66 

7.3.1.2 Luziferase-Analyse des B6-Cd14-Promotors 

Die Ergebnisse der Luziferase-Analysen des B6-Cd14-Promotors sind übersichtlich 

in Abbildung 6 dargestellt. In der Luziferase-Analyse sank die Expression durch die 

Trunkierung des Cd14-Ausgangspromotors des Stammes B6 von -1067/+199 bp auf 

eine Länge von -722/+199 bp signifikant auf 17,47%. In dem verworfenen Bereich 

befand sich bei B6 eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor OCT1, weshalb 

angenommen wurde, dass dieser eine stark aktivierende Funktion besaß. Die sich 

anschließende Reduktion auf -474/+199 bp führte, parallel zu dem Ergebnis von 

C3Bir, zu einem Anstieg der Reportertranskription - hier auf 132,3 ,29% - und wies 

auf einen potentiell inhibitorischen Einfluss der Zielsequenz für E2F in diesem 

Bereich hin. Aus der Verkürzung auf -181/+199 bp resultierte ein deutlicher Abfall der 

Aktivität auf 40,55%. Daher wurde auch in diesem Bereich von -474/+199 bp bis - 

181/+199 bp, der unter anderem ein Promotorelement für die Bindung des 

Transkriptionsfaktors B-Cell Leukemia/Lymphoma 6 (BCL6) enthielt, ein förderndes 

Element angenommen. Die kürzeste Trunkierung des Promotors auf +85/+199 bp 

enthielt vermutlich eine stark aktivierende Erkennungssequenz, denn die 

Luziferaseexpression stieg auf 165,29% an. In dem Abschnitt von -181/+199 bp zu 

+85/+199 bp lag die Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors Paired Box Gene 2 

(PAX2), der daher als dieses anregende Element angenommen wurde. In 

Übereinstimmung mit der Luziferase-Analyse des Cd14-Promotors von C3Bir wurde 

in dem +85/+199 bp großen Stück ebenfalls die Bindung des Faktors SP1 an den 

Promotor als essentiell für dessen Basalaktivität vermutet.

67 

Abbildung 6 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors

68 

Die Reportergenanalysen des Stammes C3Bir zeigten also, dass es sich bei den 

Zielsequenzen für E2F sowie SP1 vermutlich um aktivierende Elemente handelte, 

während die Bindungsstellen für PPARG, ATF2, PPARG und OCT1 einen putativ 

hemmenden Einfluss hatten. Die Luziferaseaktivitäten des B6-Cd14-Promotors 

ergaben deutliche Hinweise auf OCT1, BCL6, PAX2 sowie SP1 als anregende 

Promotorelemente und auf E2F als inhibitorische Transkriptionsfaktorbindungsstelle. 

7.3.2 Inaktivierung potentieller Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 

7.3.2.1 Deletion durch Promotorverkürzungen 

Die Ergebnisse der Luziferase-Analysen der Deletion durch Promotorverkürzungen 

sind in Abbildung 23, Abbildung 24, Abbildung 25 und Abbildung 26 dargestellt. Um 

die vermuteten Funktionen der analysierten Bindungsstellen verifizieren zu können, 

wurden die Promotoren weiter verkürzt und so gezielt einzelne 

Transkriptionsfaktorzielsequenzen eliminiert. Die entstandenen Konstrukte wurden 

zusammen mit den bereits analysierten Trunkierungen transfiziert. 

7.3.2.1.1 Luziferase-Analyse des C3Bir-Cd14-Promotors 


übersichtlich in Abbildung 7 dargestellt. Durch die Verkürzung des 

Ausgangspromotors von -1067/+203 bp auf -722/+203 bp ergab sich, wie bereits 

ermittelt, ein Anstieg der Aktivität auf 123,95%. Gleiches galt für das Resultat der 

Trunkierung auf -474/+203 bp, die abermals in eine Expressionserhöhung mündete, 

hier auf 228,98%. Die sich anschließende Reduktion auf -398/+203 bp, bei der unter 

anderem das stammspezifische Promotorelement Anionic Peroxidase 1 (AP1) 

eliminiert wurde, führte zu einer weiteren deutlichen Steigerung der Transkription auf 

319,24%, weshalb AP1 als inhibitorische Bindungsstelle angenommen wurde. Durch 

die Elimination eines weiteren Bereiches auf eine Größe von -279/+203 bp fiel die 

Reporter-Aktivität auf 195,81%. In der Region von -398/+203 bp bis -279/+203 bp lag 

unter anderem die Zielsequenz für das Transformation Related Protein 53 (P53), das 

daher einen hemmenden Einfluss zu haben schien. Aus dem Wegfall des 

Promotorabschnittes von -297/+203 bp bis -181/+203 bp, einschließlich des hier 

kodierten, stammspezifischen Promotorelementes SP2, resultierte ein Rückgang des 

Expressionsniveaus auf 7,62%, sodass SP2 als stark aktivierendes Element 

betrachtet wurde. Eine weitere Reduktion auf -166/+203 bp, mit Elimination der 

Erkennungssequenz für E2F, verursachte einen Tätigkeitsverlust auf 0,85% und die 

Funktion von E2F wurde als leicht anregend angenommen. Das kürzeste Fragment 

mit einer Länge von +85/+203 bp zeigte ein Aktivitätsniveau von 19,47% und enthielt 

eine Bindungsstelle für SP1.

69 

Abbildung 7 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors

70 

7.3.2.1.2 Luziferase-Analyse des B6-Cd14-Promotors 


übersichtlich in Abbildung 8 dargestellt. Die Trunkierung des Ausgangspromotors auf 

-989/+199 bp unter Verwerfung der Zielsequenz für OCT1 führte zu einem Abfall der 

Aktivität auf 59,1%, weshalb OCT1 als aktivierendes Promotorelement angesehen 

wurde. Eine weitere Reduktion auf -836/+199 bp, die den Schwund einer 

Erkennungssequenz für STAT1 mit sich zog, verursachte eine Reduktion der 

Transkriptionsrate auf 1,22%; folglich galt STAT1 als stark anregende Bindungsstelle. 

Den Ergebnissen der ersten Transfektionen entsprechend (siehe 7.3.1.2), zeigte das 

-722/+199 bp große Fragment eine Aktivität von 22,74%, während das 

Expressionsniveau des nächstkürzeren Promotorkonstruktes, mit einer Größe von 

-474/+199 bp, bei 117,16% lag; folglich wirkten auch hier die Zielsequenzen für 

OCT1 aktivierend und für E2F inhibierend. Die Elimination des Promotorelementes 

AP1 auf eine Konstruktlänge von -398/+199 bp bedingte eine Aktivität von 114,22%, 

die keinen Unterschied zum nächstlängeren Fragment aufwies, sodass AP1 keine 

eindeutige Funktion zugeordnet werden konnte. Durch den Wegfall des Bereiches 

von -398/+199 bp bis -279/+199 bp und der hier kodierten Erkennungssequenz für 

PPARG, erfuhr das Expressionsniveau einen signifikanten Rückgang auf 0,87%, was 

die Annahme von PPARG als stark anregende Bindungsstelle zur Folge hatte. Das 

-181/+199 bp lange Konstrukt zeigte durch den Verlust der Zielsequenz für BCL6 

eine Forcierung der Promotortätigkeit auf 25,1%, während die sich anschließende 

Verkürzung auf -166 bp einen signifikanten Anstieg der Tätigkeit auf 114,52% 

aufwies. Das zwischen -181 bp und -166 bp liegende Promotorelement für PAX2 war 

daher voraussichtlich hemmend. Der Rückgang der Aktivität auf 86,89% in dem 

+85/+199 bp großen Promotorkonstrukt wies abermals auf die SP1- 

Erkennungssequenz als kausales Element bezüglich der Hintergrundaktivität des 

Promotors hin.

71 

Abbildung 8 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors

72 

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Bindungsstellen für E2F und SP1 des 

C3Bir-Cd14-Promotors, wie bereits vermutet, und SP2 eine aktivierende Funktion zu 

haben schienen. Die Zielsequenzen für PPARG, das in den ersten 

Reportergenanalysen als inhibitorisch gehandelt wurde, AP1 sowie P53 wurden 

hemmende Eigenschaften zugesprochen. Das E2F-Promotorelement galt in B6, wie 

bereits in den ersten Transfektionen gesehen, als inhibitorisch, während den 

Erkennungssequenzen für AP1 und PAX2 durch die neuen Reportergenanalysen die 

gleiche Eigenschaft zugewiesen werden konnten. Auch die BCL6-Bindungsstelle, die 

zunächst als anregend galt, stellte sich nun als hemmend dar. Die Zielsequenzen für 

OCT1, PAX2 sowie SP1 wurden als aktivierend verifiziert und in ihrer Funktion durch 

die Promotorelemente STAT1 und PPARG ergänzt. Der weiteren AP1- 

Erkennungssequenz in B6 konnte keine eindeutige Funktion zugeordnet werden. 

7.3.2.2 Mutagenisierung der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 

Die Ergebnisse der Luziferase-Analysen der mutagenisierten 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind in Abbildung 27 und Abbildung 28 

dargestellt. Durch die Transfektion der Trunkierungen beider Cd14-Promotoren 

(siehe 7.3.1) konnten verschiedene Transkriptionsfaktorbindungsstellen ermittelt 

werden, die putativ kausal für die stammspezifische Promotoraktivität waren. Um die 

so festgestellten Ergebnisse zu verifizieren, wurden Mutagenesen der zu 

untersuchenden Zielsequenzen am Ausgangspromotor durchgeführt. Der 

Wirkungsverlust der mutagenisierten Promotorelemente und die dadurch 

hervorgerufenen Änderungen in Luziferase-Analysen ließen Rückschlüsse auf deren 

Funktion zu. 

7.3.2.2.1 Luziferase-Analyse des mutagenisierten C3Bir-Cd14-Promotors 


übersichtlich in Abbildung 9 dargestellt. Die Mutagenese der OCT1- 

Erkennungssequenz führte zu einem signifikanten Abfall der Promotoraktivität auf 

0,03%, sodass der Bindungsstelle für OCT1 in vitro die Funktion einer stark 

aktivierenden Zielsequenz erfüllte. Das korrelierte nicht mit den Vermutungen, die 

nach den Transfektionen der Trunkierungen aufgestellt wurden (siehe 7.3.2.1) und 

denen zufolge es sich hier um ein inhibitorisches Element handeln sollte. Nach der 

Veränderung der PPARG-Erkennungssequenz ergab sich ebenfalls ein Wandel des 

Expressionsniveaus, hier auf 74,33%. Entsprechend vorhergehender 

Untersuchungsergebnisse (siehe 7.3.2.1) besitzt die PPARG-Bindungsstelle daher 

eine anregende Eigenschaft. Die Tätigkeit des Cd14-Promotors nach der 

Inaktivierung der Zielsequenz für SP2 reduzierte sich auf 0,04% und die Annahme, 

dass es sich bei SP2 um ein deutlich aktivierendes Promotorelement handelte (siehe 

7.3.2.1), galt somit als bewiesen. Die der SP1-Erkennungssequenz nach den ersten

73 

Transfektionsergebnissen zugeteilte Funktion der Promotorhintergrundaktivität (siehe 

7.3.1 und 7.3.2.1) ließ sich durch die Mutation dieser 

Transkriptionsfaktorbindungsstelle nicht bestätigen, da das Expressionsniveau auf 

161,27% stieg und die SP1-Zielsequenz also eine hemmende Funktion besaß.

74 

Abbildung 9 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des C3Bir-Cd14-Promotors

75 

7.3.2.2.2 Luziferase-Analyse des mutagenisierten B6-Cd14-Promotors 


übersichtlich in Abbildung 10 dargestellt. Die Mutagenese des OCT1- 

Promotorelementes zeigte, wie bereits bei C3Bir, einen deutlichen Verlust des 

Expressionsniveaus auf 0,02%, sodass die OCT1-Erkennungssequenz, wie im 

Vorfeld bereits angenommen (siehe 7.3.2.1), bei B6 eine stark anregende Rolle 

spielte. Die E2F-Bindungsstelle, die mittels der ersten Luziferaseanalysen als 

inhibitorische Zielsequenz angesprochen wurde, stellte sich als stark aktivierend 

heraus, da ihre Veränderung einen Tätigkeitsverlust auf 0,03% zufolge hatte. 

Während das Promotorelement für PPARG zunächst als anregende 

Erkennungssequenz galt (siehe 7.3.2.1), bewirkte ihre Inaktivierung eine Zunahme 

der Aktivität auf 272,22%, weswegen eine inhibitorische Wirkung erwiesen und die 

erste Annahme widerlegt war. Aus der Mutagenese der PAX2-Bindungsstelle ging 

ein Expressionsrückgang auf 0,28% hervor, mit der Konsequenz, dass sich die 

zunächst als hemmend (siehe 7.3.2.1) betrachtete Wirkung der Zielsequenz als 

anregend herausstellte. Durch die gezielte Veränderung der SP1- 

Erkennungssequenz stieg die Tätigkeit des Promotors auf 985,6% an. Parallel zu 

C3Bir konnte der SP1-Bindungsstelle bei B6 so eine hemmende Funktion 

nachgewiesen werden, während sich die erste Annahme einer Hintergrundaktivität 

(siehe 7.3.2.1) nicht bestätigte.

76 

Abbildung 10 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des B6-Cd14-Promotors

77 

Die Zielsequenzen für PPARG und SP2 (beide C3Bir) sowie OCT1 (B6) konnten 

hinsichtlich ihrer fördernden Funktion verifiziert werden. Zusammenfassend stellten 

sich die vermeintlich aktivierenden Promotorelemente SP1 (C3Bir), PPARG sowie 

SP1 (beide B6) als inhibierend und die hemmend anmutenden 

Erkennungssequenzen für OCT1 (C3Bir), E2F sowie PAX2 (beide B6) als anregend 

heraus. 

7.4 Physikalische Interaktion von Transkriptionsfaktoren mit den Cd14- 

Promotoren von B6 und C3Bir 

Um abschließend zu überprüfen, ob eine physikalische Bindung zwischen den 

untersuchten Transkriptionsfaktorbindungsstellen und den zugehörigen Proteinen 

vorlag, wurden Electrophoretic Mobility Shift und Supershift Analysen (siehe 6.9.7) 

durchgeführt. Für die Shift-Untersuchungen wurden biotinylierte DNS-Doppelhelix- 

Fragmente verwendet, die aus einer identischen Kopie der 

Transkriptionsfaktorbindungsstelle und des sie umgebenden Abschnittes des 

Ausgangspromotors bestanden. Durch die in-vitro-Adhäsion eines 

Transkriptionsfaktors an einen DNS-Strang wurde eine geringere 

Migrationsgeschwindigkeit im Vergleich zur freien DNS und damit ein Shift im 

Bisacrylamidgel verursacht. Aufgrund der Bindung eines spezifischen Antikörpers an 

das Protein der bereits formierten Komplexe entstand ein weiteres Molekül, das 

wegen seiner Größe abermals langsamer im Gel wanderte und einen Supershift 

verursachte. So konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei dem bindenden 

Protein um den gesuchten Transkriptionsfaktor handelte. Außerdem wurde als 

Kontrolle in einem separaten Ansatz mutagenisierte DNS verwendet, die über die 

gleiche Basensequenz wie die transfizierten Mutationen des Cd14-Promotors 

verfügte; auf diese Weise wurde bewiesen, dass durch die Veränderung der 

Bindungsstelle die Adhäsion des Transkriptionsfaktors in vitro ausblieb. Um 

auszuschließen, dass die Bindung der Transkriptionsfaktoren durch die Biotinylierung 

der verwendeten DNS entstand, wurde ein weiterer EMSA angesetzt, in dem neben 

dem modifizierten Strang die 200-fache Menge an nicht biotinylierter Doppelhelix 

zugegeben wurde. Durch eine kompetitive Reaktion banden die 

Transkriptionsfaktoren hauptsächlich an die nicht biotinylierte DNS und die sichtbare 

biotinylierte Doppelhelix war frei. Die in diesen Versuchen verwendeten 

Transkriptionsfaktoren wurden aus RAW264.7-Zellen gewonnen (siehe 6.9.7).

7.4.1 EMSA der PPARG-, SP2- und OCT1-Bindungsstellen von C3Bir 

78 

Eine DNS-Doppelhelix, die für eine PPARG-Bindungsstelle kodierte, wurde mit dem 

aus RAW264.7-Zellen gewonnenen Protein-Extrakt inkubiert. Proteine banden an die 

DNS, weshalb sie im Vergleich zum freien Strang in der PAGE langsamer lief. Der 

PPARG-spezifische Antikörper (siehe 6.9.8) band nicht an die Transkriptionsfaktoren, 

daher entstand in dem Reaktionsansatz erneut ein Protein-DNS-Komplex. An die 

veränderte Transkriptionsfaktorbindungsstelle für PPARG konnte sich kein Protein 

mehr anlagern, sodass im EMSA nur die freie Doppelhelix sichtbar wurde. Die 

kompetitive Reaktion mit einem unbiotinylierten Doppelstrang führte zur 

Visualisierung freier DNS (siehe Abbildung 11). 

Abbildung 11: EMSA der Bindungsstelle für PPARG (C3Bir)

79 

An die für SP2 kodierende Doppelhelix banden Transkriptionsfaktoren und die 

entstandenen Komplexe waren deutlich größer als die freie DNS . Durch die Bindung 

eines Antikörpers an SP2 wuchs die Größe des formierten Teilchens abermals an 

und es galt als bewiesen, dass das gesuchte Protein spezifisch an das analysierte 

Promotorelement band. Die Mutagenese dieses Elementes führte zur Visualisierung 

eines freien Stranges nach Inkubation mit dem Zellextrakt, was die Unwirksamkeit 

der veränderten Bindungsstelle dokumentierte. Durch die Zugabe nicht biotinylierter 

Doppelhelix zum Protein-DNS-Gemisch entstand wieder freie DNS; das zeigte, dass 

die Bindung der Transkriptionsfaktoren nicht durch die Biotin-Enden der Doppelhelix 

verursacht wurde (siehe Abbildung 12). 

Abbildung 12: EMSA der Bindungsstelle für SP2 (C3Bir) 

Aufgrund der Adhäsion des Transkriptionsfaktors OCT1 an seine 

Erkennungssequenz formierte sich ein Komplex, der in der PAGE eine deutlich 

geringere Migrationsgeschwindigkeit als freie DNS zeigte (Bild). Die Zugabe eines für 

OCT1 spezifischen Antikörpers (siehe 6.9.8) bewirkte eine weitere Steigerung der 

Komplexgröße und einen Supershift im Gel, während sich OCT1 nicht an die 

mutagenisierte Bindungsstelle anlagern konnte und daher wieder freie Stränge in der

80 

PAGE sichtbar wurde. Mittels einer kompetitiven Reaktion zwischen biotinylierter und 

nicht modifizierter Doppelhelix im Überschuss wurde gezeigt, dass die Protein-DNS- 

Interaktion nicht durch diese Biotinylierung verursacht wurde; die Proteine banden an 

die unmodulierten Stränge, sodass nur freie Doppelhelix sichtbar war (siehe 

Abbildung 13). 

Abbildung 13: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (C3Bir) 

7.4.2 EMSA der OCT1-Bindungsstelle von B6 

Die EMSA-Analyse des Organic Cation Transporter 1 zeigte eine Bindung von 

Transkriptionsfaktoren und somit eine Größenzunahme des visualisierbaren 

Reaktionsproduktes gegenüber dem freien Strang. Nach Zugabe eines für OCT1 

spezifischen Antikörpers (siehe 6.9.8) stieg der Umfang des Komplexes erneut und 

es war dargelegt, dass der gesuchte Transkriptionsfaktor an das überprüfte 

Promotorelement band. Die Mutagenese dieses Elementes unterband die Bindung 

von Proteinen und es konnte lediglich freie Doppelhelix sichtbar gemacht werden. 

Durch eine kompetitive Reaktion biotinylierter DNS und eines unmodifizierten 

Stranges in 200-fachem Überschuss sowie die daraus resultierende sichtbare freie 

Doppelhelix wurde bewiesen, dass die Bindung von OCT1 an seine Bindungsstelle 

nicht von der Biotinylierung abhing (siehe Abbildung 14).

81 

Abbildung 14: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (B6)

8 Diskussion 

82 

Il10 -/- Mäuse dienten als Modell für humane chronisch entzündliche 

Darmerkrankungen. Sie entwickelten eine überschießende Immunreaktion auf 

luminale Xenoantigene des Darms, die verschiedene Merkmale von Colitis Ulcerosa 

und Morbus Crohn aufwiesen (KÜHN et al., 1993). Durch Untersuchungen 

verschiedener Il10 -/- -Stämme konnte gezeigt werden, dass C3Bir-Il10 -/- eine deutlich 

schwerere Form der Colitis entwickelten als B6-Il10 -/ . Durch sich anschließende 

genomweite Kopplungsanalysen an segregierenden Kreuzungspopulationen wurde 

deutlich, dass chronisch entzündliche Darmerkrankungen einer komplexen 

genetischen Kontrolle unterlagen, denn es wurden 10 QTL (Cdcs1 bis 10) gefunden. 

Innerhalb dieser QTL konnten 8 Kandidatengene identifiziert werden, zu denen unter 

anderem auch Cd14 gehörte, das in C3Bir-Il10 -/- deutlich höher exprimiert wurde als 

in B6-Il10 -/- (DE BUHR et al., 2006). Diese divergierende Cd14-Expression war mit 

stammspezifischen Promotorpolymorphismen assoziiert. In silico Analysen legten 

nahe, dass diese Promotorpolymorphismen zur Ausbildung unterschiedlicher 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen führten. Nachfolgende in vitro Untersuchungen 

der Promotoren zeigten stammspezifische Aktivitäten, die mit den in vivo detektierten 

unterschiedlichen basalen Expressionen des Cd14-Gens korrelierten (DE BUHR et 

al., 2009). Im murinen Genom liegt Cd14 innerhalb des QTL-Intervalls Cdcs6 auf 

Chromosom 18, während es beim Menschen im IBD5-Lokus auf Chromosom 5q 

kodiert wird. Um die Frage zu klären, welche Promotorpolymorphismen der 

stammspezifischen Cd14-Expression zu Grunde lagen, wurden trunkierte und 

mutagenisierte Promotoren beider Mausstämme mittels transienter Transfektion und 

Reportergenanalysen untersucht. 

8.1 Vorarbeiten zur Etablierung des Modells für die Promotoranalysen 

Um zu eruieren, welche Zelllinie am besten für die Untersuchung der Cd14- 

Promotoren geeignet war, wurden verschiedene Zelllinien hinsichtlich ihrer Cd14- 

Expression sowie Transfizierbarkeit untersucht. 

In Western Blot Untersuchungen wurde in RAW264.7-Zellen sowohl basal als auch 

nach LPS-Stimulation eine deutlich höhere Cd14-Expression nachgewiesen als in 

NIH3T3-Zellen (siehe Abbildung 4). Makrophagen gehören zur Gruppe der 

Monozyten, die sowohl eine hohe basale CD14-Expression als auch eine deutliche 

Stimulierbarkeit zeigen (NASU et al., 1991; BARBOUR et al., 1998; KITCHEN et al., 

2000), während die Stimulierbarkeit der Produktion dieses Proteins in den 

Bindegewebszellen Fibroblasten geringer ausfällt (WATANABE et al., 1996; 

MCANULTY et al., 2006). Als Referenzgen wurde in den Western Blot Analysen β-

83 

Aktin eingesetzt, das als Strukturprotein ein Bestandteil der Zellmembran in 

eukaryotischen Zellen ist (HOCK et al., 1991) und unabhängig von äußeren Faktoren 

sowie dem Typ oder dem Entwicklungsstadium der Zelle exprimiert wird (DE KOK et 

al., 2004). Die Ergebnisse der Western Blot Untersuchungen zeigten, dass sich 

RAW264.7-Zellen hinsichtlich ihrer Cd14-Expression deutlich besser für die 

Promotoranalysen eigneten als NIH3T3-Zellen. 

Da die Transfektion muriner Makrophagen nach Erfahrungen der Arbeitsgruppe 

schwierig war, wurden neben den RAW264.7-Zellen auch NIH3T3-Zellen hinsichtlich 

ihrer Transfizierbarkeit mit verschiedenen Reagenzien getestet (siehe Abbildung 15 

bis Abbildung 20 und Tabelle 3). Durch die Transfektion eines GFP-pAd-Track-CMV- 

Plasmids mit Polyfect® in NIH3T3-Zellen konnten 25% der Zellen reproduzierbar 

transfiziert werden, wie schon von SOKOLOVA et al. (2009) gezeigt wurde. Die 

transiente Transfektion der Makrophagenzelllinie wurde unter Verwendung des 

gleichen Plasmids mit verschiedenen Reagenzien untersucht: Die Applikation des 

Fugene®HD-Systems führte zur Fluoreszenz etwa jeder hundertsten Zelle, während 

eine Kombination auf Targefect® RAW und Virofect® zu einer Transfektionseffizienz 

von ca. 5% führte. Laut Herstellerangaben sollten hierdurch bis zu 20% erreicht 

werden. Mit Hilfe von Superfect® wurden Raten von etwa 7% erzielt, die in anderen 

Publikationen mit bis zu 80% transfizierter RAW264.7-Zellen deutlich höher ausfielen 

(WATANABE et al., 2003; ZHOU et al., 2004). Durch die Transfektion der Monozyten 

mittels Xtreme Gene® 9 DNA und Xtreme Gene® HP DNA sollten laut 

Herstellerangaben ca. 5 % der Zellen transfiziert werden können. Das traf für Xtreme 

Gene® 9 DNA zu, während mit Hilfe von Xtreme Gene® HP DNA eine 

Transfektionseffizienz von ca. 25% erzielt wurde. Beide Zelllinien konnten also mit 

einer reproduzierbaren Effizienz von 25% transfiziert werden. Da sich die RAW264.7- 

Zellen hinsichtlich ihrer Cd14-Expression deutlich besser für die Promotoranalysen 

eigneten als Zellen der Linie NIH3T3, wurden die Promotorstudien in der 

vorliegenden Arbeit mit Xtreme Gene® HP DNA an RAW264.7-Zellen durchgeführt. 

8.2 Aktivitäten der Cd14-Promotoren von C3Bir-Il10 -/- und B6-Il10 -/- 

Cd14 wurde im Colitis suszeptiblen Mausstamm C3Bir-Il10 -/- deutlich höher 

exprimiert als in den resistenten B6-Il10 -/- (BLEICH et al., 2003). Sequenzanalysen 

und in silico Untersuchungen ließen vermuten, dass diese divergierenden 

Expressionen durch stammspezifische Promotorpolymorphismen verursacht wurden 

und zur Ausbildung unterschiedlicher Transkriptionsfaktorbindungsstellen führten 

(DE BUHR et al., 2009). Um die Position der für die unterschiedliche 

Promotoraktivität verantwortlichen Sequenzen nun in dieser Arbeit zu bestimmen,

84 

wurden beide Promotoren zunächst in annähernd 300 bp großen Schritten verkürzt. 

Nach transienter Transfektion in RAW264.7-Zellen und Reportergenanalysen 

konnten die putativen Funktionen einiger Elemente ermittelt werden. Die 

Promotorabschnitte, die den größten Einfluss auf die Aktivität zu haben schienen, 

wurden weitergehend untersucht und durch Elimination der zu analysierenden 

Erkennungssequenzen genauer betrachtet. In einem letzten Schritt wurden die nun 

vorläufig identifizierten Wirkungsweisen einiger Zielsequenzen, die das 

Expressionsniveau stark zu beeinflussen schienen, mittels Mutagenese ihrer 

zentralen Bindungselemente analysiert. Auf diese Weise konnten die Funktionen der 

überprüften Zielsequenzen endgültig geklärt werden. 

Bei diesen Untersuchungen stellten sich PPARG, SP2 (beide C3Bir-Il10 -/- ) und OCT1 

(B6-Il10 -/- ) als aktivierend heraus. In den Trunkierungsversuchen zeigten sich SP1 

(C3Bir-Il10 -/- ), PPARG und SP1 (beide B6-Il10 -/- ) als anregend, während sich in den 

Mutageneseanalysen ihre hemmende Funktion herausstellte . Die zunächst als 

inhibitorisch betrachteten Zielsequenzen für OCT1 (C3Bir-Il10 -/- ), E2F sowie PAX2 

(beide B6-Il10 -/- ) stellten sich als anregend heraus. 

PPARG 

PPARG wird sowohl bei der Maus als auch beim Menschen auf Chromosom 6 

kodiert und fördert Plazenta-, Herz- sowie Fettgewebsentwicklung (BARAK et al., 

1999). Außerdem dient es der Makrophagendifferenzierung und wird aufgrund seiner 

antiinflammatorischen Wirkung zur Behandlung von TypII-Diabetes eingesetzt 

(TONTONOZ et al., 1998; HAARA et al., 2000). Des Weiteren werden PPARG- 

Liganden in der Colitis-Therapie gegen die Entzündungsreaktion der 

Darmschleimhaut verwendet (SU et al., 1999), denn es verhindert die 

Zytokinausschüttung von Monozyten und somit die Aktivierung des NFκB-Pfades 

(RICOTE te al., 1998). Es wurde gezeigt, dass die PPARG-Erkennungssequenz des 

C3Bir-Cd14-Promotors eine aktivierende Wirkung vermittelte. HORTECELLAS et al. 

(2011) fanden heraus, dass PPARG einen schützenden Effekt auf den Verlauf 

muriner entzündlicher Darmerkrankungen hatte. Diese antiinflammatorische Wirkung 

wurde einer Inhibition der Zytokinausschüttung sowie der Expression 

proinflammtorischer Adhäsionsmoleküle in Maus-T-Zellen zugeschrieben (GURI et 

al., 2010). Im Mausmodell konnte nachgewiesen werden, dass die Anwesenheit 

intestinaler Mikroflora zu einer erhöhten Expression von PPARG führte, die in 

murinen Darmentzündungsmodellen ausblieb (DUBUQOUY et al, 2003). Außerdem 

wurden Polymorphismen im humanen PPARG-Gen mit einer erhöhten Suszeptibilität 

für CED in Verbindung gebracht (ANDERSEN et al., 2011). Die Ergebnisse der 

vorliegenden Studie bezüglich der Funktion von PPARG stimmen also mit den bisher 

zu diesem Thema veröffentlichten Untersuchungen überein. Mittels EMSA wurde 

bewiesen, dass der PPARG-Transkriptionsfaktor im C3Bir-Cd14-Promotor

85 

physikalisch mit der zugehörigen Bindungsstelle im Promotor interagierte und sich 

dort anlagerte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass diese Bindung nach 

Mutagenese der zentralen Zielsequenz nicht entstand. 

SP2 

SP2 wird im Mausgenom auf Chromosom 11 kodiert und beim Menschen auf 

Chromosom 17q21.3. Der Transkriptionsfaktor SP2 hat eine stark aktivierende 

Funktion und reguliert das Zellwachstum sowie die Differenzierung und die 

Tumorgenese von epidermalen Stammzellen (KIM, 2011). Außerdem ist es an der 

Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt, indem es die Interfreon γ induzierte 

Expression des Suppressor of cytokine signalling (SOCS) Gens fördert 

(LETOURNEUR et al., 2009). In der vorliegenden Studie wurde bewiesen, dass die 

SP2-Bindungsstelle im C3Bir-Cd14-Promotor eine aktivierende Funktion hat. Im 

Zuge der Untersuchung des humanen Cd14-Promotors zeigte sich, dass SP2 dort – 

unseren Ergebnissen entsprechend – eine anregende Wirkung hatte. Homozygote 

Träger einer Mutation dieser Zielsequenz zeigten eine stark reduzierte Expression 

von Cd14, was mit einer erhöhten Anfälligkeit für entzündliche Erkrankungen in 

Verbindung gebracht wurde (LEVAN et al., 2001). Diese Untersuchungen stimmen 

mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit überein. Durch EMSA-Analysen konnte 

gezeigt werden, dass der SP2-Transkriptionsfaktor im C3Bir-Cd14-Promotor 

physikalisch mit der zugehörigen Bindungsstelle im Promotor interagierte und sich 

dort anlagerte. Außerdem wurde bewiesen, dass diese Bindung nach Mutagenese 

der zentralen Zielsequenz nicht entstand. 

OCT1 

OCT1 wird im Mausgenom auf Chromosom 17 kodiert und beim Menschen auf 

Chromosom 10q22.2. Es fungiert als Transportprotein sowie Transkriptionsfaktor und 

konnte mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden; so ist ein 

Polymorphismus im TNF-Promotor mit einer vierfach erhöhten Suszeptibilität für 

zerebrale Malaria assoziiert. Durch den SNP entsteht eine neue Bindungsstelle und 

es lagern sich OCT1-Proteine an den TNF-Promotor an. Das erhöht die 

Genexpression (KNIGHT et al., 1999). Der anregende Effekt von OCT1 wurde 

bereits an B-Zellen und an humanen Monozyten für die Expression von Lipoxin A4 

nachgewiesen (ANNWEILER et al., 1993; WAECHTER et al., 2012). Es wurde in der 

vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Bindungsstelle für OCT1 in den Cd14- 

Promotoren beider Stämme aktivierend auf die Expression dieses Proteins wirkt. 

Eine ähnliche Funktion von OCT1 wurde bereits mit humaner CED in Verbindung 

gebracht. Im menschlichen TNF-Promotor konnte ein SNP ermittelt werden, der die 

Bindungsstelle eines OCT1-Elementes veränderte, sodass OCT1 nicht mehr binden 

konnte; das führte zu einer erhöhten Suszeptibilität für CED (VAN HEEL et al., 2002).

86 

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stimmen mit den Angaben in der Literatur 

über die transkriptionsfördernden Eigenschaften des Promotorelements überein. 

Die Bindung des OCT1-Transkriptionsfaktors an seine Zielsequenz im Cd14- 

Promotor von C3Bir-Il10 -/- wurde durch EMSA nachgewiesen. Außerdem konnte 

gezeigt werden, dass diese Interaktion nach Mutagenese der zentralen Zielsequenz 

nicht entstand. 

E2F 

E2F wird im murinen Genom auf Chromosom 2 kodiert, während es beim Menschen 

auf Chromosom 20q11.2 liegt. Es wirkt als anregender Transkriptionsfaktor (DYSON 

et al., 1998) und ist so an der Apoptoseinduktion in eukaryotischen Zellen beteiligt 

(WU et al., 1994). Außerdem aktiviert es als Transkriptionsfaktor die Progression des 

Zellzyklus von der G2- in die Metaphase und fördert die Zelldifferenzierung (REN et 

al., 2002). Des Weiteren wirkt es antiinflammatorisch, indem es in Endothelzellen IκB 

stabilisiert und so den NFκB-Pfad blockiert (CHEN et al., 2002). Die Analyse der 

Zielsequenz für E2F im Cd14-Promotor von B6-Il10 -/- ergab, dass sie einen 

fördernden Effekt auf die Proteinexpression hatte, was mit den genannten 

Publikationen übereinstimmt. Im Rahmen einer Darmentzündung wurde E2F in der 

vorliegenden Studie zum ersten Mal untersucht und stellt bezüglich CED 

möglicherweise einen neuen Therapieansatz dar. Anhand von EMSA- 

Untersuchungen wurde bewiesen, dass der E2F-Transkriptionsfaktor im Cd14- 

Promotor von C3Bir-Il10 -/- physikalisch mit der zugehörigen Bindungsstelle im 

Promotor interagierte und sich dort anlagerte. Außerdem konnte gezeigt werden, 

dass diese Bindung nach Mutagenese der zentralen Zielsequenz nicht entstand. 

PAX2 

Pax2 liegt im Genom der Maus auf Chromosom 19 und beim Menschen auf 

Chromosom 10q24, auf dem sich auch ein Suszeptibilitätslokus für CED befindet 

(siehe Tabelle 6). Der Transkriptionsfaktor PAX2 spielt eine zentrale Rolle in der 

regelgerechten Entwicklung des Nieren- und Zentralnervensystems, indem es die 

Expression des Wilms' Tumor Suppressor Gens (WT1) fördert (FICKENSCHER et al., 

1993; DEHBI et al., 1996). Durch die Untersuchung der PAX2-Bindungsstelle des 

Cd14-Promotors von B6-Il10 -/- konnte gezeigt werde, dass sie eine aktivierende 

Wirkung hatte. Die fördernde Eigenschaft des Transkriptionsfaktors wurde im 

Rahmen der Entwicklung des Nieren- und Zentralnervensystems bereits mehrfach 

belegt. Die Assoziation zu Darmerkrankungen wird in dieser Untersuchung zum 

ersten Mal dargelegt. Möglicherweise bietet PAX2 einen Ansatz für neue Therapien 

der CED des Menschen. Die EMSA-Analyse des PAX2-Transkriptionsfaktors zeigte, 

dass er an den C3Bir-Cd14-Promotor band, und dass diese Bindung nach

87 

Mutagenese der zentralen Bindungsstelle der Erkennungssequenz nicht mehr 

zustande kam. 

In weiteren Studien wurden die CD14-Promotoren anderer Spezies untersucht, wie 

z.B. an den Leberzellen der Ratte (LIU et al., 2000): Bei der Ratte existierten, wie in 

diesem Mausmodell, zahlreiche AP1- und SP1-Erkennungssequenzen. Es wurde 

gezeigt, dass Zielsequenzen für sowohl AP1 als auch SP1 die Hintergrundaktivität 

der Expression bewirkten. Die Studie zu einem bovinen Cd14-Promotor förderte 

ebenfalls eine hohe Anzahl an Bindungsstellen für AP1 und SP1 zutage, denen eine 

basal aktivierende Wirkung zugesprochen wurde (IBEAGHA-AWEMU et al., 2008). 

Eine Analyse des Maus-Cd14-Promotors (MATSUURA et al., 1992) identifizierte 

gleichermaßen eine AP1-Bindungsstelle als für die Hintergrundaktivität des 

Promotors verantwortliches Element, ebenso wie im humanen CD14-Promotor 

(LEVAN et al., 2001). Wie in der vorliegenden Studie dargelegt, trifft das nicht auf die 

vorliegenden, untersuchten Elemente zu. Das in der 3‘-Region gelegene SP1 zeigte 

in den Trunkierungsversuchen eine inhibitorische Wirkung. Diese Wirkung trat in 

beiden Mausstämmen auf und wurde vermutlich durch ein weiteres, die SP1- 

Bindungsstelle flankierendes Promotorelement verursacht. 

Die Transkriptionsfaktorbindungsstellen PPARG, SP2 (beide C3Bir-Il10 -/- ) und OCT1 

(B6-Il10 -/- ) ließen sich hinsichtlich ihrer aktivierenden Funktion verifizieren. In den 

Trunkierungsversuchen stellten sich SP1 (C3Bir-Il10 -/- ), PPARG und SP1 (beide B6- 

Il10 -/- ) als anregend dar, während sich in den Mutageneseanalysen ihre hemmende 

Funktion zeigte. Die zunächst als inhibitorisch betrachteten Zielsequenzen für OCT1 

(C3Bir-Il10 -/- ), E2F sowie PAX2 (beide B6-Il10 -/- ) stellten sich als anregend heraus. 

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die stammesspezifische Cd14- 

Expression auf den Einfluss mehrerer divergierender Transkriptionsfaktorbindungsstellen 

zurückzuführen ist und nicht durch einen einzigen 

Promotorpolymorphismus verursacht wird. 

8.3 Ausblick 

In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von Mutagenesen gezeigt, dass die 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen für OCT1, PPARG und SP2 (C3Bir-Il10 -/- ) sowie 

E2F, Pax2 und OCT1 (B6-Il10 -/- ) aktivierende Funktionen besaßen, während SP1 

(C3Bir-Il10 -/- ), PPARG sowie SP1 (beide B6-Il10 -/- ) inhibierend wirkten. Da die 

stammspezifische Cd14-Expression jedoch durch weitere unterschiedliche 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen beeinflusst werden kann, sollten diese ebenfalls 

durch zielgerichtete Mutagenese ihrer zentralen Zielsequenzen überprüft werden.

88 

Außerdem sollten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die der 

Basalaktivität beider Promotoren zu Grunde liegenden Transkriptionsfaktorbindungsstellen 

zu orten. In den CD14-Promotoren anderer Spezies waren dafür 

SP1- und AP1- Zielsequenzen ausschlaggebend (IBEAGHA-AWEMU et al., 2008; 

MATSUURA et al., 1992; LEVAN et al., 2001), sodass auch in den beiden hier 

analysierten Stämmen diese Transkriptionsfaktoren genauer untersucht werden 

sollten. Die vermeintlich inhibierenden SP1-Sequenzen an den 5‘-Enden beider 

Promotoren sind genauer zu studieren. So kann festgestellt werden, ob die 

hemmende Eigenschaft der kürzesten Trunkierungen möglicherweise durch weitere, 

in dieser Region liegende Zielsequenzen verursacht wird. In vitro sollte eine 

Stimulation der Zellen, die die mutagenisierten Promotoren enthalten, mit LPS 

erfolgen; so kann analysiert werden, ob die Cd14-Expression in Anwesenheit von 

Bakterienbestandteilen durch die Mutagenese und damit die Inaktivierung definierter 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen nachhaltig beeinflusst wird. Das ließe 

Rückschlüsse auf die Funktion der einzelnen Promotorelemente in vivo zu. Um zu 

klären, inwieweit die Cd14-Expression durch epigenetische Faktoren beeinflusst wird, 

sollten sich den noch ausstehenden Transfektionsversuchen und LPS-Stimulationen 

Methylierungsstudien anschließen. Solche Disulfid-Sequenzierungen können zeigen, 

welche DNS-Bereiche inaktiv sind bzw. welche Sequenzen exprimiert werden, um 

Schlussfolgerungen auf die Bedeutung der Bindungsstellen in vivo ziehen zu können. 

Die zentrale Rolle einiger Bindungselemente bezüglich der Beeinflussung der Cd14- 

Expression in vitro sollte auch in vivo überprüft werden. Dazu stünde die 

Generierung von Knockout-Mäusen an, deren spezifische Bindungsstellen im Cd14- 

Promotor ausgeschaltet wären. Ihre Colitis-Suszeptibilität sollte in weiteren 

Versuchen analysiert werden. In diesem Rahmen sollten die als 

entzündungshemmend definierten Transkriptionsfaktoren SP2, OCT1, E2F und 

PAX2 näher analysiert und als Therapieform getestet werden. So könnten sich neue 

Ansätze für die Therapie humaner chronisch entzündlicher Darmerkrankungen 

ergeben.

9 Zusammenfassung 


89 

„Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der Bedeutung von CD14 

für die intestinalen Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm“ 

Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen sind rezidivierende Entzündungen des 

Gastrointestinaltraktes, die sich in die beiden Haupterscheinungsformen Colitis 

Ulcerosa und Morbus Crohn untergliedern. Sie entstehen aufgrund genetischer 

Prädisposition in Verbindung mit immunologischen und umweltbedingten Faktoren. 

Interleukin-10-defiziente (Il10 tm1Cgn , Il10 -/- ) Mäuse dienen als Modell für humane CED. 

C3Bir-Il10 -/- und B6-Il10 -/- Mäuse zeigten eine unterschiedliche Empfänglichkeit für 

Colitis. Ein Faktor in diesem Modell ist die divergierende Expression des 

schützenden Proteins CD14. Die in vitro Untersuchung der Promotoren bestätigte die 

Annahme einer höheren Aktivität im suszeptiblen Stamm C3Bir-Il10 -/- im Vergleich zu 

den suszeptiblen Mäusen B6-Il10 -/- . Diese ungleichen Expressionsniveaus waren auf 

stammesspezifische Polymorphismen zurückzuführen, die eine unterschiedliche 

Formierung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen zufolge hatten. 

In der vorliegenden Arbeit wurden die Cd14-Promotoren beider Stämme analysiert, 

um die der unterschiedlichen Expression des Oberflächenproteins zugrunde 

liegenden, divergierenden Promotorelemente zu identifizieren. Zu diesem Zweck 

wurde zunächst die Transfektion von murinen Makrophagen der Linie RAW264.7 

optimiert und die Versuche mit dem XtremeGene® HP DNA Reagenz durchgeführt. 

Die Promotorkonstrukte wurden in ein Luziferasereporterplasmid eingesetzt, 

transfiziert und mittels Kotransfektion eines für β-Galaktosidase kodierenden 

Plasmids normalisiert. Abschließend wurden die Zellextrakte mittels Luziferase- und 

β-Galaktosidaseanalysen untersucht und ausgewertet. 

Zunächst wurden die Promotoren beider Stämme in annähernd 300 bp großen 

Schritten verkürzt, um eingrenzen zu können, in welchen Bereichen sich 

Zielsequenzen befanden, die entscheidenden Einfluss auf das Expressionsniveau 

nahmen. Um die vermuteten Funktionen der untersuchten Zielsequenzen verifizieren 

zu können, wurden weitere Trunkierungen vorgenommen und so gezielt einzelne 

Promotorelemente eliminiert. Anschließend folgten zielgerichtete Mutagenesen der 

zentralen Bindungselemente der untersuchten Erkennungssequenzen, um deren 

putative Funktionen zu überprüfen. 

Die Transkriptionsfaktorbindungsstellen PPARG, SP2 (beide C3Bir-Il10 -/- ) und OCT1 

(B6-Il10 -/- ) ließen sich hinsichtlich ihrer aktivierenden Funktion verifizieren. In den 

Trunkierungsversuchen stellten sich SP1 (C3Bir-Il10 -/- ), PPARG und SP1 (beide B6-

90 

Il10 -/- ) als anregend dar, während sich in den Mutageneseanalysen ihre hemmende 

Funktion zeigte. Die zunächst als inhibitorisch betrachteten Zielsequenzen für OCT1 

(C3Bir-Il10 -/- ), E2F sowie PAX2 (beide B6-Il10 -/- ) stellten sich als anregend heraus. 

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die stammesspezifische Cd14- 

Expression auf den Einfluss mehrerer divergierender 

Transkriptionsfaktorbindungsstellen zurückzuführen ist und nicht durch einen 

einzigen Promotorpolymorphismus verursacht wird.

10 Summary 


91 

„Characterization of the murine Cd14 promoter regarding its significance for intestinal 

barrier and defense mechanisms” 

Inflammatory bowel diseases (IBD) are recurrent inflammations of the gastrointestinal 

tract that can be devided into two main forms: Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. 

Both are caused by genetic predispositions in combination with immunological and 

environmental factors. Susceptibility to colitis varies between C3Bir-Il10 -/- and B6- 

Il10 -/- . One factor in this model is the different expression of the protecting surface 

protein CD14. In vitro studies of the promoters confirmed the assumed higher activity 

in the susceptible C3Bir-Il10 -/- strain compared with 

B6-Il10 -/- mice. The varying expression levels were reduced to strain specific 

promoter polymorphisms that led to the formation of different transcription factor 

binding sites. In the study at hand Cd14 promoters of both strains were analyzed to 

identify polymorphisms that cause strain specific disease susceptibility. Therefore, 

the transient transfection of murine macrophages RAW264.7 was optimized and 

experiments were performed using XtremeGene® HP DNA. Promoter conctructs 

were inserted into luciferase reporter plasmids and transfected. Transfection 

efficiencies were normalized by co-transfection with β-galactosidase encoding 

plasmids. Subsequently, cell extracts were analyzed by luciferase and βgalactosidase 

assays. Initially promoters of both strains were truncated in 

approximately 300 bp steps to identify regions that where highly influential on 

expression levels. To verify the presumed functions of identified binding sites, further 

truncations were performed. The defined sequences were eliminated to gather 

information on their role in promoter activity. New truncations were transfected 

parallel to the ones already analyzed and evaluated. Preliminary defined functions of 

specific binding sites were checked by site-directed mutagenesis of their core 

elements in a last step. Transcription factor binding sites for PPARG, SP2 (both 

C3Bir-Il10 -/- ) und OCT1 (B6-Il10 -/- ) were confirmed as activating elements. Truncation 

experiments showed SP1 (C3Bir-Il10 -/- ), PPARG and SP1 (both B6-Il10 -/- ) to have 

stimulating role. However, mutagenesis of the central binding elements evinced an 

inhibiting influence on the expression levels. OCT1 (C3Bir-Il10 -/- ), E2F and Pax2 

(both B6-Il10 -/- ) appeared to be repressive at first and later emerged as activating 

elements. In summary, it can be stated that the strain specific Cd14 expression is 

caused by several divergent transcription factor binding sites and cannot be reduced 

to a single promoter polymorphism.

11 Anhang 1: Literaturteil 

11.1 Kandidatengene für CED 

92 

Tabelle 5: Kandidatengene für CED (modifiziert nach BÜCHLER, 2010) 

Name Lokus Gen CU MC Referenz 

IBD 1 16q12 NOD2/CARD15 + - OGURA et al., 

2001; SHUGART 

et al., 2008 

IBD 2 12p13.2-q24.1 - - + CURRAN et al., 

1998; HAMPE et 

al., 1999; 

SATSANGI et al., 

1996; DUERR et 

al., 1998; YANG et 

al., 1999; PARKES 

IBD 3 6q21.3 HLA-DRB1*1502- Allel 

HLA-DRB1*0103-Allel 

HLA-DRB1*0701-Allel 

TNF 

+ 

- 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

- 

et al., 2000 

HAMPE et al., 

1999; YANG et al., 

1999; DECHAIRO 

et al., 2001; 

ASAKURA et al, 

1982; SUGIMURA 

et al., 1993; 

FERNANDEZ et 

al., 2004; 

HANCOCK et al., 

2008; SATSANGI 

et al., 1996; 

SILVERBERG et 

al., 2003; 

ORCHARD et al., 

2002; DE LA 

CONCHA et al. 

1999; NEWMAN et 

al., 2004; AHMAD 

et al., 2002; 

O’CALLAGHAN et 

al., 2003; van 

HEEL et al., 2002; 

TREMMELING et 

al., 2006; SASHIO 

et al., 2002 

IBD 4 14q11-q12 - + - MA et al., 2000; 

DUERR et al., 

2000

93 

IBD 5 5q31 SLC22A4/SLC22A5 

IFR1, IL3-5, IL13 

IBD 6 19p13 MAST3, ICAM1, 

ICAM3, IL12RB1, 

A1011S in MYO9B 

+ - RIOUX et al., 2000; 

RIOUX et al., 2001; 

WALLER et al., 

2006; 

PELTEKOVA et al., 

2004; 

SILVERBERG et 

al., 2007 

+ + RIOUX et al., 2000; 

VAN HEEL et al., 

2003; LABBÉ et 

al., 2008 

IBD 7 1p36 - + + SHUGART et al., 

2008; CHO et al., 

2000 

IBD 8 16p - + + HAMPE et al., 

2002; ANNESE et 

al., 2003 

IBD 9 3p26 - + + SATSANGI et al., 

1996; DUERR et 

al., 2002; HAMPE 

et al., 2001 

IBD11 7q22 MUC3A + + DUERR et al., 

1998; KYO et al., 

1999; KYO et al., 

2001; 

11.2 CED Suszeptibilitätsloci und Genassoziationen 


Genassoziationen 

Locus Genassoziationen / 

Kandidatengene 

1p13.2 Protein Thyrosin 

Phosphatase (PTPN) 22 

Funktion MC CU Referenz 

Adaptives 

Immunsystem 

+ - BARRETT 

et al., 2008; 

BARRETT 

et al., 2009

1p31.3 Interleukin 23 Receptor 

(IL23R) 

1p36.13 Phospholipase A2, Group 

IIE (PLA2G2E), 

Ovarian Tumor Domain 

Containing 3 (OTUD3), 

Ring Finger Protein 186 

(RNF186) 

1p36.23 Vesicle-associated 

Membrane Protein 3 

(VAMP3) 

1q21.2 Extracellular Matrix Protein 

(ECM) 1 

1q22 Secretory Carrier 

Membrane Protein 

(SCAMP3), Mucin 1 

(MUC1) 

94 

Adaptives 

Immunsystem 

Phospholipase 

Zink Finger 

Zink Finger 

+ + DUERR et 

al., 2006; 

BELLEN- 

GUEZ et 

al., 2007; 

LIBIOULLE 

et al., 2007; 

RAELSON 

et al., 2007; 

RIOUX et 

al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FISHER et 

al., 2008; 

MC- 

GOVERN et 

al., 2010; 

FRANKE et 

- 

+ 

al., 2010 

FISHER et 

al., 2008; 

BARRETT 

et al., 2009; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

SILVER- 

BERG et 

al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2012 

Exozytose + - FRANKE et 

al., 2010 

Epithelbarriere - + FISHER et 

al., 2008; 

BARRETT 

et al., 2009; 

IMIELINSKI 

Proteintransport 

Proteinbindung 

et al., 2009 

+ - FRANKE et 

al. 2010

1q23.3 Fc Fragment of IgG Low 

Affinity IIa Receptor 

(FCGR2A), FCGR2C, 

HSPA6 

1q24 Flavin-containing 

Monooxygenase (FMO) 4 

1q31.3 Differentially Expressed in 

Normal and Neoplastic 

Cells/ MAP-kinase 

Activating Death Domain 

Containing 1B (DENND1B) 

1q32.1* IL10, IL19, IL20, 

Kinesin Family Member 

21B (KIF21B) 

2p16.1 Reticuloendotheliosis Viral 

Oncogene Homolog (REL), 

CCDC139, 

Pseudouridylate Synthase 

10 (PUS10), 

Chromosome 2 Open 

Reading Frame 74 

(C2orf74) 

95 

Adaptives 

Immunsystem 

- + ASANO et 

al., 2009; 

MC- 

GOVERN et 

al., 2009; 

ANDER- 

SON et al., 

2011 

Oxygenase + - BELLENGU 

EZ et al., 

2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

PARKES et 

al., 2007; 

FRANKE et 

al., 2008 

Endozytose + - FRANKE et 

al., 2010 

Adaptives 

Immunsystem 

Mikrotubulusaktivität 


Isomerase 

Nicht bekannt 

+ + FOWLER et 

al., 2005; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

ANDER- 

SON et al., 

2009; 

BARRETT 

et al., 2009; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010 

+ + MC- 

GOVERN et 

al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010

96 

2p21 Thyroid Adenoma 

Nicht bekannt + - FRANKE et 

Associated (THADA) 

al., 2010 

2p23.3 Glucokinase Regulator Glukokinase- + - FRANKE et 

(GCKR), DNA 

inhibition 

al., 2010 

Methyltransferase 3 Alpha DNS- 

(DNMT3A) 

Methylierung 

2q12.1 Interleukin 1 Receptor-like Adaptives + - FRANKE et 

1 (IL1RL1), Interleukin 18 

Receptor Accessory 

Protein (IL18RAP), 

IL12RL2, IL18R1 

Immunsystem 

al., 2010 

2q33.1 Special AT-rich Sequence Chromatin- - + MC- 

Binding Protein Homebox bindung 

GOVERN et 

2 (SATB2), 

al., 2009; 

Phospholipase C-like 1 Intrazelluläre 

FRANKE et 

(PLCL1) 

Signaltransduktion 

al., 2010 

2q35 Actin-Related Protein Nicht bekannt - + FRANKE et 

(ARPC) 2 

al., 2008; 

BARRETT 

et al., 2009; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

2q37.1 Autophagy Related 16-Like Autophagozytose + - DUERR et 

(ATG16L) 1, 

al., 2006; 

SP140 Nuclear Body Chromatin- 

BELLEN- 

Protein (SP140) 

bindung 

GUEZ et 

al., 2007; 

HAMPE et 

al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2010; 

MC- 

GOVERN et 

al., 2010

3p21.31 Macrophage-Stimulating 

(MST) 1, 

Bassoon (BSN) 

Glutathione Peroxidase 1 

(GPX1) 

97 

Adaptives 

Immunsystem 

+ + BELLEN- 

GUEZ et al., 

2007; 

PARKES et 

al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

MC- 

GOVERN et 

al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010 

3p24.3 Nicht bekannt Nicht bekannt + - FRANKE et 

al., 2010 

5p13.1 Prostaglandin E Receptor Prostaglandin- + + BELLEN- 

Subtype EP (PTGER) 4 Rezeptor 

GUEZ et al., 

2007; 

LIBIOULLE 

et al., 2007; 

PARKES et 

al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2010 

5p15.33 Centrosomal Protein Proteinbindung - + MC- 

72kDa (CEP72), Tubulin 

GOVERN et 

Polymerization Promoting 

Protein (TPPP) 

al., 2009 

5p33.3 IL12b (p40) Adaptives + + BARRETT 

Immunsystem 

et al., 2008; 

PARKES et 

al., 2007; 

FISHER et 

al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

MC- 

GOVERN et 

al., 2010 

5q13.2 Nicht bekannt Nicht bekannt + - FRANKE et 

al., 2010

5q15 Endoplasmic Reticulum 

Aminopeptidase (ERAP2) 

5q31.1 Solute Carrier Camily 22, 

Member 4 (SLC22) A4 / 

SLC22A5, IRF1, IL3 

5q31.3 Neural Precursor Cell 

Expressed 

developmentally Downregulated 

4 Family 

Interacting Protein 1 

(NDFIP1) 

5q33.1 Immunity-related GTPase 

Family M Member (IRGM) 

98 

Innates 

Immunsystem 

Transportprotein 

Chromatinbindung 

Adaptives 

Immunsystem 

5q33.2 IL12B Adaptives 

Immunsystem 

5q35.2 Cytoplasmic 

Polyadenylation Element 

Binding Protein (CPEB4) 

+ - FRANKE et 

al., 2010 

+ - PARKES et 

al, 2007; 

RAELSON 

et al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2010 

+ - FRANKE et 

al., 2010 

Autophagie + - BELLEN- 

GUEZ et al., 

2007; 

PARKES et 

al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

PARKES et 

al., 2008; 

FRANKE et 


al., 2010 

+ + PARKES et 

al., 2008; 

ANDERSON 

et al., 2011 

+ - FRANKE et 

al., 2010

6p21.32 BTNL2, HLA-DRA, HLA- 

DRB5, HLA-DRB1, HLA- 

DQA1, HLA-DQB1, MHC, 

Butyrophilin-Like 2 

(BTNL2) 

99 

Adaptives 

Immunsystem 

+ + KUGAT- 

HASAN et 

al., 2008; 

BARRETT 

et al., 2009; 

SILVER- 

BERG et al., 

2009; 

ANDERSON 

et al., 2011; 

FRANKE et 

al., 2012 

- + ASANO et 

6p21.33 HLA Adaptives 

Immunsystem 

al., 2009 

6p22 Cyclin-dependent kinase 5 Zell- 

+ - BARRETT 

regulatory subunit 

differenzierung, 

et al., 2008; 

associated protein 1-like 1 Apoptose 

IMIELINSKI 

(CDKAL 1) 

et al., 2009 

6p25.2 Nicht bekannt Nicht bekannt + - FRANKE et 

al., 2010 

6q15 BTB and CNC homology 1 Transkriptions- + - FRANKE et 

Basic Leucine Zipper 

Transcription Factor 2 

(BACH2) 

faktor 

al., 2010 

6q21 Nicht bekannt Nicht bekannt + - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009 

6q23.3 Nicht bekannt Nicht bekannt - + ANDERSON 

et al., 2011 

6q25.3 T-cell Activation 

Adaptives + - FRANKE et 

RhoGTPase Activating 

Protein (TAGAP) 

Immunsystem 

al., 2010 

6q27 Chemokine(C-C motif) Adaptives + - BARRETT 

receptor (CCR) 6, 

Immunsystem 

et al., 2008; 

FGFR10P, Ribonuclease A 

IMIELINSKI 

Family 2 (RNASE2) 

et al., 2009; 

MC- 

GOVERN et 

al, 2010 

7p12.2 Zona Pellucida Binding Epithelbarriere + - BARRETT 

Protein (ZPBP) 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009

7q21.1* ATP-Binding Cassette, 

Subfamily B, Member 1 

(ABCB1; Multi Drug 

Resistance1, MDR1) 

100 

Transportprotein + + SATSANGI 

et al., 1996; 

CHO et al. 

1998; 

BRANT et 

al., 2003; 

ONNIE et 

al., 2006 

7q22 MUC3A Epithelbarriere + + SATSANGI 

et al.,1996; 

KYO et al., 

1999; KYO 

7q22.1 SMAD-specific E3 

Ubiquitin-protein Ligase 1 

(SMURF1), Karyopherin 

Alpha 7 (KPNA7) 

7q31.1 SLC26A3, 

Dihydrolipoamide 

Dehydrogenase (DLD), 

Laminin Beta 1 (LAMB1), 

SLC26A3 

et al., 2001 

Proteinbindung - + FRANKE et 

al., 2010 


Glycinspaltung 

Zelladhäsion 


- + MC- 

GOVERN et 

al., 2009; 

SILVER- 

BERG et al., 

2009 

8q24.13 Nicht bekannt Nicht bekannt + - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009 

8q24.21 Nicht bekannt Nicht bekannt + - FRANKE et 

9p24.1 Janus Kinase (JAK) 2, 

Insulin-Like (INSL) 6, 

INSL4 

Signalmolekül 

Fruchtbarkeit 

al., 2010 

+ + BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

BARRETT 

et al., 2009 

9q21.32 Nicht bekannt Nicht bekannt - + SILVER- 

BERG et al., 

9q23 TNFSF15, TNFSF8 Adaptives 

Immunsystem 

2009 

+ - FRANKE et 

al., 2010

9q32* Tumor Necrosis Factor 

superfamily member 15 

(TNFS15, TNF-like ligand 

1 A, TL1A) 

9q34.3 CARD9, Inositol 

Polyphosphate-5phosphatase 

(INPP5E), 

Serologically Defined 

Colon Cancer Antigen 3 

(SDCCAG3), Putative 

UDP-N- 

Acetylglucosamine-Peptide 

N-Acetylglucosaminyltransferase 

Homolog 16 A 

(SEC16A), Small Nuclear 

RNA Activating Complex 

Polypeptide 4 (SNAPC4) 

10p11 Cycline Y (CCNY); 

cAMP-Response Element 

Modulator (CREM); 

Cullin (CUL) 2 

10p15.1 Nitrat Reductase (NR) 

IL2RA 

101 

Adaptives 

Immunsystem, 

Apoptose 

Adaptives 

Immunsystem 

Zellzyklus, 

Transkriptionsfaktor 

Zellzyklus 

Sulfitoxidase 

Adaptives 

Immunsystem 

10q21 PTPN2 Adaptives 

Immunsystem 

10q21.1 Ubiquitin-conjugating 

Enzyme E2D 1 (UBE2D1) 

+ - CHO et al., 

1998; 

YAMASAKI 

et al., 2005; 

BELLEN- 

GUEZ et al., 

2007; 

PICORNELL 

et al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008 

+ + MC- 

GOVERN et 

al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010; 

ANDERSON 

et al., 2011 

+ - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009 

+ - PARKES et 

al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2010 

+ - BARRETT 

et al., 2008; 

PARKES et 

al., 2008 

Proteinbindung + - FRANKE et 

al., 2010

102 

10q21.2 Zinc Finger (ZNF) 365 Zink Finger 

Protein 

10q22.3 Zinc Finger MIZ-type 

Containing 1 (ZMIZ1) 

10q23- 

24* 

Disks Large Homolog 

(DLG) 5 

10q24.2 Natural Killer Cellassociated 

Antigen 2 

Transcription Factor 

Related, Locus 3 (NKX2-3) 

11p15.1 Breakpoint Cluster Regiondetected 

Lymphocyte 

Antigen (NELL1) 

+ - BELLEN- 

GUEZ et al., 

2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010 

Zink Finger + + IMIELINSKI 

et al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010 

Signalmolekül + + HAMPE et 

al., 1999; 

STOLL et 

al., 2004; 

FRIED- 

RICHS et 

al., 2006; 

BROWNING 


Zellwachstum 

und - 

Differenzierung 

11q IL10 Receptor α (IL10RA) Adaptives 

Immunsystem 

11q12.2 Fatty Acid Desaturase 1 Fettsäure- 

(FADS1) 

synthese 

11q13.1 Peroxiredoxin (PRDX5), Apoptose- 

Estrogen-related Receptor regulation 

Alpha (ESRRA) 


et al., 2008 

+ + BELLEN- 

GUEZ et al., 

2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FISHER et 

al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2010 

+ - FRANKE et 

al., 2007 

+ + GLOCKER 

et al., 2009 

+ - FRANKE et 

al., 2010 

+ - FRANKE et 

al., 2010

11q13.5 Chromosome 11 Open 

Reading Frame 30 

(C11orf30) 

12q12 Leucine-rich repeat kinase 

(LRRK) 2, 

Mucin (Muc) 19, 

SLC2A13 

103 

Repressor- 

protein 

Signalmolekül 

Epithelbarriere 


12q15 IL26, IL22, IFN-γ Adaptives 

Immunsystem 

13q12.13 Ubiquitin Specific 

Peptidase 12 (USP12) 

+ - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009 

+ - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010 

- + FISHER et 

al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

SILVER- 

BERG et al., 

2009 

Peptidase - + ASANO et 

al., 2009; 

ANDERSON 

et al., 2011 

13q13.3 Nicht bekannt Nicht bekannt + + SHUGART 

et al., 2008; 

ASANO et 

13q14.11 C13orf31, 

Coiled-Coil Domain 

Containing (CCDC) 122, 

Ecto-NOX Disulfide-Thiol 

Exchanger (ENOX) 1 

TNFSF11 

14q24.1 Zinc Finger Protein 36 

C3H Type-like 1 

(ZFP36L1) 

14q31.3 Galactosylceramidase 

(GALC), G Protein-coupled 

Receptor 65 (GPR65) 

15q22.33 Mothers Against 

Decapentaplegic Homolog 

3 (SMAD3) 

15q31.1 Hect Domain and Rolled 

Leaf (HERC) 2 

Nicht bekannt 

Nicht bekannt 


Adaptives 

Immunsystem 

Adaptives 

Immunsystem 

Kationenbindung 

Glycosphingo- 

lipidrezeptor 


al., 2009 

+ - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010 

+ - FRANKE et 

al., 2010 

+ - FRANKE et 

al., 2010 

+ - FRANKE et 

al., 2010 

Nicht bekannt - + FRANKE et 

al., 2008; 

BARRETT 

et al., 2009; 

IMIELINSKI 

et al., 2009

16p11.2 IL27, CCDC101, Ceroid- 

Lipofuscinosis Neuronal 3 

(CLN3), Eukaryotic 

Translation Initiation Factor 

3 Subunit C (EIF3C), 

Nuclear Protein 

Transcriptional Regulator 1 

(NUPR1), Sulfotransferase 

Family Cytosolic 1A 

Phenol-Preferring Member 

1 (SULT1A1), SULT1A2 

104 

Adaptives 

Immunsystem 


Proteinsynthese 

Apoptoseinduktion 

+ + IMIELINSKI 

et al., 2009; 

FRANKE et 

al., 2010 

16p13.13 Class II Major 

Sulfatkonjugation 

Proteinbindung - + MC- 

Histocompatibility Complex 

GOVERN et 

Transactivator (CIITA) 

al., 2009 

16q12.1 Nucleotide-Binding Erkennung von + - DUERR et 

Oligomerization Domain Bakterien 

al., 2006; 

Containing (NOD) 2 / 

BELLEN- 

Caspase Recruitment 

GUEZ et al., 

Domain Family, Member 

2007; 

15 (CARD15) 

LIBIOULLE 

et al., 2007; 

RAELSON 

et al., 2007; 

RIOUX et 

al., 2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2010; 

MC- 

GOVERN et 

al., 2010 

16q22.1 Cadherin 1 Type 1 (CDH1) Zelladhäsion - + BARRETT 

et al., 2009 

16q24 Family with Sequence nicht bekannt + - RAELSON 

Similarity 92, member 

et al., 2007; 

(FAM92) B 

RIOUX et 

al., 2007 

17q12 Orosomucoid 1 Like 3 Sphingolipid- + - BARRETT 

(ORMDL3), ZPBP2M, synthese 

et al., 2008; 

GSDML, Chemokine (C-C 

MCmotif) 

Ligand (CCL) 2, Chemotaxis 

GOVERN et 

CCL7 

al., 2009

17q21.2 Signal Transducer and 

Activator of Transcription 

(STAT) 3, Orosomucoid 1 

Like (ORMDL) 3 

18p11.21 Protein Tyrosine 

Phosphatase, Non- 

Receptor Type (PTPN) 2 

19p13.2 Tyrosinekinase 2 (TYK2), 

Intercellular Adhesion 

Molecule 1 (ICAM1), 

ICAM3 

105 


Adaptives 

Immunsystem 

Adaptives 

Immunsystem 

+ + BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008 

+ + BELLEN- 

GUEZ et al., 

2007; 

BARRETT 

et al., 2008; 

FRANKE et 

al., 2008 

+ - FRANKE et 

al., 2010 

19q13.11 Nicht bekannt Nicht bekannt + + IMIELINSKI 

et al., 2009 

19q13.33 Fucosyltransferase 2 Antigensynthese + - FRANKE et 

(FUT2), Ras Interacting Signaltrans- 

al., 2010; 

Protein 1 (RASIP1) duktion 

MC- 

GOVERN et 

al., 2010 

20q13.13 Hepatocyte Nuclear Factor Transkriptions- - + BARRETT 

4 Alpha (HNF4A) 

faktor 

et al., 2009 

20q13.33 Tumor Necrosis Factor Adaptives + + KUGAT- 

Receptor Superfamily Immunsystem, 

HASAN et 

(TNFRSF) 6B, Regulator Apoptose 

al., 2008; 

of Telomere Elongation DNS-Helicase 

BARRETT 

Helicase 1 (RTEL1), 

et al., 2009; 

TNFRS-F6B, SLC2A4RG 

FRANKE et 

al., 2010 

21q21.1 Nicht bekannt Nicht bekannt + - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009; 

MC- 

GOVERN et 

al., 2009 

21q22.2 Proteasome (Prosome, Proteasomen + + FRANKE et 

Macropain) Assembly 

al., 2008; 

Chaperone (PSMG) 1 Adaptives 

KUGAT- 

Interleukin 10 Receptor, β Immunsystem 

HASAN et 

(Il10RB) 

al., 2008; 

GLOCKER 

et al., 2009

21q22.3 Inducible T-Cell Co- 

Stimulator Ligand 

(ICOSLG) 

106 

Adaptives 

Immunsystem 

+ - BARRETT 

et al., 2008; 

IMIELINSKI 

et al., 2009 

22q11.21 YDJC Hydrolase + - FRANKE et 

al., 2010 

22q12.2 HORMA domain 

Meiose 

+ + IMIELINSKI 

containing 2 (HORMAD2), 

et al., 2009; 

Myotubularin Related 

FRANKE et 

Protein 3 (MTMR3), 

Leukemia Inhibitory Factor 

Phosphatase 

al., 2010 

(LIF) 

Zelldifferenzierung 

22q13.1 TGF-beta Activated Kinase Adaptives + - FRANKE et 

1/MAP3K7 Binding Protein 

1 (MAP3K7IP1) 

Immunsystem 

al., 2010 

22q13.33 Interleukin 17 Receptor E- Nicht bekannt - + FRANKE et 

like (IL17REL) 

al., 2010 

* die entsprechenen Genloki wurden erstmals in Kopplungsanalysen beschrieben; 

MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa

12 Anhang 2: Material und Methoden 

12.1 Promotorsequenzen und Primer 

107 

bp1-50: 

PKlila 

Cd14-C3Bir Promotor AATGATGACGATGACGACGACGACGACGACAATAATGAAGACAATGCTGA 

PKlila/OCT1Revers IIOCT1Forward Z 

Cd14-B6 Promotor AATGATGACGATGACGACGACGACGATGACAATGATGAAGACAATGCTGA 

************************** ****** **************** 

bp 51-100: 

Cd14-C3Bir Promotor CGGCAAACCTTGCTTCCCAATTTTAGGAACACTGTGTAATGTGATTTGGC 

A 

Cd14-B6 Promotor CGGCAAACCTTGCTTCCCAATTTTAGGAACACTGTGTAATGTGATTTGGC 

************************************************** 

bp 101-150: 

Cd14-C3 Bir Promotor CAATGTACCACTATCAAATACCACATTTTGCTTTGTTTTGTTATTTAAAC 

Cd14-B6 Promotor CAATGTACCACTATCAAATACCACATTTTGCTTTGTTTTGTTATTTAAAC 

************************************************** 

bp 151-200: 

B 

Cd14-C3Bir Promotor AAGGTCTCTATTTAGTCCTAGTTGTCCTGGAACTCTTTTTGTAGGCCAGG 

B 

Cd14-B6 Promotor AAGGTCTCTATTTAGTCCTAGTTGTCCTGGAACTCTTTTTGCAGGCCAGG 

***************************************** ******** 

bp 201-250: 

Cd14-C3Bir Promotor CTGGCCCTGAACTCAAGCTGGCCTGCCTCTGCCTCTTAATTGCTGGAATT 

C 

Cd14-B6 Promotor CTGGCCCTGAACTCAAGCTGGCCTGCCTCTGTCTCTTAATTGCTAGAATT 

******************************* ************ ***** 

bp 251-300: 

900for 

Cd14-C3Bir Promotor AAAGTCATTTCCTATTAGCCTAACAAGCTTTTTATAGAAAAGTATTGAAA 

900for 

Cd14-B6 Promotor AAAGTCATTTCCTATTAGCCTAACAAGCTTTTTATAGAAAAGTATTGAAA 

************************************************** 

bp 301-350: 

Cd14-C3Bir Promotor AAGCTGGGCATGGTGGCTCACACCTATAATCCTAGCATTTGGGAGGCAGA 

Cd14-B6 Promotor AAGCTGGGCATGGTGGCTCACACCTATAATCCTAGCATTTGGGAGGCAGA 

************************************************** 

bp 351-400:

108 

Cd14-C3Bir Promotor GGCAGGAGGAAAATCATGCGTTTCAGGCTAGGCTAGATTGGGTTACTAGA 

Cd14-B6 Promotor GGCAGGAGGAAAATCATGCGTTTCAGGCTAGGCTAGATTGGGTTACTAGA 

************************************************** 

bp 401-450: 

Seq1 OCT1 Revers 

Cd14-C3Bir Promotor CTGAGATATCATGGGGAGAATGGAGAGGTAGAGAGTGGGAGAAGAATGAA 

E2F Revers 

Cd14-B6 Promotor CTGAGATATCATGGGGAGAATGGAGAGGTAGAGAGTGGGAGAAGAATGAA 

************************************************** 

bp 451-500: 

ǁ OCT1 Forward 

Cd14-C3Bir Promotor TTAATAAAGAACTGAATAAGATGGGAAGAAGGGAGAATTATTTTTCATAT 

ǁ E2F Forward 

Cd14-B6 Promotor TTAATAAAGAACTGAATAAGACGGGAAGAAGGGAGAATTATTTTTCATAT 

********************* **************************** 

bp 501-550: 

Cd14-C3Bir Promotor TAACTCTCAACTTTGAGCTTTATTCTCTGCCTGGAATCTATAGATAAGTT 

Cd14-B6 Promotor TAACTCTCAACTTTGAGCTTTATTCTCTGCCTGGAATCTATAGATAAGTT 

************************************************** 

bp 551-600: 

600 for 

Cd14-C3Bir Promotor CACAATCTTTCCACAAATGTCCAATTACATTCAAAGAAAATCAAGAGCTG 

600 for 

Cd14-B6 Promotor CACAATCTTTCCACAAATGTCCAATTACATTCAAAGAAAATCAAGAGCTG 

************************************************** 

bp 601-650: 

Cd14-C3Bir Promotor GATTTGAACGGTGGGAAATTGCTAGCAACTAAGACTAGGGGAAAATGGAG 

Cd14-B6 Promotor GATTTGAACGGTGGGAAATTGCTAGCAACTAAGACTAGGGGAAAATGGAG 

************************************************** 

bp 651-700: 

D 

Cd14-C3Bir Promotor GTGAATCAATGGGACTGAGCAACAGAATAATGATCTAAGGCACTAGGTGT 

PPARG1Revers IIPPARG1Forward/D 

Cd14-B6 Promotor GTGAATCAATGGGACTGAGCAACAGAATAATGATCTAAGGCACTAGGTGT 

**************************************************

109 

bp 701-750: 

PPARG2Revers 

Cd14-C3Bir Promotor GATTCACTCTTTTCCTGTACGCACCAGACAAGTCCGGGGCTCATAGGTCA 

PPARG2Revers 

Cd14-B6 Promotor GATTCACCCTTTTCCTGTACGCACCAGACAAGTCCGGGGCGCATAGGTCA 

******* ******************************** ********* 

bp 751-800: 

IIPPARG2Forward/E7Pax2Revers IIPAX2Forward 

Cd14-C3Bir Promotor TCCTCCTGGCACAGAATGCCCTAATGCCACTCTGAATTCTTCCTGTTTTT 

IIPPARG2Forward/E 

Cd14-B6 Promotor TCCTCCTGGCACAGAATGCCCTAATGCCACTCTGAATTCTTCCTGTTTTT 

************************************************** 

bp 801-850: 

Cd14-C3Bir Promotor CGTCCCTCCCTAAAAAACACTTCCTTGCAATATTTACTAGAAGTGAGTAG 

Cd14-B6 Promotor CGTCCCTTCCTAAAAAACACTTCGTTGCAATATTTACTAGAAGTGAGTAG 

******* *************** ************************** 

bp 851-900: 

300for 

Cd14-C3Bir Promotor GGCTGTTAGGAGGAAGAGAAGTGGAGACGCAATTAGAATTCACAGAGGAA 

300for 

Cd14-B6 Promotor GGCTGTTAGGAGGAAGAGAAGTGGAGACGCAATTAGAATTCACAGAGGAA 

************************************************** 

bp 901-950: 

Cd14-C3Bir Promotor GGGACAGGGTGACACCCCAGGATTACATAAATTTACAGGGGCTGCCGAAT 

Cd14-B6 Promotor GGGACAGGGTGACACCCCAGGATTACATAAATTTACAGGGGCTGCCAAAT 

********************************************** *** 

bp 951-1000: 

Cd14-C3Bir Promotor TGGTCGAACAAGCCCGTGGAACCTGGAAGCCAGAGAACACCATCGCTGTA 

PAX2Revers II 

Cd14-B6 Promotor TGGTCGAACAAGCCCGTGGAACCTGGAAGCCAGAGAACACCACCGCTGTA 

****************************************** ******* 

bp 1001-1050: 

F 

Cd14-C3Bir Promotor AAGGAAAGAAACTGAAGCTTTTCTCGGAGCCTATCTGGGCTGCTCAAACT 

PAX2Forward/ F 

Cd14-B6 Promotor AAGGAAAGAAACTGAAGCCTTTCTCGGAGCCTATCTGGGCTGCTCAAACT 

****************** ******************************* 

bp 1051-1100: 

Cd14-C3Bir Promotor TTCAGAATCTACCGACCATGGTGAGTCAGACAGACTGTCTTGGGGTGGAA 

Cd14-B6 Promotor TTCAGAATCTACCGACCATGGTGAGTCAGACAG----TCTTGGGGTGGAA 

********************************* ************* 

bp 1101-1150: 

Cd14-C3Bir Promotor CTGGAGCCAACCTGAGGAATCTCAGGGTCTGGCAGGAGTCTCCCTGACCC

110 

Cd14-B6 Promotor CTGGAGCCAACCTGAGGAATCTCAGGGTCTGGCAGGAGTCTCCCTGACCC 

************************************************** 

bp 1151-1200: 

130for 

Cd14-C3Bir Promotor CTACTTTCTCCTCAGGAGCGTGTGCTTGGCTTGTTGCTGTTGCTTCTGGT 

130for 

Cd14-B6 Promotor CTACTTTCTCCTCAGGAGCGTGTGCTTGGCTTGTTGCTGTTGCTTCTGGT 

************************************************** 

bp 1201-1250: 

Cd14-C3Bir Promotor GCACGCCTCTCCCGCCCCACCAGAGCCCTGCGAGCTAGACGAGGAAAGTT 

Cd14-B6 Promotor GCACGCCTCTCCCGCCCCACCAGAGCCCTGCGAGCTAGACGAGGAAAGTT 

************************************************** 

bp 1251-1278: 

PKrela 

Cd14-C3Bir Promotor GTTCCTGCAACTTCTCAGATAGATCTGG 

PKrela 

Cd14-B6 Promotor GTTCCTGCAACTTCTCAGATAGATCTGG 

**************************** 

12.2 Oligokukleotide 

12.2.1 Verwendete Oligonukleotide 

Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide 

Funktion Name Sequenz Position 

Trunkierung PKLlila ATT GAT GAC GAT GAC GAC 1-21 

des B6-Cd14- 

Promotors 

GAC 

Z GAT GAA GAC AAT GCT GAC 

GGC AAA C 

33-58 

A GTG ATT TGG CCA ATG TAC 

CAC 

90-111 

B TCC TAG TTG TCC TGG AAC TC 165-185 

C CTG CCT CTG TCT CTT AAT 

TGC 

222-243 

900for TTG AAA AAG CTG GGC ATG 

GTG G 

295-317 

600for AAG AGC TGG ATT TGA ACG 

GTG G 

593-615 

D GAT CTA AGG CAC TAG GTG 

TG 

682-702 

E CCC TAA TGC CAC TCT GAA 

TTC 

768-789 

300for GAA TTC ACA GAG GAA GGG 

ACA G 

886-908

Trunkierung 

des C3 Bir - 

Cd14- 


Mutagenese 

des B6-Cd14- 


111 

F GAA GCC TTT CTC GGA GCC TA 1013-1033 

130for TAC TTT CTC CTC AGG AGC 

GTG 

1152-1173 

PKLrela GTT GTT CCT GCA ACT TCT 

CAG ATA GAT CTGG 

1247-1278 

PKLlila ATT GAT GAC GAT GAC GAC 

GAC 

1-21 


900for TTG AAA AAG CTG GGC ATG 

GTG G 

295-317 

600for AAG AGC TGG ATT TGA ACG 

GTG G 

593-615 


TG 

682-702 

E CCC TAA TGC CAC TCT GAA 

TTC 

768-789 

300for GAA TTC ACA GAG GAA GGG 

ACA G 

886-908 

F GAA GCT TTT CTC GGA GCC TA 1013-1033 

130for TAC TTT CTC CTC AGG AGC 

GTG 

1152-1173 

PKLrela GTT GTT CCT GCA ACT TCT 

CAG ATA GAT CTGG 

1247-1278 

OCT1Revers AAT GAT GAC GAT GAC GAC 

GAC 

1-21 

OCT1Forward GAC GTT AAT TAA GAT GAA 

GAC AAT GCT GAC 

22-51 

E2FRevers TCT TTA TTA ATT CAT TCT TCT 

C 

438-460 

E2FForward ACT GAA TAA GGA AGG AAG 

AAG G 

461-483 

PPARG1Revers CCT TAG ATC ATT ATT CTG 

TTG CTC AGT CCC 

661-736 

PPARG1Forward CAC TAG GTG TGA TTC ACC 

CTT TT 

737-759 

PPARG2Revers AGG AGG ATG ACC TAT GCG 

CCC 

737-757 

PPARG2Forward GGC ACA GAT TAA TTA AAT 

GCC ACT CTG 

758-784 

PAX2Revers AGC GGT GGT GTT CTC TGG 

CTT C 

976-997 

PAX2Forward GTA AAG GAG GCC GGC CGA A 998-1016 

SP1Revers GCA CCA GAA GCA ACA GCA 1175-1201

Mutagenese 

des C3Bir- 

Cd14- 


112 

ACA GCC AAG 

SP1Forward ACG CCT CTC CGG AAC CAC 

CAG AGC CCT 

OCT1Revers TCT TTA TTA ATT CAT TCT TCT 

C 

1202-1229 

438-460 

OCT1Forward ACT GAA TAA GCG GGG AAG 

AAG G 

461-483 

PPARGRevers AGG AGG ATG ACC TAT GCG 

CCC 

737-757 

PPARGForward GGC ACA GAT TAA TTA AAT 

GCC ACT CTG 

758-784 

SP2Revers ATT AGG GCA TTC TGT GCC 

AGG AG 

753-775 

SP2Forward GCC ACT CTG ATT TCT TCC 

TGT TTT TCT TAA TTA AC 

776-810 

SP1Revers GCA CCA GAA GCA ACA GCA 

ACA GCC AAG 

1175-1201 

SP1Forward ACG CCT CTC CGG AAC CAC 

CAG AGC CCT 

1202-1229 

STAT1Revers AAG AGG CAG AGG CAG GCC 

AGC 

217-237 

STAT1Forward AAG GCC GGC CAT TAA AGT 

CAT TTC CTA 

238-265 

C-E2FRevers TAA TTC TCC TTT TAA TTA ACT 

TAG TTC 

460-487 

C-E2FForward GAA CTA AGT TAA TTA AAA 

GGA GAA TT 

460-486 

C-SP1Revers GGG CTC TCT GGT GTT AAT 

TAA GAG GCG TGC 

1176-1205 

C-SP1Forward GCA CGC CTC TTA ATT AAC 

ACC AGA GCC C 

1202-1230 

Sequenzierung RV3PrimerAG TAG CAA AAT AGG CTG TCC 

CAG 

pGL4.17 

A GTG ATT TGG CCA ATG TAC 

CAC 

90-111 


Seq2rev CAG GCC AGC TTG AGT TCA G 207-225 

C CTG CCT CTG TCT CTT AAT 

TGC 

222-243 

Seq1 GTA GAG AGT GGG AGA AGA 

ATG 

427-448 


TG 

682-702 

E CCC TAA TGC CAC TCT GAA 768-789

113 

TTC 

F GAA GCC TTT CTC GGA GCC TA 1013-1033 

qRT-PCR NeoForward ACG GTG AGG ACC TGG TTG 

TC 

NeoRevers GCC ATT CTC GAC CAT GAT 

GTT 

Luci1Forward CCT TTA CCG ACG CAC ATA TC 

Luci1Revers TTA CCT ACG CCG AGT ACT TC 

Luci2Forward TAT TCA GCC CAT AGC GCT TC 

Luci2Revers CTG CAA GCT ATT CTC GCT GC 

12.2.2 Oligonukleotide für EMSA 

Tabelle 8: Oligonukleotide für EMSA 

Name Biotinylierung Sequenz Position 

SP2(C3Bir)-WT-fw - GCC CTA ATG CCA CTC TGA 

ATT CTT CCT GTT TTT CGT CCC 

TCC CTA AAA AAC ACT TCC 

TTG 

768-827 

SP2(C3Bir)-WT- - CAA GGA AGT GTT TTT TAG 768-827 

rev 

GGA GGG ACG AAA AAC AGG 

AAG AAT TCA GAG TGG CAT 

TAG GGC 

PPARG(C3Bir)- - TCC GGG GCT CAT AGG TCA 733-792 

WT-fw 

TCC TCC TGG CAC AGA ATG 

CCC TAA TGC CAC TCT GAA 

TTC TTC 

PPARG(C3 Bir)- - GAA GAA TTC AGA GTG GCA 733-792 

WT-rev 

TTA GGG CAT TCT GTG CCA 

GGA GGA TGA CCT ATG AGC 

CCC GGA 

OCT1(C3 Bir)-WT- - GAG AGG TAG AGA GTG GGA 423-482 

fw 

GAA GAA TGA ATT AAT AAA 

GAA CTG AAT AAG ATG GGA 

AGA AGG 

OCT1(C3 Bir)-WT- - CCT TCT TCC CAT CTT ATT CAG 423-482 

rev 

TTC TTT ATT AAT TCA TTC TTC 

TCC CAC TCT CTA CCT CTC 

SP2(C3 Bir)-WT- + GCC CTA ATG CCA CTC TGA 768-827 

fw-bio 

ATT CTT CCT GTT TTT CGT CCC 

TCC CTA AAA AAC ACT TCC 

TTG 

SP2(C3 Bir)-WT- + CAA GGA AGT GTT TTT TAG 768-827 

rev-bio 

GGA GGG ACG AAA AAC AGG 

AAG AAT TCA GAG TGG CAT

114 

SP2(C3 Bir)-Mut- + 

TAG GGC 

GCC CTA ATG CCA CTC TGA 768-827 

fw-bio 

ATT CTT CCT GTT TTT CTT AAT 

TAA CTA AAA AAC ACT TCC TTG 

SP2(C3 Bir)-Mut- + CAA GGA AGT GTT TTT TAG TTA 768-827 

rev-bio 

ATT AAG AAA AAC AGG AAG 

AAT TCA GAG TGG CAT TAG 

GGC 

PPARG(C3 Bir)- + TCC GGG GCT CAT AGG TCA 733-792 

WT-fw-bio 

TCC TCC TGG CAC AGA ATG 

CCC TAA TGC CAC TCT GAA 

TTC TTC 

PPARG(C3 Bir)- + GAA GAA TTC AGA GTG GCA 733-792 

WT-rev-bio 

TTA GGG CAT TCT GTG CCA 


CCC GGA 

PPARG(C3 Bir)- + TCC GGG GCT CAT AGG TCA 733-792 

Muta-fw-bio 

TCC TCC TGG CAC AGA TTA 

ATT AAA TGC CAC TCT GAA TTC 

TTC 

PPARG(C3 Bir)- + GAA GAA TTC AGA GTG GCA 733-792 

Muta-rev-bio 

TTT AAT TAA TCT GTG CCA 


CCC GGA 

OCT1(C3 Bir)-WT- + GAG AGG TAG AGA GTG GGA 423-482 

fw-bio 


GAA CTG AAT AAG ATG GGA 

AGA AGG 

OCT1(C3 Bir)-WT- + CCT TCT TCC CAT CTT ATT CAG 423-482 

rev-bio 

TTC TTT ATT AAT TCA TTC TTC 

TCC CAC TCT CTA CCT CTC 

OCT1(C3 Bir)- + GAG AGG TAG AGA GTG GGA 423-482 

Muta-fw-bio 


GAA CTG AGG CCG GCC GGA 

AGA AGG 

OCT1(C3 Bir)- + CCT TCT TCC GGC CGG CCT 423-482 

Muta-rev-bio 

CAG TTC TTT ATT AAT TCA TTC 

TTC TCC CAC TCT CTA CCT 

CTC 

OCT1-WT-fw - AAT GAT GAC GAT GAC GAC 

GAC GAC GAT GAC AAT GAT 

GAA GAC AAT GCT GAC GGC 

AAA CCT 

1-60 

OCT1-WT-rev - AGG TTT GCC GTC AGC ATT 

GTC TTC ATC ATT GTC ATC 

GTC GTC GTC GTC ATC GTC 

1-60

115 

ATC ATT 

OCT1-WT-fw-bio + AAT GAT GAC GAT GAC GAC 

GAC GAC GAT GAC AAT GAT 


AAA CCT 

OCT1-WT-rev-bio + AGG TTT GCC GTC AGC ATT 

GTC TTC ATC ATT GTC ATC 

GTC GTC GTC GTC ATC GTC 

ATC ATT 

OCT1-Mut-fw-bio + AAT GAT GAC GAT GAC GAC 

GAC GAC GTT AAT TAA GAT 


AAA CCT 

OCT1-Mut-rev-bio + AGG TTT GCC GTC AGC ATT 

GTC TTC ATC TTA ATT AAC GTC 

GTC GTC GTC ATC GTC ATC 

ATT 

1-60 

1-60 

1-60 

1-60

13 Anhang 3: Ergebnisse 

116 

13.1 Vergleich chemischer Transfektionsmethoden 

13.1.1 Polyfect® (NIH3T3) 

Abbildung 15: Transfektion von NIH3T3-Zellen mit Polyfect® 

13.1.2 Fugene® (RAW264.7) 

Abbildung 16: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Fugene HD® 

13.1.3 Targefect® (RAW264.7) 

Abbildung 17: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Targefect®

13.1.4 Superfect® (RAW264.7) 

117 

Abbildung 18: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Superfect® 

13.1.5 Xtreme Gene 9 DNA® (RAW264.7) 

Abbildung 19: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene 9 DNA®

118 

13.1.6 Xtreme Gene HP DNA® (RAW264.7) 

Abbildung 20: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene HP DNA®

119 

13.2 Aktivität der Cd14-Promotoren von C3Bir und B6 


Messung 1 Messung 2 

MW Luz/β-Gal 

Luziferase β-Gal Luz/β-Gal Luziferase β-Gal Luz/β-Gal 

A1 - B6 1300 

1 282130 0,139 2029712,23 255940 0,12 2132833,33 2081272,78 

2 105370 0,144 731736,111 115520 0,107 1079626,17 905681,14 

3 57090 0,182 313681,319 56270 0,181 310883,978 312282,648 

4 14860 0,148 100405,405 14800 0,159 93081,761 96743,5832 

5 32560 0,317 102712,934 31780 0,355 89521,1268 96117,0303 

6 

A2 - B6 900 

36140 0,4 90350 39980 0,368 108641,304 99495,6522 

1 17260 0,111 155495,495 15640 0,116 134827,586 145161,541 

2 18880 0,115 164173,913 17620 0,111 158738,739 161456,326 

3 19000 0,201 94527,3632 18120 0,2 90600 92563,6816 

4 8020 0,121 66280,9917 7800 0,114 68421,0526 67351,0222 

5 19960 0,348 57356,3218 18900 0,255 74117,6471 65736,9844 

6 

A3 - B6 600 

37400 0,493 75862,069 42280 0,37 114270,27 95066,1696 

1 310820 0,118 2634067,8 325580 0,121 2690743,8 2662405,8 

2 241970 0,146 1657328,77 234670 0,144 1629652,78 1643490,77 

3 30060 0,144 208750 28060 0,139 201870,504 205310,252 

4 17300 0,274 63138,6861 20740 0,288 72013,8889 67576,2875 

5 19620 0,147 133469,388 15000 0,146 102739,726 118104,557 

6 

A4 - B6 300 

21800 0,401 54364,0898 23240 0,427 54426,2295 54395,1596 

1 86290 0,133 648796,992 81230 0,126 644682,54 646739,766 

2 105630 0,16 660187,5 104310 0,147 709591,837 684889,668 

3 1960 0,143 13706,2937 2380 0,14 17000 15353,1469 

4 7180 0,175 41028,5714 5980 0,172 34767,4419 37898,0066 

5 10940 0,355 30816,9014 9660 0,331 29184,29 30000,5957 

6 

A5 - B6 130 

13300 0,322 41304,3478 14560 0,352 41363,6364 41333,9921 

1 270100 0,121 2232231,4 242050 0,117 2068803,42 2150517,41 

2 195070 0,129 1512170,54 224350 0,114 1967982,46 1740076,5 

3 20340 0,451 45099,7783 18020 0,51 35333,3333 40216,5558 

4 15820 0,322 49130,4348 1640 0,358 4581,00559 26855,7202 

5 242050 0,117 2068803,42 270100 0,121 2232231,4 1690086,5 

6 

pGL4.17 

224350 0,114 1967982,46 195070 0,129 1512170,54 32216,5558 

1 3040 0,123 24715,4472 3160 0,104 30384,6154 27550,0313 

2 9520 0,123 77398,374 8660 0,12 72166,6667 74782,5203 

3 780 0,147 5306,12245 900 0,124 7258,06452 6282,09348 

4 2180 0,146 14931,5068 2080 0,167 12455,0898 13693,2983 

5 1220 0,281 4341,63701 1400 0,302 4635,76159 4488,6993 

6 1920 0,238 8067,22689 2080 0,217 9585,25346 8826,24017 


nach Trunkierung 

MW = Mittelwert; β-Gal = β-Galaktosidase; Luz = Luziferase

120 


MW Luz/β-Gal 

Luziferase 

A6 - C3Bir 1300 

β-Gal Luz/β-Gal Luziferase β-Gal Luz/β-Gal 

1 307270 0,119 2582100,84 305700 0,123 2485365,85 2533733,35 

2 380440 0,142 2679154,93 333790 0,134 2490970,15 2585062,54 

3 14560 0,186 78279,5699 28220 0,18 156777,778 117528,674 

4 32780 0,153 214248,366 32320 0,161 200745,342 207496,854 

5 67500 0,369 182926,829 61690 0,249 247751,004 215338,917 

6 

A7 - C3Bir 900 

57810 0,39 148230,769 70520 0,336 209880,952 179055,861 

1 418410 0,12 3486750 418710 0,116 3609568,97 3548159,48 

2 403210 0,135 2986740,74 459170 0,13 3532076,92 3259408,83 

3 104790 0,235 445914,894 105830 0,203 521330,049 483622,471 

4 19420 0,17 114235,294 23080 0,194 118969,072 116602,183 

5 77260 0,347 222651,297 86490 0,321 269439,252 246045,275 

6 

A8 - C3Bir 600 

44500 0,232 191810,345 42940 0,253 169723,32 180766,832 

1 583810 0,131 4456564,89 571000 0,119 4798319,33 4627442,11 

2 669850 0,117 5725213,68 646440 0,115 5621217,39 5673215,53 

3 128520 0,159 808301,887 129600 0,145 893793,103 851047,495 

4 25480 0,114 223508,772 29000 0,12 241666,667 232587,719 

5 67740 0,283 239363,958 88860 0,294 302244,898 270804,428 

6 

A9 - C3Bir 300 

88860 0,353 251728,045 60040 0,376 159680,851 205704,448 

1 29480 0,124 237741,935 25900 0,129 200775,194 219258,565 

2 37080 0,133 278796,992 31760 0,119 266890,756 272843,874 

3 1100 0,136 8088,23529 1120 0,121 9256,19835 8672,21682 

4 111480 0,301 370365,449 12700 0,321 39563,8629 204964,656 

5 3640 0,494 7368,42105 3620 0,264 13712,1212 10540,2711 

6 

A10 - C3Bir 130 

3660 0,238 15378,1513 3780 0,225 16800 16089,0756 

1 270100 0,121 2232231,4 242050 0,117 2068803,42 2150517,41 

2 195070 0,129 1512170,54 224350 0,114 1967982,46 1740076,5 

3 20340 0,451 45099,7783 18020 0,51 35333,3333 40216,5558 

4 15820 0,322 49130,4348 16400 0,358 45810,0559 47470,2453 

5 242050 0,117 2068803,42 270100 0,121 2232231,4 2090518,41 

6 

pGL4.17 

224350 0,114 1967982,46 195070 0,129 1512170,54 1800059,5 

1 3040 0,123 24715,4472 3160 0,104 30384,6154 27550,0313 

2 9520 0,123 77398,374 8660 0,12 72166,6667 74782,5203 

3 780 0,147 5306,12245 900 0,124 7258,06452 6282,09348 

4 2180 0,146 14931,5068 2080 0,167 12455,0898 13693,2983 

5 1220 0,281 4341,63701 1400 0,302 4635,76159 4488,6993 

6 1920 0,238 8067,22689 2080 0,217 9585,25346 8826,24017 


Promotors nach Trunkierung 


121 

13.2.2 Inaktivierung potentieller Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 

13.2.2.1 Deletion durch Promotorverkürzungen 


MW Luz/β-Gal 


A1 - B6 1300 

1 104940 0,158 664177,215 104200 0,152 685526,316 1349703,53 

2 303970 0,153 380570 0,148 2571418,92 2571418,92 

3 70780 0,13 544461,538 70580 0,115 544461,538 

4 36600 0,177 206779,661 34500 0,18 191666,667 398446,328 

5 29340 0,225 27840 0,21 132571,429 132571,429 

6 

A2 - B6 900 

59390 0,303 196006,601 54350 0,3 181166,667 377173,267 

1 30180 0,241 125228,216 35740 0,212 168584,906 293813,121 

2 38820 0,227 171013,216 39300 0,228 172368,421 343381,637 

3 17070 0,319 53510,9718 18730 0,297 63063,9731 116574,945 

4 13650 0,172 79360,4651 16370 0,175 93542,8571 172903,322 

5 35690 0,239 149330,544 50290 0,225 223511,111 372841,655 

6 

A3 - B6 600 

23240 0,136 170882,353 22540 0,142 158732,394 329614,747 

1 32600 0,154 211688,312 34040 0,17 200235,294 411923,606 

2 31040 0,143 217062,937 31320 0,142 220563,38 437626,317 

3 210320 0,116 1813103,45 200440 0,137 1463065,69 3276169,14 

4 204680 0,144 1421388,89 230920 0,12 1924333,33 1672861,11 

5 25360 0,108 234814,815 25920 0,103 251650,485 486465,3 

6 

A4 - B6 300 

23820 0,116 205344,828 24040 0,104 231153,846 436498,674 

1 25140 0,183 137377,049 23940 0,181 132265,193 269642,243 

2 27520 0,172 160000 27980 0,167 167544,91 327544,91 

3 15500 0,118 131355,932 14560 0,113 128849,558 260205,49 

4 10360 0,152 68157,8947 10560 0,151 69933,7748 138091,67 

5 20760 0,139 149352,518 21860 0,141 155035,461 304387,979 

6 

A5 - B6 130 

26060 0,106 245849,057 25760 0,102 252549,02 498398,076 

1 25240 0,152 166052,632 25320 0,145 174620,69 340673,321 

2 21280 0,168 126666,667 20260 0,181 111933,702 238600,368 

3 44340 0,101 439009,901 44240 0,122 362622,951 801632,852 

4 44780 0,12 373166,667 45980 0,113 406902,655 780069,322 

5 114460 0,115 995304,348 113240 0,114 993333,333 1988637,68 

6 

pGL4.17 

118800 0,116 1024137,93 110420 0,105 1051619,05 2075756,98 

1 2020 0,194 10412,3711 2040 0,322 6335,40373 16747,7749 

2 1740 0,404 4306,93069 1940 0,393 4936,38677 9243,31746 

3 3760 0,197 19086,2944 4460 0,18 24777,7778 43864,0722 

4 4300 0,179 24022,3464 4480 0,169 26508,8757 50531,2221 

5 3220 0,117 27521,3675 3140 0,117 26837,6068 54358,9744 

6 3040 0,108 28148,1481 2840 0,119 23865,5462 52013,6944 

Abbildung 23: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten 

Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung 


122 


MW Luz/β-Gal 

Luziferase 

A11 - B6 1188 


1 19940 0,179 111396,648 25380 0,181 140220,994 251617,643 

2 36200 203 178,325123 40320 0,184 219130,435 219308,76 

3 64620 0,273 236703,297 72360 0,251 288286,853 524990,149 

4 72680 0,218 333394,495 72300 0,238 303781,513 637176,008 

5 87310 0,118 739915,254 95240 0,111 858018,018 1597933,27 

6 

A12 - B6 1035 

65660 0,128 512968,75 62290 0,127 490472,441 1003441,19 

1 740 0,134 5522,38806 560 0,116 4827,58621 10349,9743 

2 1140 0,124 9193,54839 1200 0,143 8391,60839 17585,1568 

3 760 0,122 6229,5082 500 0,122 4098,36066 10327,8689 

4 740 0,119 6218,48739 800 0,122 6557,37705 12775,8644 

5 540 0,088 6136,36364 440 0,089 4943,82022 11080,1839 

6 

A14 - B6 597 

1020 0,086 11860,4651 1240 0,091 13626,3736 25486,8387 

1 38180 0,121 315537,19 44200 0,116 381034,483 1077606,16 

2 37500 0,142 264084,507 45430 0,139 326834,532 917753,572 

3 135650 0,181 749447,514 138530 0,166 834518,072 2418483,66 

4 149370 0,166 899819,277 145680 0,185 787459,459 2474738,2 

5 105790 0,133 795413,534 113740 0,145 784413,793 2364241,12 

6 

A16 - B6 478 

114560 0,111 1032072,07 105390 0,104 1013365,38 3058802,84 

1 280 0,15 1866,66667 300 0,155 1935,48387 3802,15054 

2 340 0,127 2677,16535 340 0,132 2575,75758 5252,92293 

3 560 0,103 5436,8932 820 0,129 6356,58915 11793,4824 

4 700 0,127 5511,81102 840 0,112 7500 13011,811 

5 520 0,088 5909,09091 600 0,094 6382,97872 12292,0696 

6 

A18 - B6 265 

860 0,09 9555,55556 720 0,109 6605,50459 16161,0601 

1 110080 0,201 547661,692 109410 0,192 569843,75 1117505,44 

2 80050 0,201 398258,706 93460 0,209 447177,033 845435,74 

3 154550 0,173 893352,601 163630 0,18 909055,556 1802408,16 

4 152790 0,207 738115,942 151050 0,215 702558,14 1440674,08 

5 116960 0,132 886060,606 96440 0,14 688857,143 1574917,75 

6 

pGL4.17 

91640 0,128 715937,5 91440 0,129 708837,209 1424774,71 

1 2020 0,194 10412,3711 2040 0,322 6335,40373 16747,7749 

2 1740 0,404 4306,93069 1940 0,393 4936,38677 9243,31746 

3 3760 0,197 19086,2944 4460 0,18 24777,7778 43864,0722 

4 4300 0,179 24022,3464 4480 0,169 26508,8757 50531,2221 

5 3220 0,117 27521,3675 3140 0,117 26837,6068 54358,9744 

6 3040 0,108 28148,1481 2840 0,119 23865,5462 52013,6944 


nach Deletion durch Promotorverkürzung 


123 


MW Luz/β-Gal 

Luziferase 

A6 - C3Bir 1300 


1 70020 0,213 328732,394 61890 0,178 347696,629 676429,024 

2 30020 0,153 196209,15 27740 0,137 202481,752 398690,902 

3 44680 0,176 253863,636 39620 0,185 214162,162 468025,799 

4 39640 0,172 230465,116 44240 0,165 268121,212 498586,328 

5 148320 0,122 1215737,7 144440 0,119 1213781,51 2429519,22 

6 

A7 - C3Bir 900 

111980 0,13 861384,615 120370 0,128 940390,625 1801775,24 

1 82890 0,21 394714,286 75260 0,215 350046,512 744760,797 

2 49670 0,161 308509,317 53750 0,182 295329,67 603838,987 

3 66420 0,167 397724,551 66760 0,183 364808,743 762533,294 

4 98840 0,211 468436,019 89230 0,22 405590,909 874026,928 

5 193820 0,141 1374609,93 205650 0,138 1490217,39 2864827,32 

6 

A8 - C3Bir 600 

157540 0,159 990817,61 138350 0,148 934797,297 1925614,91 

1 116840 0,16 730250 129200 0,17 760000 745125 

2 122610 0,124 988790,323 131260 0,121 1084793,39 2073583,71 

3 184100 0,181 1017127,07 199270 0,19 1048789,47 2065916,55 

4 125170 0,195 641897,436 121770 0,222 548513,514 1190410,95 

5 225990 0,145 1558551,72 214650 0,141 1522340,43 3080892,15 

6 

A9 - C3Bir 300 

259270 0,162 1600432,1 236630 0,148 1598851,35 3199283,45 

1 5580 0,19 29368,4211 4500 0,16 28125 57493,4211 

2 6140 0,135 45481,4815 6680 0,135 49481,4815 94962,963 

3 1380 0,148 9324,32432 1120 0,153 7320,26144 16644,5858 

4 1420 0,163 8711,65644 1820 0,163 11165,6442 19877,3006 

5 14220 0,14 101571,429 12260 0,134 91492,5373 193063,966 

6 

A10 - C3Bir 130 

8840 0,198 44646,4646 10140 0,197 51472,0812 96118,5459 

1 5240 0,152 34473,6842 5320 0,145 36689,6552 71163,3394 

2 11280 0,168 67142,8571 10260 0,181 56685,0829 123827,94 

3 14340 0,101 141980,198 14240 0,122 116721,311 258701,509 

4 14780 0,12 123166,667 15980 0,113 141415,929 264582,596 

5 14460 0,115 125739,13 13240 0,114 116140,351 241879,481 

6 

pGL4.17 

18800 0,116 162068,966 10420 0,105 99238,0952 261307,061 

1 2020 0,194 10412,3711 2040 0,322 6335,40373 16747,7749 

2 1740 0,404 4306,93069 1940 0,393 4936,38677 9243,31746 

3 3760 0,197 19086,2944 4460 0,18 24777,7778 43864,0722 

4 4300 0,179 24022,3464 4480 0,169 26508,8757 50531,2221 

5 3220 0,117 27521,3675 3140 0,117 26837,6068 54358,9744 

6 3040 0,108 28148,1481 2840 0,119 23865,5462 52013,6944 

Abbildung 25: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten 

Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung 


124 

Messung 1 Messung 2 MW Luz/β-Gal 


A13 - C3Bir 597 

1 115240 0,136 847352,941 113220 0,136 832500 1679852,94 

2 96020 0,164 585487,805 105550 0,165 639696,97 1225184,77 

3 360800 0,145 2488275,86 309610 0,157 1972038,22 4460314,08 

4 365840 0,175 2090514,29 311840 0,17 1834352,94 3924867,23 

5 257770 0,102 2527156,86 223890 0,111 2017027,03 4544183,89 

6 233390 0,098 2381530,61 213620 0,118 1810338,98 4191869,6 

A15 - C3Bir 478 

1 66820 0,122 547704,918 66260 0,136 487205,882 1034910,8 

2 74340 0,137 542627,737 85050 0,145 586551,724 1129179,46 

3 180740 0,166 1088795,18 220040 0,159 1383899,37 2472694,55 

4 216590 0,183 1183551,91 223020 0,173 1289132,95 2472684,86 

5 182260 0,11 1656909,09 163150 0,111 1469819,82 3126728,91 

6 5660 0,092 61521,7391 5640 0,089 63370,7865 124892,526 

A17 - C3Bir 265 

1 500 0,151 3311,25828 480 0,143 3356,64336 6667,90163 

2 480 0,126 3809,52381 240 0,126 1904,7619 5714,28571 

3 4060 0,119 34117,6471 3660 0,142 25774,6479 29946,1475 

4 140 0,115 1217,3913 120 0,107 1121,49533 2338,88663 

5 960 0,091 10549,4505 820 0,104 7884,61538 18434,0659 

6 540 0,096 5625 540 0,098 5510,20408 11135,2041 

pGL4.17 

1 2020 0,194 10412,3711 2040 0,322 6335,40373 16747,7749 

2 1740 0,404 4306,93069 1940 0,393 4936,38677 9243,31746 

3 3760 0,197 19086,2944 4460 0,18 24777,7778 43864,0722 

4 4300 0,179 24022,3464 4480 0,169 26508,8757 50531,2221 

5 3220 0,117 27521,3675 3140 0,117 26837,6068 54358,9744 

6 3040 0,108 28148,1481 2840 0,119 23865,5462 52013,6944 


Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung 


125 

13.2.2.2 Mutagenisierung der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 


MW Luz/β-Gal 


B6 Oct1 

1 0 0,213 0 0 0,21 0 0 

2 20 0,186 107,526882 0 0,2 0 107,526882 

3 20 0,181 110,497238 20 0,177 112,99435 223,491588 

4 20 0,111 180,18018 20 0,112 178,571429 358,751609 

5 20 0,099 202,020202 20 0,107 186,915888 388,93609 

6 0 0,077 0 0 0,151 0 0 

B6 E2F 

1 20 0,178 112,359551 20 0,167 119,760479 232,12003 

2 20 0,185 108,108108 40 0,174 229,885057 337,993166 

3 20 0,21 95,2380952 0 0,177 0 95,2380952 

4 0 0,134 0 0 0,135 0 0 

5 0 0,167 0 20 0,156 128,205128 128,205128 

6 20 0,132 151,515152 20 0,136 147,058824 298,573975 

B6 PPARG1 

1 208350 0,201 1036567,16 175150 0,214 818457,944 1855025,11 

2 124070 0,182 681703,297 120610 0,179 673798,883 1355502,18 

3 151130 0,181 834972,376 169640 0,174 974942,529 1809914,9 

4 90300 0,1 903000 64700 0,102 634313,725 1537313,73 

5 80670 0,095 849157,895 88410 0,095 930631,579 1779789,47 

6 106190 0,09 1179888,89 104050 0,154 675649,351 1855538,24 

B6 Pax2 

1 340 0,172 1976,74419 360 0,176 2045,45455 4022,19873 

2 140 0,18 777,777778 120 0,172 697,674419 1475,4522 

3 180 0,174 1034,48276 160 0,178 898,876404 1933,35916 

4 20 0,099 202,020202 40 0,106 377,358491 579,378693 

5 60 0,111 540,540541 80 0,11 727,272727 1267,81327 

6 60 0,076 789,473684 40 0,147 272,108844 1061,58253 

B6 Sp1 

1 263000 0,168 1565476,19 250370 0,169 1481479,29 3046955,48 

2 841260 0,178 4726179,78 820000 0,184 4456521,74 9182701,51 

3 469800 0,183 2567213,11 408170 0,171 2386959,06 4954172,18 

4 387520 0,109 3555229,36 372530 0,112 3326160,71 6881390,07 

5 467470 0,148 3158581,08 431660 0,13 3320461,54 6479042,62 

6 308570 0,115 2683217,39 342040 0,093 3677849,46 6361066,85 

B6 A1 

1 37760 0,185 204108,108 35960 0,181 198674,033 402782,141 

2 22780 0,167 136407,186 19160 0,173 110751,445 247158,631 

3 95080 0,181 525303,867 107330 0,185 580162,162 1105466,03 

4 25940 0,112 231607,143 27080 0,112 241785,714 473392,857 

5 44770 0,127 352519,685 42020 0,116 362241,379 714761,064 

6 46990 0,094 499893,617 56890 0,189 301005,291 800898,908 

pGL4.17 

1 7020 0,188 37340,4255 6960 0,181 38453,0387 75793,4642 

2 7100 0,163 43558,2822 7720 0,168 45952,381 89510,6632 

3 5520 0,187 29518,7166 5920 0,172 34418,6047 63937,3212 

4 2300 0,125 18400 2500 0,111 22522,5225 40922,5225 

5 2180 0,11 19818,1818 1860 0,109 17064,2202 36882,402 

6 2360 0,098 24081,6327 3060 0,186 16451,6129 40533,2456 


nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen 


126 


MW Luz/β-Gal 


C3Bir Oct1 

1 60 0,205 292,682927 60 0,199 301,507538 594,190465 

2 100 0,191 523,560209 120 0,2 600 1123,56021 

3 120 0,222 540,540541 120 0,221 542,986425 1083,52697 

4 20 0,137 145,985401 40 0,139 287,769784 433,755186 

5 80 0,125 640 40 0,117 341,880342 981,880342 

6 

C3Bir PPARG2 

60 0,088 681,818182 100 0,162 617,283951 1299,10213 

1 177370 0,186 953602,151 183180 0,188 974361,702 963981,926 

2 183320 0,19 964842,105 194220 0,183 1061311,48 2026153,58 

3 261880 0,181 1446850,83 260250 0,174 1495689,66 2942540,48 

4 108350 0,105 1031904,76 105950 0,111 954504,505 1986409,27 

5 90720 0,123 737560,976 85630 0,114 751140,351 1488701,33 

6 

C3Bir Sp2 

94560 0,118 801355,932 89660 0,1 896600 1697955,93 

1 40 0,088 454,545455 60 0,09 666,666667 1121,21212 

2 60 0,85 70,5882353 80 0,099 808,080808 878,669043 

3 40 0,088 454,545455 60 0,078 769,230769 1223,77622 

4 80 0,091 879,120879 40 0,093 430,107527 1309,22841 

5 60 0,11 545,454545 100 0,106 943,396226 1488,85077 

6 

C3Bir Sp1 

120 0,141 851,06383 80 0,118 677,966102 1529,02993 

1 205250 0,179 1146648,04 197190 0,18 1095500 2242148,04 

2 223930 0,176 1272329,55 239980 0,178 1348202,25 2620531,79 

3 329560 0,186 1771827,96 375000 0,188 1994680,85 3766508,81 

4 447370 0,14 3195500 412720 0,144 2866111,11 6061611,11 

5 444720 0,128 3474375 432370 0,138 3133115,94 6607490,94 

6 

C3Bir A6 

335060 0,122 2746393,44 399090 0,122 3271229,51 6017622,95 

1 286360 0,185 1547891,89 243070 0,181 1342928,18 2890820,07 

2 260150 0,183 1421584,7 229220 0,177 1295028,25 2716612,95 

3 317900 0,179 1775977,65 336500 0,194 1734536,08 3510513,74 

4 144840 0,123 1177560,98 155720 0,127 1226141,73 2403702,71 

5 179100 0,122 1468032,79 177710 0,116 1531982,76 3000015,55 

6 

pGL4.17 

162450 0,134 1212313,43 158920 0,132 1203939,39 2416252,83 

1 7020 0,188 37340,4255 6960 0,181 38453,0387 75793,4642 

2 7100 0,163 43558,2822 7720 0,168 45952,381 89510,6632 

3 5520 0,187 29518,7166 5920 0,172 34418,6047 63937,3212 

4 2300 0,125 18400 2500 0,111 22522,5225 40922,5225 

5 2180 0,11 19818,1818 1860 0,109 17064,2202 36882,402 

6 2360 0,098 24081,6327 3060 0,186 16451,6129 40533,2456 


Promotors nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen 


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KISTNER, M. T. MURTHA, M. D. REGUEIRO, J. I. ROTTER, L. P. SCHUMM, A. H. 

STEINHART, S. R. TARGAN, R. J. XAVIER, C. LIBIOULLE, C. SANDOR, M. 

LATHROP, J. BELAICHE, O. DEWITT, I. GUT, S. HEATH, D. LAUKENS, M. MNI, P. 

RZTGEERTS, A. VAN GOSSUM, D. ZELENIKA, D. FRANCHIMONT, J.-P. HUGOT, 

M. DE VOS, S. VERMEIRE, E. LOUIS, L. R. CARDON, C. A. ANDERSON, H. 

DRUMMOND, E. NIMMO, T. AHMAD, N. J. PRESCOTT, C. M. ONNIE, S. A. 

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D. MASSEY, K. BLASZCZYK, T. ELLIOT, L. COTTERILL, H. DALLAL, A. J. LOBO, 

C. MOWAT, J. D. SANDERSON, D. P. JEWELL, W. G. NEWMAN, C. EDWARDS, T. 

AHMAD, J. C. MANSFIELD, J. SATSANGI, M. PARKES, C. G. MATHEW, P. 

DONNELLY, L. PELTONEN, J. M. BLACKWELL, E. BRAMON, M. A. BROWN, J. P. 

CASAS, A. CORVIN, N. CRADDOCK, P. DELOUKAS, A. DUNCANSON, J. 

JANKOWSKI, H. S. MARKUS, C. G. MATHEW, M. I. MCCARTHY, C. N. PALMER, R. 

PLOMIN, A. RAUTANEN, S. J. SAWCER, N. SAMANI, R. C. TREMBATH, A. C. 

VISWANATHAN, N. WOOD, C. C. SPENCER, J. C. BARRETT, C. BELLENGUEZ, D. 

DAVIDSON, C. FREEMAN, A. STRANGE, P. DONNELLY, C. LANGFORD, S. E. 

HUNT, S. EDKINS, R. GWILLIAM, H. BLACKBURN, S. J. BUMPSTEAD, S. 

DRONOV, M. GILLMAN, E. GRAY, N. HAMMOND, A. JAYAKUMAR, O. T. MCCANN, 

J. LIDDLE, M. L. PEREZ, S. C. POTTER, R. RAVINDRARAJAH, M. RICKETTS, M. 

WALLER, P. WESTON, S. WIDAA, P. WHITTAKER, P. DELOUKAS, L. PELTONEN, 

C. G. MATHEW, J. M. BLACKWELL, M. A. BROWN, A. CORVIN, M. I. MCCARTHY, 

C. C. SPENCER, A. P. ATTWOOD, J. STEPHENS, J. SAMBROOK, W. H. 

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FREEMAN, R. SCHANZ, T. JAMES, D. POOLE, L. MURPHY, H. SEGALL. 

CORTELLINI, Y. C. CHENG, D. WOO, M. A. NALLS, B. MÜLLER-MYHSOK, C. 

MEISINGER, U. SEEDORF, H. ROSS-ADAMS, S. BOONEN, D. WLOCH-KOPEC, V. 

VALANT, J. SLARK, K. FURIE, H. DELAVARAN, C. LANGFORD, P. DELOUKAS, S. 

EDKINS, S. HUNT, E. GRAY, S. DRONOV, L. PELTONEN, S. GRETARSDOTTIR, G. 

THORLEIFSSON, U. THORSTEINSDOTTIR, K. STEFFANSSON, G. B. 

BONCORAGLIO, E. A. PARATI, J. ATTIA, E.HOLLIDAY, C. LEVI, M. G. FRANZOSI, 

A. GOEL, A. HELGADOTTIR, J. M. BLACKWELL, E. BRAMON, M. A. BROWN, J. P. 

CASAS, A. CORVIN, A. DUNCANSON, J. JANKOWSKI, C. G. MATHEW, C. N. 

PALMER, R. PLOMIN, A. RAUTANEN, S. J. SAWCER, R. C. TREMBATH, A. C. 

VISWANATHAN, N. W. WOOD, B. B. WORRALL, S. J. KITTNER, B. D. MITCHELL, 

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MEI, D. L. NICOLAE, M. REGUEIRO, L. P. SCHUMM, A. H. STEINHART, J. I. 

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OUWEHAND, C. M. LEWIS, L. CARDON, A. LOBO, A. FORBES, J. SANDERSON, 

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COLOMBO, A. LATIANO, O. PALMIERI, E.-J. BERNARD, C. DESLANDRES, D. W. 

HOMMES, D. J. DE JONG, P. C. STOKKERS, R. K. WEERSMA, Y. SHARMA, M. S. 

SILVERBERG, J. H. CHO, J. WU, K. ROEDER, S. R. BRANT, L. P. SCHUMM, R, H, 

DUERR, M. C. DUBINSKI, N. L. GLAZER, T. HARITUNIANS, A. IPPOLITI, G. Y. 

MELMED, D. S. SISCOVICK, E. A. VASILIAUSKAS, S. R. TARGAN, V. ANNESE, C. 

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RADFORTH-SMITH, T. AHMAD, C. W. LEES, T. BALSCHUN, J. LEE, R. ROBERTS, 

C. A. ANDERSON, J. C. BIS, S. BUMPSTEAD, D. ELLINGHAUS, E. M. FESTEN, M. 

GEORGES, T. GREEN, T. HARITUNIANS, L. JOSTINS, A. LATIANO, C. G. 

MATHEW, G. W. MONTGOMERY, N. J. PRESCOTT, S. RAYCHAUDHURI, J. I. 

ROTTER, P. SCHUMM, Y. SHARMA, L. A. SIMMS, K. D. TAYLOR, D. WHITEMAN, 

C. WIJMENGA, R. N. BALDASSANO, M. BARCLAY, T. M. BAYLESS, S. BRAND, C. 

BÜNING, A. COHEN, J.-F. COLOMBEL, M. COTTONE, L. STRONATI, T. DENSON, 

M. DE VOS, R. D’INCA, M. DUBINSKY, C. EDWARDS, T. FLORIN, D. 

FRANCHIMONT, R. GEARRY, J. GLAS, A. VAN GOSSUM, S. L. GUTHERY, J. 

HALFVARSON, H. W. VERSPAGET, J.-P. HUGOT, A. KARBAN, D. LAUKENS, I. 

LAWRENCE, M. LEMANN, A. LEVINE, C. LIBIOULLE, E. LOUIS, C. MOWAT, W. 

NEWMAN, J. PANÉS, A. PHILLIPS, D. D. PROCTOR, M. REGUEIRO, R. RUSSEL, 

P. RUTGEERTS, J. SANDERSON, M. SANS, F. SEIBOLD, A. H. STEINHART, P. F. 

C. STOKKERS, L. TORKVIST, G. KULLAK-UBLICK, D. WILSON, T. WALTERS, S. 

R. TARGAN, S. R. BRANT, J. D. RIOUX, M. D’AMATO, R. K. WEERSMA, S. 

KUGATHASAN, A. M. GRIFFITHS, J. C. MANSFIELD, S. VERMEIRE, S. H. DUERR, 

M. S. SILVERBERG, J. SATSANGI, S. SCHREIBER, J. H. CHO, V. ANNESE, H. 

HAKONARSON, M. J. DALY u. M. PARKES (2010): 

Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn's 

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153. IMIELINSKI, M., R. N. BALDASSANO, A. GRIFFITHS, R. K. RUSSELL, VITO 

ANNESE, M. DUBINSKY, S. KUGATHASAN, J. P. BRADFIELD, T. D. WALTERS, P. 

SLEIMAN, C. E. KIM, A. MUISE, K. WANG, J. T. GLESSNER, S. SAEED, H. ZHANG, 

E. C. FRACKELTON, C. HOU, J. H. FLORY, G. OTIENO, R. M. CHIAVACCI, R. 

GRUNDMEIER, M. CASTRO, A. LATIANO, B. DALLAPICCOLA, J. STEMPAK, D. J. 

ABRAMS, K. TAYLER, D. MCGOVERN, M. B. HEYMAN, G. D. FERRY, B. 

KIRSCHNER, J. LEE, J. ESSERS, R. GRAND, M. STEPHENS, A. LEVINE, D. 

PICCOLI, J. VAN LIMBERGEN, S. CUCCHIARA, D. S. MONOS, S. L. GUTHERY, L. 

DENSON, D. C. WILSON, S. F. A. GRANT, M. DALY, M. S. SILVERBERG, J. 

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KLEI, M. J. DALY, C. ABRAHAM, T. M. BAYLESS, F. BOSSA, A. M. GRIFFITHS, A. 

F. IPPOLITI, R. G. LAHAIE, A. LATIANO, P. PARÉ, D. D. PROCTOR, M. D. 

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SCOTT. L. AMININEJAD, S. BUMPSTEAD, L. BAIDOO, R. N. BALDASSANO, M. 

BARCLAY, T. M. BAYLESS, S. BRAND, C. BRÜNING, J.-F. COLOMBEL, L. A. 

DENSON, M. DE VOS, M. DUBINSKY, C. EDWARDS, D. ELLINGHAUS, R. S. N. 

FEHRMANN, J. A. B. FLOYD, T. FLORIN, D. FRANCHIMONT, L. FRANKE, M. 

GEORGES, J. GLAS, N. L. GLAZER, S. L. GUTHERY, T. HARITUNIANS, N. K. 

HAYWARD, J.-P. HUGOT, G. JOBIN, D. LAUKENS, I. LAWRENCE, M. LÉMANN, A. 

LEVINE, C. LIBIOUELLE, E. LOUIS, D. P. MCGOVERN, M. MILLA, G. W. 

MONTGOMERY, K. I. MORLEY, C. MOWAT, A. NG, W. NEWMAN, R. A. OPHOFF, 

L. PAPI, O. PALMIERI, L. PEYRIN-BIROULET, J. PANÉS, ANNE PHILLIPS, N. J. 

PRESCOTT, D. D. PROCTOR, R. ROBERTS, R. RUSSEL, P. RUTGEERTS, J. 

SANDERSON, M. SANS, P. SCHUMM, F. SEIBOLD, Y. SHARMA, L. A. SIMMS, M. 

SEIELSTAD, A. H. STEINHART, S. R. TARGAN, L. H. VAN DEN BERG, M. VATN, 

H. VERSPAGET, T. WALTERS, C. WIJMENGA, D. C. WILSON, H.-J. WESTRA, R. J. 

XAVIER, Z. Z. ZHAO, C. Y. PONSIOEN, V. ANDERSEN, L. TORKVIST, M. 

GAZOULI, N. P. ANAGNOU, T. H. KARLSEN, L. KUPCINSKAS, J. 

SVENTOREITYTE, J. C. MANSFIELD, S. KUGATHASAN, M. S. SILVERBERG, J. 

HALFVARSON, J. I. ROTTER, C. G. MATHEW, A. M. GRIFFITHS, R. GEARRY, T. 

AHMAD, S. R. BRANT, M. CHAMAILLARD, J. SATSANGI, J. H. CHO, S. 

SCHREIBER, M. J. DALY, J. C. BARRETT, M. PARKES, V. ANNESE, H. 

HAKOARSON, G. RADFORD-SMITH, R. H. DUERR, S. VERMEIRE, R. K. 

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SOARS, H. DRUMMOND, C. W. LEES, S. A. KHAWAJA, R. BAGNALL, D. A. 

BURKE, C. E. TODHUNTER, T. AHMAD, C. M. ONNIE, W. MCARDLE, D. 

STRACHAN, G. BETHEL, C. BRYAN, C. M. LEWIS, P. DELOUKAS, A. FORBES, J. 

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DRUMMOND, C. W. LEES, C. M. ONNIE, C. HANSON, K. BLASZCZYK, R. 

RAVINDRARAJAH, S. HUNT, D. VARMA, N. HAMMOND, G. LEWIS, H. ATTLESEY, 

N. WTKINS, W. OUWEHAND, D. STRACHAN, W. MCARDLE, C. M. LEWIS, A. 

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153 

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KUGATHASAN, U. BROECKEL, S. NIKOLAUS, M. J. DALY u. S. SCHREIBER 

(2006): 

Evidence of transmission ratio distortion of DLG5 R30Q variant in general and 

implication of an association with Crohn disease in men 

Hum Genet 119, 305-311 

170. BROWNING, B. L., V. ANNESE, M. L. BARCLAY, S. A. BINGHAM, S. BRAND, 

C. BÜNING, M. CASTRO, S. CUCCHIARA, B. DALLAPICCOLA, H. DRUMMOND, L. 

R. FERGUSON, A. FERRARIS, S. A. FISHER, R. B. GEARRY, J. GLAS, L. 

HENCKAERTS, C. HUEBNER, D. KNAFELZ, L. LAKATOS, P. L. LAKATOS, A. 

LATIANO, X. LIU, C. MATHEW, B. MÜLLER-MYHSOK, W. G. NEWMAN, E. R. 

NIMMO, C. L. NOBLE, O. PALIERI, M. PARKES, I. PETERMANN, P. RUTGEERTS, 

J. SATSANGI, A. N. SHELLING, K. A. SIMINOVITCH, H.-P. TÖRÖK, M. 

TREMELLING, S. VERMEIRE, M. R. VALVANO u. H. WITT (2008): 

Gender-stratified analysis of DLG5 R30Q in 4707 patients with Crohn disease and 

4973 controls from 12 Caucasian cohorts 

J Med Genet 45, 36-42 

171. GLOCKER, E.-O., M. D., D. KOTLARZ, M. D., K. BOZTUG, M. D., E. M. GERTZ, 

PH. D., A. A. SCHÄFFER, PH. D., F. NOYAN, PH. D., M. PERRO, M. SC., J. 

DIESTELHORST, B. SC., A. ALLSOTH, M. D., K.-W. SYKORA, M. D., M. SAUER, M. 

D., H. KREIPE, M. D., M. LACHER, M. D., R. NUSTEDE, M. D., C. WOELLNER, M. 

SC., U. BAUMANN, M. D., U. SALZER, M. D., S. KOLETZKO, M. D., N. SHAH, M. D., 

A. W. SEGAL, M. D., A. SAUERBREY, M. D., S. BUDERUS, M. D., S. B. SNAPPER, 

M. D., B. GRIMBACHER,. M. D. u. C. KLEIN, M. D., PH. D. (2009): 

Inflammatory Bowel Disease and Mutations Affecting the Interleukin-10 Receptor 

N Engl J Med 361, 2033-2045

15 Erklärung 

154 

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Charakterisierung des Maus-Cd14- 

Promotors hinsichtlich der Bedeutung von CD14 für die intestinalen Barriere- und 

Abwehrmechanismen im Darm“ selbstständig verfasst habe. 

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten 

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat 

von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die 

im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die 

Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: Institut für Versuchstierkunde und 

Zentrales Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover. 

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen 

ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. 

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig 

und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. 

________________________________________ 


Hiermit erkläre ich, dass ich mit der Einreichung der Arbeit als Dissertation an der 

Tierärztlichen Hochschule Hannover einverstanden bin. 

________________________________________ 

Univ.-Prof. H. J. Hedrich, Leiter des Instituts für Versuchstierkunde und Zentralen 

Tierlaboratoriums der Medizinischen Hochschule Hannover

16 Danksagung 

155 

An dieser Stelle möchte ich mich bei den Menschen bedanken, ohne die diese 

Doktorarbeit und die wunderschöne Zeit, die mit ihr verbunden war, nie zustande 

gekommen wäre. 

Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Hedrich, der mir diese Arbeit zu Teil werde ließ, 

mich während der gesamten Zeit unterstützt und an mich geglaubt hat. Ein 

besonderer Dank richtet sich an Prof. Bleich für die Möglichkeit an diesem Projekt 

mitzuwirken, für die dienstäglichen Gespräche und eine tolle Zeit in der 

Arbeitsgruppe. 

Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Distl für die Revision dieser Arbeit 

bedanken. 

Zudem möchte ich meine Dankbarkeit gegenüber Dr. Nils-Holger Zschemisch, der 

mir zu allen möglichen und unmöglichen Zeiten mit Rat und Tat zur Seite stand, 

ausdrücken. 

Natürlich gilt mein Dank auch Dr. Martina Dorsch für die Nutzung der Räumlichkeiten 

sowie Geräte und Regina Eisenblätter für das Teilen der Werkbank in Notzeiten. 

Darüber hinaus bedanke ich mich bei allen Mitarbeitern des ZTL für die schöne 

Doktorarbeitszeit. Speziell die Arbeitsgruppe Mikrobiologie und das gesamte 

Laborteam mit ihrer netten Arbeitsatmosphäre und viel Witz haben es mir ermöglicht, 

mich jeden Tag wieder auf die Arbeit zu freuen. 

Ein großes Dankeschön geht an meine Freunde – Danke für die Mittagessen, 

Pizzaabende, Stallbesuche und eure Unterstützung im Kampf gegen mein 

alltägliches Chaos. 

Außerdem möchte ich mich bei Philipp bedanken. Du hast mich mit stoischer 

Gelassenheit ertragen, beruhigt, wieder zum Lachen gebracht, wenn es nötig war, 

und mich an die Welt neben dem Schreibtisch erinnert. Ich freue mich auf die 

gemeinsame Zukunft mit dir. 

Zu guter Letzt möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, die mich durch alle 

Höhen und Tiefen begleitet, unterstützt, immer wieder motiviert und an mich geglaubt 

hat. Ihr seid das Beste, was einer Tochter oder Schwester passieren kann. Danke.

ISBN 978-3-86345-094-6 

Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 

35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375 

e-mail: info@dvg.net · Homepage: http://www.dvg.de

Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der ...

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