DNA im Zellkern - ZMBH

DNA im Zellkern
Dezember 2009
Elmar Schiebel, ZMBH

Das Genom
von E.coli
Hefegenom: 12 Mb
Menschliches Genom: 3000 Mb
Das Genom von E. coli besteht aus einem frei in der Zelle liegenden
ringförmigen DNA-Molekül. Der codierende Anteil ist fast 90%.

Konzentration
von Enzymen
und Substraten
Regulation
Schutzfunktion
Eukaryotische Zellen haben Kompartimente

Die Kernmembran als Barriere

Die Kernmembran

Die Tatsache, dass das genetische Material in eukaryotischen Zellen
in einem spezialisierten Kompartiment aufbewahrt und transkribiert
wird, macht gerichtete Transportprozesse erforderlich.

Transportprozesse durch die Kernmembran werden von
Kernporenkomplexen vermittelt. Das Bild zeigt Kerne von
Zellkulturzellen, bei denen die Kernporenkomplexe mit einem
fluoreszierenden Protein markiert wurden.
Dirk Görlich
Ionen, kleine Moleküle und kleinere Proteine können frei durch die
Poren diffundieren. Größere Moleküle werden aktiv (d.h. unter Energieverbrauch)
durch die Poren geschleust.

Kernporenkomplex
Alber et al. Nature (2007)

Ein System von Import- und Export-Signalen legt den Zielort der
Proteine fest. Entsprechende Rezeptoren vermitteln den Transport
durch die Kernpore. Energie wird dem System in Form von GTP-
Hydrolyse durch die GTPase Ran zugeführt.
Knippers, Plus6.1

Chromosomale DNA

Das menschliche Genom ist auf 22 Autosomen und zwei Geschlechtschromosomen
verteilt (46 Chromosomen pro Zelle). Individuen unterscheiden
sich typischerweise in 0.1% der Sequenz. Die Gene sind in
codierende und nicht-codierende Bereiche unterteilt (Exons und
Introns).

Das menschliche Genom in Zahlen:
Gesamtlänge
Anzahl der Gene
größtes Gen
mittlere Gengröße
mittlere Zahl an Exonen
pro Gen
größtes Exon
mittleres Exon
DNA in Exonen
DNA in repetitiven
Elementen
3 x 10 9 Basenpaare
ungefähr 25 000
2 x 10 6 Basenpaare!
27 000 Basenpaare
9
17 000 Basenpaare
145 Basenpaare
1.5%
ungefähr 50%
Bemerkungen
haploides Genom
produzieren teilweise
alternative Transkripte
Dystrophin
1 bis 178
Titin (fast 30 000 AS!!!)

Anteil von DNA-Sequenz verschiedener Kategorien
am Genom:
LINE: long interspersed repetitive elements (6000-7000 bp)
SINE: short interspersed repetitive elements (ca. 300 bp)
Heterochromatin: besonders kompaktes Chromatin (DNA+Proteine)
“Inaktives Chromatin”, im Gegensatz zu Euchromatin

LINEs (Long interspersed elements): Transposon des menschlichen
Genoms = Junk DNA
Das menschliche Genom beinhaltet 868,000 LINEs (20.4% des Genoms).
L1 Elemente sind DNA Sequenzen die von 100 - 9,000 bp lang sind.
Nur ungefähr 50 L1 Elements sind funktionell.
Ein funktionelles L1 elements (6,500 bp lang) kodiert für mehrere Proteine:
Endonuclease, Reverse-Transkriptase (macht eine DNA Kopie aus einem of an
RNA Transkript).
Die Reverse-Transkriptase kopiert die L1 RNA in L1 DNA.
Diese wird ins Genom inseriert.
Die Diversität zwischen einzelnen Individuen machen LINEs zu einem nützliche
Werkzeug für DNA "fingerprinting".
L1 Aktivität machen manchmal Kopien von mRNAs. Diese Gene werden nicht
exprimiert, da die Promoterregion fehlt: Pseudogen.

SINEs (Short interspersed elements)
SINEs sind kurze DNA Sequenzes (100–400 bp) welche revers transkribierte RNA
(RNA polymerase III) Transkripte repräsentieren: tRNA, 5S rRNA, und andere
kleine nukleäre RNAs.
Über eine Million AluI Elemente gibt es im menschlichen Genom (10.6%):
reverse Transkripte einer 7S RNA, welche Bestandteil des Signal Recognition Particles
ist.
Brauchen L1 Elemente für ihre Vermehrung.

Chromatinstruktur/organisation
Übersicht

6-7 X
40 x
Chromatin besteht aus
den genomischen DNA-
Molekülen und Proteinen.
Die platzsparende Verpackung
der DNA wird
durch das Aufwickeln um
Nukleosomen-Kerne
bewerkstelligt. Diese
bestehen aus Histonen.
Weiterhin gehören Nicht-
Histon-Proteine, wie RNA-
Polymerase oder
Transkriptionsfaktoren,
zum Chromatin.
Knippers, Abb 6.10

Molekulares Verständnis

Elektronenmikroskopische Darstellung von
Nukleosomen (Längenmaßstab 50 nm).
Eine diploide menschliche Zelle enthält
ca. 30 * 10 6 Nukleosomen. Diese erste
Stufe der Verpackung verkürzt das
DNA-Molekül gegenüber seiner ursprünglichen
Länge auf das 6-7 fache.
Die Nukleosomen-Kerne können durch
Verdau mit einer Nuklease präpariert
und auf ihre Proteinzusammensetzung
hin untersucht werden.

Histone sind relativ kleine, stark
basische Proteine (s. SDS-Gelelektrophorese),
die im Verlauf der Evolution
extrem wenig Abwandlung erfahren
haben.
Der Nukleosomen-Kern enthält ein
Histon-Oktamer aus H2A/B und
H3/H4-Proteinen.
Knippers, Abb 6.3

Histone haben eine
zentrale Domäne und
flexible N- bzw. Cterminale
Enden.
Das Histon-Oktamer
bildet sich aus einem
H3/H4-Tetramer
und zwei H2A/H2B-
Dimeren. Weiterhin
findet man 200 bp
aufgewickelte DNA
und ein Molekül H1 im
Nukleosom.
Knippers, Abb 6.4

Knippers, Abb 6.7/8
Das Faltungsmuster der Histone aus drei alpha-Helices vermittelt die
Histon-Histon-Interaktionen im Inneren des Nukleosomen-Kerns.
Histon H1 sitzt außen am Nukleosom und ist beteiligt an der weiteren
Verpackung der DNA in die 30 nm-Faser (40-fache Komprimierung).

Im Unterschied zur sequenzspezifischen Bindung von Proteinen an DNA
kann im Nukleosom DNA beliebiger Sequenz gebunden werden. Z. B.
wird die Hälfte der 142 Wasserstoffbrückenbindungen pro Nukleosom
zwischen Peptid- und Phosphodiester-Rückrad ausgebildet. Weiterhin
tragen viele hydrophobe Wechselwirkungen und Salzbrücken zu der
kompakten Struktur bei.

Veränderung der
Chromatinstruktur
Histone Code

Aus dem globulären Histon-
Kern ragen die flexiblen N-
Termini der Histone heraus.
Sie tragen vermutlich zu
den Interaktionen zwischen
den Nukleosomen in der
30 nm-Faser bei.
Die N-Termini der Histone
weisen eine Vielzahl von
posttranslationalen Modifikationen
auf. Diese bilden
ein Markierungssystem
(„Histon-Code“).

Modifikation von Aminosäureseitenketten
in den N-Termini der Histone:
Acetylierung: Übertragung einer
Acetyl-Gruppe auf die Epsilon-Amino-
Gruppe der Aminosäure Lysin
Methylierung: Übertragung einer
Methyl-Gruppe auf die Epsilon-Amino-
Gruppe von Lysinen
Phosphorylierung: Übertragung einer
Phosphatgruppe auf die Hydroxylfunktion
von Serin-Seitenketten
Beachte, dass sich der Ladungszustand
der Histon-Schwänze durch die Modifikationen
drastisch ändern kann. Wie
stark sich das strukturell auswirkt, ist
umstritten.
Knippers, Abb 6.5

Die Acetylierung von Lysin-Seitenketten in den N-Termini der Histone
wird von Histon-Acetyl-Transferasen (HATs) durchgeführt. Die
Acetyl-Gruppe wird im aktiven Zentrum der HAT von Coenzym A auf
den Histon-Schwanz übertragen.
Die Acetylierung ist eine reversible
Modifikation. Das Entfernen der Acetyl-
Gruppen wird von Histon-Deacetylasen
(HDACs) katalysiert.

Die Kombination der verschiedenen möglichen Modifikationen erzeugt
eine große Vielfalt von Histon-Varianten.
Die Modifikationen wirken sich auf die Struktur des Chromatins aus.
Bestimmte Varianten oder Kombinationen davon werden spezifisch von
anderen Proteinen oder Proteinkomplexen erkannt.

Die Kombinatorik der Histon-Varianten ergibt einen „Code“, der für
die Regulation der Genexpression von zentraler Bedeutung ist.
Weiterhin spielen die Histon-Modifikationen bei der DNA-Replikation
und bei der Zellteilung eine wichtige Rolle.

Generell ist die Acetylierung der Histone mit einer
weniger kompakten Struktur des Chromatins korreliert.
Aktiv transkribiertes Chromatin weist daher viele
acetylierte Histone auf. Im Gegensatz dazu findet man
„unteracetylierte“ Histone in Bereichen, wo keine
Transkription stattfindet.
Ein Beispiel dafür ist die Inaktivierung der
„überschüssigen“ Gene auf dem zweiten weiblichen X-
Chromosom. Das Heterochromatin des inaktivierten X-
Chromosoms enthält eine besondere Variante des Histons
H2A, unteracetylierte Histone H3 und H4 und eine
spezifische Methylierung im N-Schwanz des Histons H3.

Ein Protein mit einer Bromodomäne bindet an ein
acetyliertes Lysin eines N-terminalen Restes eines Histons.
Ein Chromodomänprotein (40-50 aa) bindet an methyliertes
Chromatin.

Veränderung der Chromatinstruktur
Chromatinremodlingkomplexe

Experimenteller Nachweis der aufgelockerten Chromatin-Struktur in
aktiv transkribiertem Chromatin:
-- Vergleich der Nuclease-Zugänglichkeit des beta-Globin Gens in
Blutkörper-Vorläuferzellen und Kontrollzellen, die kein beta-Globin
exprimieren (MSB-Zellen).
-- Isolierung genomischer DNA, DNAseI-Verdau und „Southern-Blot“-
Technik (Verdau mit selten schneidendem Restriktionsenzym,
gelelektrophoretische Auftrennung, Transfer auf eine Membran,
Hybridisierung mit radioaktiver Sonde für das beta-Globin-Gen).
Lodish, Fourth Edition

Lodish, Fourth Edition
Mit steigender Nuclease-Konzentration verschwindet das charakteristische
BamHI-Fragment aus der genomischen DNA der Blutvorläuferzellen.
Die genomische DNA der nicht-exprimierenden Zellen
ist im Bereich des Globin-Gens für die Nuclease unzugänglich.

Veränderung der Chromatinstruktur
Nukleäre Architektur

Einzelne Chromosomen
besetzen verschiedene
„Territorien“ im Zellkern.
Gezeigt ist der Kern einer
menschlichen Lymphozyte.
Fluoreszenzmarkierte,
chromosomenspezifische
Sonden wurden verwendet,
um die Territorien des
Chromosoms 18 (rot) und 19
(hellblau) darzustellen.

Organisation der 24 menschlichen
Chromosomen während der
Prometaphase (Fibroblasten).

Chromatin und der Zellzyklus

Verdichtung der Chromosomen in der Mitose:
Pollard

Interphase
Mitose
6-7 X
40 x
10,000 x
Verkürzung

Elektronenmikroskopische
Darstellung von Interphase-Chromosomen
(A)
und einem kondensierten
mitotischen Chromosom
vor der Teilung der
Schwesterchromatiden
(B).

Funktionelle Bereiche von Chromosomen, die
wichtig für ihre Vererbung sind

Drei Elemente sind essentiell für die Replikation und Weitergabe von
Chromosomen in der Mitose:
-- mehr als ein Replikations-Ursprung (1) erlaubt die effiziente
Replikation eines großen Genoms:
E.coli - nur 1 Replikationsursprung, 4,7 10 6 Nuklotide; 1000 N pro Sec.
Dauer 40 min.
Mensch - menschliches Chromosom: 150 10 6 N; 50 N pro Sec; würde
14 Tage dauern, wenn nur ein Replikationsursprung vorhanden wäre.
-- Telomere (2) am Ende des Chromosoms ermöglichen die Replikation
von linearen DNA-Molekülen, außerdem schützen sie das Ende des
DNA-Moleküls
-- das Centromer (3) ist der Ansatzpunkt für die Trennung der
Schwester-Chromatiden durch den Spindel-Apparat; der Proteinkomplex,
der sich dort anheftet, heißt Kinetochor
-- an den Centromeren findet man Heterochromatin (besonders dicht
gepacktes Chromatin); die DNA im Bereich von Telomeren und
Centromeren ist hochrepetitiv („Satelliten-DNA“)