Verbesserung der Tiefgefrierfähigkeit geschlechtsspezifisch ...

Aus dem Institut für Tierzucht Mariensee
Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft
Braunschweig und dem
Niedersächsischen Landgestüt Celle
Verbesserung der Tiefgefrierfähigkeit
geschlechtsspezifisch sortierter Hengstspermien
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Heide Friederike Buß
aus Bad Zwischenahn
Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. D. Rath
1. Gutachter: Prof. Dr. D. Rath
2. Gutachter: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2005

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 11
2 Literatur 13
2.1 Tiefgefrierkonservierungsverfahren für Hengstsperma 13
2.1.1 Prinzip der Tiefgefrierung 13
2.1.1.1 Temperaturverlauf 15
2.1.1.1.1 Einfrierverlauf 15
2.1.1.1.2 Auftauverlauf 16
2.1.1.2 Wesentliche Bestandteile eines Tiefgefrier-Verdünners 17
2.1.2 Auswirkung der Kryokonservierung auf Spermien 19
2.1.2.1 Kälteschock 21
2.1.2.1.1 Membranveränderungen durch Tiefgefrierung und Auftauen 22
2.1.2.2 Tiefgefrierung von Hengstsperma 25
2.2 Grundlagen zur Separation von X- und Y-Chromosom
tragenden Spermien 26
2.2.1 Möglichkeiten der Beeinflussung des Nachkommengeschlechts 26
2.2.2 Funktionsprinzip des Spermasorters 27
2.2.2.1 Sortierung 28
2.2.2.2 Reanalyse 31
2.2.2.3 Schädigungen durch den Sortiervorgang 32
2.2.3 Einsatz von flowzytometrisch sortierten Spermien 34
2.2.3.1 Einsatz von flowzytometrisch sortierten Spermien beim Pferd 35
2.2.3.1.1 Vitalität und Fruchtbarkeit von gesexten Spermien 36
2.2.3.1.2 Besamungsregime 36
2.2.4 Verwendung gesexter und tiefgefrorener Spermien in der Besamung 39
2.2.4.1 Tiefgefrierung von flowzytometrisch sortierten Pferdespermien 41
2.2.4.1.1 Variabilität zwischen Hengsten 43
2.3 Schlussfolgerungen aus dem derzeitigen Wissensstand zu
flowzytometrisch sortierten Hengstspermien 44

3 Material und Methoden 45
3.1 Ejakulatgewinnung 45
3.2 Samenuntersuchung 45
3.3 Beurteilungsmethoden 46
3.3.1 Spermienmotilität 46
3.3.2 Akrosomintegrität 47
3.3.3 Morphologie 48
3.4 Flowzytometrische Sortierung 50
3.5 Tiefgefrierversuche mit flowzytometrisch sortierten Spermien 52
3.5.1 Spermaaufbereitung 52
3.5.2 Kühlung 54
3.5.3 Versuchsreihe 1:
Vergleich zweier Tiefgefriersysteme (Styroporbox und automatischer
Tiefgefrier-Apparat) 55
3.5.4 Versuchsreihe 2:
Vergleich von zwei Tiefgefrierverdünnern 56
3.5.5 Versuchsreihe 3:
Vergleich von zwei Glyzerinkonzentrationen in einem Verdünner 57
3.6 Tiefgefrierung für die Besamungsversuche 57
3.6.1 Spermaaufbereitung 58
3.6.2 Tiefgefrierung der Proben 58
3.7 Statistische Auswertung 60
4 Ergebnisse 62
4.1 Tiefgefrierversuche 62
4.1.1 Temperaturverläufe in den Systemen 62
4.1.2 Spermienmotilität nach dem Auftauen 64
4.1.3 Akrosomintegrität im aufgetauten Sperma 70
4.1.4 Morphologisch abweichende Formen im aufgetauten Sperma 72
4.2 Tiefgefrierung für die Besamungsversuche 77
4.2.1 Auftaumotilitäten 77
4.2.2 Akrosomintegrität 80

4.2.3 Morphologisch abweichende Formen 81
5 Diskussion 85
5.1 Zusammenfassende Betrachtung und Schlussfolgerung 92
6 Zusammenfassung 94
7 Summary 96
8 Literaturverzeichnis 98
9 Anhang 119
9.1 Zusammensetzung der verwendeten Verdünner
und Trägerflüssigkeiten 119
9.1.1 KMT 119
9.1.2 INRA 82 120
9.1.3 Lactose-EDTA 121
9.1.4 TEST- Auffangmedium 122
9.1.5 PBS 122
9.1.6 Stallion Sheath Fluid 123
9.2 Zusammensetzung der verwendeten Stamm- und Färbelösungen 123
9.2.1 PNA 123
9.2.2 Eosin-Nigrosin 124
9.2.3 UCD Mounting Medium 124
10 Verzeichnis der Abbildungen 125
11 Verzeichnis der Tabellen 126

Abkürzungsverzeichnis
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
Abb. Abbildung
Aqua bidest. Aqua bidestillata: doppelt destilliertes Wasser
BSST Beltsville Sperm Sexing Technology
bzw. beziehungsweise
C Celsius
ca. circa
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
CASA computer-assisted-sperm-analysis
CTC Chlortetracyclin
d.h. das heißt
DMR distal mid piece reflexes: Schleifenform
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Essigsäure
ET Embryotransfer
et al. et alii: und andere
evtl. eventuell
FISH Fluoreszenz in situ Hybridisation
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
g Erdbeschleunigung
g Gramm
h Stunde
ICSI intracytoplasmatic sperm injection: Intrazytoplasmatische
Spermieninjektion
I.E. Internationale Einheiten
inkl. inklusive
IVF In vitro Fertilisation
ml Milliliter

mm Millimeter
mM Millimolar
min. Minute
Mio. Millionen
mod. modifiziert
mW Milliwatt
n Anzahl, Gruppengröße
NaCl Natriumchlorid
nm Nanometer
o.ä. oder ähnliche(s)
PBS phosphate buffered saline: phosphatgepufferte Salzlösung
PCR polymerase chain reaction: Polymerase-Kettenreaktion
pH Pondus Hydrogenii: negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
PNA Peanut Agglutinin
s. siehe
SD standard deviation: Standardabweichung
Std. Stunde, Stunden
Tab. Tabelle
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
TG Tiefgefrierung
u.a. unter anderem
UV Ultraviolett
W Watt
ξ Mittelwert
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil

1 Einleitung
11
Die instrumentelle Samenübertragung ist ein fester Bestandteil der modernen Pferdezucht.
Aufgrund des ökonomischen Interesses und für die optimierte Nutzung wertvoller Vatertiere
wäre es nützlich, das Geschlechterverhältnis der Nachkommen beeinflussen zu können.
Dieses gelingt durch die Trennung von X- und Y-chromosomalen Spermien vor der
Belegung. Das einzig derzeit verfügbare, zuverlässige Verfahren zur geschlechtsspezifischen
Trennung von Spermienpopulationen ist die „Beltsville Sperm Sexing Technology (BSST)“
(JOHNSON et al. 1989). Hiermit lassen sich ungefähr 15 Mio. X- und Y-chromosomale
Spermien pro Stunde trennen. Bislang ist nur beim Rind die BSST bis zur kommerziellen
Anwendung entwickelt worden (MAXWELL et al. 2004).
Unter experimentellen Bedingungen ist es auch beim Pferd inzwischen möglich, durch
Besamung mit sortierten Spermien Nachkommen mit dem vorbestimmten Geschlecht zu
erzeugen (BUCHANAN et al. 2000; LINDSEY et al. 2001, 2002b, c). Ein kommerzieller
Einsatz in der Pferdezucht ist bisher jedoch nicht möglich, da zum einen die Zahl der
Samenzellen, die pro Zeiteinheit getrennt werden kann, limitiert ist und zum anderen die
Vitalität sortierter Hengstspermien bislang noch nicht die des ungesexten Spermas erreicht.
Da beim Pferd ovulationsnah inseminiert werden sollte, ist es sinnvoll, Samenzellen direkt
nach der Sortierung einem Tiefgefrierverfahren zuzuführen, um sie jederzeit im Zyklus der
Stuten verfügbar zu haben. Resultate aus der konventionellen Kryokonservierung von
Pferdesperma stehen immer noch denen anderer Tierarten nach. Erschwerend kommt hinzu,
dass die Spermien nach der flowzytometrischen Spermienselektion in ihren
Membraneigenschaften labiler sind, wodurch sie sensibler auf die Belastungen der
Tiefgefrierung reagieren. Entsprechend ließen sich bislang mit gesexten und anschließend
tiefgefrorenen Hengstspermien Trächtigkeitsraten von maximal 13% erreichen (LINDSEY et
al. 2002b).

12
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Tiefgefrierung von gesexten Hengstspermien zu
verbessern und spermatologisch zu bewerten. Zusätzlich sollen in Abhängigkeit von den
Ergebnissen gesexte Spermien verschiedener Versuchsgruppen für Besamungsversuche
eingefroren werden. Die Durchführung der Besamungsversuche mit diesen Proben soll zu
einem späteren Zeitpunkt von einer australischen Arbeitsgruppe der Universität Sydney
erfolgen.

2 Literatur
2.1 Tiefgefrierkonservierungsverfahren für Hengstsperma
13
Die Samenzelle hat aufgrund ihrer hohen Differenzierung, die einer ausschließlichen
Spezialisierung zur Fertilisation dient, ihre Fähigkeit zu Wachstum, Zellteilung, Reparation
und Biosynthese eingebüßt (YOSHIDA 2000). Alle Konservierungsmaßnahmen, die eine
Aufrechterhaltung der Befruchtungskompetenz zum Ziel haben, müssen also darauf abzielen,
schädliche externe Einflüsse auf die Samenzelle zu minimieren und den Stoffwechsel auf ein
minimales Maß zu reduzieren.
Während der Lagerung im flüssigen Stickstoff werden die biologischen Stoffwechselprozesse
weitgehend reduziert. Die Samenzellen werden nur durch die terrestrische
Hintergrundstrahlung belastet, so dass die Halbwertszeit für überlebende Spermien auf 2000-
4000 Jahre geschätzt wird (MAZUR 1985). Allerdings bestehen unter Praxisbedingungen
keine thermodynamisch idealen Voraussetzungen, da zum einen die Lagergefäße regelmäßig
mit Stickstoff nachgefüllt werden müssen und zum anderen bei der Manipulation im
Besamungseinsatz erhebliche Temperaturschwankungen auftreten können. Wie aus
verschiedenen Feldstudien in den 70er und 80er Jahren hervorgeht, beeinträchtigt dies die
Lebenszeit der Spermien (ANDERSEN u. PETERSEN 1976; SALAMON et al. 1985).
Die erste Trächtigkeit aus tiefgefrorenem Hengstsperma konnte im Jahr 1957 erzielt werden
(BARKER u. GANDIER 1957). Obwohl mittlerweile die Tiefgefrierverfahren verbessert
wurden, eignet sich auch heute das Sperma vieler Hengste nicht zur Tiefgefrierung
(SQUIRES et al. 2004).
2.1.1 Prinzip der Tiefgefrierung
Zur Kryokonservierung von Hengstsperma sind verschiedene Basisschritte notwendig
(BRINSKO u. VARNER 1992).
Zunächst wird nach der Samengewinnung zur Abtrennung des Seminalplasmas das gesamte
Ejakulat verdünnt und zentrifugiert. Eine Abtrennung des Seminalplasmas ist für die Kühlung

14
und Lagerung bei 5°C vorteilhaft (JASKO et al. 1991b; PRUITT et al. 1993; DAWSON et al.
1999). Es sollten jedoch ca. 5 bis 20% des Seminalplasmas in der Probe belassen werden, da
hieraus höhere Spermienmotilitäten (JASKO et al. 1991b; PRUITT et al. 1993) und
Akrosomintegritäten (DAWSON et al. 1999) nach der Kühlung resultieren.
Nach der Zentrifugation wird das Spermienpellet mit dem zur Tiefgefrierung vorgesehenen
Verdünner resuspendiert und auf die vorgesehene Konzentration verdünnt. Dabei stellten
HEITLAND et al. (1996) fest, dass in einem Magermilch-Eidotter-Verdünner tiefgefrorene
Spermien nach dem Auftauen eine höhere Gesamtbeweglichkeit (51, 51 und 50%) und
Vorwärtsbeweglichkeit (41, 44 und 43%) zeigten, wenn sie in Konzentrationen von 20, 200
und 400 Mio. Spermien/ml tiefgefroren wurden, als wenn die Konzentrationen während der
Kryokonservierung 800 oder 1500 Mio. Spermien/ml betrugen (entsprechend 41 bzw. 32%
Gesamt- und 35 bzw. 27% Vorwärtsbeweglichkeit). Auch CROCKETT et al. (2000) fanden
nach der Tiefgefrierung bei einer niedrigeren Konzentration (250 Mio. Spermien/ml) einen
höheren Prozentsatz an motilen Spermien als wenn 500 Mio. Spermien/ml verwendet wurden.
Im Gegensatz dazu sahen LEIPOLD et al. (1998) keinen Unterschied in den
Auftaumotilitäten nach Tiefgefrierung bei Konzentrationen von 400 bzw. 1600 Mio.
Spermien/ml.
Die Größe des Inseminats übt, anders als die Anzahl der Spermien, wenig Einfluss auf die
Befruchtungsergebnisse aus (DEMICK et al. 1976), obwohl Hengste Uterusbesamer sind und
im Gegensatz zu Scheidenbesamern wie Bullen ein größeres Ejakulatvolumen besitzen.
Je nach Prozedur wird das Sperma entweder erst verpackt und dann auf 5°C gekühlt oder erst
gekühlt und dann bei 5°C verpackt. SAMPER (1995) stellte keinen Unterschied in den
Auftaumotilitäten fest, wenn Hengstspermien entweder in 0,5ml-, 2,5ml- oder 5ml-Pailletten
tiefgefroren wurden. Zum gleichen Schluss kamen auch CROCKETT et al. (2000), die die
Kryokonservierung in 0,5ml- und 2,5ml-Pailletten miteinander verglichen. GIL et al. (2003)
empfahlen, Glyzerin erst bei 5°C nach der Anpassungsphase dem Sperma zuzugeben, da dies
die Auftaumotilitäten und die Membranintegritäten in ihrer Studie an Schafbockspermien
verbesserte.

15
Nach abgeschlossenem Kühlvorgang auf 4°C folgt die kontrollierte Tiefgefrierung auf -196°C
und anschließende Lagerung im flüssigen Stickstoff.
Das Auftauen zur Besamung und die Beurteilung der Spermien erfolgt mit der mit dem
jeweiligen Einfrierprotokoll korrelierenden Methode (GRAHAM 1996), wobei die
Insemination des aufgetauten Spermas unmittelbar erfolgen sollte. Dabei ist ein
Inseminationszeitfenster von 24 Stunden vor bis 12 Stunden nach der Ovulation einzuhalten,
um zufriedenstellende Trächtigkeitsergebnisse zu erreichen (KLOPPE et al. 1988; BRINSKO
u. VARNER 1992).
2.1.1.1 Temperaturverlauf
Der optimale Temperaturverlauf beim Einfrieren und Auftauen hängt von mehreren Faktoren
ab. Dazu gehört unter anderem der Zelltyp mit seinen inhärenten Eigenschaften, die
Konfektionierung und die Verdünnerzusammensetzung. Die Komplexität aller Faktoren und
deren Optimierung ist kompliziert und gestaltet sich bei Spermien besonders schwierig, da die
Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit von vielen Faktoren vor und nach dem eigentlichen
Verarbeitungsprozess beeinflusst wird (PURSEL u. PARKS 1985).
Empirisch zeigt sich das Einfrieren bei relativ hohen Kühlraten von 15-60°C/min. am
günstigsten für das Überleben der Spermatozoen (WATSON 2000). Beim Auftauen werden
noch schnellere Geschwindigkeiten von 1000-2000°C/min. bevorzugt (WATSON 1995).
FISER (1990) weist außerdem auf einen wichtigen Zusammenhang zwischen der
Glyzerinkonzentration und der Einfrier- und Auftaurate hin und schlägt für eine
Glyzerinkonzentration von 3% eine Abkühlrate von 30°C/min sowie eine
Auftaugeschwindigkeit von 1200°C/min vor.
2.1.1.1.1 Einfrierverlauf
Die beste Überlebensrate in Abhängigkeit vom Verlauf der Einfriergeschwindigkeit lässt sich
bei Spermien, wie in den 70er Jahren vorgeschlagen wurde, durch eine Kurve in Form eines
umgekehrten U´s darstellen. Zunächst steigt die Überlebensrate mit steigender Gefrierrate an,

16
um dann nach Erreichen eines Optimums mit zunehmender Gefrierrate wieder abzufallen
(WEITZE 2001b).
Der Temperaturverlauf im Gefriergut ist besonders vom Phasenübergang flüssig zu fest
gekennzeichnet und zeigt drei Abschnitte. Das einzufrierende Sperma bleibt im
Einfrierverlauf bis unter den Gefrierpunkt flüssig. Dieses wird als Unterkühlung bezeichnet
und kennzeichnet den ersten Abschnitt der Tiefgefrierkurve. Mit Einsetzen der Kristallisation
wird Energie in Form von Wärme freigesetzt. Je nachdem, wie gut die Wärme an die
Umgebung abgegeben werden kann, folgt eine Phase der Erwärmung (rebound effect) oder
eine unterschiedlich lange Phase der Temperaturkonstanz (Gefrierplateau). Während dieser
zweiten Phase besteht die Gefahr einer intrazellulären Eisbildung. Ist die Kristallisation
abgeschlossen, kühlt das Gefriergut in der dritten Phase schnell auf seine Endtemperatur ab.
Die Hauptschäden an den Zellmembranen entstehen bei einer Temperatur zwischen -15°C
und -60°C (MAZUR 1985). Ist diese kritische Temperaturzone unterschritten, sind die Zellen
weitgehend „inert“ und können zur Aufbewahrung in flüssigen Stickstoff getaucht werden
(GRAHAM 1996).
Die Art der Konfektionierung übt einen entscheidenden Einfluss auf die Wärmeabgabe aus,
denn ein geringes Volumen und ein kleines Volumen / Oberflächen-Verhältnis erleichtern die
Wärmeabgabe. Charakteristisch bei der Kryokonservierung sind unterschiedliche
Temperaturverläufe im Zentrum und in der Peripherie des Gefriergutes (PURSEL u. PARKS
1985; BARON 1986; WEITZE et al. 1987). Bei der Konservierung in Kunststoffröhrchen
bestehen diese aber nur aus einer zeitlichen Verschiebung (WEITZE et al. 1987).
2.1.1.1.2 Auftauverlauf
Der Verlauf der Auftautemperatur hat deutliche Auswirkungen auf die Spermienqualität, denn
die Wärmeleitfähigkeit des flüssigen Aggregatzustandes ist gegenüber dem festen um den
Faktor 3 vermindert (WEITZE et al. 1987). Daraus resultiert beim Auftauen von peripher
nach zentral eine zunehmend schlechtere Leitfähigkeit, so dass zentral gelegene Bezirke
langsamere Auftauraten durchlaufen und damit für schlechtere Auftauergebnisse von
großvolumigen Einfrierbehältnissen verantwortlich sind (BARON 1986; FAZANO 1986).

17
Wenn bei einer Besamungsdosis ein Minimalvolumen von einigen Millilitern erforderlich ist,
muss eine Samenportion in mehrere kleine Volumina aufgeteilt oder in besonders flachen
Behältnissen eingefroren werden (LEPS 1988; BWANGA et al. 1991a, c), um ein homogenes
Einfrieren und vor allem Auftauen zu gewährleisten.
2.1.1.2 Wesentliche Bestandteile eines Tiefgefrier-Verdünners
Für die Konservierung müssen dem Ejakulat Nähr- und Schutzsubstanzen wie Glukose,
Puffer, Eidotter und Kryoprotektiva wie Glyzerin, DMSO o.a. zugesetzt werden. Damit
verbunden ist die Einhaltung des osmotischen Gleichgewichts zwischen Zellen und Medium
und eine ausreichende Pufferkapazität des Verdünners gegenüber aeroben und anaeroben
toxischen Abbauprodukten der Spermien in einem Bereich zwischen pH 6 und pH 7, sowie
die Senkung von Spermienstoffwechsel und Keimwachstum durch Temperaturerniedrigung
und Antibiotikazugabe (WEITZE 2001b). Verdünner zur Kryokonservierung von
Hengstsperma enthalten üblicherweise Eidotter, Zucker, Elektrolyte und Glyzerin
(HEITLAND et al. 1996). Die exakten Konzentrationen dieser Bestandteile variieren
zwischen Verdünnern (PALMER 1984; AMANN u. PICKETT 1987).
Bei den Gefrierschutzsubstanzen unterscheidet man penetrierende von nicht penetrierenden
Substanzen. Penetrierende Gefrierschutzsubstanzen (z.B. Glyzerin) agieren sowohl intra- als
auch extrazellulär (AMANN u. PICKETT 1987), während sich nicht penetrierende
Substanzen, wie z.B. Laktose und die Lipoproteine aus zugesetztem Eidotter, nur im
extrazellulären Bereich befinden. Letztere dehydrieren die Spermien, reduzieren dafür aber
die Bildung großer Eiskristalle im Intrazellularraum. Die Wirkungsweise beider Arten von
Gefrierschutzsubstanzen ist bis heute nicht genau geklärt (HAMMERSTEDT et al. 1990). Die
Effektivität einer Gefrierschutzsubstanz hängt von der Anzahl ihrer freien Elektronen, ihrer
Symmetrie in der Umgebung dieser freien Elektronen und ihrer Löslichkeit in Wasser ab
(NASH 1996).

18
POLGE et al. (1949) entdeckten, dass Glyzerin eine effektive Gefrierschutzsubstanz beim
Hahnsperma ist. Seitdem wird Glyzerin bei vielen Tierarten erfolgreich als
Gefrierschutzmittel eingesetzt (PARKS u. GRAHAM 1992). Die Gefrierschutzeigenschaft
von Glyzerin ist höher einzuschätzen als die des Eidotters (SALAMON 1973). Man geht
davon aus, dass es wie andere Zellmembran penetrierende Schutzsubstanzen durch seine
wasserbindende Eigenschaft wirkt (WEITZE 2001b). Beim Gefrieren einer Elektrolytlösung
nimmt die Menge ungefrorenen Wassers ab, je tiefer die Temperatur abgesenkt wird, wodurch
die Elektrolytkonzentration zunimmt. In Gegenwart von Glyzerin ist die Menge des bei einer
beliebigen Temperatur vorliegenden Wassers größer und somit die Elektrolytkonzentration
geringer als bei Fehlen dieser Gefrierschutzsubstanz. Der Schutzeffekt hängt von der molaren
Konzentration der Substanz ab, wobei der Anteil ungefrorenen Wassers als solcher wichtiger
zu sein scheint als jener der Elektrolytkonzentration (WATSON 1995). HAMMERSTEDT
und GRAHAM (1992) vermuteten, dass Glyzerin sowohl die Membranfluidität durch
Einlagerung in die Lipiddoppelmembran als auch alle metabolischen Reaktionen durch
Wandlung der intrazellulären Viskosität verändert.
Die Bestimmung der optimalen Glyzerinkonzentration hängt von dem zu untersuchenden
Beurteilungskriterium ab, da sich die Auswirkungen hinsichtlich der Motilität und der
Morphologie unterscheiden. Weder der Wirkungsmechanismus noch der Wirkungsort von
Glyzerin sind bekannt (MAZUR 1985). Bisher ist auch nicht eindeutig geklärt, ob es jeweils
intra- oder extrazellulären Gefrierschutz allein oder sogar beides vermittelt (ALMLID u.
JOHNSON 1988).
Gefrierschutzsubstanzen wie Glyzerin sind in hohen Konzentrationen spermientoxisch
(FAHY 1986; HAMMERSTEDT u. GRAHAM 1992) und können zu niedrigeren
Befruchtungsraten führen (PACE u. SULLIVAN 1975; DEMICK et al. 1976;
HAMMERSTEDT u. GRAHAM 1992; BEDFORD et al. 1995). Einige dieser toxischen
Effekte können auf die direkte Zerstörung der Zelle, Verletzung des osmotischen
Gleichgewichts und alterierende Interaktionen zwischen den Spermien und dem weiblichen
Genitaltrakt zurückgeführt werden (AMANN u. PICKETT 1987). Die Toxizität der einzelnen
Gefrierschutzkomponenten hängt zum einen von der chemischen Toxizität zu den Zellen
(NASH 1996) und zum anderen von der osmotischen Toxizität ab (GAO et al. 1995), also

19
davon, ob die Permeabilitätsgeschwindigkeit der Substanz durch die Zellmembran viel
langsamer ist als die von Wasser.
Hengstspermien überstehen die Kryokonservierung nicht ohne Gefrierschutzsubstanzen
(SQUIRES et al. 2004). Deshalb muss die Konzentration der dem Verdünner zugefügten
Gefrierschutzsubstanz zwar niedrig genug sein, um den toxischen Effekt möglichst gering zu
halten, gleichzeitig jedoch den maximal möglichen Schutz bieten (GRAHAM 1996).
SQUIRES et al. (2004) suchten in ihren Experimenten nach Alternativen zu Glyzerin bei der
Tiefgefrierung von Hengstspermien und stellten dabei fest, dass sich Methyl-Formamid und
Dimethyl-Formamid genauso effektiv wie Glyzerin als Kryoprotektiva eignen und dabei
anscheinend nicht spermientoxisch wirken. Die Autoren empfehlen weitere Experimente mit
Sperma von Hengsten, welches sich nur schlecht mit Glyzerin tiefgefrieren lässt.
2.1.1 Auswirkung der Kryokonservierung auf Spermien
Vorrangiges Ziel der Samenkonservierung ist es, das Befruchtungsvermögen des Spermas
möglichst lange zu erhalten. Die einzig messbare Sameneigenschaft zur Ermittlung des
Ausmaßes von Fertilisationsbeeinträchtigungen ist die Fruchtbarkeit selber (WATSON 2000),
allen anderen Sameneigenschaften kann nur hinweisende Bedeutung beigemessen werden
(WABERSKI et al. 1999) und hängt von den besonderen Bedingungen jedes einzelnen
Konservierungsverfahrens ab.
Seit der Entdeckung der Gefrierschutzeigenschaften des Glyzerins vor über 50 Jahren
(POLGE et al. 1949) ist es außer beim Bullen noch nicht gelungen, mit tiefgefrorenem
Sperma Fruchtbarkeitsresultate zu erzielen, die den Ergebnissen von frisch übertragenem
Sperma entsprechen. WATSON (2000) sieht als Begründung hierfür die Kombination aus
einer verminderten Vitalität der Spermien und einer beeinträchtigten Funktion der
überlebenden Population. Die anhand der Parameter Spermienmotilität und Akrosomintegrität
bestimmte Anzahl der den Tiefgefrier- und Auftauprozess überlebenden, als potenziell fertil
anzusehenden Spermien ist danach gegenüber den Ausgangswerten um etwa 50% reduziert
(WATSON 2000).

20
Um bei der Besamung mit kältekonserviertem Sperma Befruchtungsergebnisse zu erreichen,
die mit denen von flüssigkonserviertem Sperma vergleichbar sind, ist daher die exakt auf den
Ovulationszeitpunkt ausgerichtete Insemination erforderlich (WATSON u. GREEN 1999).
SQUIRES und PICKETT (1995) fassten Daten verschiedener Studien (ALEIV 1981;
VOLKMANN u. VAN ZYL 1987; KLOPPE et al. 1988) zusammen und empfahlen zur
Verbesserung der Befruchtung mit tiefgefrorenem Sperma bei der Stute eine Besamung 12 bis
24 Std. vor der Ovulation. Dies bedingt mindestens zweimal am Tag eine ultrasonographische
Kontrolle der Ovarien, sobald ein Follikel der Größe 35mm nachgewiesen wird.
Spermamängel können kompensierbar und nicht kompensierbar sein (SAACKE et al. 1998,
2000). Kompensierbare Mängel sind solche, die einzelne Samenzellen betreffen und durch
andere Spermien im Ejakulat soweit ausgeglichen werden, dass eine maximale Fruchtbarkeit
des Ejakulates bzw. der Samenportion erhalten bleibt. Diese Kompensation kann nur vor der
Befruchtung erfolgen. Nicht kompensierbare Spermamängel hingegen sind beispielsweise
numerische oder strukturelle DNA-Schäden, die zwar die initiale Befruchtungsfähigkeit der
Spermien nicht einschränken, jedoch zu Inkompetenzen nach der Fertilisation führen und sich
in schlechten Embryonenqualitäten und Embryonenverlusten äußern (WABERSKI et al.
1999). Morphologisch normal erscheinende Spermien werden am ehesten als Kandidaten für
nicht kompensierbare Schädigungen angesehen.
Beim Vorliegen von nicht kompensierbaren Samenzellschäden kann demnach auch eine
Erhöhung der Inseminationsdosis entsprechend einem von SCHWARTZ et al. (1981)
vorgestellten Modell nicht zu einer Steigerung der Fruchtbarkeit beitragen.
Tertiäre Schäden der Spermien durch den Tiefgefrierprozess sind weitgehend kompensierbar,
sofern ausreichend Spermien in der Besamungsportion vorhanden sind. Dementsprechend
liegt die notwendige Inseminationsdosis von Tiefgefriersperma deutlich über der von flüssig
konserviertem Sperma (JOHNSON 1985).
Kennzeichnend für Tiefgefrierschäden ist die verkürzte Lebensdauer von Spermien im
weiblichen Genitale (PURSEL et al. 1978b). Eine Verkürzung des von den Spermien
zurückzulegenden Weges, z.B. durch laparoskopische Besamung, liefert bessere
Befruchtungsergebnisse. Dies deutet darauf hin, dass kryokonservierte Spermien mit
subletalen Schädigungen zwar Befruchtungsvermögen besitzen, aber nicht mehr in der Lage

21
sind, die physiologische Passage durch den weiblichen Genitaltrakt in ausreichendem Maße
zu vollziehen (HOLT 2000). Es wird vermutet, dass Membranveränderungen wie z.B.
frühzeitige Kapazitation die Abwehrreaktion von Immun- und Epithelzellen im weiblichen
Genitaltrakt beeinflussen (ZERBE et al. 2003).
Die vielfältigen Einflüsse der Kryokonservierung auf Spermienmembran und –organellen
sind noch nicht vollkommen erforscht. Man geht davon aus, dass viele
fruchtbarkeitsreduzierende Einflüsse auf Veränderungen der Plasmamembran, der äußeren
Akrosommembran und der Membranen der Mitochondrien beruhen (WATSON 1995).
Elektronenmikroskopisch nachweisbar sind Schädigungen an Axonema, Mitochondrien und
Akrosomen (COURTENS u. PAQUIGNON 1985; COURTENS et al. 1989).
2.1.2.1 Kälteschock
An Bullensperma beobachtete MILOVANOV (1934) als erster das Phänomen einer
irreversiblen Schädigung durch Abkühlung. Verlust von Membranintegrität und Zellfunktion
sind typische Indikatoren dieser Kälteschockschädigungen (BWANGA 1991).
Charakteristische Merkmale sind außerdem abnorme Bewegungsmuster (zirkulär und
rückwärts), schneller Verlust der Motilität und Verlust der Akrosomintegrität (WATSON
1995).
Hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Kälteeinflüssen bestehen speziesspezifische
Unterschiede, wobei Spermien von Ungulaten besonders prädisponiert sind (WATSON
1995). Hinzu kommt eine positive Korrelation zwischen dem Prozentsatz überlebender
Spermien nach Kälteschock und der Fruchtbarkeit nach Tiefgefrierung und Auftauen
(WATSON u. PLUMMER 1985).
Die Effekte des Kälteschocks können minimiert werden, indem kontrollierte Abkühlraten vor
allem im kritischen Bereich für Hengstsperma zwischen 19°C und 8°C eingehalten werden
(MORAN et al. 1992) und Lipide wie Eidotter und Lipoproteine z.B. mit Milch dem
Tiefgefrierverdünner zugefügt werden.

2.1.2.1.1 Membranveränderungen durch Tiefgefrierung und Auftauen
22
Der Aufbau der Spermienmembran wurde im wesentlichen in einem Modell von SINGER
und NICHOLSON (1972) dargestellt. Eine hauptsächlich aus Phospholipiden bestehende
amphipatische Lipiddoppelschicht ist mit integralen und peripheren Proteinen durchsetzt, die
aufgrund der allgemeinen Membranfluidität eine gewisse Beweglichkeit besitzen. Bedingt
durch Interaktionen der einzelnen Komponenten untereinander und mit dem Zellinneren
zeigen Membranen lebender Zellen keine homogene Verteilung der einzelnen
Membranbestandteile, sondern eine Asymmetrie zwischen innerer und äußerer Lipidschicht
sowie eine Kompartimentierung einzelner Membranbereiche (HAMMERSTEDT et al. 1990).
Hauptbestandteile der Spermienmembran sind eine tierartlich unterschiedliche
Zusammensetzung von Phospholipiden und Cholesterin (DARIN-BENNETT u. WHITE
1977). Diese unterschiedliche Zusammenstellung der Lipide scheint Auswirkungen auf die
Kühlschockempfindlichkeit der Spermien zu haben, denn Tierarten mit einer hohen
Kälteempfindlichkeit des Spermas zeigen Übereinstimmungen in ihrem Membranaufbau
(WATSON u. PLUMMER 1985; PARKS u. LYNCH 1992). Dieses trifft neben den
Phospholipidklassen auch für das Cholesterin / Phospholipid -Verhältnis zu. Ebenso spielen
die Länge und der Grad an ungesättigten Fettsäuren, der beim Rind, Schaf und Schwein hoch
ist, eine wichtige Rolle (DARIN-BENNETT u. WHITE 1977; WATSON u. PLUMMER
1985). Spermien von kühlschockresistenten Arten wie Mensch und Kaninchen haben
hingegen einen größeren Anteil an gesättigten Fettsäuren.
Unabhängig von den sich daraus ergebenen strukturellen Effekten auf die Spermienmembran
ist zusätzlich durch einen hohen Anteil an ungesättigten Fettsäuren mit oxidativen
Schädigungen durch freie Radikale während der Samenverarbeitung zu rechnen (PARKS u.
GRAHAM 1992). Auch Einflüsse durch den Verdünner sorgen dafür, dass der Anteil an
mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den Spermien nach dem Auftauen in erheblichem Maße
vermindert ist (CEROLINI et al. 2001). Solange jedoch die unterschiedliche Verteilung der
einzelnen Membranbestandteile innerhalb der einzelnen Kompartimente nicht aufgeklärt ist,
sind prognostische Aussagen bezüglich der Membranstabilität schwierig (DE LEEUW et al.
1990). Auch lassen sich durch die Membranzusammensetzungen bei den einzelnen Tierarten
die unterschiedlichen Erfolge beim Einfrieren und Auftauen nicht erklären (HOLT 2000).

23
Temperaturerniedrigung bewirkt eine Veränderung der Lipidmuster und -organisation der
Doppelmembran (BUHR et al. 1994). Wird eine wässrige Zellsuspension gefroren, so bilden
sich extrazellulär Eiskristalle und die Phospholipide gehen vom Flüssig- in den Gelzustand
über, was als Phasenverschiebung bezeichnet wird. Entscheidend für Art und Ausmaß der
Phasenübergänge ist die molekulare Membranzusammensetzung, die für die unterschiedliche
Abkühlempfindlichkeit bei den verschiedenen Spezies mitverantwortlich ist (DE LEEUW et
al. 1990).
Die Zellmembranen verhindern ein Kristallwachstum in das Zellinnere (MAZUR 1985).
Folglich wird der Zellinhalt unterkühlt und bleibt somit auch unterhalb des Gefrierpunktes
flüssig. Durch die Eisformation steigt die extrazelluläre Ionenkonzentration, so dass Wasser
entlang des osmotischen Gradienten diffundiert und auf diese Weise sowohl den
Intrazellularraum als auch die Zellmembran dehydriert. Eine weitere Temperaturerniedrigung
führt durch die Eisbildung zu einer Einengung der noch nicht gefrorenen Bereiche, in denen
sowohl Zellen als auch Salze weiter konzentriert werden.
Dabei können folgende schädigende Mechanismen auftreten: Eine zu hohe Dehydratation der
Zellmembran durch langsames Herunterkühlen lässt diese permeabel werden, indem es zu
einer lateralen Phasenseparation bzw. einer lysotropen Phasentransition kommt, wobei die
einzelnen Phospholipidklassen zu stabilen hexagonalen Arealen aggregieren (STEPONKUS
u. LYNCH 1989). Membranproteine werden von diesen soliden Arealen ausgeschlossen und
konzentrieren sich in den flüssigen Bereichen. Prinzipiell ist dieser Zustand reversibel (DE
LEEUW et al. 1990), doch können die Membranveränderungen während der
Gefrierkonservierung zu irreversiblen Zellschädigungen führen. Diese beruhen auf einer
erhöhten Permeabilität, Störungen im Lipidaufbau und Ionentransport (WATSON u.
PLUMMER 1985) sowie auf einer erniedrigten Enzymaktivität.
Erschwerend kommt hinzu, dass die Membran bezüglich struktureller und funktioneller
Merkmale nicht als ein eigenständiges und homogenes Ganzes betrachtet werden kann,
sondern dass aufgrund der sich unterscheidenden Membrankompartimente einige für
bestimmte Membranbereiche als gut angesehene Maßnahmen für andere wiederum ohne
Nutzen bzw. sogar schädlich sein können (KOEHLER 1985).
Durch den Wasserefflux kommt es zu osmotischem Stress und zum Schrumpfen der Zelle und
damit verbundenen strukturellen Belastungen. Des weiteren kann es bei zu schneller

24
Abkühlung zur Bildung großer, schädlicher intrazellulärer Eiskristalle kommen (MAZUR
1985). Eine mechanische Schädigung der Zellen tritt ebenfalls auf, wenn die Zellen in den
eisfreien Zwischenräumen durch das sich ausdehnende Eis gestaucht werden (COURTENS u.
PAQUIGNON 1985).
Der Schutz durch Gefrierverdünner vor Schäden der Eiskristallbildung (BWANGA et al.
1991b), ein optimaler Temperaturverlauf während des Einfrierens und ein dazu passender
Auftauvorgang sind also wichtige Bestandteile eines Gefrierprotokolls. Es wird empfohlen,
langsam eingefrorene Zellen auch langsam wieder aufzutauen, um den Zellen die Zeit für die
notwendige volumetrische bzw. osmotische Anpassung zu geben, und schnell eingefrorene
auch schnell wieder aufzutauen, um ein Weiterwachsen intrazellulärer Eiskristalle zu
verhindern (MAZUR 1985).
Nach dem Erwärmen weist gekühltes Sperma ein Membranverhalten auf, das dem einer
teilweise kapazitierten Samenzelle entspricht (WATSON 1995, 2000). Die Membran ist
besser durchlässig für Ca 2+ -Ionen, wodurch die Kapazitation und die Akrosomreaktion
gefördert werden (WATSON 1995). Deswegen erreicht aufgetautes Human- und
Ziegensperma im Gegensatz zu frischem Sperma ohne Inkubation eine maximale Penetration
von zonafreien Hamsteroozyten (WATSON 1995). Auch PURSEL (1983) berichtete von
einer verkürzten Kapazitationszeit von aufgetautem Sperma im weiblichen Genitale, machte
dafür aber nicht alleine den Einfrier- und Auftauprozess verantwortlich. Eine mikroskopische
Unterscheidung von kapazitierten und nicht kapazitierten Spermien ist nicht möglich (HOLT
u. MEDRANO 1997).
Eine häufig benutzte Färbung zur Beobachtung einzelner Spermien ist die Chlortetracyclin-
(CTC-) Färbung (WARD u. STOREY 1984), die Unterschiede im Calcium-Ionen-Gehalt
sichtbar machen kann, von denen man auf Kapazitation schließt (WANG et al. 1995).
KOTZIAS-BANDEIRA (1997) fand nach dem Auftauen eingefrorener Eberspermien eine
deutliche Abnahme fluoreszierender Spermienköpfe, welche als nicht kapazitiert diskutiert
wurden. Allein Abkühlung und Wiederaufwärmung können bei Eberspermien gemessen an
CTC-Färbung und Ca 2+ -Aufnahme ein Verhalten bewirken, wie Spermien es zeigen, die in
einem Kapazitationsmedium inkubiert wurden (WATSON u. GREEN 1999). Entsprechend
finden diese Veränderungen im lebenden Teil der Samenzellpopulation statt und sind nicht

25
Ausdruck eines Vitalitätsverlustes (WATSON u. GREEN 1999). Die CTC-Färbung gilt
allerdings mittlerweile als sehr umstritten, da ihr Wirkungsmechanismus unklar ist (HOLT u.
MEDRANO 1997). Besser geeignet scheinen Verfahren zu sein, die die
Lektinbindungsreaktion untersuchen (s. 2.1.3.1.3).
2.1.2.2 Tiefgefrierung von Hengstsperma
Die Eignung zur Kryokonservierung von Hengstspermien unterliegt dem individuellen
Einfluss einzelner Hengste (MERKT 1976; COCHRAN et al. 1983; LOOMIS et al. 1983;
MÜLLER 1987; JASKO et al. 1991a; SAMPER et al. 1991; VIDAMENT et al. 1997b).
PICKETT und AMANN (1993) schätzten, dass das Sperma von 25-30% aller Hengste sich
gut und von 25-50% aller Hengste mittelmäßig einfrieren lässt. Bei 25-40% aller Hengste
lässt sich das Sperma nur schlecht einfrieren. Außerdem lassen sich unterschiedliche
Ejakulate des gleichen Individuums nicht immer gleich gut kryokonservieren (PICKETT et al.
1987). Zudem ist zu beachten, dass das Sperma einzelner Hengste sehr unterschiedlich auf die
Tiefgefrierung in verschiedenen Verdünnern reagieren kann (SQUIRES u. PICKETT 1995;
GRAHAM 1996).
Auch MAGISTRINI et al. (1987) und VIDAMENT et al. (1998a) bestätigten die großen
individuellen Schwankungen in der Spermaqualität nach der Kryokonservierung. Neben der
Beurteilung der Vorwärtsbeweglichkeit wandten sie verschiedene Färbemethoden zur
Bestimmung der Vitalität an und analysierten die Plasmamembranintegrität mit Hilfe des
hypoosmotischen Schwellungstests. VIDAMENT et al. (1997a) untersuchten Hengstsperma
vor dem Einfrieren und danach hinsichtlich verschiedener Samenqualitätsparameter. Sie
fanden kein zuverlässiges Kriterium bei der Untersuchung des Nativspermas, um die Qualität
nach dem Einfrieren und Auftauen vorhersagen zu können.
Auch die computergestützte Motilitätsanalyse brachte keine genauere Vorhersage
(MAGISTRINI et al. 1997). Die Untersuchungsergebnisse von DIGRASSI (2000) zeigten,
dass die Variabilität der verschiedenen Spermaqualitätsparameter bei den untersuchten
Tiefgefriersamenproben von 29 Hengsten zum größten Teil auf individuelle Unterschiede
zurückzuführen ist. Sowohl bei der subjektiven Beurteilung der Motilität, als auch bei der

26
flowzytometrischen Bestimmung der Integrität der Spermachromatinstruktur, der
Plasmamembranintegrität und des Mitochondrienmembranpotentials ergaben sich große
individuelle Unterschiede.
2.2 Grundlagen zur Separation von X und Y-Chromosom tragenden Spermien
GUYER (1910) berichtete erstmals von der Existenz der Geschlechtschromosomen. Das
genetische Geschlecht wird beim Säugetier durch das befruchtende Spermium festgelegt.
Spermien besitzen in ihrem haploiden Chromosomensatz entweder ein X-Gonosom (weiblich
determinierend = Gynäkospermium) oder ein Y-Gonosom (männlich determinierend =
Androspermium) (SCHNORR 1989).
Darauf beruhend wurden viele Versuche unternommen, morphologische, physikalische,
physiologische, biochemische (THORMÄHLEN 1973; AMANN 1989b) und
immunologische (AMANN 1989b) Unterschiede zu charakterisieren. Doch erst JOHNSON et
al. (1999) erzielten mit der Entwicklung der „Beltsville Sperm Sexing Technology“ (BSST)
praktisch nutzbare Ergebnisse, die zu einer Auftrennung der Spermienpopulationen führen.
2.2.1 Möglichkeiten der Beeinflussung des Nachkommengeschlechts
Die Möglichkeiten zur Geschlechtsdiagnose können generell in zwei Methoden unterteilt
werden. Die erste Methode beinhaltet die postkonzeptionelle Geschlechtsbestimmung, bei der
die Diagnose an Präimplantationsembryonen oder an Feten durchgeführt wird. Bei dieser
Methode ist jedoch nur noch die Identifizierung des Geschlechts möglich und eine Änderung
könnte theoretisch nur durch Abortauslösung erreicht werden (SEIDEL u. JOHNSON 1999).
Bei der zweiten Methode, der präkonzeptionellen Geschlechtsbestimmung, werden die
Spermien schon vor der Befruchtung in Populationen mit X- bzw. Y-Chromosom tragenden
Samenzellen separiert.
Seit vielen Jahrzehnten wurde versucht, eine Verschiebung des Geschlechterverhältnisses
durch Vor- oder Rückverlagerung des Kopulations- bzw. Inseminationszeitpunktes im
Verhältnis zum Östrus zu erzielen. Ältere positive Berichte konnten durch eine groß angelegte
Studie von FOOTE (1977) nicht bestätigt werden.

27
Eine intensiv untersuchte Möglichkeit der geschlechtsspezifischen Trennung geht von einer
schnelleren Beweglichkeit der Y-chromosomalen Spermien aus. Hieraus entwickelten
ERICSSON et al. (1973) ein Verfahren, in dem sich Y-chromosomale Spermien in einer
Albuminschicht bzw. einem Albumingradienten anreichern sollten. Beim Rind erbrachte
diese Methode keine Verschiebung des Geschlechterverhältnisses (BEAL et al. 1984). Auch
flowzytometrisch konnte keine Anreicherung von Androspermien bei Bullen- (BEAL et al.
1984; JOHNSON 1988) oder Ebersamen (JOHNSON 1988) bewiesen werden. Entsprechend
konnte bei flowzytometrisch getrennten Bullenspermien per Computer-assisted-sperm-
analysis (CASA) kein Unterschied der Fortbewegungsgeschwindigkeit zwischen Andro- und
Gynäkospermien gefunden werden (PENFOLD et al. 1998). Ebenso verlief eine Überprüfung
der Segregation von menschlichen Androspermien im Albumingradienten mittels Polymerase
chain reaction (PCR) und Fluoreszenz in situ Hybridisation (FISH) negativ (FLAHERTY u.
MATTHEWS 1996).
Beruhend auf der Annahme eines immunologischen Unterschiedes zwischen X- und Y-
chromosomalen Spermien erfolgten Versuche, geschlechtsspezifische Antikörper zu
entwickeln. JOHNSON (1988) und HENDRIKSEN et al. (1993) testeten dazu
Antikörperstrukturen auf der Oberfläche von Spermien, die zuvor flowzytometrisch in reine
X- und Y-Chrosom tragende Populationen getrennt worden waren. Dabei wurde für rund
1000 Oberflächenproteine kein Unterschied zwischen den Populationen festgestellt. Auch für
H-y-Antikörper wurde für Bullen- und Ebersperma kein geschlechtsspezifischer Unterschied
gefunden (HENDRIKSEN et al. 1993).
Auch durch Trennverfahren wie Laminarflow-Fraktionierung, Freeflow-Elektrophorese,
Dichtegradientenzentrifugation oder andere auf physikalischen Unterschieden beruhende
Methoden konnte keine Trennung der Spermienpopulationen erreicht werden (AMANN
1989b).
2.2.2 Funktionsprinzip des Spermasorters
MORUZZI (1979) machte als erster auf den unterschiedlichen DNA-Gehalt männlich und
weiblich determinierender Säugetierspermien als Möglichkeit zur Spermientrennung

28
aufmerksam. Das Y-Chromosom ist kleiner und trägt weniger DNA als das größere X-
Chromosom, während die Autosomen der X- bzw. Y-determinierenden Spermien einen
identischen DNA-Gehalt besitzen. Dieser DNA-Unterschied beträgt bei den Haussäugetieren
zwischen 3 und 4,5 %, beim Hengst liegt er bei 4,0% (JOHNSON u. WELCH 1999).
Die Grundlagen der Flowzytometrie, die durch FULWYLER (1965) sowie KAMENTSKY
und MELAMED (1967) begründet wurden, stellen die Basis der Beltsville Sperm Sexing
Technology (BSST) dar (JOHNSON et al. 1989). Die ersten flowzytometrischen Messungen
des DNA-Gehaltes von Spermien unternahmen GLEDHILL et al. (1976) auf der Suche nach
mutagenen Veränderungen. Versuche, die Spermien nach ihrem DNA-Gehalt aufzutrennen,
verliefen jedoch noch erfolglos.
2.2.2.1 Sortierung
Der durch UV-Licht anregbare Fluoreszenzfarbstoff Bisbenzimid (Hoechst 33342) bindet
bevorzugt an Adenin-Thymin-Regionen der DNA-Helix (MULLER u. GAUTIER 1975) und
färbt die DNA so spezifisch und relativ uniform (JOHNSON et al. 1987a). Von allen
Farbstoffen, die die Plasmamembran lebender Zellen durchdringen können, hat Hoechst
33342 den geringsten toxischen Effekt und erwies sich auch dadurch gegenüber früheren
Farbstoffen zur Auftrennung von Spermatozoen nach ihrem DNA-Gehalt als überlegen
(JOHNSON et al. 1987a).
Die asymmetrische, paddelförmige Morphologie der Samenzellen bereitete jedoch bis zur
Entwicklung einer Düse, die einen bandförmigen Auslasströpfchenstrom erzeugt („beveled
needle“), bei der Bestimmung des DNA-Gehaltes Schwierigkeiten (DEAN et al. 1978). Vor
allem im Hinblick auf die gonosomale Auftrennung von Spermien ist deren optimale
Orientierung zum Laserstrahl wichtig (JOHNSON u. PINKEL 1986), da schon leichte
Rotationen aus der Detektionsebene den geringen Unterschied an DNA-Gehalt bei den
meisten Säugern verdecken.
Die Einführung eines zweiten Emissionsdetektors (JOHNSON u. PINKEL 1986), welcher im
Winkel von 90° zum ersten steht, erlaubt durch Messung der Fluoreszenzemission aus dem
Spermienrand die exakte Bestimmung der Orientierung und den elektronischen Ausschluss

29
nicht exakt orientierter Spermien. Dieser Anteil konnte von ca. 75% auf ca. 30% reduziert
werden, indem eine weitere Modifikation der Auslassdüse „orienting nozzle“ (RENS et al.
1998, 1999) unter verbesserter Ausnutzung hydrodynamischer Kräfte mit einer Verkürzung
des Abstandes zwischen Austrittsöffnung und Messeinheit kombiniert wurde.
Die optimierte Ausbeute in Verbindung mit einer schnelleren Sortiergeschwindigkeit durch
den MoFlo®-„high speed cell sorter“ (DakoCytomation, Fort Collins, CO, USA) (JOHNSON
et al. 1999), der 1996 in den Markt eingeführt wurde, erlaubt heute das Sexen von bis zu
5.000 Hengst-Spermien pro Sekunde mit einer Genauigkeit von über 90% (RATH u. SIEME
2003). SEIDEL und GARNER (2002) gehen bei perfekter Orientierung der Spermien von
einem oberen Limit von 10.000 lebenden Spermien jedes Geschlechts pro Sekunde aus,
womit die heutige Sortierrate maximal verdoppelt werden könnte.
Die Sortierbarkeit von Spermien zeigt deutliche Speziesunterschiede, welche unter anderem
von der Differenz im DNA-Gehalt zwischen den Geschlechtern abhängen (JOHNSON 2000).
Die geschlechtsspezifische Trennbarkeit wird erreicht, wenn der DNA-Gehalt sich um
mindestens 3% unterscheidet, die Spermien optimal zum Laser ausgerichtet werden können
und sich gleichmäßig anfärben lassen (JOHNSON 2000).
Heutzutage kann bei den meisten Spezies ohne Probleme mit einer Reinheit von ca. 95%
sortiert werden (JOHNSON 1992; RATH et al. 1999). Bei manchen Spezies, bei denen der
Unterschied im DNA-Gehalt größer ist, wie z.B. beim Chinchilla langier (7,5% DNA-Gehalt-
Differenz, JOHNSON et al. 1987b), kann sogar eine Reinheit von 100% erreicht werden
(JOHNSON u. WELCH 1999).
Eine höhere Effizienz der Sortierraten kann erlangt werden, wenn ein Lebensmittelfarbstoff
wie z.B. FD&C#40 der Spermiensuspension vor dem Sortiervorgang zugesetzt wird. Dieser
Farbstoff dringt in den Spermienkopf ein, wenn die Membranintegrität verändert ist und
reduziert das Fluoreszenzsignal von Hoechst 33342. Hierdurch werden FD&C#40-positive
Zellen mit geringerer Fluoreszenz vom Sortiervorgang ausgeschlossen (JOHNSON et al.
1994).
Das Prinzip der flowzytometrischen Spermiensortierung ist in Abbildung 1 dargestellt.

30
Prinzip der flowzytometrischen Spermientrennung
Abbildung 1: Darstellung des Funktionsprinzips eines Flowzytometers zum Sortieren
von Hengstspermien
Die mit Hoechst 33342 gefärbte Probe wird über den Probeneinlass ins Flowzytometer
gegeben, vom vorbeiströmenden Hüllstrom erfasst und als Flüssigkeitsstrom am Laser
vorbeigeführt. Durch Vibrationen wird der Flüssigkeitsstrom in einen Tröpfchenstrom
zerteilt, wobei jeder Tropfen eine Samenzelle enthält. Aufgrund des unterschiedlichen
DNA-Gehaltes ergibt sich im Laserstrahl ein unterschiedlich starkes
Fluoreszenzsignal, das von zwei im rechten Winkel zueinander stehenden Fotozellen
erfasst und im Rechner verarbeitet wird. Es werden nur Spermien zum Trennprozess
zugelassen, die ein eindeutiges Fluoreszenzsignal senden und somit eindeutig
identifizierbar sind. Diese werden abhängig von der Stärke des Signals elektrisch
aufgeladen oder verbleiben neutral, falls keine eindeutige Zuordnung vorgenommen
werden kann. Im nachgeordneten elektrischen Feld werden die Tropfen ihrer Ladung
entsprechend abgelenkt und können in separaten Auffanggefäßen gesammelt werden.

31
Beim Präparieren der Spermien für den Sortiervorgang ist zu beachten, dass die
Wahrscheinlichkeit für sortierte Spermien, ihre Fertilisationsfähigkeit zu behalten, größer ist,
je weniger Einflüsse auf die Spermien einwirken (JOHNSON et al. 1989; JOHNSON u.
WELCH 1999). Beispiele für negative Einflüsse, die die Fertilisationsfähigkeit beeinflussen,
sind das Zufügen von Farbstoffen, Erwärmung während der Inkubation, Druckänderungen im
Sortiersystem oder Zentrifugation der sortierten Spermien (JOHNSON 2000).
2.2.2.2 Reanalyse
Die Genauigkeit der geschlechtsspezifischen, flowzytometrischen Sortierung im BSST-
Verfahren kann durch flowzytometrische Reanalyse (WELCH u. JOHNSON 1999) oder
durch unabhängige Methoden wie PCR (WELCH et al. 1995) und FISH (KAWARASAKI et
al. 1998; PARRILLA et al. 2003) überprüft und abgesichert werden.
Bei der Reanalyse mittels PCR werden einzelne Spermien auf das Vorhandensein von X- oder
Y- Chromosomen untersucht. Diese Methode nimmt sehr lange Zeit in Anspruch und ist
deshalb für den praktischen Einsatz nicht sehr vorteilhaft (WELCH u. JOHNSON 1999). Sie
erlaubt jedoch, den Reinheitsgrad mit einem unabhängigen Verfahren zu überprüfen.
Die Fluoreszenz in situ Hybridisation (FISH) ist eine weitere unabhängige Möglichkeit zur
Überprüfung der Trenngenauigkeit (KAWARASAKI et al. 1998; PARRILLA et al. 2003).
Bei Spermien des Menschen mit einem DNA-Gehalt-Unterschied von 2,8% ist diese Methode
notwendig, da die Reanalyse im Flowzytometer nicht mit einer zufriedenstellenden
Genauigkeit durchgeführt werden kann (JOHNSON et al. 1993; FUGGER et al. 1998).
Vorteile der Reanalyse mittels FISH sind sowohl eine hohe Qualität, da chromosomen-
spezifische Untersuchungen benutzt werden, als auch eine hohe Quantität, da leicht 200 oder
mehr Zellen pro Proben ausgezählt werden können (WELCH u. JOHNSON 1999). Man kann
viele Proben auf einmal anfertigen, jedoch ist dies sehr arbeitsaufwendig und benötigt
mehrere Stunden bis zur Vollendung (WELCH u. JOHNSON 1999).
Die drei Nachweisverfahren liefern identische Ergebnisse (WELCH u. JOHNSON 1999). Als
Vorteil der flowzytometrischen Reanalyse ist jedoch die Verfügbarkeit der Daten innerhalb

32
von 30 Minuten und somit schon vor der Nutzung der sortierten Spermien. Als möglicher
Nachteil gilt, dass das selbe System (Sorter) für die Reanalyse wie auch für die
vorangegangene Sortierung benutzt wird (WELCH u. JOHNSON 1999).
2.2.2.3 Schädigungen durch den Sortiervorgang
Durch den Sortierprozess sind die Spermien einer unphysiologischen Belastung, insbesondere
hoher Verdünnung, Kernfärbung, Inkubation oder mechanischen Einflüssen und UV-Laser-
Strahlexposition, ausgesetzt (MAXWELL u. JOHNSON 1999). Bis heute ist nicht genau
geklärt, welcher dieser Stressfaktoren den größten Einfluss auf die Fruchtbarkeit der
Spermien hat. Vieles deutet darauf hin, dass das elektrische Feld auf das Spermienmittelstück
mit einer Polarisierung der Membranen wirkt und dass Radikale die Membranfluidität
verändern.
Es ist bekannt, dass die sich an den Sortierprozess anschließende Zentrifugation die Spermien
zur Kapazitation anregen kann (MAXWELL et al. 2000). Flowzytometrisch sortierte
Spermien zeigen ein ähnliches Membranverhalten hinsichtlich der Kapazitation (MAXWELL
et al. 2000), das dem von aufgetautem Sperma ähnelt (MAXWELL u. JOHNSON 1997).
Die Fertilität sortierter Spermien ist vermindert (SEIDEL et al. 1999; BUCHANAN et al.
2000), und die Vitalität nach der Kryokonservierung reduziert (SCHENK et al. 1999). Bei den
meisten Versuchen zur Überprüfung der Fertilität war die Besamungsdosis der sortierten
Spermien zudem geringer als bei Besamungen mit unsortiertem Sperma (SEIDEL u.
GARNER 2002). Wurde die Spermienzahl je Besamungsdosis so groß gewählt wie in der
unsortierten Probe, wurden um 20 bis 40% geringere Trächtigkeitsraten erzielt als in den
Kontrollgruppen (SEIDEL et al. 1999; DOYLE et al. 1999).
In einer Studie zu den DNA-Schädigungen und der Mortalität der sortierten Spermien durch
mechanische Einflüsse, der Anregung des Lasers und der Färbung während des
Sortiervorganges befanden GARNER et al. (2001), dass die meisten Schädigungen an
sortierten Spermien allein vom Durchgang durch den Zellsorter herrühren, auch ohne, dass sie
gefärbt oder durch den Laser angeregt werden. Der zusätzliche Schaden durch die Färbung

33
oder den Laserstrahl war gering und nicht statistisch signifikant, was sich mit den
Veröffentlichungen von GUTHRIE et al. (2002) und LIBBUS et al. (1987) deckt.
Hoechst 33342 bindet interkalierend an die Basen der DNA-Helix, was die allenfalls selten
auftretenden kleinen mutagenen Schäden erklären könnte (SCHENK et al. 1999). Außerdem
wird Hoechst 33342 durch Wellenlängen (351-362 nm) angeregt, die nicht dafür bekannt
sind, DNA-Schäden zu verursachen (SCHENK et al. 1999). Auch CATT et al. (1997)
entdeckten in ihren Studien keine vermehrten DNA-Schäden nach Anregung durch den UV-
Laser oder nach Inkubation mit Hoechst 33342.
MORRIS et al. (2003) fanden nach der Färbung und Inkubation bei Hengstspermien eine
Abnahme an intakten Akrosomen. Nach dem Sortiervorgang war jedoch der Anteil intakter
Akrosome höher als vor dem Sortiervorgang. Innerhalb von 48 Stunden nach der Sortierung
nahm der Anteil intakter Akrosome ab, während der Anteil ungleichmäßiger Akrosome gleich
blieb und der Anteil abgelöster Akrosome zunahm (MORRIS et al. 2003). Nach 12 Stunden
war die Spermienmotilität bei der Lagerung bei 20°C signifikant höher als bei der Lagerung
bei 4°C.
Die Zeit, die ein Spermium benötigt, um den Laserstrahl zu passieren, beträgt 2-3µs
(JOHNSON 1997). Die Intensität des Laserstrahls ist dabei direkt über die Kraft desselben zu
regulieren. Die Kraft des Lasers ist für eine bessere oder schlechtere Auflösung zwischen den
X- und Y-Spitzen verantwortlich. Ein Absenken der Laser-Kraft von 200mW auf 125mW
zeigte beim Kaninchen eine Verringerung der Anzahl unbefruchteter Oozyten und eine
bessere Embryonalentwicklung (JOHNSON et al. 1996). Jedoch ist damit oft ein Verlust der
Sortiergenauigkeit verbunden, so dass für einen optimalen Sortierprozess zwar die Kraft des
Lasers so niedrig wie möglich eingestellt werden muss, jedoch auch so hoch wie nötig, um
eine zufriedenstellende Auflösung und damit Sortiergenauigkeit zu erreichen (JOHNSON u.
WELCH 1999).

34
2.2.3 Einsatz von flowzytometrisch sortierten Spermien
JOHNSON und CLARKE (1988) wiesen erstmals die potentielle Befruchtungsfähigkeit
sortierter Spermienköpfe nach, indem sie die Spermienköpfe in das Zytoplasma von
Hamsteroozyten injizierten.
Die ersten Nachkommen mit sortierten Spermien wurden beim Kaninchen mittels
chirurgischer Insemination erzielt (JOHNSON et al. 1989). Mehr als 50 Nachkommen, die
alle keine phänotypischen Veränderungen aufwiesen und sich ohne Komplikationen
entwickelten, wurden mit dem für sie vorbestimmten Geschlecht geboren.
Erste Kälber wurden nach In-vitro-Befruchtung mit gesextem Sperma und anschließendem
Embryotransfer erzielt (CRAN et al. 1993, 1995). PARANACE et al. (2003) kombinierten die
flowzytometrische Sortierung mit Embryotransfer nach Superovulation und konnten so
Kälber erzeugen.
Inzwischen ist es gelungen, Nachkommen von Schweinen (JOHNSON 1991; JOHNSON et
al. 2000), Schafen (JOHNSON 1992; CRAN et al. 1997) und Pferden (SCHMID et al. 2000)
durch chirurgische Besamung in den Eileiter sowie Nachkommen von Rindern (SEIDEL et al.
1999; DOYLE et al. 1999), Schweinen (VAZQUEZ et al. 2003; RATH et al. 2003) und
Pferden (BUCHANAN et al. 2000; LINDSEY et al. 2002b) durch unblutige Besamung in das
Uterushorn zu erzielen. Auch beim Menschen führte die intrauterine Insemination von
sortierten Spermien zu Schwangerschaften und Geburten von Kindern mit dem
vorherbestimmten Geschlecht (FUGGER 1999).
In einem Feldversuch mit 1000 Rindern konnte das Geschlechtsverhältnis auf etwa 90%
weibliche Kälber verschoben werden (SEIDEL et al. 1999). Beim Schwein gelang es RATH
et al. (1997, 1999), 43 von insgesamt 44 Ferkeln mit dem prognostizierten weiblichen
Geschlecht zu erzeugen. ABEYDEERA et al. (1998) produzierten mit flowzytometrisch
separierten, Y-chromosomalen Spermien 9 Ferkel, die alle männlich waren.

35
Auch neuere Biotechniken wie die Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) wurden
erfolgreich mit flowzytometrisch sortierten Spermien bei Schaf (CATT et al. 1996), Mensch
(FUGGER 1999), Rind (HAMANO et al. 1999) und Schwein (PROBST 2001) durchgeführt.
Die In-vitro-Fertilisation (IVF) mit flowzytometrisch sortierten Eberspermien führte erstmals
durch RATH et al. (1997) zum Erfolg. Von 379 in vivo maturierten Oozyten, welche mit
weiblich gesexten Spermien fertilisiert wurden, konnten 92 auf zwei Empfängersauen
übertragen werden und führten zu zwei Würfen mit insgesamt 10 weiblichen Ferkeln.
Unterdessen gelang es ABEYDEERA et al. (1998) und RATH et al. (1999) auch mittels IVF
bei in vitro maturierten Oozyten, Ferkel zu produzieren.
Es ist heute außerdem heute möglich, mit flowzytometrisch sortierten Spermien durch IVF
Embryonen zu produzieren (CRAN et al. 1995), einzufrieren und nach Übertragung auf
Empfängerkühe Kälber des gewünschten Geschlechts zu erhalten (LU et al. 1999).
Erst kürzlich wurde vom ersten Nachkommen aus flowzytometrisch sortierten Spermien bei
einer Elchkuh berichtet, der aus der Insemination mit sortierten, tiefgefrorenen und wieder
aufgetauten Spermien hervorging (SCHENK u. DEGROFFT 2003).
Sortiertes Büffelsperma führte ebenfalls zur Geburt von Kälbern nach konventioneller
Samenübertragung (PRESICCE et al. 2005). Auch bei verschiedenen Primatenarten,
Delphinen und anderen bedrohten Tierarten wird sortiertes Sperma bereits eingesetzt
(MAXWELL et al. 2004).
2.2.3.1 Einsatz von flowzytometrisch sortierten Spermien beim Pferd
Wie bei anderen Tierarten wurde auch beim Pferd die Erfahrung gemacht, dass sich das
Sperma vieler Samenspender nicht für die flowzytometrische Sortierung eignet (LINDSEY et
al. 2002b). Eine genaue Vorauswahl ist daher notwendig. Dabei gibt eine gute Fruchtbarkeit
des unsortierten Spermas wenig Aufschluss über seine Sortierbarkeit und die Fruchtbarkeit
nach dem Sortieren. Dennoch sollten diese Kriterien eine Voraussetzung zur Verwendung
sein.

2.2.3.1.1 Vitalität und Fruchtbarkeit von gesexten Spermien
36
Die Fertilität sortierter Spermien ist ebenso wie ihre Lebensdauer nach Kryokonservierung
generell niedriger als diejenige entsprechender Kontrollgruppen (SCHENK et al. 1999;
SEIDEL et al. 1999; BUCHANAN et al. 2000).
Vor der Sortierung werden die Spermien zusätzlich zur Färbung mit Hoechst 33342 mit
einem Lebensmittelfarbstoff gefärbt, der die Membranen toter Zellen penetrieren kann.
Dadurch wird die Fluoreszenz vermindert, so dass die Zellen vom Sortiervorgang
ausgeschlossen werden können (MAXWELL et al. 2004). Dieser Prozess scheint beim
Schafbock, Eber und Hengst einen hohen Anteil an akrosomintakten Zellen zu ergeben
(HOLLINSHEAD et al. 2002, 2003). Diese verbesserte Akrosomintegrität bleibt bei
Inkubation nach der Sortierung beim Schafbock (HOLLINSHEAD et al. 2003) und Hengst
(MORRIS et al. 2003) erhalten. An Hengstspermien konnten MORRIS et al. (2003) 12
Stunden nach der Sortierung und bei Lagerung bei 20°C noch 27% Beweglichkeit feststellen,
während die Lagerung bei 4°C eine signifikant niedrigere Motilität ergab. Die Motilität von
Bullen- und Eberspermien nahm nach dem Sortieren und Tiefgefrieren schneller ab als bei
den Kontrollgruppen, die diesen Prozess nicht durchlaufen haben (RATH et al. 2003). Dies
zeigt zwar Speziesunterschiede an, jedoch muss zur Zeit grundsätzlich davon ausgegangen
werden, dass die Überlebensfähigkeit sortierter Spermien innerhalb des weiblichen
Genitaltraktes geringer ist als bei unsortierten Spermien (MAXWELL et al. 2004). Durch
ovulationsnahe Besamung kann die Kurzlebigkeit sortierter Spermien zumindest teilweise
kompensiert werden (LINDSEY et al. 2002a).
2.2.3.1.2 Besamungsregime
Bei der Besamung mit Frischsperma werden Stuten während des Östrus üblicherweise täglich
mit 500 Mio. vorwärtsbeweglichen Spermien besamt (PICKETT u. VOSS 1975). Für eine
maximale Effizienz empfehlen PICKETT et al. (2000) eine Inseminationsdosis von 500 Mio.
frischen vorwärtsbeweglichen Spermien bei Besamung vor Ort, 1000 Mio.
vorwärtsbewegliche Spermien für flüssiges Versandsperma und insgesamt 800 Mio. für
tiefgefrorenes Sperma, das mindestens 30% Vorwärtsbeweglichkeit nach dem Auftauen

37
zeigen muss. Eine Dosis von 50 Mio. vorwärtsbeweglichen Spermien wird von
HOUSEHOLDER et al. (1981) bei der Besamung mit Frischsperma als kritische
Besamungsdosis angesehen.
Geht man von einer Sortierrate von 5000 Samenzellen pro Sekunde aus (RATH u. SIEME
2003), benötigt man für die flowzytometrische Sortierung einer Inseminationsdosis von 100
Mio. Spermien 5,6 Stunden. Entsprechend erhöht sich diese Zeit, wenn die Besamungsdosis
100 Mio. motile Spermien enthalten soll (12 Std. bei 50% und 18 Std. bei 30% Motilität).
In frühen Experimenten mit gesexten Hengstspermien wurde deshalb von SCHMID et al.
(2000) die chirurgische Besamung mit 150.000 Zellen gewählt, um trotz der limitierten
Besamungsdosis Trächtigkeiten zu erzielen. BUCHANAN et al. (2000) benutzten als erste die
unblutige tief intrauterine Besamung in das ipsilateral zum Follikel liegende Uterushorn unter
rektaler ultrasonographischer Kontrolle mit 25 Mio. vorwärtsbeweglichen gesexten
Hengstspermien. Eine erste Gruppe von Stuten wurde dabei mit 25 Mio. Spermien in 1 ml
Magermilchverdünner besamt. Dabei stellten die Autoren keinen signifikanten Unterschied in
der Trächtigkeitsrate zwischen der Besamung mit ungesexten und gesexten Spermien fest.
Sechzehn Tage nach der Besamung waren 30% der Stuten tragend, die Trächtigkeitsrate sank
jedoch bis zum 60. Trächtigkeitstag auf 10%. Die zweite Gruppe von Stuten wurde auf die
gleiche Weise mit gesextem Sperma besamt, das mit einem eigelbhaltigen
Magermilchverdünner versetzt worden war. In dieser Gruppe wurden Trächtigkeitsraten von
50% am Tag 16 nach der Besamung und nur 10% Verlust der Trächtigkeit bis Tag 60
beobachtet. Im Rahmen dieser Experimente mit sortierten Spermien wurden im Sommer 1999
vier gesunde Fohlen geboren (BUCHANAN et al. 2000).

38
Tabelle 1: Einfluss der Besamungstechnik mit ungesextem Sperma auf die Trächtigkeitsrate
Stuten
(n)
von Stuten (mod. nach SIEME et al. 2004)
Besamungs-
technik
Art des
Spermas
Besamungs-
volumen (ml)
Spermienzahl
(x 10 6 )
Trächtigkeits-
rate (%)
31 Uteruskörper Frisch 12 50 58,1
32 kraniales Uterushorn Frisch 12 50 50,0
27 Hysteroskopisch Frisch 12 50 55,6
28 Hysteroskopisch Frisch 2 50 67,9
34 Uteruskörper Frisch 12 300 58,8
37 Uteruskörper TG 0,5 100 43,3
38 kraniales Uterushorn TG 0,5 100 44,7
48 Hysteroskopisch TG 0,5 100 45,8
21 Uteruskörper TG 12 800 42,9
Die kritische Dosis nicht sortierter Spermien, ab der die endoskopische Besamung der
konventionellen intrauterinen Besamung vorgezogen werden sollte, liegt bei 10 Mio.
vorwärtsbeweglichen Spermien (SIEME et al. 2003). MORRIS et al. (2000) befanden in ihren
Versuchen zur hysteroskopischen Besamung mit niedrigen Besamungsdosierungen, dass bei
der Unterschreitung einer Dosis von 1 Mio. unsortierten Spermien die Fertilisation nach
Besamung auf die Eileiterpapille deutlich nachlässt.
Da mit der hysteroskopischen Methode die höchsten Trächtigkeitsraten in Versuchen mit
niedrigen Besamungsdosen erreicht wurden (Tab. 1), wurde sie auch für Besamungen mit
sortierten Hengstspermien angewendet.
Für eine hysteroskopische Besamung kann die erforderliche Anzahl an Spermien im High-
speed-cell-sorter innerhalb von 4 Stunden sortiert werden. Eine erfolgreiche
Besamungstechnik mit reduzierter Spermiendosis würde den Einsatz von gesexten Spermien
erheblich erleichtern (LINDSEY et al. 2002a, b).

39
Nach hysteroskopischer Insemination von je 5 Mio. sortierten bzw. nicht sortierten Spermien
wurden Trächtigkeitsraten von 37,5 und 40% erzielt (LINDSEY et al. 2002b). Alternativ
wurde Sperma nach der Gewinnung vor dem Sortiervorgang für 18 Stunden bei 20°C
Raumtemperatur gelagert. LINDSEY et al. (2001) besamten 20 Stuten mit 20 Mio. frisch
sortierten Spermien. Die Trächtigkeitsergebnisse unterschieden sich mit 35% nicht mehr von
den parallel durchgeführten Besamungen mit ungesextem Sperma.
In einer weiteren Versuchsreihe, die sich mit derselben Problematik befasste, besamten
LINDSEY et al. (2002c) jeweils 25 und 22 Stuten hysteroskopisch mit 20 Mio. sortierten
Frischspermien. Im ersten Fall wurde das Sperma bei 15°C und in der zweiten Gruppe bei
5°C für 18 Stunden gelagert. In einer dritten Gruppe wurde eine Dosis von 20 Mio. gesexten
Frischspermien nach 18 Stunden Verwahrung bei 5°C mittels rektal geleiteter tief-
intracornualer Besamung direkt an die Hornspitze verbracht. Bei den hysteroskopisch
besamten Stuten fielen die Trächtigkeitsergebnisse mit 72, 55 und 38% besser aus, wenn das
Sperma zuvor bei 15°C gelagert worden war.
2.2.4 Verwendung gesexter und tiefgefrorener Spermien in der Besamung
Nicht nur die Anzahl der sortierten Spermien pro Zeiteinheit, sondern auch die verminderte
Lebenszeit der Spermien nach der Sortierung stellen ein Hindernis bei der Verwendung
sortierter Spermien dar. Um diese Probleme zu minimieren, muss die Besamung mit sortierten
Spermien so schnell wie möglich und so ovulationsnah wie möglich erfolgen (LINDSEY et
al. 2002a; RATH u. SIEME 2003). Dies ist organisatorisch nicht immer möglich, so dass die
Verwendung sortierter und tiefgefrorener Spermien eine große Vereinfachung darstellen
würde. Bislang liegt lediglich ein Bericht über den erfolgreichen Einsatz von gesexten,
tiefgefrorenen Spermien mit einer Trächtigkeitsrate von 13% (2 von 15 Stuten) vor
(LINDSEY et al. 2002b).
Die optimale Anpassungszeit an 5°C vor der Tiefgefrierung flowzytometrisch sortierter
Spermien hängt vom genutzten Verdünner und den Eigenschaften der Spermatozoen einzelner
Individuen ab (SCHENK et al. 1999). Die Optimierung der Anpassungszeit ist wichtig, um
Schäden an den Spermien zu minimieren. Beim Bullen befanden SCHENK et al. (1999) bei

40
der Betrachtung der Motilitäten 1 bis 2 Stunden nach dem Auftauen eine Anpassungszeit an
5°C von 3 bzw. 6 Stunden für besser als 18 Stunden. Bei ihren Versuchen wurden jedoch nur
Ejakulate von 4 Bullen benutzt, was keine allgemeingültigen Rückschlüsse auf Ejakulate
anderer Bullen zulässt (SCHENK et al. 1999). Die Autoren vermuten jedoch, dass nur bei
einer Minderheit von Bullen eine Anpassungszeit von mehr als 6 Stunden als optimal
anzusehen ist.
Bei sortierten Rinderspermien führte die Tiefgefrierung nach dem Auftauen zu einer
signifikanten Reduktion der Motilität (durchschnittlich 30-35%), während sich der Anteil
intakter Akrosome nicht von dem der parallel eingefrorenen unsortierten Kontrollgruppe
unterschied (SCHENK et al. 1999). SEIDEL et al. (1998) und DOYLE et al. (1999) führten
Inseminationsversuche mit gesexten Rinderspermien durch, bei denen das Sperma sortiert und
mit einer Samendichte von 1,63 Mio. Spermien/ml bei 5°C eingesetzt oder mit einer Dichte
von 20 Mio. Spermien/ml tiefgefroren wurde. Mit nicht tiefgefrorenen, sortierten Spermien
wurden bei Rindern ähnliche Trächtigkeitsraten erzielt wie mit nicht sortiertem
Kontrollsperma (SEIDEL et al. 1998). Bei Kühen war die Trächtigkeitsrate sowohl für
sortierte, als auch für sortierte und tiefgefrorene Spermien schlechter als die der
Kontrollgruppen (DOYLE et al. 1999). Die Trächtigkeitsraten für sortierte, nicht tiefgefrorene
und sortierte, tiefgefrorene Spermien unterschieden sich indes nicht voneinander, wobei
allerdings zu bedenken gilt, dass die Besamungsdosis für sortierte tiefgefrorene Spermien mit
1 Mio. doppelt so groß war wie die der sortierten, nicht tiefgefrorenen Vergleichsgruppe.
Auch SEIDEL et al. (1999) erzielten bei östrussynchronisierten Rindern durch Insemination
mit gesexten, tiefgefrorenen Spermien eine gegenüber der Kontrollgruppe um 70-90%
reduzierte Trächtigkeitsrate. Hierbei wurden ca. 1,0-1,5 Mio. sortierte Spermien in den
Gebärmutterkörper oder in die Gebärmutterhörner inseminiert. Die Kontrollen wurden mit
einer Spermiendosis von 20-40 Mio. konventionell in den Gebärmutterkörper besamt.
Die chirurgische Besamung mit sortierten, tiefgefrorenen und aufgetauten Eberspermien
führte nach JOHNSON et al. (2000) zur Geburt von Ferkeln. Dabei wurde der Anteil der
Spermien, die sowohl den Sortierprozess, als auch die Tiefgefrierung überstanden hatten, auf
30% geschätzt (JOHNSON 2000).

41
Auch mit gesexten tiefgefrorenen Schafbockspermien wurden Nachkommen erzeugt
(HOLLINSHEAD et al. 2001).
Ein erheblicher Vorteil für Zuchtprogramme wäre es, wenn bereits tiefgefrorenes Sperma
nach dem Auftauen sortiert werden könnte. So könnten ältere Spemaproben, die eingelagert
wurden, nachträglich einer Geschlechtsselektion unterzogen werden, was z.B. für
Genreserveprogramme sinnvoll ist. Außerdem könnte Sperma für den Transport über längere
Strecken zu einem „Sortierzentrum“ tiefgefroren werden. Dieses Vorgehen ist jedoch mit
Problemen wie der Entfernung des Eidotters sowie dem hohen Anteil an toten Spermien
behaftet und konnte noch nicht in ausreichender Weise gelöst werden (STAP et al. 1998).
Das Sexen gefrorener und aufgetauter Spermien zum sofortigen Gebrauch oder zum Wieder-
Einfrieren und späterem Gebrauch ist nach MAXWELL et al. (2004) möglich und in einigen
Versuchen beim Schaf erfolgreich verlaufen. Aus dem Transfer in vitro gereifter Embryonen,
sowohl aus gefrorenen, aufgetauten und sortierten als auch aus gefrorenen, aufgetauten,
sortierten, eingefrorenen und aufgetauten Spermien, wurden 30 Lämmer mit dem
vorherbestimmten Geschlecht geboren (O´BRIEN et al. 2004).
2.2.4.1 Tiefgefrierung flowzytometrisch sortierter Pferdespermien
Beim Pferd führen wie auch bei anderen Spezies Besamungen mit frischen sortierten
Spermien und auch mit gelagerten und sortierten Spermien zum Erfolg, sofern die
Besamungen endoskopisch durchgeführt werden. Auch sortierte und tiefgefrorene Spermien
können eingesetzt werden, aber ihr Einsatz benötigt noch weitere Untersuchungen zur
Qualitätsverbesserung (RATH u. SIEME 2003).
Im Rahmen konventioneller Methoden zur Tiefgefrierung von Hengstsperma hat sich bisher
kein bestimmtes Verdünnungsmedium als besonders gut geeignet erwiesen (SQUIRES et al.
1999). Gleiches erwartet man, wenn flowzytometrisch sortierte Hengstspermien dem
Tiefgefrierprozess unterzogen werden. Jedoch sollte auch hier das Medium, das die besten
Resultate bei der Mehrzahl der Hengste hervorbringt, identifiziert und benutzt werden
(LINDSEY et al. 2002b).

42
Zu beachten gilt, dass nicht nur in Hinblick auf die Eignung zur Kryokonservierung, sondern
auch auf die Eignung zur Sortierung ein individueller Unterschied zwischen Hengsten besteht
(LINDSEY et al. 2002b). Aufgrund dieser Variationen ist es notwendig, Hengste für die
Tiefgefrierung flowzytometrisch sortierter Spermien zu selektieren, deren Spermien sowohl
den Sortierprozess als auch die Tiefgefrierung gut überleben (LINDSEY et al. 2002b).
In Tabelle 2 ist die sich teilweise deutlich zwischen einzelnen Hengsten unterscheidende
Spermienmotilität 0,5h nach dem Auftauen dargestellt.
Tabelle 2: Individuelle Unterschiede der Anteile insgesamt beweglicher und
vorwärtsbeweglicher Spermien nach dem Auftauen bei Hengsten (mod. nach
LINDSEY et al. 2002b)
Hengst Totale Motilität (%) Vorwärtsmotilität (%)
A 41 a
B 36 a
C 36 a
D 24 b
E 23 b
F 17 c
G 13 c
a,b,c,d Werte mit verschiedenen Indizes innerhalb einer Spalte unterscheiden sich signifikant
(p

43
die Spermien zu starkem Stress ausgesetzt wurden. Diesbezügliche Versuche wurden
allerdings nicht in ausreichender Zahl reproduziert (LINDSEY et al. 2002b).
Tabelle 3: Hysteroskopische und nicht chirurgische intrauterine Besamung mit gesexten
und ungesexten Spermien bei Verwendung verschiedener Konzentrationen von
frischen und gelagerten gesexten Spermien sowie tiefgefrorenen/aufgetauten
Spermien (mod. nach BUCHANAN et al. 2000; LINDSEY et al. 2001, 2002a, b,
c, 2005)
Besamungstechnik
Hysteroskopische
Besamung
tief intrauterine
Besamungs-
Dosis
(x 10 6 )
Spermienart
Anzahl
Stuten /
Gruppe
Trächtig-
keiten
(%)
5 gesext / TG 15 13
5 18h gelagert / gesext 20 25
20 frisch / gesext 20 30
0,5 frisch / gesext 15 33
5 frisch / gesext 15 37,5
5 Ungesext / TG 16 37,5
5 frisch / ungesext 10 40
20 18h gelagert / gesext
(5°C)
12 55
20 18h gelagert / gesext
(15°C)
18 72
5 frisch / gesext 10 0
Besamung 25 18h gelagert / gesext
(5°C)
2.2.4.1.1 Variabilität zwischen Hengsten
22 38
Die Spermien der meisten Spezies werden ohne Probleme mit einer Reinheit von ca. 95%
sortiert (JOHNSON 1992; RATH et al. 1999). Innerhalb einer Art zeigen sich jedoch

44
Unterschiede in der Sortierbarkeit von Spermien, die so weit führen können, dass die
Spermien einzelner Individuen als nicht sortierbar erscheinen (JOHNSON 1997).
PICKETT und AMANN (1993) vermuteten, dass nur 25-30% aller Hengste Sperma
produzieren, das sich gut einfrieren lässt, während der Rest entweder mäßig oder sogar
schlecht einzufrierendes Sperma produziert. Ähnliche Ergebnisse erhielten auch LINDSEY et
al. (2002b) in ihren Versuchen mit flowzytometrisch sortierten und tiefgefrorenen
Hengstspermien. Dabei erwies sich die Spermienmotilität nach dem Auftauen als noch
niedriger als bei unsortierten Hengstspermien. Legt man eine Mindestanforderung von >30%
Motilität nach dem Auftauen zugrunde, hätten in der Studie von LINDSEY et al. (2002b) nur
3 von 7 Hengsten, also 43% der Hengste, diese erfüllt.
2.3 Schlussfolgerungen aus dem derzeitigen Wissensstand zu flowzytometrisch
sortierten Hengstspermien
Die Tiefgefrierung von Hengstspermien geht nach wie vor mit einer z.T. erheblichen
Beeinträchtigung des Befruchtungsvermögens einher. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, ist
es daher erforderlich, den Einfrierprozess schonend durchzuführen. Die Problematik des
Einfrierens flowzytometrisch sortierter Spermien stellt diesbezüglich eine neue
Herausforderung dar. Die geringe Anzahl sortierter Spermien und deren Vorbelastungen
durch den Sortiervorgang sind dabei von besonderer Relevanz. Beim Pferd liegen zur Zeit
noch wenige Erfahrungen auf dem Gebiet der Kryokonservierung gesexter Spermien vor.
Auch Besamungen mit gesexten, tiefgefrorenen und aufgetauten Spermien wurden noch nicht
in ausreichender Zahl durchgeführt. In der Literatur wird bislang nur über 15 mit gesextem
TG-Sperma besamte Stuten und eine daraus resultierende Trächtigkeitsrate von 13% berichtet
(LINDSEY et al. 2002b).
Ziel dieser Arbeit war es, die Tiefgefrierung sortierter Hengstspermien durch Vergleich
verschiedener Tiefgefriersysteme, Glyzerinkonzentrationen und Verdünner zu verbessern.
Dabei erfolgte die Überprüfung der Methodik durch spermatologische Tests, während die
Fertilität zur Zeit durch Besamungen an der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität
Sydney kontrolliert wird.

3 Material und Methoden
3.1 Ejakulatgewinnung
45
Ejakulate zweier Landbeschäler des Niedersächsischen Landgestüts in Celle im Alter von 19
und 12 Jahren 1 mit bekannter Fertilität wurden zwei- bis dreimal wöchentlich morgens in der
Zeit zwischen 6.30 Uhr und 8.30 Uhr im Rahmen des routinemäßigen Betriebes in der
Hengstprüfungsanstalt in Adelheidsdorf gewonnen. Die Entnahme erfolgte an einem Phantom
(Modell „Celle“, KLUG 1993) mittels einer künstlichen Scheide (Modell „Hannover“, KLUG
1993) in Anwesenheit einer rossigen Stute. In die künstliche Scheide wurde
Einmalschlauchfolie (Fa. Minitüb, Tiefenbach) eingezogen. Als Auffanggefäße dienten
sterile, skalierte Glasflaschen, die mit einem Gazefilter (Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen
waren, um grobe Verunreinigungen und die schleimige Fraktion vom Rest des Ejakulates
abzutrennen.
3.2 Samenuntersuchung
Jedes Ejakulat wurde sofort nach der Entnahme routinemäßig auf Farbe (grau, weiß, gelb),
Konsistenz (wässrig, molkig, milchig, rahmig), Volumen (ml), Dichte (Spermien/ml) und
Anteil beweglicher Spermien (%) untersucht. Zur Dichtebestimmung diente ein Photometer
(SpermaCue®, Fa. Minitüb, Tiefenbach). Die Schätzung der Motilität des Nativsamens
erfolgte in einem Phasenkontrastmikroskop (BX 60, Fa. Olympus, Hamburg) auf einem 38°C
warmen Objekttisch (HAT 400, Fa. Minitüb, Tiefenbach).
Für alle folgenden Versuche fand nur solches Sperma Verwendung, welches die bestehenden
Mindestanforderungen an Ejakulate nach den Richtwerten des Instituts für
Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule in Hannover (s. Tab. 4) hinsichtlich der
Konsistenz und Vorwärtsbeweglichkeit erfüllte.
1 im Jahr 2003: Hengst 1 geb. 1984, Hengst 2 geb. 1991

46
Tabelle 4: Mindestanforderungen an Hengstsperma (mod. nach Richtlinien des Instituts für
Konsistenz
Reproduktionsmedizin, Tierärztliche Hochschule Hannover)
Volumen
[ml]
Dichte
[Mio./ml]
Anteil vorwärtsbeweglicher
Spermien [%]
molkeähnlich 40 30 50
Die weitergehende Behandlung des Spermas ist den einzelnen Versuchsbeschreibungen sowie
den entsprechenden Färbeprotokollen zu entnehmen (Abschnitte 3.3 bis 3.6).
3.3 Beurteilungsmethoden
3.3.1 Spermienmotilität
Die Beurteilung der Spermienmotilität erfolgte unmittelbar nach der Ejakulatgewinnung und
vor dem Einfrieren bei 5°C zur Überprüfung der einzelnen Behandlungsschritte sowie nach
dem Auftauen in den jeweiligen Medien.
Bei Versuchen mit gesexten Spermien erfolgte zusätzlich eine Motilitätsschätzung
unmittelbar vor dem Sortierprozess an der gefärbten Probe sowie zu Beginn der
Anpassungsphase auf 5°C.
Nach dem Auftauen wurde die Motilität in folgenden Zeitabständen geschätzt: direkt nach
dem Auftauen (0 min.), nach 10 min., nach 10 min. und einer Zugabe von Koffein (10 min. +
Coff) und danach jeweils im Abstand von einer halben Stunde bis zu 2,5 Stunden lang (30,
60, 90, 120 und 150 min.) jeweils ohne Koffeinzugabe. Die aufgetauten
Spermiensuspensionen wurden dabei in vorgewärmten 1,5 ml-Reaktionsgefäßen (Fa.
Eppendorf, Hamburg) während des Thermobelastungstests in einem auf 38°C beheizten
Aluminiumblock gelagert. Die Bestimmung der Motilität erfolgte in einem
Phasenkontrastmikroskop (BX 60, Fa. Olympus, Hamburg) als subjektive Schätzung, die stets
von derselben Person durchgeführt wurde.
Es wurde, außer bei der Schätzung mit Koffein, ein 10µl großer Tropfen der jeweiligen
Spermiensuspension auf einen vorgewärmten Objektträger pipettiert, mit einem

47
vorgewärmten Deckglas abgedeckt und der Anteil vorwärts-, orts- und unbeweglicher
Spermien Motilität auf einem 38°C warmen Objekttisch geschätzt. Bei der Schätzung nach 10
min. mit Koffein wurden 5µl einer 2mM Koffein-Lösung auf den Objektträger gegeben,
diesem Tropfen 5µl Spermiensuspension zugegeben und die Motilität geschätzt.
Da die unterschiedlichen Eigelbkonzentrationen in den beiden Verdünnern (s. Kapitel 3.5.4)
zum Teil einen genauen Vergleich erschwerten, wurde zur Überprüfung der Ergebnisse
zeitgleich eine Schätzung der Spermienmotilitäten mit Hoechst 33342 gefärbter Spermien
unter einem Fluoreszenzmikroskop (BX 60, mit Filtereinsatz U-URBC, F 06398, Fa.
Olympus, Hamburg) durchgeführt. Das Ergebnis dieser zweiten Schätzung floss direkt in die
erste Schätzung ein, so dass als Endergebnis nur ein Wert erhoben wurde.
3.3.2 Akrosomintegrität der Spermien
Die Färbung zur Darstellung der Akrosomintegrität, soweit sie in Zusammenhang mit
Kapazitation und Akrosomreaktion steht, wurde mit Fluoreszeinisothiocyanat-Peanut-
Agglutinin (FITC-PNA) vorgenommen. Dieses Lektin der Arachis hypogaea, das mit
Fluoreszein konjugiert ist, zeigt eine besondere Affinität zu -Galaktose-Resten und markiert
die äußere akrosomale Membran.
Vom verdünnten Ejakulat und von jeder aufgetauten Probe wurde ein 10µl großer Tropfen auf
einen Objektträger pipettiert, nach Art der Blutausstrichtechnik ausgestrichen und
luftgetrocknet. 20µl einer PNA-Färbelösung (s. Anhang) wurden in der Größe von ca. 2 cm 2
auf dem Ausstrich gleichmäßig verteilt und der Objektträger mindestens 20 min. waagerecht
in einer dunklen, feuchten Umgebung luftgetrocknet. Anschließend wurde der Objektträger
zweimal in ein 50ml PBS enthaltendes Gefäß gedippt und zum Trocknen senkrecht in eine
dunkle, feuchte Umgebung gestellt. Nach weiteren 40 min. wurde ein Tropfen UCD
Mounting Medium (s. Anhang) zur Verstärkung der Fluoreszenz auf die gefärbte Fläche des
Objektträgers gegeben, ein Deckgläschen fest angepresst und unverzüglich unter Verwendung
eines Fluoreszenzfilters mit einer Wellenlänge von 450-490 nm bei 1000-facher
Vergrößerung und Ölimmersion im Fluoreszenzmikroskop (BX 60, mit Filtereinsatz U-

48
URBC, F 06398, Fa. Olympus, Hamburg) 200 Spermienzellen ausgezählt. Es wurde eine
Einteilung in vier Klassen vorgenommen (Abb. 2):
I II III IV
Abbildung 2: Schematische Darstellung des akrosomalen Status der FITC-PNA-Färbung
I: grüne Fluoreszenz über gesamte Kopfkappe
II: unterbrochen grüne Fluoreszenz
III: Reste von Fluoreszenz in der Äquatorialgegend
IV: keine Fluoreszenz
Spermien, die den Klassen 1 und 2 zugerechnet wurden, werden als akrosomintakt angesehen,
Spermien der Klassen 3 und 4 wurden der Gruppe „akrosomreagiert“ zugeordnet. Der Anteil
akrosomintakter Zellen wurde prozentual ausgewertet.
3.3.3 Morphologisch abweichende Spermienformen
Die Spermienmorphologie wurde im Eosin-Nigrosin-Ausstrich beurteilt. Dazu wurde von
jeder aufgetauten Probe ein 10µl großer Tropfen auf einen Objektträger pipettiert. In diesen
Tropfen wurden 10µl Eosin-Nigrosin-Färbelösung (s. Anhang) gegeben, ein Ausstrich nach
Art der Blutausstrichtechnik angefertigt und der Objektträger luftgetrocknet. Bis zur
Auswertung verblieben die Ausstriche unter Lichtausschluss im Kühlschrank bei 4°C.
Die gefärbten Ausstriche wurden mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (1000-fache
Vergrößerung und Ölimmersion) ausgewertet. Dabei wurden jeweils 200 Samenzellen
ausgezählt und nach folgendem Schema der Tabelle 5 prozentual ausgewertet:

49
Tabelle 5: Auswertungsschema zur Erfassung der morphologischen Spermien-
veränderungen (nach BARTH u. OKO 1989)
Veränderungen Genauere Differenzierung
Normal keine Veränderungen erkennbar
Kopfveränderungen
- abgelöster Kopf
Kopf vom Hals gelöst
- andere Kopfveränderungen Sichtbare Kopfkappenveränderungen, z. B.
Hals- und
Verbindungsstückveränderungen
deformiert, zu klein oder zu groß
gebrochen, paraxialer Schwanzansatz, retroaxialer
Schwanzansatz, doppelt, fibrillär, axial,
deformiert
Proximaler Plasmatropfen Persistierender Plasmatropfen an Hals- oder
Verbindungsstück
Distaler Plasmatropfen Persistierender Plasmatropfen an Haupt- oder
Endstück
DMR (distal mid piece reflexes) Schleifenform
Haupt- und Endstückveränderungen Aufgerollt, abgeknickt, rudimentär
Die Auflistung der Veränderungen erfolgt hierarchisch, so dass Spermien unter diejenige
Kategorie fielen, die von oben nach unten als erste auf sie zutraf.
3.4 Flowzytometrische Sortierung
Nach der routinemäßigen Samenuntersuchung (Kapitel 3.2) wurde das Ejakulat im Verhältnis
1:1 mit auf 34°C vorgewärmtem KMT (Kenney + Modified Tyrode`s, KENNEY et al. 1975,
s. Anhang) verdünnt und bei ca. 650*g 10 min. zentrifugiert.
Nach der Dekantierung und Resuspension des spermienreichen Retentats mit KMT folgte
eine Dichtebestimmung im Hämozytometer (Thoma neu®, Fa. Hecht, Sontheim). Die
Probendichte wurde auf 111 Mio. Spermien/ml eingestellt.

50
Jeweils 1,8 ml dieser Spermiensuspension wurden in 2ml-Reaktionsgefäße (Fa. Eppendorf,
Hamburg) pipettiert. Mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 (bisBenzimid, 5mg/ml, Fa.
Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde eine Reihe verschiedener Verdünnungskonzentrationen
nach dem in Tabelle 6 ersichtlichen Schema angelegt und mit KMT auf ein Volumen von
2 ml aufgefüllt. Dieses war notwendig, um trotz Schwankungen zwischen verschiedenen
Ejakulaten eine am jeweiligen Arbeitstag geeignete Konzentration an Fluoreszenzfarbstoff für
den Sortierprozess zu erhalten.
Tabelle 6: Anlegen einer Reihe von Konzentrationen mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Hoechst 33342
Spermiensuspension
[ml]
Hoechst 33342 (5mg/ml)
[µl]
KMT
[µl]
1,8 5 195
1,8 10 190
1,8 15 185
1,8 20 180
1,8 25 175
1,8 30 170
Jeder Ansatz wurde in zweifacher Ausführung angelegt. Die gefärbten Proben wurden in
einem Inkubationsgefäß (Steuergerät HF 50, Fa. Minitüb, Tiefenbach) gelagert und während
des Transportes vom Labor der Hengstprüfungsanstalt in Adelheidsdorf zum Labor des
Instituts für Tierzucht in Mariensee für 90 min. bei 34°C inkubiert.
Zur flowzytometrischen Sortierung wurde nach der Inkubation jeweils eine Probe jeder
Farbstoffkonzentration durch einen Filter der Porenweite von 20 µm (BD Falcon TM , Becton
Dickinson Labware, MA, USA) filtriert und mit 667µl KMT auf eine Endkonzentration von
75 Mio. Spermien/ml gebracht. Kurz vor dem Sortiervorgang wurden dem Probenröhrchen
2 µl des Lebensmittelfarbstoffes FD&C#40 (Fa. Warner Jenkinson Company Inc., St. Louis,
MO, USA) aus einer Stocklösung mit 25mg/ml hinzugegeben. Hierdurch wird das
Fluoreszenzsignal bei membranveränderten Spermien reduziert und derartige Spermien vom

51
Sortierprozess ausgeschlossen (s. Abb. 1). Eine Einwirkdauer von weniger als einer Minute
war dabei ausreichend.
Die benötigte Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs Hoechst 33342 in den zu sortierenden
Proben schwankte von Tag zu Tag und lag an den meisten Tagen zwischen 15µl und 25µl.
Um eine ausreichende Anzahl Probenmaterial zur flowzytometrischen Sortierung
bereitzustellen, wurden, sobald die für den jeweiligen Tag benötigte Konzentration ermittelt
war, mehrfache Ansätze dieser Konzentration angelegt und wie oben beschrieben inkubiert.
Die Sortierung der gefärbten Samenzellen erfolgte nach der „Beltsville Sperm Sexing
Technology“ nach JOHNSON et al. (1999) mit einem „high speed cell sorter“ (Moflo
DakoCytomation, Fort Collins, CO, USA), welcher mit einem 5W Argon UV-Laser bei
200mW betrieben wurde. Der Anregungswellenbereich lag zwischen 351-364 nm. Als
Hüllstrom diente Stallions Sheath Fluid (s. Anhang) mit einem pH-Wert von 7,2. Es wurde
bei einem Arbeitsdruck von 3,6 bar sortiert. Während der Durchführung der Versuche konnte
eine durchschnittliche Sortierrate von 3500-4500 Zellen pro Sekunde erzielt werden.
Als Auffanggefäße dienten 10ml-Zentrifugenröhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht), die mit
0,5 ml Auffangmedium gefüllt waren. Das Auffangmedium bestand aus dem Überstand einer
bei 850*g für 10 min. zentrifugierten 2%igen TEST-Eidotter-Lösung (s. Anhang), welche
nach der Überprüfung des pH-Wertes von 7,4 und bis um Einsatz am Versuchstag bei –20°C
gelagert wurde. Nach dem Auftauen wurde das Auffangmedium durch einen Filter mit einer
Porengröße von 20 µm (BD Falcon TM , Becton Dickinson Labware, MA, USA) gegeben.
3.5 Tiefgefrierversuche mit flowzytometrisch sortierten Spermien
3.5.1 Spermaaufbereitung
Die einzelnen Samenproben enthielten nach der flowzytometrischen Sortierung jeweils 8
Mio. Spermien. Zur Konzentrierung und Abtrennung des Trägermediums wurden sie direkt
nach dem Sortiervorgang für 15 min. bei ca. 700*g zentrifugiert. Der Überstand wurde
entfernt und das verbliebene Pellet von ca. 15 µl mit 75 µl Verdünner ohne Glyzerin
resuspendiert. Die zur Verfügung stehenden Medien waren sowohl ein modifizierter

52
Magermilchverdünner (INRA82, IJAZ u. DUCHARME 1995), dem 2% klarifizierter Eidotter
zugesetzt war, als auch ein 20% Eidotter enthaltender Lactose-EDTA-Verdünner (MARTIN
et al. 1979).
Nach Zugabe des Verdünners wurde die Spermiensuspension entsprechend der im
nachfolgenden Abschnitt (3.5.2) beschriebenen Methode auf 5°C heruntergekühlt. Im
Anschluss daran wurden die Gefäße ihrem Wassermantel entnommen und jedem 70 µl des
jeweiligen Verdünners inkl. der aus Tabelle 7 ersichtlichen Glyzerinkonzentration zugefügt.
So entstand eine Spermienendkonzentration von 40 Mio. Spermien/ml.
Tabelle 7: Glyzerinkonzentrationen bei Zugabe von 70µl Verdünner
Verdünner Zugabe Glyzerin (%) Endkonz. Glyzerin (%)
INRA 82 + 2% Eidotter 5,7 2,5
INRA 82 + 2% Eidotter 11,4 5,0
Lactose-EDTA (20% Eidotter) 9,143 4,0
Exkurs 1: Berechnung der zuzufügenden Glyzerinkonzentrationen
Verschiedene Messungen ergaben, dass nach Abzug von Luft und der Menge an
Flüssigkeit, die im PVP-Verschlussstopfen des 0,25ml-Kunststoffröhrchens
(System Minitüb, Tiefenbach) verloren geht, ein effektives Endvolumen von
160 µl im Gefäß verbleibt. Darin enthalten sind 75 µl Verdünner, sowie ca. 15 µl
für das bei der Zentrifugation entstandene Pellet. Um ein Gesamtvolumen von
160 µl zu erreichen, sind somit 70 µl hinzugegeben.
Um eine Glyzerinendkonzentration von 2,5% zu erreichen, müssen in den 70 µl
Verdünner 5,7% Glyzerin enthalten sein, für eine Endkonzentration von 5%
entsprechend 11,4%. Eine entsprechende Menge der jeweiligen konzentrierten
Lösungen wurde vor der Anwendung im Kühlraum auf eine Temperatur von 5°C
gebracht.

Exkurs 2: Berechnung der Spermienendkonzentration in einer Paillette
53
In jedem Auffanggefäß müssten beim Abfüllen der Pailletten in 160 µl
Spermiensuspension 8 Mio. Spermien enthalten sein, die im Flowzytometer
während des Sortiervorgangs abgezählt wurden. Jedoch muss wegen der sich dem
Sortiervorgang anschließenden Zentrifugation ein Zellverlust von 20% abgezogen
werden. Es sind also pro Paillette 0,8 x 8 Mio. = 6,4 Mio. Spermien vorhanden.
Die Spermienendkonzentration berechnet sich demnach wie folgt:
1 ml : 0,160 = 6,25 x 6,4 Mio. = 40 Mio. Spermien/ml.
Das Abfüllen erfolgte manuell in gekennzeichneten 0,25ml-Kunststoffpailletten (French Type
Straws, Fa. Minitüb, Tiefenbach). Dabei wurde zuerst eine vorbereitete und gekühlte Menge
von ca. 50 µl des jeweils mit 2,5%, 5% (INRA82) oder 4% (Lactose-EDTA) Glyzerin
angesetzten Verdünners ohne Spermien in die Paillette aufgezogen. Dieses diente der
Verhinderung von Zellverlusten, da die Menge an Spermiensuspension, die in den am Ende
der Paillette vorhandenen Verschlussstopfen gesogen wird, unwiederbringlich beim
Aufschneiden der Pailletten nach dem Auftauen verloren geht. Anschließend folgten das
Abfüllen der Spermiensuspension und das Verschließen mit Hilfe von metallischen
Verschlusskugeln (Sealing Balls for straws, Fa. Minitüb, Tiefenbach). Um
Temperatursprünge zu vermeiden, fanden diese Vorgänge im Kühlraum bei einer Temperatur
von 5°C statt.
Die Pailletten wurden in zwei unterschiedlichen Systemen, einer mit flüssigem Stickstoff
gefüllten Styroporbox und einem automatischen Gefrierautomaten (Minidigicool , Fa. IMV,
L´Aigle, Frankreich), wie es in Abschnitt 3.5.3 beschrieben wird, kryokonserviert und
anschließend in flüssigem Stickstoff bei -196°C gelagert.
Zu jeder tiefgefrorenen Probe sortierter Spermien wurde eine Kontrollprobe mit unsortiertem
Sperma angefertigt. Dieses wurde in gleicher Weise behandelt wie die sortierten Spermien.
Lediglich die Inkubation, die Sortierung sowie der zweite Zentrifugationsvorgang vor der
Kühlung, Abfüllung und Tiefgefrierung unterblieben.

54
Das Auftauen aller Pailletten erfolgte bei 37°C im Wasserbad für 30 Sekunden. Die Pailletten
wurden trocken gewischt und jeweils in ein leeres, im Aluminiumblock bei 38°C
vorgewärmtes Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf, Hamburg) entleert. Es folgten die unter 3.3
erläuterten Beurteilungen.
Eine Reanalyse für die Proben der Tiefgefrierversuche wurde nicht durchgeführt, da im
Gegensatz zum reinen Sortiervorgang die Sortiergenauigkeit im Rahmen dieser
Versuchsreihen nicht von Bedeutung war. Die Proben wurden nach dem Auftauen und den
spermatologischen Untersuchungen vernichtet. Eine Besamung mit den für die
Tiefgefrierversuche erstellten Proben fand nicht statt.
3.5.2 Kühlung
Zur Kühlung wurden die Auffanggefäße mit der Spermiensuspension sofort in 100ml-
Plastikflaschen gestellt, die mit 95 ml ca. 21°C (Raumtemperatur) warmem Leitungswasser
gefüllt waren. In diesem Wassermantel wurden sie anschließend in einen Kühlraum mit einer
Temperatur von ungefähr 5°C verbracht. Der Wassermantel diente dabei sowohl der
Verminderung von Temperaturschwankungen innerhalb der Spermiensuspension als auch der
moderaten Abkühlung derselben.
Der Temperaturverlauf in einem Verdünner und Spermien enthaltenden 10ml-Gefäß wurde
stichprobenartig für beide Verdünner durch einen Messfühler aufgezeichnet. Dabei ergaben
sich die in Abbildung 3 dargestellten Temperaturkurven:

Temperatur in Grad Celsius
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
55
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
Zeit in Minuten
Lactose-EDTA INRA82
Abbildung 3:Temperaturverlauf bei Kühlung in einem 95ml-Wassermantel von
Raumtemperatur auf 5°C in 2,5 h.
3.5.3 Versuchsreihe 1:
Vergleich zweier Tiefgefriersysteme (Styroporbox und automatischer
Tiefgefrier-Apparat)
Die Tiefgefrierung erfolgte in zwei unterschiedlichen Systemen, d.h. mit einer Styroporbox
oder einem automatischen Gefrierapparat. Bei Anwendung des Systems „Box“ wurde eine
Styroporbox mit den Maßen 68cm x 73cm x 49cm ca. 5 cm hoch mit flüssigem Stickstoff
gefüllt und der Deckel für einige Minuten geschlossen, um im Inneren der Box eine
weitestgehend gleichmäßige Verteilung des Stickstoffdampfes und damit eine gleichmäßige
Temperatur sicherzustellen. Anschließend wurden die Pailletten auf Einfrierrampen innerhalb
der Box 4,5 cm über dem Stickstoffspiegel gelagert und die Box für mindestens 7 Minuten

56
wieder verschlossen. Danach wurden die Pailletten in den flüssigen Stickstoff (-196°C)
getaucht und zur Lagerung in entsprechende Container überführt.
Zur Tiefgefrierung im automatischen Gefrierautomaten (Minidigicool®, Fa. IMV, L´Aigle,
Frankreich) wurden die gekühlten und in Pailletten abgefüllten Spermien in das ca. 60
Minuten entfernt gelegene Labor des Niedersächsischen Landgestüts Celle in der
Hengstprüfungsanstalt Adelheidsdorf verbracht, da die dazu notwendige Ausrüstung nur dort
vorhanden war. Während des Transports befanden sich die Pailletten für den Zeitraum von
etwa einer Stunde in einer mit dem 12V-Zigarettenanzünder des Autos verbundenen Kühlbox
(Frigobox, Fa. Waeco, Emsdetten) bei einer konstanten Temperatur von ca. 5°C. Nach
Ankunft im Labor wurden sie noch ca. eine halbe Stunde in der Kühlbox belassen, bis die
Metallbox des automatischen Gefrierautomaten auf 5°C gekühlt war. Erst dann wurden sie
auf Einfrierrampen umgelagert und nach der von KLUG und SIEME (2003) beschriebenen
Methode mit einer Geschwindigkeit von -60 °C pro Minute bis -160°C kryokonserviert. Nach
weiteren 10 min. wurden die gefrorenen Pailletten in flüssigen Stickstoff (-196°C) überführt
und zum Rücktransport nach Mariensee und zur Lagerung in entsprechende Container
umgelagert.
3.5.4 Versuchsreihe 2:
Vergleich von zwei Tiefgefrierverdünnern
Es wurden zwei unterschiedliche Verdünner getestet, die standardmäßig bei der
Kryokonservierung von Hengstspermien Anwendung finden.
Beim ersten handelt es sich um einen modifizierten Magermilchverdünner (INRA 82, IJAZ u.
DUCHARME 1995), der mit 2% klarifiziertem Eidotter und 2,5% Glyzerin als
Tiefgefrierverdünner zum Einsatz kommt. Er wird in Versuchsreihe 3 (Abschnitt 3.5.5) zu
Vergleichszwecken modifiziert auch mit 5% Glyzerin angewendet. Der zweite Verdünner ist
ein Lactose-EDTA-Verdünner (MARTIN et al. 1979) mit 20% Eidotter und 4% Glyzerin. Die
Zusammensetzungen beider Verdünner sind im Anhang beschrieben.
Die sortierten und zentrifugierten Spermien wurden mit jeweils 75 µl eines Verdünners ohne
Zusatz von Glyzerin resuspendiert und zur Kühlung, wie in 3.5.2 beschrieben, in den

57
Kühlraum verbracht. Nach abgeschlossener Kühlung wurde den Spermiensuspensionen zur
Herstellung einer Endkonzentration von 40 Mio. Spermien/ml erneut 70 µl Verdünner mit der
jeweiligen Glyzerinkonzentration, wie in 3.5.1 beschrieben, zugegeben.
3.5.5 Versuchsreihe 3:
Vergleich von zwei Glyzerinkonzentrationen in einem Verdünner
Glyzerin wurde erst nach Abschluss des Kühlvorganges direkt vor dem Abfüllen und der
Kryokonservierung der Spermiensuspensionen bei einer Temperatur von 5°C zugegeben, wie
es von GIL et al. (2003) für Schafsperma empfohlen wird. Dadurch sollten Schädigungen des
Kühlgutes durch Glyzerin weitestgehend verhindert werden.
Es wurden zwei unterschiedliche Glyzerinkonzentrationen im modifizierten
Magermilchverdünner (INRA82) verglichen. Zur Anwendung kam zum einen eine
Glyzerinendkonzentration von 2,5%, wie sie in diesem Tiefgefrierverdünner routinemäßig
angewendet wird, zum anderen eine Glyzerinendkonzentration von 5%. Die genaue
Vorgehensweise ist in Abschnitt 3.5.1 sowie in Tabelle 7 beschrieben.
Der Temperaturverlauf während der Kryokonservierung wurde stichprobenartig für beide
Systeme und den jeweiligen Verdünner bzw. die jeweilige Glyzerinkonzentration mittels
eines in einer Paillette angebrachten Messfühlers aufgezeichnet.
3.6 Tiefgefrierung für die Besamungsversuche
Die Ejakulatgewinnung, Samenuntersuchung sowie die mikroskopischen und funktionellen
Untersuchungen erfolgte auch für die Besamungsversuche analog der in den Abschnitten 3.1
bis 3.3 dargestellten Vorgehensweise.

3.6.1 Spermaaufbereitung
58
Nach der routinemäßigen Samenuntersuchung wurde das Ejakulat im Verhältnis 1:1 mit auf
34°C vorgewärmtem Kenney-Verdünner (KENNEY et al. 1975) verdünnt. Diese
Spermiensuspension wurde bei 400*g für 10 min. zentrifugiert und der Überstand dekantiert.
Ein Teil des spermienreichen Retentats wurde mit dem Lactose-EDTA-Verdünner auf eine
Konzentration von 80 Mio. Spermien/ml bzw. 800 Mio. Spermien/ml gebracht. Nach der
Kühlung wie in 3.5.2 beschrieben, wurde der Spermiensuspension bei 5°C Lactose-EDTA-
Verdünner mit 8% Glyzerin im Verhältnis 1:1 zugefügt. So wurde eine
Glyzerinendkonzentration von 4% und eine Spermienendkonzentration von 40 Mio.
Spermien/ml bzw. 400 Mio. Spermien/ml eingestellt. Diese Spermiensuspensionen wurden
als Kontrollgruppen auf gleiche Art und Weise tiefgefroren und gelagert wie die
entsprechenden sortierten Spermien.
Der andere Teil des Spermienpellets wurde wie in Kapitel 3.4 beschrieben mit KMT-
Verdünner resuspendiert und auf eine Konzentration von 111 Mio. Spermien pro ml
eingestellt. Es folgte die Färbung, Inkubation und flowzytometrische Sortierung (s. Kapitel
3.4).
Für die sortierten Spermien wurden jeweils am selben Tag flowzytometrische Reanalysen
durchgeführt, um die Sortiergenauigkeit zu bestimmen. Ihre Reinheit lag im Durchschnitt bei
93% (Hengst 1: 92%, Hengst 2: 94,5%).
3.6.2 Tiefgefrierung der Proben
Die Kryokonservierung der Proben für die Besamungsversuche erfolgte in 4 Gruppen. Die
Gruppen 1 und 2 beinhalteten die Proben mit sortierten Spermien, wobei Pailletten dieser
Gruppe entweder weiblich- (Gruppe 1) oder männlich-determinierende (Gruppe 2) Spermien
enthielten. Sie wurden in einer Konzentration von 40 Mio. Spermien/ml abgefüllt und
tiefgefroren. Die Gruppen 3 und 4 enthielten Kontrollen, d.h. nicht sortierte Spermien. Dabei
wurden die Proben, die Gruppe 3 angehörten, in derselben Konzentration wie die der Gruppen

59
1 und 2 tiefgefroren (40 Mio. Spermien/ml), während die Gruppe 4 Proben die zehnfache
Konzentration enthielt (400 Mio. Spermien/ml). Vergleiche dazu auch Tabelle 8.
Tabelle 8: Kryokonservierungsgruppen für den Besamungsversuch
TG-Gruppe Nr. Art der Spermien Spermien / ml
1 sortiert / X 40
2 sortiert / Y 40
3 nicht sortiert 40
4 nicht sortiert 400
Nach der flowzytometrischen Sortierung enthielten die Proben in den Auffanggefäßen jeweils
8 Mio. Spermien und wurden direkt nach dem Sortiervorgang für 15 min. bei ca. 700*g
zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das verbliebene Pellet von ca. 15 µl mit 75 µl
des Lactose-EDTA-Verdünners ohne Glyzerin resuspendiert (vgl. Kapitel 3.5.1).
Anschließend wurde die Spermiensuspension nach der in 3.5.2 beschriebenen Methode auf
5°C heruntergekühlt. Die Gefäße wurden ihrem Wassermantel entnommen und jedem 70 µl
des Lactose-EDTA-Verdünners inkl. 9,143% Glyzerin zugefügt. So entstand eine
Spermienendkonzentration von 40 Mio. Spermien / ml und eine Glyzerinendkonzentration
von 4%.
Das Abfüllen der sortierten Spermien erfolgte manuell in gekennzeichneten 0,25ml-Pailletten
(Fa. Minitüb, Tiefenbach). Dabei wurden zunächst eine vorbereitete und gekühlte Menge von
ca. 50 µl des mit 4% Glyzerin angesetzten Verdünners ohne Spermien in die Paillette
aufgezogen, bevor die ca. 160 µl umfassende Spermiensuspension folgte. Anschließend
erfolgte das Verschließen der Pailletten mit Hilfe einer automatischen Abfülleinrichtung
(MRS-1®, Fa. IMV, L´Aigle, Frankreich), von der jedoch nur die Verschließtechnik in
Anspruch genommen wurde.
Für die Kontrollgruppen erfolgte sowohl das Abfüllen als auch das Verschließen automatisch
mit der oben genannten Abfülleinrichtung.

60
Alle Pailletten wurden in einer mit flüssigem Stickstoff gefüllten Styroporbox, wie in
Abschnitt 3.5.3 beschrieben, kryokonserviert und anschließend in flüssigem Stickstoff bei
-196°C gelagert.
Zur mikroskopischen und funktionellen Untersuchung wurde jeweils eine Paillette mit
sortierten Spermien, d.h. der Gruppe 1 oder der Gruppe 2, sowie eine Paillette jeder
Kontrollgruppe, d.h. der Gruppe 3 und der Gruppe 4, bei 37°C im Wasserbad für 30
Sekunden aufgetaut. Es folgten die in Abschnitt 3.3 erläuterten Beurteilungen.
In der Zeit von Januar bis Februar 2004 wurde insgesamt die in Tabelle 9 dargestellte Anzahl
von Proben tiefgefroren.
Tabelle 9: Anzahl produzierter Pailletten und Anzahl Besamungsportionen
TG-Gruppe Pailletten Besamungs-
Hengst 1 Hengst 2
portionen
Pailletten Besamungs-
portionen
1 33 16 31 15
2 33 16 31 15
3 94 47 133 66
4 380 23 616 38
3.7 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Computersoftware „Sigma Stat for
Windows “ (Jandel Scientific Cooperation, Erkrath). Es wurde das arithmetische Mittel (ξ)
und die Standardabweichung (SD) berechnet. Die Ergebnisse wurden auf Normalverteilung
geprüft. Bei vorliegender Normalverteilung erfolgte die Varianzanalyse mittels ANOVA. Bei
nicht vorhandener Normalverteilung wurden die Medianwerte ermittelt und die Daten durch
ANOVA on Ranks geprüft. Die Einzelwerte wurden, wenn nicht anders erwähnt, per Tukey-
Test analysiert.

61
Die Daten der Hengste wurden zunächst getrennt voneinander untersucht, anschließend alle
Werte beider Hengste zusammengefasst und untersucht. Unterschiede zwischen den Gruppen
galten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von P≤0,05 als signifikant.
Die statistische Auswertung der mit einem Messfühler aufgezeichneten Temperaturkurven
erfolgte mittels einer zweifaktoriellen Varianzanalyse (two way ANOVA), um Unterschiede
zwischen den Systemen bzw. zwischen den Verdünnern und Glyzerinkonzentrationen zu
ermitteln.
Unterschiede zwischen den in den Tiefgefrierversuchen verwendeten Systemen, Verdünnern
und Glyzerinkonzentrationen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (one way
ANOVA) geprüft. Dabei wurde auf Unterschiede zwischen Medien innerhalb der sortierten
Spermien und der Kontrollgruppen geprüft. Unterschiede zwischen sortierten und nicht
sortierten Spermien wurden jeweils nur innerhalb eines der drei Medium geprüft.
Gleichzeitig wurde durch die einfaktorielle Varianzanalyse ermittelt, zu welchem Zeitpunkt
sich die Spermienmotilitäten innerhalb einer Gruppe signifikant vom Ausgangswert bei 0
Minuten unterschieden. Hierfür wurden die Ergebnisse mit dem der Gruppe zugehörigen
Ausgangswert mittels Dunnett´s Methode oder bei nicht vorhandener Normalverteilung
entsprechend mittels Dunn´s Test verglichen.
Für die Auswertung der erhobenen Daten aus der Tiefgefrierung für die Besamungsversuche
erfolgte eine Einteilung in die Gruppen „sortierte Spermien“, „Kontrolle mit 40 Mio.
Spermien/ml“ und „Kontrolle mit 400 Mio. Spermien/ml“, die mittels einfacher
Varianzanalyse miteinander verglichen wurden.

4 Ergebnisse
4.1 Tiefgefrierversuche
62
4.1.1 Temperaturverläufe in den Systemen
Die Temperaturverläufe der zwei Tiefgefriersysteme unterschieden sich signifikant (p 0,05)
voneinander (s. Abb.4). Der Kurvenverlauf der im Gefrierautomaten gemessenen
Temperaturen war anfangs deutlich flacher, die Temperaturkurve fiel jedoch unterhalb von
-20°C deutlich steiler ab als in der Styroporbox. Die Temperatur direkt vor dem Absenken der
Pailletten in den flüssigen Stickstoff lag bei der Box (ξ=-103,4°C) signifikant über der des
Einfrierautomaten (ξ=-155,6).
Temperatur in °C
40,0
-10,0
-60,0
-110,0
-160,0
-210,0
0
Zeit in Sekunden
20*
40*
60*
80*
100*
120*
140*
160**
180
200
Box INRA82 2.5% Glycerin Maschine INRA82 2.5% Glycerin
Box INRA82 5.0% Glycerin Maschine INRA82 5.0% Glycerin
Box Lactose-EDTA Maschine Lactose-EDTA
220**
240*
260*
280*
300*
320*
340*
360*
380*
400*
420*
Abbildung 4:Temperaturverlauf in den Tiefgefriersystemen Styroporbox und automatischer
Gefrierapparat und jeweils drei unterschiedlichen Verdünnern bzw.
Glyzerinkonzentrationen
* p 0,001 zwischen den Systemen
** p 0,05 zwischen den Systemen

63
Die in den verschiedenen Verdünnern aufgezeichneten Temperaturkurven unterschieden sich
bei Nutzung ein- und desselben Tiefgefriersystems über 320 Sekunden nicht signifikant.
Allerdings kühlten die Proben 340 bis 360 Sekunden nach Beginn der Kryokonservierung im
Lactose-EDTA-Verdünner deutlich langsamer ab als im INRA82-Verdünner mit 2,5%
Glyzerin. Zwischen 340 und 400 Sekunden nach Beginn der Temperaturaufzeichnung sank
die Temperatur deutlich langsamer als im INRA82-Verdünner mit 5% Glyzerin. Nach 420
Sekunden, dem Endpunkt der Messung, gab es bei Nutzung des Einfrierautomaten keine
signifikanten Unterschiede zwischen der Temperatur der Proben in unterschiedlichen
Verdünnern. Bei den mit dem System Box eingefrorenen Proben wiesen dagegen die Proben
im Lactose-EDTA-Verdünner am Ende der Temperaturaufzeichnung eine deutlich höhere
Temperatur auf als die Proben im INRA82-Verdünner mit 5% Glyzerin (s. Abb.4).
Reboundeffekt und Gefrierplateau stellten sich innerhalb der Gruppen sehr unterschiedlich
dar. In Abbildung 5 sind typische Rebound-Kurven für beide Systeme dargestellt.
Temperatur in °C
10,0
5,0
0,0
-5,0
-10,0
-15,0
-20,0
0
4
8
12
16
20
Box Maschine
24
28
32
Zeit in Sekunden
Abbildung 5:Typische Temperaturkurven für die Tiefgefriersysteme Box und Maschine im
Bereich des Rebound-Effektes
36
40
44
48

64
4.1.2 Spermienmotilität nach dem Auftauen
Der Vergleich der Spermienmotilität ergab für Hengst 1 keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Tiefgefriersystemen, Verdünnern oder Glyzerinkonzentrationen. Zwischen im
gleichen Medium tiefgefrorenen sortierten und nicht sortierten Spermien lagen im Automaten
10 bis 30 Minuten nach dem Auftauen signifikante Unterschiede vor (p 0,05; Tab.10). In der
Box waren Unterschiede zwischen gesexten und nicht gesexten Spermien bis 60 Minuten
nach dem Auftauen zu erkennen (Tab.11).
Die Motilität war gegenüber dem Ausgangswert (0 min.) bei Hengst 1 in fast allen Gruppen
nach 60 Minuten im Thermoresistenztest signifikant reduziert (p 0,05). Bei den in der Box im
INRA82-Verdünner mit 5% Glyzerin und im Lactose-EDTA-Verdünner tiefgefrorenen
sortierten Spermien war eine signifikante Reduktion erst nach 90 Minuten vorhanden. Im
Automaten und INRA82-Verdünner tiefgefrorene sortierte Spermien zeigten einen
signifikanten Verlust der Motilität schon nach 30 Minuten im Thermoresistenztest. Auch die
in der Box eingefrorenen Kontrollgruppen im INRA82-Verdünner mit 5% Glyzerin und im
Lactose-EDTA-Verdünner wiesen schon nach 30 Minuten signifikant geringere Motilitäten
gegenüber den Ausgangswerten auf (Tab.10 u. 11).

65
Tabelle 10: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien [%] von
Automat
Hengst 1
Hengst 1 nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei Verwendung
unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
0 min 64 ± 10,7 B
10 min 63 ± 7,6 d
10 min +Koff 72 ± 2,6 b
30 min 50 ± 6,1 b
60 min 36 ± 13,4 A
90 min 23 ± 10,4 A
120 min 10 ± 12,0 A
150 min 13 ± 12,6 A
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
59 ± 8,6 B
58 ± 10,4 b
61 ± 13,9 B
58 ± 13,7 d
65 ± 4,5 68 ± 10,3 b
45 ± 10,0 d
23 ± 9,7 A
8 ± 12,2 A
5 ± 11,2 A
2 ± 2,9 A
50 ± 10,0 d
26 ± 10,2 A
17 ± 9,7 A
11 ± 8,6 A
6 ± 7,9 A
38 ± 6,1 B
32 ± 7,5 c
53 ± 6,9 C,a
26 ± 6,5 A,a
18 ± 9,0 A
15 ± 9,0 A
8 ± 7,3 A
8 ± 2,9 A
35 ± 7,1 B
31 ± 5,8 a
52 ± 5,3 C
17 ± 5,7 A,c
11 ± 8,2 A
8 ± 7,4 A
6 ± 6,1 A
2 ± 2,6 A
33 ± 4,1 B
24 ± 8,0 c
52 ± 9,8 C,a
23 ± 9,3 c
18 ± 9,7 A
12 ± 8,0 A
13 ± 9,6 A
7 ± 2,9 A
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner

66
Tabelle 11: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien [%] von
Box
Hengst 1
Hengst 1 nach Tiefgefrierung in der Styroporbox bei Verwendung
unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
0 min 68 ± 6,1 B,b
10 min 63 ± 8,2 d
10 min +Koff 73 ± 2,7 b
30 min 53 ± 6,7 d
60 min 41 ± 5,5 A,b
90 min 24 ± 14,6 A
120 min 15 ± 10,8 A
150 min 10 ± 13,3 A
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
67 ± 5,2 B,b
60 ± 15,2 d
64 ± 12,4 B
58 ± 19,4 d
34 ± 3,8 B,a
33 ± 5,2 c
63 ± 5,2 66 ± 9,7 54 ± 9,2 C,a
42 ± 8,4 A,b
25 ± 7,9 A
11 ± 16,2 A
6 ± 13,4 A
8 ± 14,4 A
43 ± 11,5 A,b
22 ± 9,7 A
21 ± 4,4 A
11 ± 8,8 A
5 ± 8,5 A
26 ± 7,7 c
18 ± 8,4 A,a
16 ± 10,7 A
14 ± 8,4 A
10 ± 7,9 A
33 ± 4,2 B,a
29 ± 3,8 c
38 ± 5,2 B
29 ± 10,2 c
48 ± 13,7 53 ± 9,8
17 ± 10,4 a
22 ± 7,6 a
8 ± 9,9 13 ± 8,0
7 ± 6,7 A
5 ± 7,5 A
3 ± 5,8 A
11 ± 7,6 A
12 ± 6,5 A
10 ± 5,0 A
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
Die statistische Auswertung der Spermienmotilität von Hengst 2 ergab keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Tiefgefriersystemen, Verdünnern oder Glyzerinkonzentrationen.
Auch Unterschiede zwischen sortierten und nicht sortierten Spermien lagen nur bis 10
Minuten nach dem Auftauen vor (Tab.12 u. 13).
Die Motilität der in der Box im INRA82-Verdünner mit 2,5% Glyzerin tiefgefrorenen
Spermien von Hengst 2 reduzierte sich im Thermoresistenztest erst nach 90 Minuten
signifikant gegenüber den Ausgangswerten (0 min.). Im Automaten eingefrorene Proben im
INRA82-Verdünner mit 5% Glyzerin und sortierte auf gleiche Art eingefrorene Spermien im
INRA82-Verdünner mit 2,5% Glyzerin zeigten einen signifikanten Verlust ihrer Motilität

67
bereits nach 30 Minuten. Alle anderen Proben hielten die Motilität bis 60 Minuten nach dem
Auftauen aufrecht (Tab.12 u. 13).
Tabelle 12: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien [%] von
Automat
Hengst 2
Hengst 2 nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei Verwendung
unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
0 min 71 ± 3,8 B,d
10 min 63 ± 5,2 b
10 min +Koff 73 ± 4,2
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
70 ± 4,5 B,d
58 ± 6,8 b
68 ± 11,3
30 min 50 ± 14,1 35 ± 27,8 A
60 min 37 ± 18,6 A
90 min 20 ± 17,9 A
120 min 19 ± 14,8 A
150 min 14 ± 12,9 A
26 ± 28,0 A
14 ± 20,8 A
13 ± 15,3 A
13 ± 12,5 A
66 ± 13,9 B,b
67 ± 11,3 d
71 ± 10,2
44 ± 12,4 B,c
41 ± 9,7 a
52 ± 6,8
55 ± 14,1 30 ± 5,0 A
34 ± 29,7 A
22 ± 25,3 A
23 ± 20,6 A
21 ± 18,2 A
25 ± 6,4 A
43 ± 12,1 B,c
35 ± 8,9 a
50 ± 15,8
26 ± 5,5 A
14 ± 9,1 A
16 ± 5,6 A 7 ± 6,0 A
13 ± 6,8 A
11 ± 9,6 A
8 ± 9,6 A
9 ± 8,1 A
45 ± 8,9 B,a
36 ± 13,6 c
53 ± 14,4
27 ± 11,0
18 ± 13,5 A
13 ± 11,6 A
11 ± 8,5 A
13 ± 11,5 A
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner

68
Tabelle 13: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien [%] von
Box
Hengst 2
Hengst 2 nach Tiefgefrierung in der Styroporbox bei Verwendung
unterschiedlicher Verdünnerr und Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
0 min 64 ± 7,4 B,b
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
65 ± 3,2 B,b
68 ± 6,1 B,b
10 min 58 ± 9,4 56 ± 13,9 57 ± 14,4 b
10 min +Koff 66 ± 9,2
59 ± 10,7
67 ± 13,7
39 ± 12,8 B,a
43 ± 12,9 B,a
43 ± 12,6 B,a
36 ± 17,2 34 ± 13,9 33 ± 6,1 a
50 ± 13,4
40 ± 14,8
49 ± 7,4
30 min 53 ± 19,6 43 ± 27,3 39 ± 18,2 32 ± 8,4 23 ± 16,2 28 ± 7,6
60 min 38 ± 23,8 24 ± 30,0 A
90 min 22 ± 26,5 A
120 min 16 ± 16,5 A
150 min 20 ± 16,2 A
18 ± 27,3 A
15 ± 17,8 A
21 ± 18,2 A
29 ± 25,8 A
19 ± 27,6 A
19 ± 21,7 A
20 ± 17,3 A
24 ± 7,1 13 ± 10,7 A
15 ± 7,7 A
14 ± 7,4 A
13 ± 12,5 A
11 ± 10,6 A
8 ± 9,9 A
22 ± 11,3 A
19 ± 11,0 A
18 ± 11,1 A
10 ± 10, A 0 13 ± 11,5 A
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
Auch bei der Gesamtbetrachtung beider Hengste ergab der Vergleich der Spermienmotilität
keine signifikanten Unterschiede zwischen den Tiefgefriersystemen, Verdünnern oder
Glyzerinkonzentrationen. Signifikante Unterschiede (p 0,05) zwischen sortierten und nicht
sortierten Spermien lagen bis 30 Minuten nach dem Auftauen vor. Diese bezogen sich nach
der Zugabe von Koffein nach 10 Minuten nur jeweils auf die Proben der Spermien im
INRA82-Verdünner mit 2,5% Glyzerin und die im Gefrierautomaten tiefgefrorenen Spermien
im Lactose-EDTA-Verdünner (Tab.14 u. 15). Im Lactose-EDTA-Verdünner bestanden auch
noch nach 30 Minuten signifikante Unterschiede (p 0,05) für im Gefrierautomaten
tiefgefrorene Spermien (Tab.14).

69
Die Motilität war gegenüber dem Ausgangswert (0 Min.) in allen Gruppen spätestens nach 60
Minuten im Thermoresistenztest signifikant reduziert (p 0,05). Die im Automaten im
INRA82-Verdünner mit 5% Glyzerin tiefgefrorenen sortierten Spermien zeigten genauso wie
die in der Box tiefgefrorenen nicht sortierten Spermien im INRA82-Verdünner mit 5%
Glyzerin und im Lactose-EDTA-Verdünner einen hohen Motilitätsverlust (p 0,05) schon 30
Minuten nach dem Auftauen (Tab.14 u. 15).
Tabelle 14: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien [%] von
Automat
Gesamt
zwei Hengsten (1 und 2) nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei
Verwendung unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
0 min 68 ± 8,4 B,d
10 min 63 ± 6,2 b
10 min +Koff 72 ± 3,3 b
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
65 ± 8,6 B,d
58 ± 8,4 b
63 ± 13,5 B,d
67 ± 8,3 70 ± 9,9 b
30 min 41 ± 14,5 25 ± 7,8 50 ± 10,3 b
60 min 26 ± 19,6 A
90 min 19 ± 19,7 A
120 min 15 ± 15,2 A
150 min 13 ± 14,7 A
18 ± 10,5 A
15 ± 10,0 A
14 ± 8,9 A
12 ± 8,2 A
41 ± 9,8 B,c
63 ± 12,7 b 36 ± 9,6 a
36 ± 15,7 A
21 ± 14,3 A
14 ± 13,3 A
14 ± 11,4 A
52 ± 6,6 C,a
53 ± 11,8
30 ± 22,3 A
20 ± 19,1 A
16 ± 15,4 A
14 ± 15 A
39 ± 10,4 B,c
33 ± 7,5 a
51 ± 11,2 C
25 ± 9,9 A
18 ± 11,3 A
13 ± 9,6 A
12 ± 8,6 A
10 ± 8,4 A
39 ± 9,0 B,c
30 ± 12,2 a
53 ± 11,8 C,a
40 ± 20,4 a
25 ± 20,8 A
11 ± 16,8 A
9 ± 13,0 A
7 ± 10,1 A
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner

70
Tabelle 15: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien [%] von
Box
Gesamt
zwei Hengsten (1 und 2) nach Tiefgefrierung in der Styroporbox bei Verwendung
unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
0 min 66 ± 6,7 B,d
10 min 60 ± 8,9 b
10 min +Koff 69 ± 7,3 b
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
66 ± 4,2 B,d
58 ± 14,1 b
30 min 53 ± 13,8 43 ± 19,0 A
60 min 39 ± 17,3 A
90 min 23 ± 21,0 A
120 min 15 ± 12,7 A
150 min 15 ± 14,3 A
66 ± 9,5 B,d
57 ± 16,3 b
37 ± 9,4 B,c
35 ± 12,1 a
61 ± 8,3 66 ± 11,3 52 ± 11,2 C,a
24 ± 21,8 A
15 ±22,1 A
10 ± 15,2 A
15 ± 16,3 A
28 ± 5,9 A
21 ± 8,2 A
15 ± 6,9 A
11 ± 7,1 A
10 ± 6,6 A
38 ± 10,6 B,c
32 ± 10,1 a
40 ± 9,4 B,c
31 ± 8,2 a
44 ± 14,3 51 ± 8,6 C
29 ± 8,3 20 ± 13,2 22 ± 7,1 A
21 ± 8,0 A
16 ± 8,7 A
14 ± 7,5 A
11 ± 9,5 A
11 ± 10,1 A
9 ± 8,8 A
6 ± 8,3 A
7 ± 8,2 A
13 ± 8,4 A
7 ± 6,4
7 ± 7,3 A
6 ± 6,7 A
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
4.1.3 Akrosomintegrität im aufgetauten Sperma
Die statistische Analyse der Akrosomintegrität zeigte weder für die einzelne Betrachtung
noch für die Gesamtbetrachtung beider Hengste signifikante Unterschiede zwischen den
Versuchsgruppen (Tab.16, 17 u. 18).

71
Tabelle 16: Anteil intakter Akrosome [%] bei aufgetauten Spermien von Hengst 1 nach
Hengst 1
Tiefgefrierung mit zwei unterschiedlichen Systemen, Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5% Glyzerin
INRA82
5,0% Glyzerin
Lactose-EDTA
Maschine Box Maschine Box Maschine Box
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Kontrolle 92 ± 3,8 96 ± 2,7 94 ± 3,0 95 ± 1,8 90 ± 6,2 93 ± 4,0
Sortiert 90 ± 2,3 92 ± 5,2 91 ± 5,5 93 ± 3,4 93 ± 3,9 93 ± 2,2
Tabelle 17: Anteil intakter Akrosome [%] bei aufgetauten Spermien von Hengst 2 nach
Hengst 2
Tiefgefrierung mit zwei unterschiedlichen Systemen, Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5% Glyzerin
INRA82
5,0% Glyzerin
Lactose-EDTA
Maschine Box Maschine Box Maschine Box
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Kontrolle 93 ± 3,9 95 ± 2,1 93 ± 4,4 95 ± 1,0 89 ± 4,5 95 ± 3,7
Sortiert 93 ± 3,3 92 ± 2,8 89 ± 5,9 92 ± 2,8 93 ± 34,2 92 ± 5,4
Tabelle 18: Anteil intakter Akrosome [%] bei aufgetauten Spermien von zwei Hengsten (1
Gesamt
und 2) nach Tiefgefrierung mit zwei unterschiedlichen Systemen, Verdünnern
und Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5% Glyzerin
INRA82
5,0% Glyzerin
Lactose-EDTA
Maschine Box Maschine Box Maschine Box
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Kontrolle 93 ± 3,7 95 ± 2,4 93 ± 3,6 95 ± 1,4 90 ± 5,2 94 ± 3,8
Sortiert 91 ± 3,3 92 ± 4,0 90 ± 5,5 93 ± 3,0 93 ± 3,9 92 ± 4,0

4.1.4 Morphologisch abweichende Spermienformen nach dem Auftauen
72
Die morphologische Integrität unterschied sich weder zwischen Tiefgefriersystemen,
Verdünnern oder Glyzerinkonzentrationen noch zwischen sortierten und nicht sortierten
Spermien signifikant (Tab.19 u. 20).
Tabelle 19: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter aufgetauter
Automat
Hengst 1
Spermien [%] von Hengst 1 nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei
Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Normal 49,2 ± 10,0 56,7 ± 9,4 44,7 ± 13,9 60,0 ± 7,8 63,2 ± 7,6 47,3 ± 8,5
Abgelöster Kopf 1,0 ± 0,9 1,0 ± 1,1 0,7 ± 1,2 1,2 ± 1,0 0,7 ± 0,8 0,5 ± 0,5
andere Kopfveränderungen
Hals- und
Verbindungsstückveränderungen
Proximaler
Plasmatropfen
Distaler
Plasmatropfen
0,2 ± 0,4 1,2 ± 1,6 0,5 ± 0,5 0,5 ± 0,5 0,2 ± 0,4 0,8 ± 0,8
8,8 ± 4,6 7,5 ± 2,6 8,0 ± 4,5 9,0 ± 3,3 6,0 ± 4,5 9,7 ± 3,9
2,5 ± 1,5 5,0 ± 1,7 3,8 ± 2,3 3,0 ± 1,8 3,2 ± 1,2 3,5 ± 2,1
0,3 ± 0,5 0,8 ± 0,8 1,2 ± 1,2 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,8 0,3 ± 0,5
DMR 2,3 ± 2,6 2,7 ± 2,7 1,3 ± 2,3 2,5 ± 2,1 2,3 ± 1,6 2,0 ± 2,4
Haupt- und
Endstückveränderungen
35,7 ± 10,1 25,2 ± 7,8 39,8 ± 13,8 23,8 ± 6,8 24,0 ± 5,9 35,8 ± 10,4

73
Tabelle 20: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter aufgetauter
Box
Hengst 1
Spermien [%] von Hengst 1 nach Tiefgefrierung in der Styroporbox bei
Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Normal 55,2 ± 12,6 47,3 ± 8,9 49,8 ± 11,3 63,7 ± 6,7 59,7 ± 7,2 50,7 ± 9,1
Abgelöster Kopf 1,3 ± 1,4 2,5 ± 1,9 0,8 ± 0,8 1,0 ± 0,6 1,2 ± 1.2 0,8 ± 1,2
andere Kopfveränderungen
Hals- und
Verbindungsstückveränderungen
Proximaler
Plasmatropfen
Distaler
Plasmatropfen
0,3 ± 0,8 1,2 ± 1,2 0,5 ± 0,8 0,5 ± 0,8 0,5 ± 0,8 0,3 ± 0,5
9,5 ± 5,8 10,8 ± 4,0 9,3 ± 4,5 8,3 ± 3,1 9,0 ± 5,0 8,8 ± 3,3
3,0 ± 1,8 2,8 ± 1,8 3,8 ± 1,2 1,5 ± 0,8 2,3 ± 1,8 3,0 ± 2,3
1,0 ± 0,9 0,3 ± 0,5 1,2 ± 0,8 0,2 ± 0,4 0,3 ± 0,5 1,0 ± 1,5
DMR 2,2 ± 1,7 3,0 ± 3,1 2,5 ± 3,6 3,0 ± 2,6 3,2 ± 2,2 3,8 ± 3,2
Haupt- und
Endstückveränderungen
27,5 ± 10,8 32,0 ± 10,0 32,0 ± 12,7 21,8 ± 5,2 23,8 ± 8,5 31,5 ± 10,4

74
Auch bei Hengst 2 ergab die Auswertung der morphologischen Parameter keinen Unterschied
zwischen den verschiedenen Gruppen (Tab.21 u. 22).
Tabelle 21: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter aufgetauter
Automat
Hengst 2
Spermien [%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei
Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Normal 32,7 ± 4,8 37,0 ± 5,4 37,5 ± 9,1 44,5 ± 9,5 46,2 ± 14,0 45,7 ± 7,7
Abgelöster Kopf 0,7 ± 1,2 0,7 ± 0,8 0,5 ± 0,8 0,3 ± 0,5 0,0 ± 0,0 0,7 ± 0,8
andere Kopfveränderungen
Hals- und
Verbindungsstückveränderungen
Proximaler
Plasmatropfen
Distaler
Plasmatropfen
1,3 ± 2,0 0,3 ± 0,5 0,8 ± 0,8 1,5 ± 1,6 0,3 ± 0,8 0,3 ± 0,5
29,0 ± 6,9 25,8 ± 6,4 24,2 ± 7,1 22,0 ± 6,3 23,7 ± 5,6 20,3 ± 10,2
4,8 ± 3,3 5,2 ± 2,3 4,8 ± 1,5 4,2 ± 1,5 3,2 ± 1,8 2,7 ± 2,1
2,0 ± 1,4 1,0 ± 1,3 1,5 ± 0,5 0,5 ± 0,8 1,0 ± 0,9 0,2 ± 0,4
DMR 7,8 ± 5,4 9,5 ± 4,8 5,3 ± 6,9 4,3 ± 4,9 5,8 ± 5,2 5,3 ± 3,6
Haupt- und
Endstückveränderungen
21,7 ± 6,9 20,5 ± 6,0 25,3 ± 8,0 22,7 ± 7,8 19,8 ± 5,9 24,8 ± 12,1

75
Tabelle 22: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter aufgetauter
Box
Hengst 2
Spermien [%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung in der Styroporbox bei
Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Normal 38,0 ± 5,8 35,7 ± 9,5 37,2 ± 8,8 44,7 ± 7,4 41,0 ± 2,4 41,8 ± 7,5
Abgelöster Kopf 0,2 ± 0,4 0,3 ± 0,5 0,5 ± 0,5 0,2 ± 0,4 0,7 ± 0,5 0,3 ± 0,5
andere Kopfveränderungen
Hals- und
Verbindungsstückveränderungen
Proximaler
Plasmatropfen
Distaler
Plasmatropfen
0,2 ± 0,4 1,0 ± 1,3 0,2 ± 0,4 0,3 ± 0,8 0,5 ± 0,8 0,2 ± 0,4
27,3 ± 7,6 29,3 ± 10,5 24,7 ± 9,5 23,2 ± 7,0 25,8 ± 5,3 23,3 ± 9,1
5,0 ± 2,8 4,0 ± 2,5 6,5 ± 5,0 2,7 ± 2,7 2,8 ± 1,6 2,0 ± 0,6
2,0 ± 1,1 1,2 ± 1,0 0,7 ± 0,8 0,3 ± 0,5 0,5 ± 0,5 0,5 ± 0,8
DMR 4,8 ± 4,0 7,0 ± 4,9 4,8 ± 4,5 4,2 ± 5,7 6,2 ± 5,7 4,3 ± 4,9
Haupt- und
Endstückveränderungen
22,5 ± 4,2 21,5 ± 7,0 25,5 ±7,9 24,5 ±7,1 22,5 ± 5,7 27,5 ± 4,4
Die morphologische Integrität der Spermien unterschied sich auch bei der Gesamtbetrachtung
beider Hengste nicht signifikant zwischen Tiefgefriersystemen, Verdünnern, Glyzerin-
konzentrationen oder sortierten und nicht sortierten Spermien (Tab.23 u. 24).

76
Tabelle 23: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter aufgetauter
Automat
Gesamt
Spermien [%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei
Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Normal 40,9 ± 11,4 46,8 ± 12,6 41,1 ± 11,8 52,3 ± 11,6 54,7 ± 13,9 46,5 ± 7,8
Abgelöster Kopf 0,8 ± 1,0 0,8 ± 0,9 0,6 ± 1,0 0,8 ± 0,9 0,3 ± 0,7 0,6 ± 0,7
andere Kopfveränderungen
Hals- und
Verbindungsstückveränderungen
Proximaler
Plasmatropfen
Distaler
Plasmatropfen
0,8 ± 1,5 0,8 ± 1,2 0,7 ± 0,7 1,0 ± 1,2 0,3 ± 0,6 0,6 ± 0,7
18,9 ± 11,9 16,7 ± 10,7 16,1 ± 10,2 15,5 ± 8,3 14,8 ± 10,4 15,0 ± 9,2
3,7 ± 2,7 5,1 ± 1,9 4,3 ± 1,9 3,6 ± 1,7 3,2 ± 1,5 3,1 ± 2,0
1,2 ± 1,3 0,9 ± 1,0 1,3 ± 0,9 0,3 ± 0,6 0,8 ± 0,9 0,3 ± 0,5
DMR 5,1 ± 4,9 6,1 ± 5,2 3,3 ± 5,3 3,4 ± 3,7 4,1 ± 4,1 3,7 ± 3,4
Haupt- und
Endstückveränderungen
28,7 ± 11,0 22,8 ± 7,0 32,6 ± 13, 23,3 ± 7,0 21,9 ± 6,0 30,3 ± 12,2

77
Tabelle 24: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter aufgetauter
Box
Gesamt
Spermien [%] von zwei Hengsten (1 und 2) nach Tiefgefrierung in der
Styroporbox bei Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern und
Glyzerinkonzentrationen
INRA82
2,5%
Glyzerin
Kontrolle Flowzytometrisch sortiert
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
INRA82
2,5%
Glyzerin
INRA82
5,0%
Glyzerin
Lactose-
EDTA
ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD ξ ± SD
Normal 46,6 ± 13,0 41,5 ± 10,7 43,5 ± 11,7 54,2 ± 12,0 50,3 ± 11,0 46,3 ± 9,2
Abgelöster Kopf 0,8 ± 1,1 1,4 ± 1,7 0,7 ± 0,7 0,6 ± 0,7 0,9 ± 0,9 0,6 ± 0,9
andere Kopfveränderungen
Hals- und
Verbindungsstückveränderungen
Proximaler
Plasmatropfen
Distaler
Plasmatropfen
0,3 ± 0,6 1,1 ± 1,2 0,3 ± 0,7 0,4 ± 0,8 0,5 ± 0,8 0,3 ± 0,5
18,4± 11,3 20,1 ± 12,3 17,0 ± 10,7 15,8 ± 9,3 17,4 ± 10,1 16,1 ± 10,0
4,0 ± 2,4 3,4 ± 2,2 5,2 ± 3,7 2,1 ± 2,0 2,6 ± 1,6 2,5 ± 1,7
1,5 ± 1,1 0,8 ± 0,9 0,9 ± 0,8 0,3 ± 0,5 0,4 ± 0,5 0,8 ± 1,2
DMR 3,5 ± 3,3 5,0 ± 4,5 3,7 ± 4,1 3,6 ± 4,3 4,7 ± 4,4 4,1 ± 4,0
Haupt- und
Endstückveränderungen
25,0 ± 8,2 26,8 ± 9,9 28,8 ± 10,6 23,2 ± 6,1 23,2 ± 7,0 29,5 ± 7,9
4.2 Tiefgefrierung für die Besamungsversuche
4.2.1 Spermienmotilität nach dem Auftauen
Wie aus Tabelle 25 ersichtlich, liegen die prozentualen Motilitätswerte der unsortierten
Spermien von Hengst 1 0, 10 und 30 Minuten nach dem Auftauen signifikant über den
sortierten Spermien (p 0,001, p 0,05 und p 0,001). Bei Koffeinzugabe nach 10 Minuten

78
sowie nach 90 Minuten war kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen
festzustellen. Dennoch lagen die Motilitäten des aufgetauten Kontrollspermas mit 400 Mio.
Spermien/ml 60 und 120 Minuten nach Beginn des Thermoresistenztests signifikant über der
Bewegungsaktivität der sortierten Spermien (p 0,05). Zusätzlich galt dies für alle Kontroll-
und Versuchsgruppen 150 und 180 Minuten nach dem Auftauen (Tab.25).
Gegenüber dem Ausgangswert (0 min.) waren die Motilitäten der Kontrollgruppen nach 30
Minuten signifikant reduziert, während die sortierten Spermien erst nach 60 Minuten einen
signifikanten Verlust ihrer Motilität zeigten (Tab.25).
Tabelle 25: Mittelwerte und Standardabweichungen der Spermienmotilität von Hengst 1 zu
Hengst 1
unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Auftauen
Kontrolle
40 Mio. / ml
ξ ± SD
0 min 61,0 ± 7,4 B,d
10 min 56,0 ± 8,2 b
10 min + Koff 62,0 ± 11,5
30 min 44,0 ± 8,2 A,d
60 min 19,8 ± 7,7 A
90 min 17,8 ± 6,6 A
120 min 16,4 ± 7,4 A
150 min 7,9 ± 6,2 A,a
180 min 4,7 ± 4,4 A,a
Kontrolle
400 Mio. / ml
ξ ± SD
67,0 ± 7,6 B,d
56,0 ± 8,2 b
57,0 ± 4,5
43,0 ± 5,7 A,d
25,2 ± 5,5 A,b
24,4 ± 9,3 A
25,0 ± 6,1 A,b
16,8 ± 3,9 A,b
16,6 ± 4,2 A,b
Flowzytometrisch
sortiert
ξ ± SD
29,0 ± 9,6 B,c
26,0 ± 9,6 a
56,0 ± 6,5 C
18,6 ± 8,2 c
13,2 ± 6,8 A,a
11,4 ± 8,5 A
10,8 ± 8,0 A,a
7,4 ± 4,4 A,a
5,2 ± 3,8 A,a
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
Bei Hengst 2 zeigten sich in beiden Kontrollgruppen deutlich höhere Auftaumotilitäten als in
der Gruppe mit sortierten Spermien bis 30 Minuten (p 0,001 bzw. p 0,05) nach dem

79
Auftauen und auch nach Zugabe von Koffein nach 10 Minuten (p 0,05), während es zu
späteren Zeitpunkten keine signifikanten Abweichungen mehr gab (Tab.26).
Nach 60 Minuten reduzierte sich in allen drei Gruppen die Motilität signifikant gegenüber
ihren Ausgangswerten (Tab.26).
Tabelle 26: Mittelwerte und Standardabweichungen der Spermienmotilität von Hengst 2 zu
Hengst 2
unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Auftauen
Kontrolle
40 Mio. / ml
ξ ± SD
0 min 67,0 ± 6,7 B,d
10 min 61,0 ± 17,5 b
10 min + Koff 71,0 ± 5,5 b
30 min 61,0 ± 5,5 d
60 min 35,6 ± 21,7 A
90 min 28,8 ± 16,8 A
120 min 26,2 ± 15,1 A
150 min 19,6 ± 12,2 A
180 min 15,6 ± 5,6 A
Kontrolle
400 Mio. / ml
ξ ± SD
67,0 ± 7,6 B,d
64,0 ± 4,2 b
70,0 ± 6,1 b
51,6 ± 12,9 b
45,2 ± 19,2 A
28,2 ± 15,1 A
27,6 ± 13,7 A
23,4 ± 14,3 A
13,1 ± 8,9 A
Flowzytometrisch
sortiert
ξ ± SD
34,0 ± 6,5 B,c
31,0 ± 9,6 a
57,0 ± 2,7 C,a
30,2 ± 7,3 a,c
19,2 ± 5,6 A
16,6 ± 9,0 A
16,0 ± 4,2 A
11,2 ± 5,7 A
8,6 ± 4,2 A
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
Die Gesamtbetrachtung der Auftaumotilitäten beider Hengste ergab in den Kontrollgruppen
zu den Zeitpunkten 0, 10 und 30 Minuten signifikant höhere Durchschnittswerte als in der
Gruppe der sortierten Spermien (p 0,001). Nach der Zugabe von Koffein nach 10 Minuten
lagen die Motilitätswerte der Kontrollgruppe mit 40 Mio. Spermien/ml signifikant über denen
der sortierten Spermien (p 0,05). Signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe mit
400 Mio. Spermien/ml und den sortierten Spermien stellten sich nach 60 Minuten und nach
120 Minuten bzw. später ein (Tab.27).

80
Die sortierten Spermien und die Kontrollgruppe mit 40 Mio. Spermien/ml verloren nach 60
Minuten, die Kontrollgruppe mit 400 Mio. Spermien/ml nach 30 Minuten signifikant an
Motilität (p 0,05).
Tabelle 27: Mittelwerte und Standardabweichungen der Spermienmotilität von beiden
Gesamt
Hengsten (1 und 2) zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Auftauen
Kontrolle
40 Mio. / ml
ξ ± SD
0 min 64,0 ± 7,4 B,d
10 min 58,5 ± 13,1 d
10 min + Koff 66,5 ± 9,7 b
30 min 52,5 ± 11,1 d
60 min 27,7 ± 17,4 A
90 min 23,3 ± 13,3 A
120 min 21,3 ± 12,3 A
150 min 13,8 ± 11,0 A
180 min 10,2 ± 7,5 A
Kontrolle
400 Mio. / ml
ξ ± SD
67,0 ± 7,1 B,d
60,0 ± 7,5 d
Flowzytometrisch
sortiert
ξ ± SD
31,5 ± 8,2 B,c
28,5 ± 9,4 c
63,5 ± 8,5 56,5 ± 4,7 C,a
47,3 ± 10,4 A,d
35,2 ± 17,0 A,b
26,3 ± 12,0 A
26,3 ± 10,1 A,b
20,1 ± 10,5 A,b
14,9 ± 6,8 A,b
24,4 ± 9,5 c
16,2 ± 6,7 A,a
14,0 ± 8,7 A
13,4 ± 6,6 A,a
9,3 ± 5,2 A,a
6,9 ± 4,2 A,a
A:B p 0,05 innerhalb eines Mediums
a:b p 0,05 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
c:d p 0,001 zwischen Kontrollsperma und sortiertem Sperma im jeweiligen selben Verdünner
4.2.1 Akrosomintegrität im aufgetauten Sperma
Die Integrität der Akrosome unterschied sich zwischen den drei Gruppen weder bei den
einzelnen Hengsten noch bei der Gesamtbetrachtung statistisch signifikant voneinander
(Tab.28).

81
Tabelle 28: Mittelwerte und Standardabweichungen des Anteils intakter Akrosome [%] der
für die Besamungsversuche tiefgefrorenen Proben nach dem Auftauen
Kontrolle
40 Mio. / ml
ξ ± SD
Kontrolle
400 Mio. / ml
ξ ± SD
Flowzytometrisch
sortiert
ξ ± SD
Hengst 1 91,6 ± 3,3 91,1 ± 2,5 90,1 ± 3,9
Hengst 2 92,1 ± 4,5 91,8 ± 3,1 92,4 ± 3,3
Total 91,9 ± 3,9 91,5 ± 2,7 91,3 ± 3,7
4.2.2 Morphologisch abweichende Spermienformen nach dem Auftauen
Bei Hengst 1 war der Anteil morphologisch normaler Spermien zwischen den drei Gruppen
gleich. Auch die einzelnen morphologischen Parameter unterschieden sich nicht. Lediglich
der Anteil der Haupt- und Endstückveränderungen lag bei den sortierten Spermien deutlich
über dem der Kontrollgruppe mit 400 Mio. Spermien/ml (p 0,05; Tab.29).

82
Tabelle 29: Anteil morphologisch veränderter aufgetauter Spermien im für die
Besamungsversuche tiefgefrorenen Samen von Hengst 1
Hengst 1
Kontrolle
40 Mio. / ml
ξ ± SD
Normal 58,2 ± 13,5
Abgelöster Kopf 2,8 ± 2,2
andere Kopfveränderungen 0,0 ± 0,0
Hals- und Verbindungsstückveränderungen 10,2 ± 2,8
Proximaler Plasmatropfen 2,4 ± 1,7
Distaler Plasmatropfen 1,2 ± 1,1
DMR 0,0 ± 0,0
Haupt- und Endstückveränderungen 25,2 ± 11,5
a:b p 0,05 innerhalb einer Zeile
Kontrolle
400 Mio. / ml
ξ ± SD
67,8 ± 9,2
1,5 ± 1,4
0,2 ± 0,4
10,0 ± 2,1
5,5 ± 3,8
0,7 ± 0,5
0,2 ± 0,4
14,2 ± 8,2 a
Flowzyto-
metrisch
sortiert
ξ ± SD
52,5 ± 5,4
0,3 ± 0,5
0,0 ± 0,0
5,3 ± 4,1
2,8 ± 3,1
0,8 ± 1,0
0,0 ± 0,0
38,5 ± 7,7 b
Bei Hengst 2 unterschied sich der Anteil morphologisch normaler Zellen zwischen den
Gruppen nicht, während der Anteil der Hals- und Verbindungsstückveränderungen bei den
sortierten Spermien signifikant niedriger war als in den Kontrollgruppen (p 0,05). Alle
anderen morphologischen Veränderungen zeigten zwischen den Gruppen keine signifikanten
Unterschiede (Tab.30).

83
Tabelle 30: Anteil morphologisch veränderter aufgetauter Spermien im für die
Besamungsversuche tiefgefrorenen Samen von Hengst 2
Hengst 2
Kontrolle
40 Mio. / ml
ξ ± SD
Kontrolle
400 Mio. / ml
ξ ± SD
Flowzyto-
metrisch
sortiert
ξ ± SD
Normal 45,1 ± 6,8 44,1 ± 9,5 45,9 ± 9,2
Abgelöster Kopf 1,6 ± 2,1 0,6 ± 0,7 1,4 ± 1,3
andere Kopfveränderungen 0,6 ± 1,0 0,0 ± 0,0 0,4 ± 0,8
Hals- und Verbindungsstückveränderungen 23,9 ± 3,8 b
25,9 ± 5,3 b
17,0 ± 2,5 a
Proximaler Plasmatropfen 6,6 ± 4,1 7,8 ± 2,4 5,1 ± 4,1
Distaler Plasmatropfen 2,1 ± 2,0 3,8 ± 2,3 2,3 ± 2,4
DMR 2,3 ± 2,7 1,3 ± 1,9 1,7 ± 1,5
Haupt- und Endstückveränderungen 17,9 ± 9,4 16,6 ± 9,5 26,1 ± 10,2
a:b p 0,05 innerhalb einer Zeile
Bei der Gesamtbetrachtung der Morphologie beider Hengste traten Haupt- und
Endstückveränderungen bei den sortierten Spermien signifikant häufiger auf als bei den
Spermien der in einer Konzentration von 400 Mio. Spermien/ml tiefgefrorenen
Kontrollgruppe (p 0,05; Tab.31). Alle anderen Parameter zeigten keine signifikanten
Unterschiede zwischen den drei Gruppen.

84
Tabelle 31: Anteil morphologisch veränderter aufgetauter Spermien im für die
Besamungsversuche tiefgefrorenen Samen von beiden Hengsten (1 und 2)
Gesamt
Kontrolle
40 Mio. / ml
ξ ± SD
Kontrolle
400 Mio. / ml
ξ ± SD
Flowzyto-
metrisch
sortiert
ξ ± SD
Normal 50,6 ± 11,7 53,6 ± 15,1 48,3 ± 8,4
Abgelöster Kopf 2,1 ± 2,1 0,9 ± 1,1 1,0 ± 1,2
andere Kopfveränderungen 0,3 ± 0,8 0,1 ± 0,3 0,3 ± 0,6
Hals- und Verbindungsstückveränderungen 18,2 ± 7,8 19,5 ± 9,1 12,7 ± 6,6
Proximaler Plasmatropfen 4,8 ± 3,8 6,9 ± 3,2 4,3 ± 3,8
Distaler Plasmatropfen 1,8 ± 1,7 2,5 ± 2,4 1,7 ± 2,1
DMR 1,3 ± 2,3 0,9 ± 1,6 1,1 ± 1,4
Haupt- und Endstückveränderungen 20,9 ± 10,5 15,6 ± 8,8 a
a:b p 0,05 innerhalb einer Zeile
30,6 ± 10,9 b

5 Diskussion
85
Ziel dieser Arbeit war es, die Tiefgefrierung von gesextem Hengstsperma zu verbessern und
anhand spermatologischer Kriterien zu beurteilen. Zwar liegen mehrere Literaturberichte
(BUCHANAN et al. 2000; LINDSEY et al. 2001, 2002a, b, c) über Befruchtungsergebnisse
von frischem gesexten Hengstsperma vor. Über die Verwendung von gesextem,
tiefgefrorenen Hengstsperma wurde bislang nur von LINDSEY et al. (2002b) berichtet. Bei
15 besamten Stuten lag die Trächtigkeitsrate bei 13%.
Nicht von jedem Hengst eignet sich das Sperma für die Sortierung im Flowzytometer oder für
die Tiefgefrierung. Eine Kombination beider Verfahren ist zurzeit sogar nur bei einem kleinen
Prozentsatz von Hengsten möglich (LINDSEY et al. 2002c). Für die vorliegenden
Untersuchungen mit gesexten Spermien wurden zwei in der Besamung eingesetzte Hengste
des Niedersächsischen Landgestüts in Celle ausgewählt, deren Sperma aufgrund von
Vorversuchen sowohl für den Sortiervorgang als auch für die Tiefgefrierung geeignet
erschien.
Von anderen Tierarten ist bekannt, dass routinemäßig bewährte Tiefgefrierverfahren nur
bedingt auf gesextes Sperma übertragen werden können (KLINC 2005). Voruntersuchungen
an der Universität Sydney hatten zum Beispiel gezeigt, dass eine Verkürzung der Einfrierzeit
im Stickstoffdampf sich positiv auf die Auftauqualität von gesextem Hengstsperma auswirkt 2 .
In der vorliegenden Arbeit wurden drei Versuchsreihen zur Tiefgefrierung sortierter Spermien
in zwei Tiefgefriersystemen, zwei Verdünnern und zwei Glyzerinkonzentrationen
durchgeführt. Qualitätskriterien zur Vorhersage der Befruchtungsfähigkeit wurden anhand der
Spermaparameter Motilität, Akrosomintegrität und Spermienmorphologie bestimmt.
Die in den Tiefgefriersystemen „Styroporbox“ und „Einfrierautomat“ gemessenen
Temperaturkurven stellten sich sehr unterschiedlich dar. Die Temperaturabsenkung im
Einfrierautomaten verlief im Bereich bis ca. –20°C deutlich langsamer, danach jedoch
deutlich schneller als in der Styroporbox. Ob eher eine langsame oder eher eine schnelle
Kühlrate vorteilhaft für Spermien ist, wird schon lange diskutiert. MERRYMAN (1966)
vertrat die Meinung, eine langsame Kühlung sei behutsamer, weil dabei hauptsächlich
2 laut persönlicher Mitteilung von J. Clulow, Oktober 2003

86
extrazelluläres Eis gebildet und eine intrazelluläre Kristallisierung weitgehend vermieden
wird. MAZUR (1980) entwickelte die sogenannte „Zweifaktoren-Hypothese“, welche besagt,
dass schnelles Einfrieren die Gefahr intrazellulärer Eisbildung erhöht, während langsames
Einfrieren eine länger andauernde Wirkung der „Lösungseffekte“ ermöglicht.
Schnelle Einfrierraten verursachen intrazelluläre Eiskristalle, die aber zunächst unschädlich
sind (MAZUR 1980). Erst die Zusammenballung dieser kleinen Eiskristalle aufgrund ihrer
großen Oberflächenenergie und damit verbundener Instabilität bei zu langsamem Auftauen
verursachen Zellschäden, weshalb die Auftaurate immer der Einfrierrate angepasst werden
muss (MAZUR 1980). Der mittlere Temperaturbereich zwischen –15 und –60°C ist nach
MAZUR (1980) die kritische Zone, in der die meisten letalen Schäden auftreten.
Auch DELIUS (1985) erkannte keinen signifikanten Vorteil eines Einfrierverfahrens oder
einer bestimmten Einfriergeschwindigkeit, stellte jedoch anhand von Motilität und
Akrosinaktivität eine tendenziell bessere Qualität des Hengstsamens bei höherer Einfrierrate
fest. Das Einfrieren in einer Styroporkiste mit flüssigem Stickstoff erwies sich in ihren
Untersuchungen als ungünstiger gegenüber dem computergesteuerten Einfrierprozess mit
schneller Kühlrate. Auch bei anderen Tierarten war der computergesteuerte Einfrierprozess
vorteilhafter als eine ungesteuerte Styroporbox (DEMINATUS 1959; BRUEMMER et al.
1963; MAHLER 1966). MAHLER (1966) wies außerdem auf die Ausschaltung menschlicher
Fehlerquellen durch Anwendung von Einfrierautomaten hin. OSMERS (1983) schaffte mit
der computergesteuerten Standardisierung des Einfrierverfahrens beim Rind kontrollierbare
und reproduzierbare Bedingungen und erhöhte damit die Non-Return-Raten.
Obwohl sich die Kühlraten in den vorliegenden Versuchen stark voneinander unterschieden,
waren bei der Auswertung der einzelnen Spermienparameter Unterschiede zwischen den
beiden Einfriersystemen weder für die gesexten noch für die unbehandelten Spermien zu
erkennen. Dies deutet darauf hin, dass die physikalische Belastungsfähigkeit der Spermien
sich nicht wesentlich zwischen den Behandlungen unterscheidet.
In allen untersuchten Gruppen lag der durchschnittliche Anteil an Spermien mit intaktem
Akrosom über 90% und überschritt damit die von McDONALD und PINEDA (1989) für die
Besamung erforderliche Akrosomintegrität von aufgetautem Hengstsperma von mindestens
50% deutlich. Unterschiede zwischen den Gruppen lagen hinsichtlich der Akrosomintegrität
nicht vor.

87
Da sich die beiden Tiefgefriersysteme nicht unterschieden, wurde das Sperma aufgrund der
technischen Verfügbarkeit in den weiteren Untersuchungen zur Tiefgefrierung von sortierten
Hengstspermien für einen Besamungsversuch im Stickstoffdampf einer Styroporbox
eingefroren und auf die computergesteuerte Anlage verzichtet.
Obwohl es keinen Verdünner gibt, der sich für die Tiefgefrierung von Spermien aller Hengste
eignet (SQUIRES u. PICKETT 1995; GRAHAM 1996), sollte zunächst für später geplante
Besamungsversuche ein Medium gefunden werden, in dem sich sortierte Spermien beider
Hengste zufriedenstellend kryokonservieren ließen. In Versuchsreihe 2 wurden deshalb zwei
Verdünner miteinander verglichen. Dabei handelte es sich um den französischen Verdünner
INRA82 (IJAZ u. DUCHARME 1995) mit 2% Eidotter und einen Lactose-EDTA-Verdünner
mit 20% Eidotter (MARTIN et al. 1979). Mit ersterem wurde das Sperma beider Hengste im
Niedersächsischen Landgestüt routinemäßig zur Kryokonservierung verdünnt, wobei eine
Glyzerinkonzentration von 2,5% eingestellt wurde.
Die während der Tiefgefrierung aufgezeichneten Temperaturkurven unterschieden sich
zwischen den Verdünnern erst nach Durchschreiten des von verschiedenen Autoren als
kritisch angesehenen Temperaturbereiches signifikant. So erklärte MAZUR (1980), dass im
Temperaturbereich zwischen –15 und –60°C die meisten Schäden an Zellmembranen der
Säugetierspermien auftreten. Der für Hengstsperma als kritisch angesehene Bereich schwankt
in Abhängigkeit von der Kühlrate. RÖBBELEN (1993) sah bei einer langsamen
Gefriergeschwindigkeit einen Bereich zwischen -10 und -20°C als kritisch an, während dieser
bei einer schnelleren Kühlrate zwischen -20 und -30°C lag. Nach Durchschreiten dieses
Temperaturbereiches sind die Zellen „inert“, d.h. sie können zur Aufbewahrung in flüssigen
Stickstoff getaucht werden (GRAHAM 1996).
Hinsichtlich Motilität, Akrosomintegrität oder Morphologie der Spermien bestand zwischen
den Verdünnern kein Unterschied. Die Entscheidung, welches Medium für
Besamungsversuche genutzt werden sollte, fiel auf den Lactose-EDTA-Verdünner. Er wurde
im Thermoresistenztest beim direkten Vergleich der Motilität von sortierten Spermien, die an
ein- und demselben Tag tiefgefroren worden waren, subjektiv geringfügig besser
eingeschätzt, was sich jedoch in der statistischen Auswertung nicht niederschlug.

88
Aus der Toxizität einer Gefrierschutzsubstanz resultiert auch eine verminderte Fertilität
(PACE u. SULLIVAN 1975; DEMICK et al. 1976; HAMMERSTEDT u. GRAHAM 1992;
BEDFORD et al. 1995). Daher sollte ihre Konzentration so niedrig wie möglich gehalten
werden, gleichzeitig aber hoch genug, um einen maximalen Schutz bieten zu können
(GRAHAM 1996). VIDAMENT et al. (1998) erreichten mit einer Konzentration von 2,5%
Glyzerin im INRA82-Verdünner mit 2% Eidotter zufriedenstellende Ergebnisse nach der
Besamung mit tiefgefrorenem Sperma. Ein akzeptables Trächtigkeitsniveau wird bei Zugabe
von 2,5% und 4% Glyzerin zum Verdünner erreicht, bei einer Konzentration von 5,5% jedoch
wird die Fertilität stark vermindert (VINCENT et al. 2004). Hinsichtlich der
Spermienmotilität ist die optimale Glyzerinkonzentration in einem auf Milch basierenden
Verdünner schwer zu bestimmen, kann aber nach VIDAMENT et al. (2001) bei 3% vermutet
werden. Auch BALL und VO (2001) zeigten, dass eine Erhöhung der Glyzerinkonzentration
im Verdünner negative Effekte an Spermien hervorruft, die sich in veränderter Motilität,
Vitalität sowie dem Zustand der Mitochondrien und der Akrosome äußert. Trotz
unterschiedlicher Angaben in der Literatur gilt es inzwischen als erwiesen, dass eine
umgekehrt proportionale Beziehung zwischen der Glyzerinkonzentration und dem Prozentsatz
motiler Spermien sowie der Akrosomintegrität besteht, die unabhängig vom Gefriermodus ist
(GRAHAM u. GRABO 1972; PURSEL et al. 1978; OBANDO et al. 1984; ALMLID et al.
1988; VENGUST et al. 1989). Alle erwähnten Studien beziehen sich auf ungesextes Sperma,
während über die Nutzung von Kryoprotektiva bei sortierten Spermien keine Angaben in der
Literatur vorliegen.
Aus den vorliegenden Ergebnissen ist ein Einfluss der verwendeten Glyzerinkonzentrationen
weder auf Motilität und Akrosomintegrität noch auf die Spermienmorphologie abzuleiten. Für
sortierte Spermien der beiden eingesetzten Hengste kann entsprechend davon ausgegangen
werden, dass eine Erhöhung der Glyzerinkonzentration nicht zu einer Verbesserung des
Gefrierschutzes führt.
Ähnlich wie in früheren Untersuchungen an gesexten Bullenspermien (SCHENK et al. 1999)
waren in den Tiefgefrierversuchen die Auftaumotilitäten der sortierten Spermien gegenüber
denen der entsprechenden Kontrollgruppen deutlich reduziert. Zu beachten ist hier aber, dass
sich die Werte der Kontrollgruppen innerhalb einer Zeit von nur 30 Minuten (Hengst 2), 60

89
Minuten (Gesamtbetrachtung) bzw. 90 Minuten (Hengst 1) im Thermoresistenztest denen der
sortierten Spermien anglichen.
KLINC (2005) ist der Ansicht, dass eine punktuelle Bestimmung der Motilität nach dem
Auftauen keinen ausreichenden Rückschluss auf die Qualität der aufgetauten Proben zulässt.
Nach Beobachtung der Motilität tiefgefrorener gesexter und nicht gesexter Bullenspermien
nach dem Auftauen im Thermoresistenztest (37°C) über 12 Stunden verloren die sortierten
Spermien im TRIS-Verdünner mehr als 90% ihrer Motilität, während die unsortierten
Kontrollgruppen ihre Motilität aufrecht erhalten konnten.
Dies konnte für Hengstspermien in dieser Studie nicht gezeigt werden. Auch für die
Kontrollgruppen lag der Zeitpunkt, zu dem die Motilitätswerte im Thermoresistenztest
signifikant von den Ausgangswerten abwichen, im Bereich zwischen 30 und 90 Minuten. Die
Zeitpunkte sind jedoch nur bedingt vergleichbar, da sich schon die Ausgangswerte zwischen
den Gruppen unterschieden. Wichtig ist in diesem Zusammenhang, dass bei fast allen
Gruppen ein signifikanter Verlust der Motilität zwischen 30 bis 60 Minuten nach dem
Auftauen beobachtet wurde.
Für kryokonserviertes Hengstsperma gilt nach den Richtlinien des Instituts für
Reproduktionsmedizin (Tierärztliche Hochschule Hannover) als Kriterium für den
Besamungseinsatz ein Anteil von mindestens 30% vorwärtsbeweglichen Spermien nach dem
Auftauen. Es fiel auf, dass das unsortierte Tiefgefriersperma diese Motilität im
Thermoresistenztest und im besten Verdünner für ungefähr 60 Minuten halten kann. Die
Auftaumotilität sortierter tiefgefrorener Spermien erreichte diesen kritischen Wert bereits
nach ca. 30 Minuten. Um diese auch im weiblichen Genitale stark verkürzte Vitalität
sortierter Spermien zu kompensieren (MAXWELL et al. 2004), muss die Besamung mit
sortierten tiefgefrorenen Spermien deshalb zeitlich nah zum Auftauen und zur Ovulation
erfolgen (LINDSEY et al. 2002b).
Wie von SCHENK et al. (1999) für Bullensperma berichtet, unterschied sich auch die in den
Tiefgefrierversuchen erfasste Akrosomintegrität genauso wie der Anteil morphologisch
abweichender Samenzellen nicht signifikant zwischen sortierten und unsortierten
tiefgefrorenen Spermien. Auch MORRIS et al. (2003) fanden keinen signifikanten

90
Unterschied bezüglich des Anteils intakter Akrosome zwischen Spermien vor der Inkubation
und Spermien nach der Sortierung. In ihren Studien waren die Spermien jedoch keiner
Kryokonservierung unterzogen worden.
Um Spermien für Besamungsversuche zu kryokonservieren und sie hinsichtlich ihrer Fertilität
zu überprüfen, wurden aus den Ergebnissen der Tiefgefrierversuche ein Tiefgefriersystem, ein
Verdünner und eine Glyzerinkonzentration ausgewählt. Die mit einer Reinheit von
mindestens 90% sortierten Spermien wurden im Lactose-EDTA-Verdünner gekühlt und in
diesem Verdünner mit 4% Glyzerin in der Styroporbox kryokonserviert.
Der Vergleich der Spermienmotilität ergab bei Hengst 1 erwartungsgemäß bis 30 Minuten
nach dem Auftauen signifikant höhere Werte für die beiden nicht sortierten Kontrollgruppen
als für die Gruppe der sortierten Spermien. Die Beweglichkeit der sortierten Spermien konnte
dabei in höherem Maße durch Koffein stimuliert werden als die der Kontrollgruppen, d.h. die
Motilität der nicht sortierten und der sortierten Spermien unterschieden sich nach Zufügen
von Koffein zum Zeitpunkt 10 Minuten nach dem Auftauen nicht mehr signifikant
voneinander. Der Phosphodiesterase-Hemmer Koffein steigert die Motilität innerhalb einer
Spermiensuspension (COSCIONI et al. 2001) und dient damit z.B. der Erkennung aller
potenziell motilen Spermien. Die Zugabe von Koffein führt nur zu einer kurzzeitigen
Stimulation (AITKEN et al. 1986; SALEM et al. 1992) und anschließend zu einer schnellen
Abnahme der Motilität aller Spermien in einer Suspension, weshalb in der vorliegenden
Studie die Koffein-Zugabe direkt auf dem Objektträger erfolgte. Da aber nicht bekannt ist,
inwieweit die durch Koffein unter dem Mikroskop stimulierte Motilität als
Fruchtbarkeitsvorhersage geeignet ist, kann aus diesem Wert nur die maximale
Stimulierbarkeit der Spermien, die kurz nach dem Auftauen nicht selbstständig ihren
Höchstwert erreicht, abgelesen werden.
Die Ergebnisse der Akrosomintegrität unterschieden sich zwischen den drei Gruppen weder
für die einzelnen Hengste noch für die Gesamtbetrachtung signifikant voneinander. Auch
SCHENK et al. (1999) und MORRIS et al. (2003) fanden keine signifikanten Unterschiede
hinsichtlich der Akrosomintegrität zwischen Spermien vor und nach der Sortierung. Sie
stellten lediglich fest, dass Spermien nach der Färbung und Inkubation einen niedrigeren

91
Prozentsatz intakter Akrosome zeigten als nach der sich anschließenden Sortierung. Dieses
widerspricht den hier aus den Tiefgefrierversuchen hervorgegangen Daten, die keine
Unterschiede erkennen ließen.
Bei Hengst 1 ergab die Auswertung der Spermienmorphologie lediglich einen signifikant
höheren Anteil an Haupt- und Endstückveränderungen bei den sortierten Spermien gegenüber
der Kontrollgruppe mit 400 Mio. Spermien/ml. Ein Unterschied zwischen den sortierten
Spermien und der in derselben Konzentration eingefrorenen Kontrollgruppe bestand jedoch
nicht. Auch bei Hengst 2 unterschied sich der Anteil morphologisch intakter Spermien
zwischen den Gruppen nicht. Interessanterweise lag der Anteil der Hals- und
Verbindungsstückveränderungen bei den sortierten Spermien sogar signifikant unter dem der
Kontrollgruppen. Die Gesamtbetrachtung ergab wie bei Hengst 1 nur einen signifikant
erhöhten Anteil an Haupt- und Endstückveränderungen bei den sortierten Spermien
gegenüber der Kontrolle mit 400 Mio. Spermien/ml.
Bedingt durch die limitierte Verfügbarkeit gesexter Spermien mussten die Versuche auf zwei
Hengste begrenzt werden. Dennoch lässt sich aus dieser Arbeit folgern, dass sortierte genauso
wie nicht sortierte Spermien eine niedrigere Glyzerinkonzentration im INRA82-Verdünner
bevorzugen. Es bestand außerdem für diesen Versuchsaufbau kein Unterschied zwischen den
Tiefgefriersystemen Styroporbox und automatischem Gefriergerät. Bekannt ist, dass nicht
sortierte Spermien verschiedener Hengste unterschiedlich auf die Tiefgefrierung in
verschiedenen Verdünnern reagieren (SQUIRES u. PICKETT 1995; GRAHAM 1996).
Dieses kann auch für sortierte Spermien vorausgesetzt werden. Hengst 2 blieb in der
vorliegenden Studie indifferent gegenüber den beiden Verdünnern, während Hengst 1 auf eine
Veränderung des Verdünners reagierte. Auch die bei PICKETT et al. (1987) erwähnten
Tagesschwankungen hinsichtlich der Tiefgefrierfähigkeit waren in den vorliegenden Studien
zu erkennen.
Um eine Verbesserung der Methodik zur Tiefgefrierung sortierter Spermien zu erreichen, sind
Folgestudien erforderlich. Es bleibt die Frage offen, wie sortierte Spermien anderer Hengste
auf die Tiefgefrierung reagieren und ob andere Tiefgefrierprogramme oder andere

92
Tiefgefriermedien bessere Spermienqualitäten nach dem Auftauen ergeben. Für die
vorliegende Arbeit wurden Tiefgefriersysteme und Tiefgefrierverdünner zum Vergleich
ausgewählt, die routinemäßig in der Reproduktionsmedizin des Pferdes zum Einsatz kommen.
In Vorversuchen stellte sich heraus, dass bei sortierten Spermien im Hinblick auf eine
akzeptable Auftaumotilität zur Anpassung an 5°C mindestens 2,5 Stunden unbedingt
einzuhalten sind. Kürzere Anpassungszeiten minimierten die Spermienmotilität nach dem
Auftauen zum Teil beträchtlich.
Ein Ansatz zu weiteren Versuchen können die neuesten Erkenntnisse von KLINC (2005) sein.
Erst kürzlich wurde für Bullenspermien ein neues Verdünnersystem (Sexcess®) entwickelt,
das schon vor bzw. während des Sortiervorganges den Spermien zugesetzt wird und während
des Sortiervorganges die Motilität reversibel inhibiert. Daraus resultiert durch optimale
Orientierung eine erhöhte Ausbeute an Spermien während des Sortiervorganges. Kürzlich
erfolgte Feldversuche zeigten, dass die Fertilität sortierter Spermien durch die Zugabe dieser
Verdünner beibehalten werden kann und ultrasonographische Trächtigkeitskontrollen keinen
Unterschied in der Trächtigkeitsrate zwischen sortierten Spermien und den unsortierten
Kontrollgruppen hervorbrachten (KLINC 2005).
5.1 Zusammenfassende Betrachtung und Schlussfolgerung
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass es möglich ist, sortierte Hengstspermien einem
Tiefgefrierverfahren zu unterziehen und die Motilität soweit zu erhalten, dass eine akzeptable
Befruchtungsrate möglich erscheint. Dies ist durch derzeit laufende Besamungsversuche noch
zu verifizieren. Dazu wurden sortierte Spermien zweier Hengste in jeweils zwei
verschiedenen Tiefgefriersystemen, unterschiedlichen Verdünnern und, in einem dieser
Verdünner, verschiedene Glyzerinkonzentrationen miteinander verglichen. Aus den
vorliegenden Ergebnissen dieser Tiefgefrierversuche wurden das System „Styroporbox“,
sowie ein Lactose-EDTA-Verdünner mit 4% Glyzerin für die Tiefgefrierung von Proben für
Besamungsversuche ausgewählt.
Durch die Bestimmung der Spermaparameter Motilität zu unterschiedlichen Zeiten nach dem
Auftauen im Thermoresistenztest bei 38°C, sowie Akrosomintegrität und Morphologie wurde

93
die Spermaqualität ermittelt. Die Motilität der sortierten Spermien war gegenüber der
Motilität unsortierter Kontrollen reduziert. Die Mindestanforderungen an die Motilität von zur
Besamung genutztem tiefgefrorenem Hengstsperma von 30% konnten nach Auftauen nur für
10 bis 30 Minuten im Thermoresistenztest aufrechterhalten werden. Für zufriedenstellende
Befruchtungsergebnisse ist zur Zeit also eine ovulationsnah und zeitlich kurz nach dem
Auftauen durchgeführte Besamung erforderlich.
Eine endgültige Fertilitätsaussage über die sortierten und tiefgefrorenen Spermien wird
zurzeit in einem parallel laufenden Besamungsprojekt überprüft.
Die Forschung zur Tiefgefrierung sortierter Spermien befindet sich beim Hengst noch in den
Anfängen. Auch die vorliegenden Ergebnisse lassen keinen endgültigen Schluss über ein
optimales Verfahren zur Tiefgefrierung sortierter Spermien aller Hengste zu, aber die
Ergebnisse erlauben ein Tiefgefrierprotokoll anzuwenden, dass zu Nachkommen mit
gewünschtem Geschlecht führen kann.

6 Zusammenfassung
94
Heide Friederike Buß (2005): Verbesserung der Tiefgefrierfähigkeit geschlechtsspezifisch
sortierter Hengstspermien
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine zufriedenstellende Methodik zur Tiefgefrierung
flowzytometrisch sortierter Spermien zu erstellen. Anhand sortierter Spermien zweier
Hengste wurden drei Versuchsreihen zum Vergleich von zwei Tiefgefriersystemen, zwei
Verdünnern und zwei Glyzerinkonzentrationen durchgeführt. Die Qualität der Spermien
wurde nach dem Auftauen anhand der Spermaparameter Motilität, Akrosomintegrität und
Morphologie bestimmt und zusätzlich die sortierten Spermien mit den auf gleiche Art
behandelten unsortierten Kontrollgruppen verglichen.
Bei den in Versuchsreihe 1 verglichenen Systemen handelte es sich um eine Styroporbox und
einen automatischen Gefrierapparat. In der Styroporbox wurden die Pailletten im
Stickstoffdampf für mindestens 7 Minuten kryokonserviert. Für die Kryokonservierung im
automatischen Gefrierapparat wurden Pailletten kontrolliert mit einer Kühlrate von
–60°C/min. bis auf –160°C eingefroren. Es folgten jeweils der Transport bzw. die Lagerung
in flüssigem Stickstoff bei –196°C und die Auswertung nach dem Auftauen für 30 Sekunden
im 37°C warmen Wasserbad. Die Proben im System Box kühlten zunächst deutlich schneller,
nach Durchschreiten einer Temperatur von ungefähr –20°C deutlich langsamer ab als jene im
Automaten. Unterschiede der Spermienqualität zwischen den Tiefgefriersystemen bestanden
nicht, so dass aufgrund der technischen Verfügbarkeit in den weiteren Untersuchungen zur
Tiefgefrierung von sortierten Hengstspermien für einen Besamungsversuch auf die
computergesteuerte Anlage verzichtet wurde.
In Versuchsreihe 2 fand ein Vergleich zwischen den beiden Verdünnern INRA82 mit 2%
Eidotter und 2,5% bzw. 5% Glyzerin sowie Lactose-EDTA mit 20% Eidotter und 4%
Glyzerin statt. Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Verdünnern.
Im INRA82-Verdünner wurden in der Versuchsreihe 3 die Glyzerinkonzentrationen 2,5% und
5% miteinander verglichen. Die Spermaproben wurden zunächst ohne Zugabe von Glyzerin
an 5°C angepasst, danach erfolgten die Glyzerinzugabe, das Abfüllen und die

95
Kryokonservierung. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den verschiedenen
Gruppen.
Der Anteil beweglicher sortierter Spermien war gegenüber dem der unsortierten
Kontrollgruppen deutlich reduziert. Die Werte unterschieden sich jedoch nach einer Zeit von
30 Minuten (Hengst 2), 60 Minuten (Gesamtbetrachtung) bzw. 90 Minuten (Hengst 1) im
Thermoresistenztest nicht mehr signifikant. Hinsichtlich der Akrosomintegrität und der
Morphologie gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen gesexten und ungesexten
Spermien.
Um Besamungsportionen für die Überprüfung der Fertilität tiefgefrorener sortierter Spermien
bereit zu stellen, wurden die Styroporbox als Tiefgefriersystem und der Lactose-EDTA-
Verdünner mit 4% Glyzerin als Tiefgefriermedium ausgewählt. Im Frühjahr 2004 wurden
insgesamt ca. 30 Besamungsportionen mit sortierten Spermien jedes Hengstes und eine
entsprechende Anzahl Kontrollgruppen tiefgefroren. Besamungsversuche werden zur Zeit von
einer australischen Arbeitsgruppe der Universität Sydney durchgeführt.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein vorläufiges Protokoll zur Kryokonservierung sortierter
Spermien erstellt, das den Erhalt der Motilität entsprechend den Mindestanforderungen von
30% nach dem Auftauen für ca. 30 Minuten im Thermoresistenztest gewährleistet. Eine
Besamung mit diesen Spermien sollte daher derzeit möglichst kurz nach dem Auftauen und
ovulationsnah erfolgen.

7 Summary
Heide Friederike Buß (2005): Improvement of the freezability of sex-sorted stallion
spermatozoa
96
The objective of the present investigation was to develop a method for the cryopreservation of
flow-sorted sperm. Three series of tests were carried out using the sorted sperm of two
stallions to compare two freezing systems, two extenders and two glycerol concentrations.
The quality of the frozen/thawed semen was determined by the sperm parameters of motility,
acrosome integrity and morphology. Frozen/thawed flow sorted sperm was also compared
with frozen/thawed non-sorted spermatozoa.
The first trial involved a comparison of freezing systems. One was simply a styrofoam box
filled with liquid nitrogen and the other was a programmable freezing device. Straws of
semen to be frozen in nitrogen vapour were placed onto a rack over liquid nitrogen in the
styrofoambox for 7 minutes and then were submerged into the liquid nitrogen. For
cryopreservation with the automatic freezing system, straws were cooled using a programmed
rate of 60°C per minute down to a temperature of –160°C. At this point the straws were
plunged into liquid nitrogen for storage at –196°C. In both systems, the straws were thawed in
a waterbath for 30 seconds at 37°C and evaluated. Samples cooled in nitrogen vapor in the
styrofoam box system were found to cool much faster initially but, after reaching a
temperature of –20°C, their cooling rate was slower than that of samples in the programmed
device. Since there was no difference in the quality of sperm frozen by these two methods, the
more simple nitrogen vapor cooling system was used for the rest of the study.
Experiment 2 involved a comparison of freezing success using two different extenders. The
first consisted of INRA82-extender supplemented with 2% egg-yolk and 2.5% or, in some
cases, 5% glycerol. The second consisted of lactose-EDTA-extender supplemented with 20%
egg-yolk and 4% glycerol. Again, there was no statistically significant difference between the
two experimental groups.
Experiment three examined the effect of glycerol concentration. Glycerol concentrations of
2.5% and 5% were both compared using the INRA82-extender. In this test, the samples were

97
first cooled to 5°C without glycerol and then precooled glycerol was added to give the desired
concentration and the semen was placed into straws for freezing. There was no significant
difference between the two different concentrations of glycerol.
In all cases, the post-thaw motility of sexed spermatozoa were significantly reduced in
comparison to that of unsorted sperm immediately after thawing, however, after incubation at
38°C for 30 minutes the sperm from stallion 2 no longer showed any difference between the
two groups, after 60 minutes pooling the data for both stallions showed no significance
difference between groups however, the sperm from stallion 1 alone showed a significant
difference until they had been incubated for 90 minutes. The analysis of acrosome integrity
and morphology revealed no significant difference between sorted and unsorted sperm.
The final experiment involves a field study of the fertilization competence of sexed sperm.
For this experiment, sperm were frozen with nitrogen vapour cooling in a styrofoam box
using lactose-EDTA-extender with 4% glycerol. In spring 2004, 30 insemination doses of
flow-sorted sperm and a corresponding number of doses of non-sorted sperm were prepared
from each stallion. Insemination is currently being performed by Australian colleagues at the
University in Sydney.
In the work described above, a satisfactory method for the cryopreservation of sorted stallion
sperm was developed, which gives a motility of 30% for a period of 30 minutes in a post-
thawing thermal resistance test. We conclude that insemination with frozen/thawed sexed
stallion sperm should be performed immediately after thawing and at a time very close to the
point of ovulation.

7 Literaturverzeichnis
98
ABEYDEERA, L. R., L. A. JOHNSON, G. R. WELCH, W. H. WANG, A. C. BOQUEST, C.
CANTLEY, A. RIEKE u. B. N. DAY (1998):
Birth of piglets preselected for gender following in vitro fertilisation of in vitro matured pig
oocytes by x and y bearing spermatozoa sorted by high speed flow cytometry.
Theriogenology 50, 981-988
AITKEN, R. J., A. MATTEI u. S. IRVINE (1986):
Paradoxical stimulation of human sperm motility by 2-desoxyadenosine.
J. Reprod. Fertil. 78, 515-527
ALEIV, A. I. (1981):
The effect of ovaritropin on reproductive function of mares and the optimum time of
insemination with frozen-thawed semen.
Anim. Breed. 49, 805 (abstr.)
ALMLID, T. u. L. A. JOHNSON (1988):
Effects of glycerol concentration, equilibration time and temperature of glycerol addition on
post-thaw viability of boar spermatozoa frozen in straws.
J. Anim. Sci. 66, 2899-2905
ALMLID, T., L.A. JOHNSON, R.N. CLARKE u. V.G. PURSEL (1988):
Cryopreservation of boar semen: Studies to determine optimum glycerol levels and the
relationship of in vitro evaluation to in vivo fertility.
in: 11th Int.Congr.on Anim.Reprod.and AI, Dublin 1988, 220
AMANN, R. P. (1989):
Treatment of sperm to predetermine sex.
Theriogenology 31, 49-60
AMANN, R. P. u. B. W. PICKETT (1987):
Principle of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa.
J. Equine Vet. Sci. 7, 145
ANDERSEN, J.B. u. H. PETERSEN (1976):
Breeding efficiency of frozen bull semen after 5 years storage at -196°C in liquid nitrogen.
in: Proc.VIIIth Int.Congr.Anim.Reprod.And Artif.Insem., Krakow 1976, 783-785
BALL, B. A. u. A. VO (2001):
Osmotic tolerance of equine spermatozoa and the effects of soluble cryoprotectants on equine
sperm motility, viability and mitochondrial membrane potential.
J. Androl. 72, 1061-1069
BARKER, C. A. V. u. J. C. C. GANDIER (1957):
Pregnancy in a mare resulted from frozen epididymal spermatozoa.
Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. 21, 47

99
BARON (1986):
Tiefgefrierung von Ebersamen in Kunststoffrohren: "In vitro"-Untersuchungen zum Einfluss
zweier Konfektionsformen und verschiedener Einfrier- und Auftaugeschwindigkeiten.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
BARTH, A.D. u. R.J. OKO (1989):
Abnormal morphology of bovine spermatozoa.
Iowa State University Press
BEAL, W. E., L. M. WHITE u. D. L. GARNER (1984):
Sex ratio after insemination of bovine spermatozoa isolated using a bovine serum albumin
gradient.
J. Anim. Sci. 58, 1432-1436
BEDFORD, S. J., D. J. JASKO, J. K. GRAHAM, R. P. AMANN, E. L. SQUIRES u. B. W.
PICKETT (1995):
Effect of seminal extenders containing egg yolk and glycerol on motion characteristics and
fertility in stallion spermatozoa.
Theriogenology 43, 955-967
BRINSKO, S.P. u. D.D. VARNER (1992):
Artificial insemination and preservation of semen.
in: Vet.Clin.North Am.Equine Pract., 8, 205-218
BRUEMMER, J. H., R. W. EDDY u. W. J. DURYEA (1963):
Temperature control in low temperature preservation of spermatozoa.
J. Cellul. Comp. Physiol. 62, 113-117
BUCHANAN, B. R., G. E. JR. SEIDEL, P. M. MCCUE, J. L. SCHENK, L. A.
HERICKHOFF u. E. L. SQUIRES (2000):
Insemination of mares with low numbers of either unsexed or sexed spermatozoa.
Theriogenology 53, 1333-1344
BUHR, M. M., E. F. CURTIS u. N. S. KAKUDA (1994):
Composition and behaviour of head membrane lipids of fresh and cryopreserved boar sperm.
Cryobiol. 31, 224-238
BWANGA, C. O. (1991):
Cryopreservation of boar semen I: a literature review.
Acta vet. scand. 32, 431-453
BWANGA, C. O., S. EINARSSON u. H. RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ (1991a):
Cryopreservation of boar semen II: Effect of cooling rate and duration of freezing point
plateau on boar semen frozen in mini- and maxi-straws and plastic bags.
Acta vet. scand. 32, 455-461

100
BWANGA, C. O., S. EINARSSON u. H. RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ (1991b):
Cryopreservation of boar semen III: Ultrastructure of boar spermatozoa frozen ultra-rapidly at
various stages of conventionel freezing and thawing.
Acta vet. scand. 32, 463-471
BWANGA, C. O., S. EINARSSON u. H. RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ (1991c):
Deep freezing of boar semen packaged in plastic bags and straws.
Reprod. Dom. Anim. 26, 117-125
CATT, S. L., J. W. CATT, M. C. GOMEZ, W. M. C. MAXWELL u. G. EVANS (1996):
The birth of a male lamb derived from an invitro matured oocyte fertilized by
intracytoplasmatic injection of a single presumptive "male" sperm.
Vet. Rec. 139, 494-495
CATT, S. L., D. SAKKAS, D. BIZARRO, P. G. BIANCHI, W. M. C. MAXWELL u. G.
EVANS (1997):
Hoechst staining and exposure to UV laser during flow cytometric sorting does not affect the
frequency of detected endogenous DNA nicks in abnormal and normal spermatozoa.
Mol. Hum. Reprod. 3, 821-825
CEROLINI, S., A. MALDJIAN, F. PIZZI u. T. M. GLIOZZI (2001):
Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen.
Reproduction 121, 395-401
COCHRAN, J. D., R. P. AMANN, E. L. SQUIRES u. B. W. PICKETT (1983):
Fertility of frozen-thawed stallion semen extended in lactose-EDTA-egg yolk extender and
packaged in 1.0 ml straws.
Theriogenology 20, 735-741
COSCIONI, A. C., H. D. REICHENBACH, J. SCHWARTZ, V. S. N. LAFALCI, J. L.
RODRIGUES u. A. BRANDELLI (2001):
Sperm function and production of bovine embryos in vitro after swim-up with different
calcium and caffeine concentration.
Anim. Reprod. Sci. 67, 59-67
COURTENS, J. L., H. EKWALL, M. PAQUIGNON u. L. PLÖEN (1989):
Preliminary study of water and some element contents in boar spermatozoa before, during and
after freezing.
J. Reprod. Fertil. 87, 613-626
COURTENS, J.L. u. M. PAQUIGNON (1985):
Ultrastructure of fresh, frozen and frozen-thawed spermatozoa of the boar.
in: 1st Int.Conf.on Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala 1985, 61-87
CRAN, D. G., L. JOHNSON, N. G. A. MILLER, D. COCHRANE u. C. E. POLGE (1993):
Production of bovine calves following separation of X- and Y-bearing sperm and in vitro
fertilization.
Vet. Rec. 132, 40-41

101
CRAN, D. G., L. A. JOHNSON u. C. E. POLGE (1995):
Sex preselection in cattle: A field trial.
Vet. Rec. 135, 495-496
CRAN, D. G., W. A. C. MCKELWAY, M. E. KING, D. P. DOLMEN, T. G. MCEVOY, P. J.
BROADBENT u. J. J. ROBINSON (1997):
Production of lambs by low dose intrauterine insemination with flow cytometrically sorted
and unsorted semen.
Theriogenology 47, 267 (abstr.)
CROCKETT, E. C., J. K. GRAHAM, J. E. BRUEMMER u. E. L. SQUIRES (2000):
Effect of cooling of equine spermatozoa before freezing on post-thaw motility: Preliminary
results.
Theriogenology 55, 793-803
DARIN-BENNETT, A. u. I. G. WHITE (1977):
Influence of cholesterol content of mammalian spermatozoa on susceptibility to cold-shock.
Cryobiol. 14, 466-470
DAWSON, G.R., G.W. WEBB, J.A. PRUITT, T.M. LOUGHLIN u. M.J. ARNS (1999):
Effect of different processing techniques on motility and acrosomal integrity of cold-stored
stallion spermatozoa.
in: Proc.ENPS 1999, 77-82
DE LEEUW, F. E., B. COLENBRANDER u. A. J. VERKLEIJ (1990):
The role membrane damage plays in cold shock and freezing injury.
Reprod. Dom. Anim. 1 (Suppl.), 95-104
DEAN, P. N., D. PINKEL u. M. L. MENDELSON (1978):
Hydrodynamic orientation of sperm heads for flow cytometry.
Biophys. J. 23, 7-13
DELIUS (1985):
Untersuchungen zur Tiefgefrierung von Pferdesamen in 5,5ml Volumeneinheiten mit Hilfe
computergesteuerter Einfrierprogramme.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
DEMICK, D. L., J. L. VOSS u. B. W. PICKETT (1976):
Effects of cooling, storage, glycerolization, and spermatozoal number on equine fertility.
J. Anim. Sci. 43, 955-967
DEMINATUS, F. (1959):
Fortschritte in der Sperma-Tiefkühltechnik (-79°C) durch ein halbautomatisches Einfriergerät.
Dtsch. tierärztl. Wochenschrift 17 (469), 477
DIGRASSI (2000):
Evaluation of stallion frozen-thawed semen using conventional and flow cytometric assays.
Blacksburg, Virginia Polytechnic Institute and State University, Diss.

102
DOYLE, S.P., G.E. SEIDEL, J.L. SCHENK, L.A. HERICKHOFF u. D.G. CRAN (1999):
Artificial insemination of lactating angus cows with sexed semen.
in: Proc.Western Sect.American Soc.of Anim.Sci., 50, 203-205
ERICSSON, R. J., C. N. LANGEVIN u. M. NISHIMO (1973):
Isolation of fractions rich in human y sperm.
Nature 253, 421-424
FAHY, G. M. (1986):
The relevance of cryoprotectant toxicity to cryobiology.
Cryobiol. 23, 1-13
FAZANO (1986):
Zur Kryokonservierung von Ebersperma, verschiedene Verfahren zur Samenbehandlung und
unterschiedliche Konservierungsmethoden unter Berücksichtigung der
Einfriergeschwindigkeit.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
FISER, P. S. (1990):
Interactions of cooling velocity, warming velocity and glycerol concentration on the survival
of frozen-thawed boar semen.
Reprod. Dom. Anim. 1 (Suppl.), 123-137
FLAHERTY, S. P., u. C. D. MATTHEWS (1996):
Application of modern techniques to evaluate sperm sex selection methods.
Mol. Hum. Reprod. 2, 937-942
FOOTE, R. H. (1977):
Sex ratios in dairy cattle under various conditions.
Theriogenology 8, 349-356
FUGGER, E. F. (1999):
Clinical experience with flow cytometric separation of human X- and Y-chromosome bearing
sperm.
Theriogenology 52, 1435-1440
FUGGER, E. F., S. H. BLACK, K. KEYVANFAR u. J. D. SCHULMAN (1998):
Births of normal daughters after MicroSort sperm separation and intrauterine insemination,
in-vitro fertilization, or intracytoplasmatic sperm injection.
Human Reprod 13, 2367-2370
FULWYLER, M. J. (1965):
Electronic separation of biological cells by volume.
Science 150, 910-911

103
GAO, D. Y., J. LIU, C. LIU, L. E. MCGANN, P. F. WATSON u. F. W. KLEINHAUS
(1995):
Prevention of osmotic injury to human spermatozoa during addition and removal of glycerol.
Hum. Reprod. 10, 1109-1122
GARNER, D.L., J.L. SCHENK u. G.E.JR. SEIDEL (2001):
Chromatin stability in sex-sorted sperm.
in: Proc.VIIth Internat.Congr.of Androl., Montreal, Canada: Short Communications,
Medimond, Englewood, NJ 2001, 3-7
ROBAIRE, E., H. CHEMES u. C.R. MORALES: Andrology in the Twenty-first century
GIL, J., N. LUNDEHEIM, L. SÖDERQUIST u. H. RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ (2003):
Influence of extender, temperature, and addition of glycerol on post-thaw sperm parameters in
ram semen.
Theriogenology 59, 1241-1255
GLEDHILL, B. L., S. LAKE, L. L. STEINMETZ, J. W. GRAY, J. R. CRAWFORD, P. N.
DEAN u. M. A. VAN DILLA (1976):
Flow microfluorometric analysis of sperm DNA content: Effect of cell shape on fluorescence
distribution.
J. Cell. Physiol. 87, 367-376
GRAHAM, J. K. (1996):
Cryopreservation of stallion spermatozoa.
Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 12 (1), 131-147
GRAHAM, E.F. u. B.G. GRABO (1972):
Some factors influencing the freezing of boar spermatozoa.
in: 7.Int.Konf.über tier.Fortpflanz.u.Haustierbes., München 1972, 2, 1627-1632
GUTHRIE, H. D., L. A. JOHNSON, W. M. GARRETT, G. R. WELCH u. J. R.
DOBRINSKY (2002):
Flow cytometric sperm sorting: effects of varying laser power on embryo development in
swine.
Mol. Reprod. Dev. 61, 87-92
GUYER, M. F. (1910):
Accessory chromosomes in man.
Biol. Bull. Marine Biol. Lab. (Woods Hole) 19, 219-221
HAMANO, K., X. LI, X. Q. QUIAN, K. FUNAUCHI, M. FURUDATE u. Y. MINATO
(1999):
Gender preselection in cattle with intracytoplasmatically injected, flowcytometrically sorted
sperm heads.
Biol. Reprod. 60, 1194-1197

104
HAMMERSTEDT, R. H. u. J. K. GRAHAM (1992):
Cryopreservation of poultry sperm: The enigma of glycerol.
Cryobiol. 29, 26-38
HAMMERSTEDT, R. H., J. K. GRAHAM u. J. P. NOLAN (1990):
Cryopreservation of mammalian sperm: What we ask them to survive.
J. Androl. 11, 73-88
HEITLAND, A. V., D. J. JASKO, E. L. SQUIRES, J. K. GRAHAM, B. W. PICKETT u. C.
HAMILTON (1996):
Factors affecting motion characteristics of frozen-thawed stallion spermatozoa.
Equine vet. J. 28 (1), 47-53
HENDRIKSEN, P. J. M., M. TIEMAN, T. VAN DER LENDE u. L. A. JOHNSON (1993):
Binding of anti-H-Y monoclonal antibodies to separated X and Y chromosome bearing
porcine spermatozoa.
Mol. Reprod. Dev. 5, 189-196
HOLLINSHEAD, F. K., L. GILLAN, J. K. O´BRIEN, G. EVANS u. W. M. C. MAXWELL
(2003):
In vitro and in vivo assessment of functional capacity of flow cytometrically sorted ram
spermatozoa after freezing and thawing.
Reprod. Fertil. Dev. 15, 351-359
HOLLINSHEAD, F. K., W. M. C. MAXWELL, G. EVANS u. J. K. O´BRIEN (2002):
Flow cytometric sorting of frozen-thawed ram spermatozoa.
Reprod. Fertil. Dev. 14, 21 (abstr.)
HOLLINSHEAD, F. K., J. K. O´BRIEN, L. HE, W. M. C. MAXWELL u. G. EVANS
(2001):
Pregnancies after insemination of ewes with sorted, cryopreserved ram spermatozoa.
Proc. Soc. Reprod. Biol. 32, 20 (abstr.)
HOLT, W. V. (2000):
Fundamental aspects of sperm cryobiology: The importance of species and individual
differences.
Theriogenology 53, 47-58
HOLT, W. V. u. A. MEDRANO (1997):
Assessment of boar sperm function in relation to freezing and storage.
J. Reprod. Fertil. Suppl.52, 213-222
HOUSEHOLDER, D. D., B. W. PICKETT, J. L. VOSS u. T. T. OLAR (1981):
Effect of extender, number of spermatozoa and HCG on equine fertility.
J. Equine Vet. Sci. 1, 9-13

105
IJAZ, A. u. R. DUCHARME (1995):
Effect of various extenders and taurine on survival of stallion sperm cooled to 5°C.
Theriogenology 44, 1039-1050
JASKO, D. J., D. H. LEIN u. R. H. FOOTE (1991a):
The repeatability and effect of season on seminal characteristics and computer-aided sperm
analysis in the stallion.
Theriogenology 30, 1159-1167
JASKO, D. J., D. M. MORAN, M. E. FARLIN u. E. L. SQUIRES (1991b):
Effect of seminal plasma dilution or removal on spermatozoal motion characteristics of
cooled stallion semen.
Theriogenology 35, 1059-1067
JOHNSON, L. A. (1991):
Sex preselection in swine: Altered sex ratio in offspring following surgical insemination with
flow sorted X- and Y-bearing sperm.
Reprod. Dom. Anim. 26, 309-314
JOHNSON, L. A. (1988):
Flow cytometric determination of sperm sex ratio in semen purportedly enriched for x- and ybearing
sperm.
Theriogenology 29, 265 (abstr.)
JOHNSON, L.A. (1985):
Fertility results of frozen boar spermatozoa.
in: 1st Int.Conf.on Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala 1985, 199-222
JOHNSON, L. A. (1992):
Gender preselection in domestic animals using flow cytometrically sorted sperm.
J. Anim. Sci. 70 (Suppl.2), 8-18
JOHNSON, L. A. (1997):
Advances in gender preselection in swine.
J. Reprod. Fertil. Suppl.52, 255-266
JOHNSON, L. A. (2000):
Sexing mammalian sperm for production of off-spring: the state-of-the-art.
Anim. Reprod. Sci. 60-61, 93-107
JOHNSON, L. A. u. R. N. CLARKE (1988):
Flow sorting of X and Y chromosome-bearing mammalian sperm: Activation and pronuclear
development of sorted bull, boar and ram sperm microinjected into hamster oocytes.
Gamete Res. 21, 335-343

106
JOHNSON, L.A., D.G. CRAN, G.R. WELCH u. C. POLGE (1996):
Gender preselection in mammals.
in: American Society of Animal Science, Savoy, IL, USA, 151-164
MILLER, R.H., V.G. PURSEL u. H.D. NORMAN: Beltsville Symposium XX
Biotechnology´s Role in the Genetic Improvement of Farm Animals
JOHNSON, L. A., J. P. FLOOK u. J. W. HAWK (1989):
Sex Preselection in Rabbits: Live Births from X and Y Sperm Separated by DNA and Cell
Sorting.
Biol. Reprod. 41, 199-203
JOHNSON, L. A., J. P. FLOOK u. M. V. LOOK (1987a):
Flow cytometry of X and Y chromosome-bearing sperm for DNA using an improved
preparation method and staining with Hoechst 33342.
Gamete Res. 17, 203-212
JOHNSON, L. A., J. P. FLOOK, M. V. LOOK u. D. PINKEL (1987b):
Flow sorting of X and Y chromosome-bearing spermatozoa into two populations.
Gamete Res. 16, 1-9
JOHNSON, L. A., H. D. GUTHRIE, P. FISER, W. M. C. MAXWELL u. G. R. WELCH
(2000):
Cryopreservation of flow cytometrically sorted boar sperm: effects on in vivo embryo
development.
J. Anim. Sci. 78 (Suppl.1)
JOHNSON, L. A. u. D. PINKEL (1986):
Modification of a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis of mammalian
spermatozoa.
Cytometry 7, 267-273
JOHNSON, L. A. u. G. R. WELCH (1999):
Sex preselection: High-speed flow cytometric sorting of X and Y sperm for maximum
efficiency.
Theriogenology 52, 1323-1341
JOHNSON, L. A., G. R. WELCH u. D. L. GARNER (1994):
Improved flow sorting resolution of X and Y chromosomes bearing viable spermatozoa
separated using dual staining and dead cell gating.
Cytometry 17 (Suppl.7), 28 (abstr.)
JOHNSON, L. A., G. R. WELCH, K. KEYVANFAR, A. DORFMANN, E. F. FUGGER u. J.
D. SCHULMANN (1993):
Gender preselection in humans? Flow cytometric separation of X and Y spermatozoa for the
prevention of X-linked diseases.
Human Reprod 8, 1733-1739

107
JOHNSON, L. A., G. R. WELCH u. W. RENS (1999):
The Beltsville Sperm Sexing Technology: High-speed sperm sorting gives improved sperm
output for in vitro fertilization and AI.
J. Anim. Sci 77, 213-220
KAMENTSKY, L. A. u. R. R. MELAMED (1967):
Spectrophotometric cell sorter.
Science 156, 1364-1365
KAWARASAKI, T., G. R. WELCH, C. R. LONG, M. YOSHIDA u. L. JOHNSON (1998):
Verification of flow cytometrically-sorted X-and Y-bearing porcine spermatozoa and
reanalysis of spermatozoa for DNA content using the fluorescence in situ hybridization
(FISH) technique.
Theriogenology 50, 625-635
KENNEY, R. M., R. V. BERGMAN, W. L. COOPER u. G. W. MORSE (1975):
Minimal contamination techniques for breeding mares: technique and preliminary findings.
Proc. Am Assoc Equine Pract 21, 327-335
KLINC, P. (2005):
Improved Fertility of Flowcytometrically Sex Selected Bull Spermatozoa.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
KLOPPE, L. H., D. D. VARNER, R. G. ELMORE, K. N. BRETZLAFF u. J. W. SHULL
(1988):
Effect of insemination timing on the fertilizing capacity of frozen/thawed equine
spermatozoa.
Theriogenology 29, 429-440
KLUG, E. (1993):
Frischsamenübertragung beim Pferd - Ein Grundkursus.
4. Aufl., Verlag Schaper, Alfeld
KLUG, E. u. H. SIEME (2003):
Samenübertragung beim Pferd in Theorie und Praxis.
Verlag Schaper, Alfeld
KOEHLER, J.K. (1985):
Sperm mebranes: Segregated domains of structure and function.
in: 1st Int.Conf.on Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala 1985, 37-60
KOTZIAS-BANDEIRA, E. (1997):
Cooling of boar spermatozoa prior to freezing and post-thaw quality and evaluation of
membrane status using CTC staining.
Dtsch. tierärztl. Wochenschrift 104, 302-306

108
LEIPOLD, S. D., J. K. GRAHAM, E. L. SQUIRES, P. M. MCCUE, S. P. BRINSKO u. D. K.
VANDERWALL (1998):
Effect of spermatozoal concentration and number on fertility of frozen equine semen.
Theriogenology 49, 1537-1543
LEPS (1988):
Zur Kryokonservierung von Ebersperma: Einfluß verschiedener Konfektionierungsarten,
insbesondere Flachbehältnisse auf Gefrier- und Auftauvorgänge sowie Auftauqualität.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
LIBBUS, G. L., S. D. PERREAULT, L. A. JOHNSON u. D. PINKEL (1987):
Incidence of chromosome aberrations in mammalian sperm stained with Hoechst 33342 and
UV-laser irradiated during flow sorting.
Mutation Research 182, 265-274
LINDSEY, A. C., J. E. BRUEMMER u. E. L. SQUIRES (2001):
Low dose insemination of mares using non-sorted and sex-sorted sperm.
Anim. Reprod. Sci. 68, 279-289
LINDSEY, A. C., L. H. A. MORRIS, W. R. ALLEN, J. L. SCHENK, E. L. SQUIRES u. J. E.
BRUEMMER (2002a):
Hysteroscopic insemination of mares with low numbers of nonsorted or flow sorted
spermatozoa.
Equine vet. J. 34 (2), 128-132
LINDSEY, A. C., J. L. SCHENK, J. K. GRAHAM, J. E. BRUEMMER u. E. L. SQUIRES
(2002b):
Hysteroscopic insemination of low numbers of flow sorted fresh and frozen/thawed stallion
spermatozoa.
Equine vet. J. 34 (2), 121-127
LINDSEY, A. C., D. D. VARNER, G. E. JR. SEIDEL, J. E. BRUEMMER, E. L. SQUIRES
u. M. J. EVANS (2002c):
Hysteroscopic or rectally guided, deep-uterine insemination of mares with spermatozoa stored
18 h at either 5 or 15 °C prior to flow-cytometric sorting.
Theriogenology 58, 659-662
LINDSEY, A. C., D. D. VARNER, G. E. JR. SEIDEL, J. E. BRUEMMER u. E. L. SQUIRES
(2005):
Hysteroscopic or rectally guided, deep-uterine insemination of mares with spermatozoa stored
18 h at either 5 degrees C or 15 degrees C prior to flow-cytometric sorting.
Anim. Reprod. Sci. 8, 125-130
LOOMIS, P. R., E. L. AMANN, E. L. SQUIRES u. B. W. PICKETT (1983):
Fertility of unfrozen and frozen stallion spermatozoa extended in EDTA-lactose-egg yolk and
packaged in straws.
J. Anim. Sci. 56, 687-693

109
LU, K. H., D. G. CRAN u. G. E. SEIDEL (1999):
In vitro fertilizationwith flow-cytometrically sorted bovine sperm.
Theriogenology 52, 1393-1405
MAGISTRINI, M., PH. CHANTELOUBE u. E. PALMER (1987):
Influence of season and frequency of ejaculation on production of stallion semen for freezing.
J. Reprod. Fertil. Suppl.35, 127-133
MAGISTRINI, M., M. SATTLER, J.M. YVON u. M. VIDAMENT (1997):
Freezability of stallion spermatozoa evaluated by motility, membrane integrity and ATP
content.
in: 34th Annual meeting of the society of cryobiology, Barcelona 1997, abstr. 95
MAHLER (1966):
Versuche über das Einfrieren und Tiefkühlen von Bullenejakulaten mittels eines mit
flüssigem Stickstoff betriebenen automatischen Einfriergerätes: III. Beitrag.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
MARTIN, J. C., E. KLUG u. A. R. GÜNZEL (1979):
Centrifugation of stallion semen and its storage in large volume straws.
J. Reprod. Fertil. 27 (Suppl. 27), 47-51
MAXWELL, W. M. C., G. EVANS, F. K. HOLLINSHEAD, R. BATHGATE, S. P. DE
GRAAF, B. M. ERIKSSON, L. GILLAN, K. M. MORTON u. J. K. O´BRIEN (2004):
Integration of sperm sexing technology into the ART toolbox.
Anim. Reprod. Sci. 82-83, 79-95
MAXWELL, W. M. C. u. L. A. JOHNSON (1997):
Chlortetracycline analysis of boar spermatozoa after incubation, flow cytometric sorting,
cooling, or cryopreservation.
Mol. Reprod. Dev. 46, 408-418
MAXWELL, W. M. C. u. L. A. JOHNSON (1999):
Physiology of spermatozoa at high dilution rates: The influence of seminal plasma.
Theriogenology 52, 1353-1362
MAXWELL, W.M.C., L.A. JOHNSON u. S.T. MORTIMER (2000):
Evaluation of morphology and function of frozen-thawed boar spermatozoa in vitro.
in: Boar Semen Preservation IV, Beltsville 2000, 43-49
MAZUR, P. (1980):
Fundamental aspects of the freezing of cells, with the emphasis on mammalian ova and
embryos.
in: Proc.9th Int.Congr.on Anim.Reprod.and A.I., Madrid 1980, 431-434
MAZUR, P. (1985):
Basic concepts in freezing cells.
in: 1st Int.Conf.on Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala 1985, 91-111

110
MCDONALD, L. E. u. M. H. PINEDA (1989):
Veterinary Endocrinology and Reproduction.
4. Aufl., Lea & Febiger, Philadelphia, London
MERKT, H. (1976):
Equine artificial insemination.
Vet. Rec. 99, 69-71
MERRYMAN, H. T. (1966):
Review of biological freezing.
Cryobiol. 1966 , 2-114
MILOVANOV, V. K. (1934):
Jskustvennoe osemenenie S.-L. Zivonyh (Artificial insemination of livestock).
Mascow, Seljhozgiz.
MORAN, D. M., D. J. JASKO u. E. L. SQUIRES (1992):
Determination of temperature and cooling rate which induce cold shock in stallion
spermatozoa.
Theriogenology 38, 999-1012
MORRIS, L. H. A., F. K. HOLLINSHEAD, G. EVANS u. W. M. C. MAXWELL (2003):
The longevity and acrosome status of stallion flow sorted spermatozoa.
Theriogenology 59, 512 (abstr.)
MORRIS, L. H. A., R. H. F. HUNTER u. W. R. ALLEN (2000):
Hysteroscopic insemination of small numbers of spermatozoa at the uterotubal junction of
preovulatory mares.
J. Reprod. Fertil. 118, 95-100
MORUZZI, J. F. (1979):
Selecting a mammalian species for the separation of x- and y-chromosome-bearing
spermatozoa.
J. Reprod. Fertil. 57, 319-323
MULLER, W. u. F. GAUTIER (1975):
Interaction of heteroaromatic compounds with nucleic acids.
Eur. J. Biochem. 54, 385-394
MÜLLER, Z. (1987):
Practicalities of insemination of mares with deep-frozen semen.
J. Reprod. Fertil. Suppl.35, 121-125
NASH, T. (1996):
Chemical constitution and physical properties of compounds able to protect living cells
against damage due to freezing and thawing.
Cryobiol. 1996 , 179-210

111
OBANDO, H., T. TAMAYO u. A. CASTRO (1984):
Evaluation of some factors affecting swine spermatozoa during freezing.
in: 10th Int.Congr.on Anim.Reprod.and AI, Urbana 1984, 197
OSMERS (1983):
Vergleichende Tiefgefrierversuche an Bullensperma unter Verwendung eines
computergesteuerten programmierten Einfrierverfahrens mit induzierter Kristallisation
(Seeding).
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
O´BRIEN, J. K., F. K. HOLLINSHEAD, G. EVANS u. W. M. C. MAXWELL (2004):
In vivo development capacity of in vitro produced sexed embryos derived from sex-sorted
and re-cryopreserved frozen-thawed ram sperm.
Reprod. Fertil. Dev. 16 (2), 286 (abstr.)
PACE, M. M. u. J. J. SULLIVAN (1975):
Effect of timing of insemination, numbers of spermatozoa and extender components on the
pregnancy rate in mares inseminated with frozen stallion semen.
J. Reprod. Fertil. Suppl.23, 115-121
PALMER, E. (1984):
Factors affecting stallion semen survival and fertility.
in: Proc.of the 10th Int.Congr.Anim.Reprod.and Artificial Insem., 1, 377
PARANACE, M., M. MEDINA, L. CATTANEO, J. CABALLERO, H. CERRATE, M.
DALLA LASTA u. KAISER (2003):
Embryo production using sexed semen in superovulated cows and heifers.
Theriogenology 59, 513 (abstr.)
PARKS, J. E. u. J. K. GRAHAM (1992):
Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes.
Theriogenology 38, 209-222
PARKS, J. E. u. D. V. LYNCH (1992):
Lipid composition and thermotropic phase behaviour of boar, bull, stallion and rooster sperm
membranes.
Cryobiol. 29, 255-266
PARRILLA, I., J. M. VAZQUEZ, M. OLIVER-BONET, J. NAVARRO, J. YELAMOS, J.
ROCA u. E. A. MARTINEZ (2003):
Fluorescence in situ hybridization in diluted and flow cytometrically sorted boar spermatozoa
using specific DNA direct probes labelled by nick translation.
Reproduction 126, 317-325

112
PENFOLD, L. M., C. HOLT, W. V. HOLT, G. R. WELCH, D. G. CRAN u. L. A. JOHNSON
(1998):
Comparative motility of x and y chromosome bearing sperm separated on the basis of DNA
content by flow sorting.
Mol. Reprod. Dev. 50, 323-327
PICKETT, B. W. u. R. P. AMANN (1993):
Cryopreservation of semen.
in: MCKINNON, A.O. and J.L. VOSS (Hrsg.): Equine Reproduction.
Lea & Febiger, Philadelphia, London, S.769-789
PICKETT, B. W., E. L. SQUIRES u. A. O. MCKINNON (1987):
Procedures for collection, evaluation and utilization of stallion semen for artificial
insemination.
Anim. Reprod. Lab. Bull. No. 3, CSU, Fort Collins
PICKETT, B. W. u. J. L. VOSS (1975):
The effect of semen extenders and sperm number on mare fertility.
J. Reprod. Fertil. Suppl.23, 95-98
PICKETT, B. W., J. L. VOSS, E. L. SQUIRES, D. K. VANDERWALL, P. M. MCCUE u. J.
E. BRUEMMER (2000):
Collection, preparation and insemination of stallion semen.
Anim. Reprod. Lab. Bull. No. 10, CSU, Fort Collins , 94-95
POLGE, C., A. U. SMITH u. A. S. PARKES (1949):
Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures.
Nature 164, 666
PRESICCE, G., S. VERBERCKMOES, E. SENATORE, P. KLINC u. D. RATH (2005):
First Established Pregnancies in Mediterranean Italian Buffaloes (Bubalas bubalis) Following
Deposition of Sexed Spermatozoa near the Utero Tubal Junction.
Reprod. Dom. Anim. 40 (1), 73-75
PROBST (2001):
Die Intracytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit geschlechtsspezifisch sortierten
Spermien in aktivierten Oozyten beim Schwein.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
PRUITT, J. A., M. J. ARNS u. K. C. POOL (1993):
Seminal plasma influences recovery of equine spermatozoa following in vitro culture (37°C)
and cold-storage (5°C).
Theriogenology 39, 291 (abstr.)
PURSEL, V. G. (1983):
Effect of processing of semen on capacitation time of fresh and frozen-thawed boar
spermatozoa.
J. Anim. Sci. 56, 1161-1166

113
PURSEL, V.G. u. C.S. PARKS (1985):
Freezing and thawing procedures for boar spermatozoa.
in: 1st Int.Conf.on Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala 1985, 147-166
PURSEL, V. G., L. L. SCHULMAN u. L. A. JOHNSON (1978a):
Distribution and morphology of fresh and frozen-thawed sperm in the reproductive tract of
gilts after artificial insemination.
Biol. Reprod. 19, 69-76
PURSEL, V. G., L. L. SCHULMAN u. L. A. JOHNSON (1978b):
Effect of glycerol concentration on frozen boar sperm.
Theriogenology 9, 305-312
RATH, D., L. A. JOHNSON, J. R. DOBRINSKY u. G. R. WELCH (1997):
Production of piglets preselected for sex following in vitro fertilization with X- and Ychromosome-bearing
spermatozoa sorted by flow cytometry.
Theriogenology 47, 795-800
RATH, D., C. R. LONG, J. R. DOBRINSKY, G. R. WELCH, L. L. SCHREIER u. L. A.
JOHNSON (1999):
In vitro production of sexed embryos for gender preselection: high speed sorting of Xchromosome-bearing
sperm to produce piglets after embryo transfer.
J. Anim. Sci. 77, 3346-3352
RATH, D., B. SIEG, J. LEIGH, P. KLINC, M. BESSELING, C. KRÜGER, A. WOLKEN, A.
FRENZEL, P. WESTERMANN, S. PROBST, R. GROßFELD, K.G. HADELER u. C.
EHLING (2003):
Current perspectives of sperm sorting in domestic farm animals.
in: Proc.19th Meeting Association Europeenne de Transfert Embryonnaire, Rostock 2003,
125-128
RATH, D. u. H. SIEME (2003):
Sexing of Stallion Semen.
Pferdeheilkd. 19 (6), 675-676
RENS, W., G. R. WELCH u. L. A. JOHNSON (1999):
Improved flow cytometric sorting of X- and Y- chromosome bearing sperm: Substantial
increase in yield of sexed semen.
Mol. Reprod. Dev. 52, 50-56
RENS, W., G. R. WELCH u. L. A. JOHNSON (1998):
A novel nozzle for more efficient sperm orientation improve sorting efficiency of X and Y
chromosome bearing sperm.
Cytometry 33, 476-481

114
RÖBBELEN (1993):
Vergleichende Untersuchungen an unterschiedlich aufbereitetem Pferdetiefgefriersamen.
Einfluß verschiedener Tiefgefrierverdünner, der Anpassungszeit sowie variierter
Einfriergeschwindigkeit auf Motilität und Membranintegrität der Samenzellen.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
SAACKE, R.G., J.C. DALTON, S. NADIR, J. BAME u. R.L. NEBEL (1998):
Spermatozoal charactersistics important to sperm transport, fertilization and early embryonic
development.
in: LAURIA,A.(Hrsg.): Gametes: Development and function.Serona Symposia, Rom 1998,
320-335
SAACKE, R. G., J. C. DALTON, S. NADIR, R. L. NEBEL u. J. BAME (2000):
Relationship of seminal traits and insemination time to fertilization rate and embryo quality.
Anim. Reprod. Sci. 60-61, 663-677
SALAMON, S. (1973):
Deep freezing of boar semen III: Effects of centrifugation, diluent and dilution rate.
Aust. J. Biol. Sci. 26, 239-247
SALAMON, S., W.M.C. MAXWELL u. G. EVANS (1985):
Fertility of ram semen frozen-stored for 16 years.
in: Proc.Australian Soc.Reprod.Biol., Adelaide 1985
SALEM, M. H., M. Y. MEKKAWY, N. A. AHMED, I. Y. ABDEL-AZIZ, A. A.
MOHAMED, H. A. EL-OKSH u. V. G. PURSEL (1992):
Effect of cyclic AMP on fructose utilization, progressive motility and protein synthesis by
ram spermatozoa.
Theriogenology 37, 1061-1074
SAMPER, J. C. (1995):
Stallion semen cryopreservation: Male factors affecting pregnancy rates.
Theriogenology Proc. Soc. Study, 160-165
SAMPER, J. C., J. C. HELLANDER u. B. G. CRABO (1991):
Relationship between the fertility of fresh and frozen stallion semen and semen quality.
J. Reprod. Fertil. Suppl.44, 107-114
SCHENK, J. L. u. D. L. DEGROFFT (2003):
Insemination of cow elk with sexed frozen semen.
Theriogenology 59, 514 (abstr.)
SCHENK, J. L., T. K. SUH u. G. E. JR. SEIDEL (1999):
Cryopreservation of flow-sorted bovine spermatozoa.
Theriogenology 52, 1375-1391

115
SCHMID, R. L., H. KATO, L. A. HERICKHOFF, J. L. SCHENK, P. M. MCCUE, Y. G.
CHUNG u. E. L. SQUIRES (2000):
Effects of follicular fluid or progesterone on in vitro maturation of equine oocytes before
intracytoplasmatic sperm injection with nonsorted and sex-sorted spermatozoa.
J. Reprod. Fertil. Suppl.56, 519-525
SCHNORR, B. (1989):
Embryologie der Haustiere
Verlag Enke, Stuttgart, S.12, 35
SCHWARTZ, D., P. D. M. MCDONALD u. V. HEUCHEL (1981):
On the relationship between the number of spermatozoa and the probability of conception.
Reprod. Nutr. Dev. 21, 979-988
SEIDEL, G. E., L. A. HERICKHOFF, J. L. SCHENK, S. P. DOYLE u. R. D. GREEN
(1998):
Artificial insemination of heifers with unfrozen sexed semen.
Theriogenology 49, 365 (abstr.)
SEIDEL, G. E. u. L. A. JOHNSON (1999):
Sexing mammalian sperm - overview.
Theriogenology 52, 1267-1272
SEIDEL, G. E. JR. u. D. L. GARNER (2002):
Current status of sexing mammalian spermatozoa.
Reproduction 124, 733-743
SEIDEL, G. E. JR., J. L. SCHENK, L. A. HERICKHOFF, S. P. DOYLE, Z. BRINK, R. D.
GREEN u. D. G. CRAN (1999):
Insemination of heifers with sexed sperm.
Theriogenology 52, 1407-1420
SIEME, H., A. BONK, H. HAMANN, E. KLUG u. T. KATILA (2004):
Effects of different artificial insemination techniques and sperm doses on fertility of normal
mares and mares with abnormal reproductive history.
Theriogenology 62, 915-928
SIEME, H., A. BONK, J. RATJEN, E. KLUG u. D. RATH (2003):
Effect of sperm number and site / technique of insemination on pregnancy in mares.
Pferdeheilkd. 19 (6), 677-683
SINGER, S. J. u. G. L. NICHOLSON (1972):
The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.
Science 175, 720-731
SQUIRES, E. L., S. L. KEITH u. J. K. GRAHAM (2004):
Evaluation of alternative cryoprotectants for preserving stallion spermatozoa.
Theriogenology 62, 1056-1065

116
SQUIRES, E.L. u. B.W. PICKETT (1995):
Pregnancy rates with cryopreserved semen.
in: Proc.of the techniques for handling and utilization of transported cooled and frozen equine
spermatozoa, Fort Collins, CO, USA, 106
SQUIRES, E. L., B. W. PICKETT, J. K. GRAHAM, D. K. VANDERWALL, P. M. MCCUE
u. J. E. BRUEMMER (1999):
Cooled and Frozen Stallion Semen.
Anim. Reprod. and Biotechnol. Lab. Bull. No. 9, CSU, Fort Collins, CO, USA
STAP, J., R. A. HOEBE, J. S. MERTON, R. M. HARING, P. J. M. BAKKER u. J. A. ATEN
(1998):
Improving the resolution of cryopreserved x- and y-sperm during DNA flow cytometric
analysis with the addition of percoll to quench the fluorescence of dead sperm.
J. Anim. Sci. 76, 1896-1902
STEPONKUS, P. L. u. D. V. LYNCH (1989):
Freeze/thaw-induced destabilization of the plasma membrane and the effects of cold
acclimation.
J. Bioenerg. Biomembr. 21, 21-41
THORMÄHLEN (1973):
Dichtegradientenzentrifugation von Samenzellen und Beeinflussung des Geschlechtes von
Nachkommen des Kaninchens.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
VAZQUEZ, J. M., E. A. MARTINEZ, I. PARRILLA, J. ROCA, M. A. GIL u. J. L.
VAZQUEZ (2003):
Birth of piglets after deep intrauterine insemination with flow cytometrically sorted boar
spermatozoa.
Theriogenology 59, 1605-1614
VENGUST, M., M. TOMSIK, S. JANZEKOVIC u. J. SENEGACNIK (1989):
Neue Erfahrungen zur Problematik der Gefriertauglichkeit von Bullen-, Eber-, Hengst- und
Schafsamen.
in: 36.Int.Fachtagung "Fortpflanzung und Besamung", Wels, Österreich 1989
VIDAMENT, M., E. COGNARD, M. MAGISTRINI u. E. PALMER (1997a):
Comparison of 8 criteria estimating various aspects of frozen-thawed stallion spermatozoa.
in: 34th Annual meeting of the society of cryobiology, Barcelona 1997a, abstr. 94
VIDAMENT, M., A. M. DUPÈRE, P. JULIENNE, P. EVAIN, P. NOUE u. E. PALMER
(1997b):
Equine frozen semen freezability and fertility field results.
Theriogenology 48, 907-917

117
VIDAMENT, M., E. COGNARD, J. M. YVON, M. SATTLER, E. PALMER u. M.
MAGISTRINI (1998a):
Evaluation of stallion semen before and after freezing.
Reprod. Dom. Anim. 33, 271-277
VIDAMENT, M., P. ECOT, A.M. DUPÉRÉ, P. NOUE, C. BOURGEOIS, C. COUTY, J.M.
YVON, M. MAGISTRINI u. E. PALMER (1998b):
La semence congelée d´étalon: améliorations récentes.
in: 24ème Journée de la recherche équine, 25-38
VIDAMENT, M., J. M. YVON, I. COUTY, G. ARNAUD, J. NGUEKAM-FEUGANG, P.
NOUE, S. COTTRON, A. LE TELLIER, F. NOEL, E. PALMER u. M. MAGISTRINI
(2001):
Advances in cryopreservation of stallion semen in modified INRA82.
Anim. Reprod. Sci. 3-4, 201-218
VINCENT, P., J.M. YVON, F.X. MARTIN, B. BRUNEAU, V. CINQUALBRE, C.
BERLAND, B. BITEAU u. M. VIDAMENT (2004):
Le glycérol est-il un facteur limitant pour la conservation de la semence dans les espèces asine
et équine?
in: 30ème journée de la recherche équine, Les Haras Nationaux (Direction de connaissances),
55-62
VOLKMANN, D. H. u. D. VAN ZYL (1987):
Fertility of stallion semen frozen in 0,5ml straws.
J. Reprod. Fertil. Suppl. 35, 143-148
WABERSKI, D., A. PETROUNKINA, K. F. WEITZE u. E. TÖPFER-PETERSEN (1999):
In-vitro Beurteilung von Sperma zur Vorhersage der Fertilität.
Tierärztl. Prax. 27 (G), 1-7
WANG, W. H., L. R. ABEYDEERA, L. R. FRASER u. K. NIWA (1995):
Functional analysis using chlortetracycline fluorescence and in vitro fertilization of frozenthawed
ejaculated boar spermatozoa incubated in a protein-free chemically defined medium.
J. Reprod. Fertil. 104, 305-313
WARD, C. R. u. B. T. STOREY (1984):
Determination of the time course of capacitation in mouse spermatozoa using
chlortetracycline fluorescence assay.
Dev. Biol. 104, 287-291
WATSON, P. F. (1995):
Recent developments and concepts in cryopreservation of spermatozoa and the assessment of
their post-thawing function.
Reprod. Fertil. Dev. 7, 871-891

118
WATSON, P. F. (2000):
The causes of reduced fertility with cryopreserved semen.
Anim. Reprod. Sci. 60-61, 481-492
WATSON, P.F. u. C.E. GREEN (1999):
Cooling and capacitation of boar sperm: what do they have in common?
in: Proc.IV Int.Conf.of Boar Semen Preserv., Beltsville 1999
WATSON, P.F. u. J.M. PLUMMER (1985):
The response of boar sperm membranes to cold shock and cooling.
in: 1st Int.Conf.on Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala 1985, 113-127
WEITZE, K. F. (2001):
Assistierte Techniken: Prinzipien der Verdünnung und Konservierung.
in: BUSCH, W. and A. HOLZMANN (Hrsg.): Veterinärmedizinische Andrologie.
Verlag Schattauer, Stuttgart, S.511-517
WEITZE, K. F., D. RATH u. G. BARON (1987):
Neue Aspekte der Tiefgefrierkonservierung von Ebersperma in Plastikrohren.
Dtsch. tierärztl. Wochenschrift 94, 441-496
WELCH, G. R. u. L. A. JOHNSON (1999):
Sex preselection: Laboratory validation of the sperm sex ratio of flow-sorted X- and Y-sperm
by reanalysis for DNA.
Theriogenology 52, 1343-1352
WELCH, G. R., G. C. WALDBIESER, R. J. WALL u. L. A. JOHNSON (1995):
Flow cytometric sperm sorting and PCR to confirm separation of x- and y-chromosome
bearing bovine sperm.
Anim. Biotechnol. 6, 131-139
YOSHIDA, M. (2000):
Conservation of sperms: Current status and new trends.
Anim. Reprod. Sci. 60-61, 349-355
ZERBE, H., H. J. SCHUBERTH, F. ENGELKE, J. FRANK, E. KLUG u. W. LEIBOLD
(2003):
Development and comparison of in vivo and in vitro models for endometritis in cows and
mares.
Theriogenology 60 (2), 209-223

9 Anhang
119
9.1 Zusammensetzung der verwendeten Verdünner und Trägerflüssigkeiten
9.1.1 KMT
Inhaltsstoffe Einheit Menge
1. Komponente : KENNEY = EZ Mixin
Aqua bidest. [ml] 100
Glucose [g] 4,9
Magermilchpulver [g] 2,4
2. Komponente: MODIFIED TYRODE`S
Aqua bidest. [ml] 100
NaCl [mg] 420
KCl [mg] 187
NaHCO3 [mg] 210
NaH2PO4 [mg] 5
Lactic acid (60%) [ml] 0,31
CaCl2 [mg] 29
MgCl2 x 6 H2O [mg] 17
HEPES [mg] 238
Na Pyruvat [mg] 11
pH 6,9
65% Kenney extender (EZ Mixin) + 35% Modified Tyrodes miteinander vermischen, dann
Antibiotika hinzufügen:
Penicillin [g/l] 0,05
Streptomycin [g/l] 0,058

9.1.2 INRA 82
120
Inhaltstoffe Einheit Menge
INRA 82 = Französischer Verdünner
Aqua bidest. [l] 1
Glucose [g] 50
Lactose-Monohydrat [g] 3
Raffinose x 5H2O [g] 3
Na Citrat x 2 H2O [g] 0,5
K Citrat x H2O [g] 0,82
HEPES [g] 9,52
Penicillin [g] 1
Gentamycin [g] 1
Magermilch (0,3% Fett) [l] 1
Für den TG Verdünner:
INRA 82 [ml] 935
Eidotter 1
[ml] 40
Glycerin 2,5 % bzw. 5 %
≅ 25 ml bzw. 50 ml
1 Eidotter und Aqua bidest. 1:1 verdünnen und 10 min. bei 15.000*g zentrifugieren. Daraus
den Überstand verwenden.

9.1.3 Lactose-EDTA
121
Inhaltsstoffe Einheit
1. Komponente (11% Lactose)
Lactose [g] 11
Aqua bidest. [ml] 100
2. Komponente (Glucose/EDTA)
Glucose [g] 6
NaCitrat [g] 0,37
Na EDTA [g] 0,37
NaHCO3 [g] 0,12
Aqua bidest. [g] 100
Komponente 1 [ml] 50
Komponente 2 [ml] 25
Eidotter [ml] 20
Equex STM [ml] 0,5
Penicillin-G [g] 0,06
Streptomycin [g] 0,06
Bei 1000*g für 30 Minuten zentrifugieren. Den Überstand verwenden. Diesem kurz vor
Gebrauch 4% Glycerin zufügen.

9.1.4 TEST- Auffangmedium
122
Inhaltsstoffe Einheit 2%-TEST-Eidotter-Lösung
Aqua bidest. [ml] 50
TES [g] 2,1629
Tris [g] 0,5135
Glucose [g] 0,1
Streptomycin-Sulfat [g] 0,0125
Penicillin [g] 0,0075
Frischer Eidotter (2%) [ml] 1,25
Bei 850*g 10minzentrifugieren, den Überstand verwenden.
pH 7,4
9.1.5 PBS
Inhaltsstoffe Einheit
Aqua bidest. [ml] 500
Na-Pyruvat [g] 1,8
Glucose-Monohydrat [g] 54,99
CaCl2 x H2O [g] 6,65
Streptomycin [g] 2,5
Penicillin [g] 3

9.1.6 Stallion Sheath Fluid
Inhaltsstoffe Einheit
123
Aqua bidest. [l] 1
CaCl2 x H2O [g] 0,14
KCl [g] 0,37
MgCl2 x 6 H2O [g] 0,1
NaH2PO4 x H2O [g] 0,03
NaCl [g] 6,54
Na-Pyruvat [g] 0,02
Lactic acid (60%) [ml] 3,51
HEPES [g] 2,38
NaHCO3 [g] 0,42
Penicillin G [g] 0,058
Streptomycin Sulfate [g] 0,05
pH 7,2
9.2 Zusammensetzung der verwendeten Stamm- und Färbelösungen
9.2.1 PNA-Färbelösung
• Anlegen einer Stammlösung mit einer Konzentration von 1mg/ml aus PNA (Sigma L-
7381; Sigma Chemical Co., Deisenhofen) und PBS
• Jeweils 20µl dieser Stammlösung in Eppendorfreagenzgefäße (Fa. Eppendorf-Netheler-
Hintz-GmbH, Hamburg) abfüllen und im Tiefkühlfach, bei –18°C und vor Licht
geschützt, lagern
• Ein 20µl Gefäß auftauen und mit 480µl PBS verdünnen, um eine Endkonzentration von
10µg/ml zu erhalten
• Jede Arbeit mit dem Farbstoff unter Ausschluss von Licht vornehmen

9.2.2 Eosin-Nigrosin
124
• 0,67 g Eosin Y (C.I. 45380, Europa M 15935) und
0,9 g NaCl in 100ml Aqua bidest. unter leichtem Erhitzen mischen
• 10 g Nigrosin (C.I. 50420, Europa M 15924) hinzugeben
• Lösung aufkochen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen
• Lösung durch ein Filterpapier geben und in einer dunklen Glasflasche lagern
9.2.3 UCD Mounting Medium
• 8 ml PBS mit 2 ml Glyzerin mischen
• 100mg/ml DABCO (1,4 Diazabicyclo-(2.2.2)-octane, Fa. Sigma) zugeben
• nach guter Mischung aliquotieren (2ml) und bei 4°C lagern

125
10 Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1: Darstellung des Funktionsprinzips eines Flowzytometers zum Sortieren
von Hengstspermien........................................................................................ 30
Abbildung 2: Schematische Darstellung des akrosomalen Status der FITC-PNA-
Färbung............................................................................................................ 48
Abbildung 3: Temperaturverlauf bei Kühlung in einem 95ml-Wassermantel von
Raumtemperatur auf 5°C in 2,5 h.................................................................... 55
Abbildung 4: Temperaturverlauf in den Tiefgefriersystemen Styroporbox und
automatischer Gefrierapparat und jeweils drei unterschiedlichen
Verdünnern bzw. Glyzerinkonzentrationen .................................................... 62
Abbildung 5: Typische Temperaturkurven für die Tiefgefriersysteme Box und
Maschine im Bereich des Rebound-Effektes .................................................. 63

11 Verzeichnis der Tabellen
126
Tabelle 1: Einfluss der Besamungstechnik mit ungesextem Sperma auf die
Trächtigkeitsrate von Stuten (mod. nach SIEME et al. 2004) ........................ 38
Tabelle 2: Individuelle Unterschiede der Anteile insgesamt beweglicher und
vorwärtsbeweglicher Spermien nach dem Auftauen bei Hengsten (mod.
nach LINDSEY et al. 2002b) .......................................................................... 42
Tabelle 3: Hysteroskopische und nicht chirurgische intrauterine Besamung mit
gesexten und ungesexten Spermien bei Verwendung verschiedener
Konzentrationen von frischen und gelagerten gesexten Spermien sowie
tiefgefrorenen/aufgetauten Spermien (mod. nach BUCHANAN et al.
2000; LINDSEY et al. 2001, 2002a, b, c, 2005)............................................. 43
Tabelle 4: Mindestanforderungen an Hengstsperma (mod. nach Richtlinien des
Instituts für Reproduktionsmedizin, Tierärztliche Hochschule Hannover) .... 46
Tabelle 5: Auswertungsschema zur Erfassung der morphologischen Spermien-
veränderungen (nach BARTH u. OKO 1989)................................................. 49
Tabelle 6: Anlegen einer Reihe von Konzentrationen mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Hoechst 33342................................................................................................. 50
Tabelle 7: Glyzerinkonzentrationen bei Zugabe von 70µl Verdünner............................. 52
Tabelle 8: Kryokonservierungsgruppen für den Besamungsversuch............................... 59
Tabelle 9: Anzahl produzierter Pailletten und Anzahl Besamungsportionen .................. 60
Tabelle 10: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien
[%] von Hengst 1 nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei
Verwendung unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen...... 65
Tabelle 11: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien
[%] von Hengst 1 nach Tiefgefrierung in der Styroporbox bei
Verwendung unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen...... 66
Tabelle 12: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien
[%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung im Gefrierautomaten bei
Verwendung unterschiedlicher Verdünner und Glyzerinkonzentrationen...... 67

127
Tabelle 13: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien
[%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung in der Styroporbox bei
Verwendung unterschiedlicher Verdünnerr und Glyzerinkonzentrationen .... 68
Tabelle 14: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien
[%] von zwei Hengsten (1 und 2) nach Tiefgefrierung im
Gefrierautomaten bei Verwendung unterschiedlicher Verdünner und
Glyzerinkonzentrationen ................................................................................. 69
Tabelle 15: Anteil beweglicher sortierter und nicht sortierter aufgetauter Spermien
[%] von zwei Hengsten (1 und 2) nach Tiefgefrierung in der
Styroporbox bei Verwendung unterschiedlicher Verdünner und
Glyzerinkonzentrationen ................................................................................. 70
Tabelle 16: Anteil intakter Akrosome [%] bei aufgetauten Spermien von Hengst 1
nach Tiefgefrierung mit zwei unterschiedlichen Systemen, Verdünnern
und Glyzerinkonzentrationen .......................................................................... 71
Tabelle 17: Anteil intakter Akrosome [%] bei aufgetauten Spermien von Hengst 2
nach Tiefgefrierung mit zwei unterschiedlichen Systemen, Verdünnern
und Glyzerinkonzentrationen .......................................................................... 71
Tabelle 18: Anteil intakter Akrosome [%] bei aufgetauten Spermien von zwei
Hengsten (1 und 2) nach Tiefgefrierung mit zwei unterschiedlichen
Systemen, Verdünnern und Glyzerinkonzentrationen .................................... 71
Tabelle 19: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter
aufgetauter Spermien [%] von Hengst 1 nach Tiefgefrierung im
Gefrierautomaten bei Verwendung von zwei unterschiedlichen
Verdünnern und Glyzerinkonzentrationen...................................................... 72
Tabelle 20: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter
aufgetauter Spermien [%] von Hengst 1 nach Tiefgefrierung in der
Styroporbox bei Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern
und Glyzerinkonzentrationen .......................................................................... 73
Tabelle 21: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter
aufgetauter Spermien [%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung im

128
Gefrierautomaten bei Verwendung von zwei unterschiedlichen
Verdünnern und Glyzerinkonzentrationen...................................................... 74
Tabelle 22: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter
aufgetauter Spermien [%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung in der
Styroporbox bei Verwendung von zwei unterschiedlichen Verdünnern
und Glyzerinkonzentrationen .......................................................................... 75
Tabelle 23: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter
aufgetauter Spermien [%] von Hengst 2 nach Tiefgefrierung im
Gefrierautomaten bei Verwendung von zwei unterschiedlichen
Verdünnern und Glyzerinkonzentrationen...................................................... 76
Tabelle 24: Anteil morphologisch veränderter sortierter und nicht sortierter
aufgetauter Spermien [%] von zwei Hengsten (1 und 2) nach
Tiefgefrierung in der Styroporbox bei Verwendung von zwei
unterschiedlichen Verdünnern und Glyzerinkonzentrationen......................... 77
Tabelle 25: Mittelwerte und Standardabweichungen der Spermienmotilität von
Hengst 1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Auftauen.................... 78
Tabelle 26: Mittelwerte und Standardabweichungen der Spermienmotilität von
Hengst 2 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Auftauen.................... 79
Tabelle 27: Mittelwerte und Standardabweichungen der Spermienmotilität von
beiden Hengsten (1 und 2) zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem
Auftauen.......................................................................................................... 80
Tabelle 28: Mittelwerte und Standardabweichungen des Anteils intakter Akrosome
[%] der für die Besamungsversuche tiefgefrorenen Proben nach dem
Auftauen.......................................................................................................... 81
Tabelle 29: Anteil morphologisch veränderter aufgetauter Spermien im für die
Besamungsversuche tiefgefrorenen Samen von Hengst 1 .............................. 82
Tabelle 30: Anteil morphologisch veränderter aufgetauter Spermien im für die
Besamungsversuche tiefgefrorenen Samen von Hengst 2 .............................. 83
Tabelle 31: Anteil morphologisch veränderter aufgetauter Spermien im für die
Besamungsversuche tiefgefrorenen Samen von beiden Hengsten (1 und
2) ..................................................................................................................... 84

Danksagung
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Bei Herrn Prof. Dr. Rath möchte ich mich herzlich für die Überlassung dieses interessanten
Themas sowie die Förderung und Unterstützung bei der Arbeit bedanken.
Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Harald Sieme für die Betreuung dieser Arbeit und
die zwei ausgesprochen lehrreichen und heiteren Saisons in der Besamungsstation Celle.
Herrn Landstallmeister Dr. Bade sowie allen Mitarbeitern des Niedersächsischen Landgestüts
Celle danke ich für die freundliche Zusammenarbeit. Vor allem sei Jan für zwei Jahre
frühmorgendliches Beisammensein und Eva für ihr bayrisches Lachen gedankt.
Ein ganz besonderer Dank gilt Birgit Sieg für ihr stetiges Engagement, ihre konstruktive
Kritik und ihren unermüdlichen Einsatz bis in den späten Feierabend. Ebenso danke ich
Christina Struckmann für ihre Mühen. Außerdem möchte ich mich an dieser Stelle bei Primoz
Klinc und Jennifer Clulow bedanken. Allen anderen Mitarbeitern der Abteilung
Biotechnologie im Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in
Mariensee sei natürlich ebenso gedankt. Herrn Dr. Baulain danke ich für seine nette und
bereitwillige Unterstützung in allen Fragen der Statistik.
Zu guter Letzt danke ich meiner Familie, die mir stets mit Rat, Tat und Aufmunterung zur
Seite stand und ohne deren Hilfe die Anfertigung der Dissertation nicht möglich gewesen
wäre.
Dirk danke ich besonders für seine Unterstützung, seine Aufmunterung und sein Verständnis
in dieser Zeit.