DNA im Zellkern - ZMBH
DNA im Zellkern - ZMBH
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<strong>DNA</strong> <strong>im</strong> <strong>Zellkern</strong><br />
Dezember 2009<br />
Elmar Schiebel, <strong>ZMBH</strong>
Das Genom<br />
von E.coli<br />
Hefegenom: 12 Mb<br />
Menschliches Genom: 3000 Mb<br />
Das Genom von E. coli besteht aus einem frei in der Zelle liegenden<br />
ringförmigen <strong>DNA</strong>-Molekül. Der codierende Anteil ist fast 90%.
Konzentration<br />
von Enzymen<br />
und Substraten<br />
Regulation<br />
Schutzfunktion<br />
Eukaryotische Zellen haben Kompart<strong>im</strong>ente
Die Kernmembran als Barriere
Die Kernmembran
Die Tatsache, dass das genetische Material in eukaryotischen Zellen<br />
in einem spezialisierten Kompart<strong>im</strong>ent aufbewahrt und transkribiert<br />
wird, macht gerichtete Transportprozesse erforderlich.
Transportprozesse durch die Kernmembran werden von<br />
Kernporenkomplexen vermittelt. Das Bild zeigt Kerne von<br />
Zellkulturzellen, bei denen die Kernporenkomplexe mit einem<br />
fluoreszierenden Protein markiert wurden.<br />
Dirk Görlich<br />
Ionen, kleine Moleküle und kleinere Proteine können frei durch die<br />
Poren diffundieren. Größere Moleküle werden aktiv (d.h. unter Energieverbrauch)<br />
durch die Poren geschleust.
Kernporenkomplex<br />
Alber et al. Nature (2007)
Ein System von Import- und Export-Signalen legt den Zielort der<br />
Proteine fest. Entsprechende Rezeptoren vermitteln den Transport<br />
durch die Kernpore. Energie wird dem System in Form von GTP-<br />
Hydrolyse durch die GTPase Ran zugeführt.<br />
Knippers, Plus6.1
Chromosomale <strong>DNA</strong>
Das menschliche Genom ist auf 22 Autosomen und zwei Geschlechtschromosomen<br />
verteilt (46 Chromosomen pro Zelle). Individuen unterscheiden<br />
sich typischerweise in 0.1% der Sequenz. Die Gene sind in<br />
codierende und nicht-codierende Bereiche unterteilt (Exons und<br />
Introns).
Das menschliche Genom in Zahlen:<br />
Gesamtlänge<br />
Anzahl der Gene<br />
größtes Gen<br />
mittlere Gengröße<br />
mittlere Zahl an Exonen<br />
pro Gen<br />
größtes Exon<br />
mittleres Exon<br />
<strong>DNA</strong> in Exonen<br />
<strong>DNA</strong> in repetitiven<br />
Elementen<br />
3 x 10 9 Basenpaare<br />
ungefähr 25 000<br />
2 x 10 6 Basenpaare!<br />
27 000 Basenpaare<br />
9<br />
17 000 Basenpaare<br />
145 Basenpaare<br />
1.5%<br />
ungefähr 50%<br />
Bemerkungen<br />
haploides Genom<br />
produzieren teilweise<br />
alternative Transkripte<br />
Dystrophin<br />
1 bis 178<br />
Titin (fast 30 000 AS!!!)
Anteil von <strong>DNA</strong>-Sequenz verschiedener Kategorien<br />
am Genom:<br />
LINE: long interspersed repetitive elements (6000-7000 bp)<br />
SINE: short interspersed repetitive elements (ca. 300 bp)<br />
Heterochromatin: besonders kompaktes Chromatin (<strong>DNA</strong>+Proteine)<br />
“Inaktives Chromatin”, <strong>im</strong> Gegensatz zu Euchromatin
LINEs (Long interspersed elements): Transposon des menschlichen<br />
Genoms = Junk <strong>DNA</strong><br />
Das menschliche Genom beinhaltet 868,000 LINEs (20.4% des Genoms).<br />
L1 Elemente sind <strong>DNA</strong> Sequenzen die von 100 - 9,000 bp lang sind.<br />
Nur ungefähr 50 L1 Elements sind funktionell.<br />
Ein funktionelles L1 elements (6,500 bp lang) kodiert für mehrere Proteine:<br />
Endonuclease, Reverse-Transkriptase (macht eine <strong>DNA</strong> Kopie aus einem of an<br />
RNA Transkript).<br />
Die Reverse-Transkriptase kopiert die L1 RNA in L1 <strong>DNA</strong>.<br />
Diese wird ins Genom inseriert.<br />
Die Diversität zwischen einzelnen Individuen machen LINEs zu einem nützliche<br />
Werkzeug für <strong>DNA</strong> "fingerprinting".<br />
L1 Aktivität machen manchmal Kopien von mRNAs. Diese Gene werden nicht<br />
expr<strong>im</strong>iert, da die Promoterregion fehlt: Pseudogen.
SINEs (Short interspersed elements)<br />
SINEs sind kurze <strong>DNA</strong> Sequenzes (100–400 bp) welche revers transkribierte RNA<br />
(RNA polymerase III) Transkripte repräsentieren: tRNA, 5S rRNA, und andere<br />
kleine nukleäre RNAs.<br />
Über eine Million AluI Elemente gibt es <strong>im</strong> menschlichen Genom (10.6%):<br />
reverse Transkripte einer 7S RNA, welche Bestandteil des Signal Recognition Particles<br />
ist.<br />
Brauchen L1 Elemente für ihre Vermehrung.
Chromatinstruktur/organisation<br />
Übersicht
6-7 X<br />
40 x<br />
Chromatin besteht aus<br />
den genomischen <strong>DNA</strong>-<br />
Molekülen und Proteinen.<br />
Die platzsparende Verpackung<br />
der <strong>DNA</strong> wird<br />
durch das Aufwickeln um<br />
Nukleosomen-Kerne<br />
bewerkstelligt. Diese<br />
bestehen aus Histonen.<br />
Weiterhin gehören Nicht-<br />
Histon-Proteine, wie RNA-<br />
Polymerase oder<br />
Transkriptionsfaktoren,<br />
zum Chromatin.<br />
Knippers, Abb 6.10
Molekulares Verständnis
Elektronenmikroskopische Darstellung von<br />
Nukleosomen (Längenmaßstab 50 nm).<br />
Eine diploide menschliche Zelle enthält<br />
ca. 30 * 10 6 Nukleosomen. Diese erste<br />
Stufe der Verpackung verkürzt das<br />
<strong>DNA</strong>-Molekül gegenüber seiner ursprünglichen<br />
Länge auf das 6-7 fache.<br />
Die Nukleosomen-Kerne können durch<br />
Verdau mit einer Nuklease präpariert<br />
und auf ihre Proteinzusammensetzung<br />
hin untersucht werden.
Histone sind relativ kleine, stark<br />
basische Proteine (s. SDS-Gelelektrophorese),<br />
die <strong>im</strong> Verlauf der Evolution<br />
extrem wenig Abwandlung erfahren<br />
haben.<br />
Der Nukleosomen-Kern enthält ein<br />
Histon-Oktamer aus H2A/B und<br />
H3/H4-Proteinen.<br />
Knippers, Abb 6.3
Histone haben eine<br />
zentrale Domäne und<br />
flexible N- bzw. Cterminale<br />
Enden.<br />
Das Histon-Oktamer<br />
bildet sich aus einem<br />
H3/H4-Tetramer<br />
und zwei H2A/H2B-<br />
D<strong>im</strong>eren. Weiterhin<br />
findet man 200 bp<br />
aufgewickelte <strong>DNA</strong><br />
und ein Molekül H1 <strong>im</strong><br />
Nukleosom.<br />
Knippers, Abb 6.4
Knippers, Abb 6.7/8<br />
Das Faltungsmuster der Histone aus drei alpha-Helices vermittelt die<br />
Histon-Histon-Interaktionen <strong>im</strong> Inneren des Nukleosomen-Kerns.<br />
Histon H1 sitzt außen am Nukleosom und ist beteiligt an der weiteren<br />
Verpackung der <strong>DNA</strong> in die 30 nm-Faser (40-fache Kompr<strong>im</strong>ierung).
Im Unterschied zur sequenzspezifischen Bindung von Proteinen an <strong>DNA</strong><br />
kann <strong>im</strong> Nukleosom <strong>DNA</strong> beliebiger Sequenz gebunden werden. Z. B.<br />
wird die Hälfte der 142 Wasserstoffbrückenbindungen pro Nukleosom<br />
zwischen Peptid- und Phosphodiester-Rückrad ausgebildet. Weiterhin<br />
tragen viele hydrophobe Wechselwirkungen und Salzbrücken zu der<br />
kompakten Struktur bei.
Veränderung der<br />
Chromatinstruktur<br />
Histone Code
Aus dem globulären Histon-<br />
Kern ragen die flexiblen N-<br />
Termini der Histone heraus.<br />
Sie tragen vermutlich zu<br />
den Interaktionen zwischen<br />
den Nukleosomen in der<br />
30 nm-Faser bei.<br />
Die N-Termini der Histone<br />
weisen eine Vielzahl von<br />
posttranslationalen Modifikationen<br />
auf. Diese bilden<br />
ein Markierungssystem<br />
(„Histon-Code“).
Modifikation von Aminosäureseitenketten<br />
in den N-Termini der Histone:<br />
Acetylierung: Übertragung einer<br />
Acetyl-Gruppe auf die Epsilon-Amino-<br />
Gruppe der Aminosäure Lysin<br />
Methylierung: Übertragung einer<br />
Methyl-Gruppe auf die Epsilon-Amino-<br />
Gruppe von Lysinen<br />
Phosphorylierung: Übertragung einer<br />
Phosphatgruppe auf die Hydroxylfunktion<br />
von Serin-Seitenketten<br />
Beachte, dass sich der Ladungszustand<br />
der Histon-Schwänze durch die Modifikationen<br />
drastisch ändern kann. Wie<br />
stark sich das strukturell auswirkt, ist<br />
umstritten.<br />
Knippers, Abb 6.5
Die Acetylierung von Lysin-Seitenketten in den N-Termini der Histone<br />
wird von Histon-Acetyl-Transferasen (HATs) durchgeführt. Die<br />
Acetyl-Gruppe wird <strong>im</strong> aktiven Zentrum der HAT von Coenzym A auf<br />
den Histon-Schwanz übertragen.<br />
Die Acetylierung ist eine reversible<br />
Modifikation. Das Entfernen der Acetyl-<br />
Gruppen wird von Histon-Deacetylasen<br />
(HDACs) katalysiert.
Die Kombination der verschiedenen möglichen Modifikationen erzeugt<br />
eine große Vielfalt von Histon-Varianten.<br />
Die Modifikationen wirken sich auf die Struktur des Chromatins aus.<br />
Best<strong>im</strong>mte Varianten oder Kombinationen davon werden spezifisch von<br />
anderen Proteinen oder Proteinkomplexen erkannt.
Die Kombinatorik der Histon-Varianten ergibt einen „Code“, der für<br />
die Regulation der Genexpression von zentraler Bedeutung ist.<br />
Weiterhin spielen die Histon-Modifikationen bei der <strong>DNA</strong>-Replikation<br />
und bei der Zellteilung eine wichtige Rolle.
Generell ist die Acetylierung der Histone mit einer<br />
weniger kompakten Struktur des Chromatins korreliert.<br />
Aktiv transkribiertes Chromatin weist daher viele<br />
acetylierte Histone auf. Im Gegensatz dazu findet man<br />
„unteracetylierte“ Histone in Bereichen, wo keine<br />
Transkription stattfindet.<br />
Ein Beispiel dafür ist die Inaktivierung der<br />
„überschüssigen“ Gene auf dem zweiten weiblichen X-<br />
Chromosom. Das Heterochromatin des inaktivierten X-<br />
Chromosoms enthält eine besondere Variante des Histons<br />
H2A, unteracetylierte Histone H3 und H4 und eine<br />
spezifische Methylierung <strong>im</strong> N-Schwanz des Histons H3.
Ein Protein mit einer Bromodomäne bindet an ein<br />
acetyliertes Lysin eines N-terminalen Restes eines Histons.<br />
Ein Chromodomänprotein (40-50 aa) bindet an methyliertes<br />
Chromatin.
Veränderung der Chromatinstruktur<br />
Chromatinremodlingkomplexe
Exper<strong>im</strong>enteller Nachweis der aufgelockerten Chromatin-Struktur in<br />
aktiv transkribiertem Chromatin:<br />
-- Vergleich der Nuclease-Zugänglichkeit des beta-Globin Gens in<br />
Blutkörper-Vorläuferzellen und Kontrollzellen, die kein beta-Globin<br />
expr<strong>im</strong>ieren (MSB-Zellen).<br />
-- Isolierung genomischer <strong>DNA</strong>, <strong>DNA</strong>seI-Verdau und „Southern-Blot“-<br />
Technik (Verdau mit selten schneidendem Restriktionsenzym,<br />
gelelektrophoretische Auftrennung, Transfer auf eine Membran,<br />
Hybridisierung mit radioaktiver Sonde für das beta-Globin-Gen).<br />
Lodish, Fourth Edition
Lodish, Fourth Edition<br />
Mit steigender Nuclease-Konzentration verschwindet das charakteristische<br />
BamHI-Fragment aus der genomischen <strong>DNA</strong> der Blutvorläuferzellen.<br />
Die genomische <strong>DNA</strong> der nicht-expr<strong>im</strong>ierenden Zellen<br />
ist <strong>im</strong> Bereich des Globin-Gens für die Nuclease unzugänglich.
Veränderung der Chromatinstruktur<br />
Nukleäre Architektur
Einzelne Chromosomen<br />
besetzen verschiedene<br />
„Territorien“ <strong>im</strong> <strong>Zellkern</strong>.<br />
Gezeigt ist der Kern einer<br />
menschlichen Lymphozyte.<br />
Fluoreszenzmarkierte,<br />
chromosomenspezifische<br />
Sonden wurden verwendet,<br />
um die Territorien des<br />
Chromosoms 18 (rot) und 19<br />
(hellblau) darzustellen.
Organisation der 24 menschlichen<br />
Chromosomen während der<br />
Prometaphase (Fibroblasten).
Chromatin und der Zellzyklus
Verdichtung der Chromosomen in der Mitose:<br />
Pollard
Interphase<br />
Mitose<br />
6-7 X<br />
40 x<br />
10,000 x<br />
Verkürzung
Elektronenmikroskopische<br />
Darstellung von Interphase-Chromosomen<br />
(A)<br />
und einem kondensierten<br />
mitotischen Chromosom<br />
vor der Teilung der<br />
Schwesterchromatiden<br />
(B).
Funktionelle Bereiche von Chromosomen, die<br />
wichtig für ihre Vererbung sind
Drei Elemente sind essentiell für die Replikation und Weitergabe von<br />
Chromosomen in der Mitose:<br />
-- mehr als ein Replikations-Ursprung (1) erlaubt die effiziente<br />
Replikation eines großen Genoms:<br />
E.coli - nur 1 Replikationsursprung, 4,7 10 6 Nuklotide; 1000 N pro Sec.<br />
Dauer 40 min.<br />
Mensch - menschliches Chromosom: 150 10 6 N; 50 N pro Sec; würde<br />
14 Tage dauern, wenn nur ein Replikationsursprung vorhanden wäre.<br />
-- Telomere (2) am Ende des Chromosoms ermöglichen die Replikation<br />
von linearen <strong>DNA</strong>-Molekülen, außerdem schützen sie das Ende des<br />
<strong>DNA</strong>-Moleküls<br />
-- das Centromer (3) ist der Ansatzpunkt für die Trennung der<br />
Schwester-Chromatiden durch den Spindel-Apparat; der Proteinkomplex,<br />
der sich dort anheftet, heißt Kinetochor<br />
-- an den Centromeren findet man Heterochromatin (besonders dicht<br />
gepacktes Chromatin); die <strong>DNA</strong> <strong>im</strong> Bereich von Telomeren und<br />
Centromeren ist hochrepetitiv („Satelliten-<strong>DNA</strong>“)