Flow Injection Analysis

Flow Injection Analysis
AF ELO HARALD HANSEN
Flow Injection Analysis (FIA)
er et koncept til automatisk
kemisk analyse, der, som baseret
på continuous-flow (CF)
metodikken, blev opfundet og
udviklet ved Institut for Kemi
på Danmarks Tekniske Universitet
i 1974, og som i dag anvendes
over hele verden. For at
sætte FIA i perspektiv, vil vi
starte med at se på, hvorledes
udviklingen af kvantitativ kemisk
analyse i historisk perspektiv
summarisk er foregået.
Til bestemmelse af mængder
eller koncentrationer af stoffer
ved kemisk analyse har man
gennem århundreder altovervejende
benyttet vådkemiske metoder,
dvs. hvor man udfører de
kemiske reaktioner i opløsninger
(som oftest vandige). Således
er generationer af kemikere
blevet indoktrineret til at tage
det for givet, at den eneste fornuftige
måde at udføre kemisk
analyse på var at opløse prøven
i opløsningsmiddel, tilsætte
reagens, blande opløsningen
omhyggeligt og så vente på, at
ligevægt var etableret og den
kemiske reaktion løbet til ende
(se Figur 1(a)). Herefter kunne
så måles på en passende parameter,
f.eks. en opstået farve,
hvis tilstedeværelse viste, at et
givet stof var til stede, mens
intensiteten af farven angav
koncentrationen af stoffet i
prøven. Dette koncept med at
homogenisere prøve og reagens
samt vente på ligevægt var
mantraet selv helt frem til midten
af 1900-tallet, hvor automatiske
analysesystemer blev introduceret.
Disse omfatter dels
batch-systemer, dels continuous-flow
systemer. Principperne
for disse er illustreret i
hhv. Figur 1(b) og 1(c).
I batch-analyse forbliver opløsningen
inde i en beholder,
1
f.eks. reagens- eller bægerglas.
Mens Figur 1(a) viser den
ovenfor omtalte fremgangsmåde
til manuel analyse, illustrerer
Figur 1(b), hvorledes man
kunne forestille sig at mekanisere
eller automatisere analysegangen.
Nemlig ved i princippet
at placere en beholder på et
transportbånd, hvor beholderen
successivt bliver bragt til at
Figur 1. Sammenligning af prøvningsprocedurer ved (a) manuel og (b,c)
automatisk kemisk analyse med fotometrisk detektion. (b) Batchanalyse,
hvor prøven kører på et transportbånd gennem flere stationer. (c) Continuous-flow
analyse, hvor væskestrømmene segmenteres med luftbobler:
Fælles for alle 3 procedurer er, at prøve og reagens homogeniseres, og
udlæsning af signal foregår under steady-state betingelser.

passere gennem forskellige
stationer, hvor der kan udføres
individuelle enhedsoperationer,
såsom tilsætning af prøve og
efterfølgende reagens(er), omrøring
for at blande homogent,
evt. også opvarmning eller afkøling
og sluttelig, efter en
passende tid for at opnå ligevægt,
transport til en detektor,
som kan registrere en passende
parameter. Hvis det, som vist
på figuren, drejer sig om optisk
måling (for at måle en farve),
benyttes et spektrofotometer.
Batch-systemer kan udformes
på forskellig vis, men de har
det til fælles, at væskerne er
stationære, mens beholderen
bevæger sig, dvs. de imiterer
den manuelle procedure.
I continuous-flow (CF) systemer
går man den modsatte
vej, idet man benytter et stationært
system og lader væskerne
bevæge sig gennem et sæt
slanger. I Figur 1(c) er vist et
skematisk eksempel på et af de
første kommercielle systemer,
en såkaldt AutoAnalyser fra
firmaet Technicon, som benyttede
dette koncept. Det består
af en pumpe (symboliseret ved
den grå firkant), som huser 3
pumpeslanger: En, hvori prøven
løber, idet de enkelte prøver
sekventielt aspireres fra
prøvekarusellen (S), en til reagens
(R), og en, hvori der løber
luft (A). Gennem fremdrift af
prøve og reagens vil disse blive
blandet, hvilket foregår i blandingsslangen,
som gøres så
lang, at kemisk ligevægt kan nå
at etablere sig under transporten.
Luftbobler bliver med regelmæssige
mellemrum aspireret,
dels for at adskille de en-
kelte prøver fra hinanden, dels
for at opdele de enkelte prøver
i en række segmenter for at
effektivisere blandingen i hver
enkelt af disse (se Figur 1(c)).
Konceptuelt hviler dette CFsystem
således på præcis det
samme princip som batchsystemet,
nemlig fuldstændig
opblanding af prøve og reagens
(homogenisering) og opnåelse
af ligevægt for den kemiske
reaktion (såkaldt steady-state),
hvilket kan ses i den registrerede
udskrift fra detektoren, hvor
den endelige signaludlæsning
sker på den flade top. Anvendelse
af luftbobler er i og for
sig ret genial, men da en væskestrøm,
som indeholder
mange luftbobler, er kompressibel,
bliver timingen fra blanding
af prøve og reagens til
måling af signal dårligt defineret,
dvs. kun steady-state signalet
er pålideligt. Sammenfattende
kan siges, at i CFprocedurer
er systemet stationært
mens væskerne bevæger
sig.
2
Ved sammenligning mellem
automatiske batch- og CFprocedurer
kan anføres, at de
førstnævnte i kraft af de mange
mekaniske dele ofte er komplicerede,
mens de sidstnævnte
generelt er simplere og derfor
billigere at operere i praksis.
I Figur 1(c) er vist den udskrift,
som detektoren registrerer
som funktion af tiden. Da
signalet er proportionalt med
koncentrationen af prøven, og
da man kan beskrive den registrerede
kurve matematisk, vil
det sige, at såfremt man kunne
ramme eksakt det samme sted
af kurven hver gang (f.eks.
60,5 % signal), ville det være et
lige så godt mål for steady-state
signalet som steady-state niveauet
selv. Det ville imidlertid
kræve, at der var en meget nøjagtig
og reproducerbar timing i
systemet, dvs. fra blanding af
prøve og reagens til detektion,
og det kan ikke lade sig gøre i
det konventionelle CF-system
pga. tilstedeværelse af luftbobler.
Et rent væskesystem, som
Figur 2. Dispersionprofil af injiceret prøvezone (oprindelig koncentration
C o ). Til hver koncentration (C) langs gradienten korresponderer en specifik
tid (ti), som målt fra injektionstidspunktet (to).

ikke er kompressibelt, ville
derimod indebære den nøjagtige
timing, hvilket ville medføre,
at man kunne gennemføre
analysen meget hurtigere, da
man ikke skulle afvente steadystate.
Dette var et af aspekterne
da nærværende forfatter sammen
med kollegaen Jarda
Ruzicka i 1974 på Danmarks
Tekniske Universitet (DTU)
opfandt og udviklede det såkaldte
Flow Injection Analysis
koncept, som sidenhen så at
sige har revolutioneret den måde,
hvorpå kemisk analyse nu
udføres. Ikke blot giver FIA
øget analysefrekvens i forhold
til konventionelle CF-systemer,
men som beskrevet i det følgende,
har det også medført en
række unikke analysemuligheder,
som ikke kan lade sig gøre
på anden vis.
PRINCIPPERNE FOR FIA
Opbygningen af et FIA-system
er basalt meget enkelt, idet det
består af en pumpeenhed, et
slangesystem, en injektionsventil
og en detektor. I Figur 3(a)
er således vist et enkeltstrengssystem,
hvor et nøje afmålt
volumen af prøveopløsning ved
hjælp af en injektionsventil
sprøjtes ind i en bærestrøm,
som indeholder reagenser. Efter
indsprøjtningen vil prøven
undergå dispersion (opblanding)
i væskestrømmen, hvorved
der dannes en koncentrationsprofil
af prøven som den,
der er afbildet i Figur 2. Kontakten
mellem prøve og reagens
giver anledning til kemisk
reaktion og dannelse af et produkt,
som løbende kan registreres
i en passende detektor. I
hvilken udstrækning dispersionen
foregår, afhænger af en
række faktorer (prøvevolumen,
pumpehastighed, slangediameter
og vejlængde), som vi er
herrer over, og derfor kan vi
kontrollere dispersionen. FIA
er derfor baseret på følgende 3
hovedhjørnesten, nemlig prøveinjektion,
kontrollerbar dispersion
og reproducerbar timing
(da tiden mellem blanding af
prøve og reagens til detektion
for et givet system er identisk
fra gang til gang). Kombinationen
af disse tre elementer medfører,
at det er unødvendigt at
opnå kemisk ligevægt. Ligesom
det er muligt at udnytte de
enkelte koncentrationer i de
forskellige væskeelementer,
som tilsammen danner koncentrationsgradienten,
idet hvert
enkelt væskeelement er knyttet
til en specifik tid, som vi kan
udvælge og benytte analytisk.
Så derfor kan man også sige, at
hvor konventionel CF systemer
kun giver én slutkoncentration
(nemlig den, som fremkommer
ved total opblanding / homogenisering),
giver FIA adgang til
et teoretisk set ubegrænset antal
koncentrationer mellem 0
og C max (svarende til toppen af
dispersionsprofilen), som hver
især formelt kan udnyttes.
Idet der henvises til litteraturen
(se referencer) om specifikke
detaljer vedrørende de
enkelte enheder i FIAsystemet,
skal her opsummeres
nogle fakta: Pumpen er normalt
en peristaltisk pumpe, som kan
akkommodere op til flere pumpeslanger
således, at der kan
konstrueres flerstrengssystemer,
hvor flere reagenser kan
3
tilsættes sekventielt til bærestrømmen.Pumpehastighederne
ligger normalt på 0,1–0,8
mL/min. Der kan også benyttes
stempelpumper, men disse er
ikke så almindelige i FIA pga.
begrænset volumenkapacitet.
Injektionsventilen er som oftest
en drejeventil, hvor et internt
eller eksternt loop afgrænser et
givet volumen prøveopløsning
(typisk 25–200 µL); når ventilen
drejes, bliver loopet en del
af slangesystemet og vil derfor
blive transporteret fremad.
Slangesystemet består af plastslanger
(f.eks. PVC eller PTFE
(Teflon)) med en indre diameter
på 0,5–0,8 mm. Slangerne
vil typisk blive rullet sammen
eller knyttet i knuder. Herved
vil dispersionen blive minimeret
og samtidigt øges det sekundære
flow (det vil sige, man
vil få effektiv lokal opblanding
i de enkelte væskeelementer).
Som en tommelfingerregel bør
man gøre slangelængden så
kort som mulig for at undgå
overdreven dispersion (dvs.
fortynding af prøven). Som
detektor kan anvendes alle detektionsanordninger
som tillader
væskegennemstrømning
(typisk optiske og elektrokemiske).
Som sagt kan man vælge
at benytte et hvilket som helst
element i gradienten til udlæsning,
men i praksis benytter
man som oftest tophøjden (dvs.
svarende til C max ), da den er let
at identificere og ikke kræver
brug af elektronisk udstyr. Opholdstiden
for en prøve i FIAsystemet
er typisk mindre end
30 s, hvorfor der teoretisk kan
opnås meget høje prøvningsfrekvenser.
FIA-systemer har

meget korte startop- og lukkenedtider
(typisk få min), og da
det er simpelt at omfigurere
slangesystemet, er det med FIA
blevet økonomisk attraktivt at
anvende automatiske metoder
til selv meget små serier af
analyser (tidligere var det således,
at CF-metoder kun var
aktuelle, når mange analyser
forelå). I denne forbindelse skal
også anføres, at der – som skal
omtales senere – er typer af
analyser, som kun lader sig
gennemføre, hvis man benytter
FIA.
Men lad os se på et praktisk
eksempel for at illustrere FIA.
Her kan vi passende tage udgangspunkt
i det system, som
er skematiseret i Figur 3, som
viser bestemmelse af chlorid i
et enkeltstrengssystem, hvor
der foregår følgende reaktionssekvenser:
Hg(SCN)2 + 2 Cl – ⇌
HgCl2 + 2 SCN –
Fe 3+ + SCN – ⇌ Fe(SCN) 2+
Chlorid i prøven reagerer med
reagenset kviksølv(II)thiocyanat
under dannelse af udissocieret
kviksølv(II)chlorid og med
samtidig frigivelse af thiocyanationer,
som efterfølgende
reagerer med jern(III) under
dannelse af det intensivt rødfarvedejern(III)thiocyanatkompleks,
hvis absorbans slutteligt
måles spektrofotometrisk.
Intensiteten af den røde farve er
således direkte proportional
med chloridkoncentrationen i
prøven (kemien har i øvrigt
tidligere dannet grundlag for
standardmetoden til bestem-
melse af chlorid, men er nu
afskaffet pga. anvendelse af et
kviksølvsalt). I Figur 2(b) er
vist absorbanssignalerne for en
række standarder i koncentrationsintervallet
5–75 ppm, hvor
der i hvert tilfælde er injiceret
30 µL prøve via injektionsventilen,
og hvor bærestrømmen
kontinuert monitoreres ved en
bølgelængde på 480 nm i en
mikro-flowcelle (10 µL volumen).
For at demonstrere reproducerbarheden
af de enkelte
koncentrationsniveauer, er de
syv standarder hver især injiceret
4 gange, dvs. der blev fore-
4
taget 28 injektioner på ca. 14
min., svarende til en frekvens
på 120 prøver per time. Som
man kan se på de to scans for
75 og 30 ppm standarderne,
som blev optaget med stor
skriverhastighed, var der mindre
end 1% af opløsning tilbage
i flowcellen, når den næste
(injiceret til tiden S2) ville
komme frem til den, og at der
var ingen afsmitning (carryover)
mellem prøverne, når
disse blev injiceret med intervaller
på 30 s. Disse eksperimenter
viser med al tydelighed,
at et af de fundamentale karak-
Figur 3. (a) Flow diagram (manifold) for spektrofotometrisk bestemmelse
af chlorid. S er injektionsposition (30 µL), D er detektor og W er afløb
(spild). (b) Til venstre er vist signaler for en række standarder (koncentrationer
5–75 ppm, hver injiceret fire gange), mens der til højre er vist hurtige
scans for henholdsvis 75 og 30 ppm standarderne.

Figur 4. (a) Flow diagram for spektrofotometrisk bestemmelse af
phosphat. De to reagensstrømme blandes on-line umiddelbart før prøven
S injiceres (30 µL). Begge de anvendte slangeruller er 50 cm med en indre
diameter på 0,5 mm.
teristika i FIA er, at alle prøver
sekventielt bliver behandlet på
eksakt den samme måde under
deres passage i den analytiske
kanal – eller sagt på en anden
måde: hvad der sker for én
prøve sker på præcis samme vis
for en hvilken som helst prøve.
Som et eksempel på et flerstrenget
FIA system kan refereres
til Figur 4, der viser et system
til bestemmelse af
phosphat, hvor den analytiske
procedure bygger på kemiske
reaktioner fra den klassiske
kemi til identifikation af
phosphat og som tillige er basis
for standardproceduren i de
fleste lande. Således danner
phosphat heteropolysyrer med
molybdat. I dette gulfarvede
kompleks kan Mo(VI) med et
mildt reduktionsmiddel såsom
ascorbinsyre (eller Sn(II)) reduceres
til Mo(V), der har en
intensiv blå farve (høj molær
absorptionskoefficient) ved 660
nm. Reaktionerne kan udtrykkes
som følger:
H
3
PO
4 �12 H2MoO
4 �
H3P(Mo3O 10)
4 � 12 H2
( ) → ( )
O
De to reagenser blandes on-line
umiddelbart inden injektion af
den phosphatholdige prøve.
Dette skyldes, at ascorbinsyre
faktisk kan reducere molybdat,
selv når der ikke er phosphat til
stede, men det er en meget
langsom reaktion. Derfor kan al
efterfølgende genereret blå
farve helt og holdent relateres
til phosphatkoncentrationen i
prøven.
Som det fremgår af ovenstående
er FIA meget økonomisk
mht. prøve- og reagensforbrug
per prøve, hvilket på sin side
betyder, at generering af affaldsstoffer
er beskedent. Det
er nu til dags en vigtig parameter,
idet det ofte er dyrere at
slippe af med sit kemiske affald
end at købe de anvendte kemikalier.
DISPERSION I FIA
Eftersom den kontrollerbare
dispersion er en af hovedhjørnestenene
i FIA, kan det være
værdifuldt at se nærmere på
denne. Graden af dispersion,
eller fortynding, i et FIAsystem
er karakteriseret ved
dispersionskoefficienten D.
Lad os betragte et simpelt dispersionseksperiment.
Vi tænker
5
os, at vi har en prøveopløsning
med koncentrationen C o , som
vi indlægger i FIA-systemets
injektionsventil. Hvis denne
opløsning kunne scannes af en
optisk detektor (måling af absorbans
mod tid), ville det, som
det er vist til venstre på Figur
2, resultere i et firkantet signal,
hvor højden er proportional
med koncentrationen. Når prøven
injiceres i bærestrømmen,
vil den indlagte zone følge bevægelsen
af bærestrømmen og
under fremdriften undergå dispersion
i denne. Dispersionsprofilen
(også kaldet gradienten)
vil afhænge af kanalens
geometri og flowhastigheden,
men den vil fremstå som vist
på Figur 2 til højre. Den vil
således komme til at reflektere
et kontinuum af koncentrationer,
hvor intet væskeelement i
gradienten har samme koncentration
som dets naboer. Det er
således nyttigt at opfatte dette
kontinuum af koncentrationer
som individuelle væskeelementer,
som hver især har en given
prøvekoncentration C, idet hver
enkelt af disse elementer er en
potentiel kilde til signaludlæsning
(nemlig gennem identifikation
af den tilhørende tid ti,
som er forløbet siden injektionen).
For at kunne designe et FIAsystem
rationelt, er det vigtigt
at vide, hvor meget den injicerede
prøve fortyndes på vej til
detektoren, og hvor lang tid der
går mellem injektion og signaludlæsning.
Derfor defineres
dispersionskoefficienten D som
forholdet mellem prøvekoncentrationen
før og efter dispersionen
har fundet sted i det væ-

skeelement, som danner grundlag
for udlæsning af det analytiske
signal, dvs. D = C o /C,
som for C = C max giver D =
C o /C max (0 < D < ∞). Med
andre ord, hvis det analytiske
signal er baseret på den maksimale
tophøjde, betyder det, at
det imaginære væskeelement
som svarer til koncentrationen
C max benyttes. Med kendskab
til D kan prøvekoncentrationen
(og dermed reagenskoncentrationen)
estimeres. Bestemmelse
af D for et givet FIA-system
eller en manifold, som man ofte
kalder det, er meget enkel at
udføre. Den simpleste måde er
at injicere et veldefineret volumen
af en farvet opløsning
ind i en farveløs bærestrøm og
så kontinuerligt monitorere
absorbansen (A) af den dispergerede
farvezone ved hjælp af
et spektrofotometer. Hvis man
benytter udlæsning ved toppen
af kurven, vil absorbansen svare
til C max , dvs. A max . Dernæst
kan man så fylde flowcellen i
spektrofotometeret med den
originale farveopløsning, hvilket
giver absorbansen for C o
(A o ). Herefter kan D-værdien
let beregnes, idet D = C o /C =
A o /A max . Bemærk, at definitionen
af D-værdien udelukkende
refererer til den fysiske dispersionsproces.
I denne forbindelse
skal det understreges, at en
hvilken som helst FIA-top generelt
er resultatet af to kinetiske
processer, som finder sted
samtidigt, nemlig den fysiske
proces repræsenteret ved dispersionen
af den injicerede
prøvezone, og den/de overlejrede
kemiske processer, som
finder sted via reaktion mellem
prøvemateriale og reagens(er).
Definitionen på D indebærer,
at når for eksempel D = 2, så er
prøven blevet fortyndet med
bærestrømmen i forholdet 1:1.
De parametre, som har indflydelse
på dispersionen har været
genstand for nøje studier. Kortfattet
kan det anføres, at den
mest effektive måde at manipulere
D på, er via det injicerede
væskevolumen og de fysiske
dimensioner af FIA-systemet
(længden og indre diameter af
slangerne), opholdstiden i systemet
samt flowhastigheden.
Dertil kommer, at man kan
spille på at benytte enkeltstrengssystemer
i stedet for
manifolder, hvor flere slanger
konfluerer (hvert samlepunkt
medfører øget fortynding). Og
endelig kan man, som nævnt
ovenfor, vælge at foretage sin
udlæsning på andre punkter af
gradienten end det, som svarer
til maksimal tophøjde.
Man har valgt at klassificere
prøvedispersionerne som begrænset
(D = 1–2), middel (D =
2–10) , stor (D > 10), og reduceret
(D < 1), idet de tilhørende
FIA-systemer er blevet designet
til en lang række forskellige
opgaver. Begrænset dispersion
benyttes, hvis den injicerede
prøve skal transporteres til en
detektionsenhed på stort set
ufortyndet form, dvs. FIAsystemet
skal i den henseende
udelukkende benyttes som et
middel til præcis og rigoristisk
transport og præsentation af
prøven til detektoren (anvendes
typisk i forbindelse med ionselektive
elektroder eller atomabsorptionsspektrometri).Mid-
6
del dispersion anvendes, når
analytten skal blandes og reagere
med bære- / reagensstrømmen
for at danne et produkt,
der kan detekteres. Stor dispersion
benyttes udelukkende til at
fortynde en given prøve for at
bringe den på et koncentrationsniveau,
som detektoren kan
acceptere. Reduceret dispersion
implicerer, at den prøvekoncentration,
som detektoren registrerer,
er højere end den,
som injiceres i FIA-systemet,
dvs. der er on-line blevet foretaget
en opkoncentrering af
prøven. Dette kan gøres på
forskellig vis, f.eks. ved væske-
eller fastfaseekstraktion eller
ved at benytte en ionbytterkolonne.
På de følgende sider er der
angivet nogle eksempler på de
forskellige typer dispersionsmønstre.
Når det betænkes, at
FIA-litteraturen i dag er meget
omfangsrig (i foråret 2011 var
der publiceret næsten 20.000
videnskabelige artikler og lige
knapt 40 monografier), er det
naturligvis umuligt at dække
mere end blot nogle få aspekter,
og læseren opfordres derfor
til at konsultere litteraturen for
at opnå yderligere information.
Det store litteraturvolumen
viser også, at FIA har etableret
sig som et magtfuldt koncept i
moderne analytisk kemi. Hvor
det oprindeligt blev set på som
et middel til hurtigt at udføre
serielle analyser, har det etableret
sig som en generelt anvendelig
teknik til behandling af
opløsninger. Derudover har det
demonstreret, at det giver muligheder
for at foretage unikke
analytiske procedurer, som

ellers er meget vanskelige eller
umulige at udføre med konventionelle
faciliteter. Her kan
blandt andet peges på dannelse
og måling på metastabile (ikke
stabile) forbindelser; gennemførelse
af kinetiske diskriminationsprocedurer,
hvor man udnytter
forskelle i reaktionshastigheder
for kemiske processer,
der foregår samtidig; og
udnyttelse af detektion ved
processer, som giver anledning
til kemi- eller bioluminescens.
Derfor er akrononymet FIA i
mange sammenhæng simpelthen
blevet erstattet af FI for at
understrege, at flow injection
systemet i tilgift til at kunne
anvendes til rene analytiske
formål også kan benyttes som
et effektivt redskab til håndtering
af opløsninger.
FIA TIL REPRODUCER-
BAR OG PRÆCIS PRØVE-
PRÆSENTATION (BE-
GRÆNSET DISPERSION)
Som nævnt ovenfor er systemer
med begrænset dispersion at
foretrække, hvis man blot ønsker
at transportere prøven til
detektoren på præcis og reproducerbar
facon, og – for at opnå
lavest mulige detektionsgrænse
– helst uden at prøven
fortyndes i nævneværdig grad.
Det gælder ikke mindst, hvis
detektoren er en elektrode eller
sensor, hvis respons er diffusionskontrolleret
eller hvis detektorens
responsmønster er afhængigt
af, hvor længe prøven
eksponeres til detektoren. Et
eksempel på førstnævnte er
ion-selektive elektroder og biosensorer,
mens sidstnævnte kan
eksemplificeres ved kombina-
Figur 5. Typisk potential-tid responsprofil for en ion-selektiv elektrode
med hensyn til den primære ion (A) og en interfererende ion (B). Hvis
udlæsning foretages ved tiden, som svarer til den punkterede linje, er
bidraget fra B minimalt.
tionen af FIA med atomabsorptionsspektrometri
(AAS), som
vist i det følgende.
Ved potentiometrisk måling
med mange ion-selektive elektroder
(ISEer) i dynamiske systemer
(såsom FIA) fås hurtige
og reproducerbare udlæsningssignaler.
ISEer er imidlertid
genenerelt karakteriseret ved
relativt lange responstider til at
nå til steady-state (det har de
fleste sikkert oplevet ved pHmåling
med en glaselektrode),
og derfor kan det være vanskeligt
at beslutte præcist hvornår,
man skal tage udlæsningen.
Ved at inkorporere ISEer i FIA,
overlades denne beslutning til
systemet, idet prøven når detektoren
efter en tid, som eksklusivt
er en funktion af den
benyttede FIA-manifold. På
trods af, hvad man skulle forvente
efter deres navn, så kan
7
ISEer udvise interferens fra
andre ioner, men ofte er det
muligt kinetisk at diskriminere
mellem den primære ion og de
interfererende ioner, dvs. under
det korte tidsinterval, hvor prøven
er eksponeret til elektroden,
kan dennes respons til de
to typer ioner variere betydeligt,
hvilket på sin side kan
udnyttes til at øge selektiviteten
og elektrodens detektionsgrænse
(man siger også, at de to
typer ioner udviser forskellig
indsvingningstid). Dette er illustreret
i Figur 5, hvor man kan
se, at såfremt udlæsningen af
signal finder sted ved steadystate
(til højre i figuren), vil der
være betydelig interferens fra
ion B på den primære ion (A),
mens interferensen er signifikant
mindre, såfremt man tager
udlæsningen ved tiden, som
svarer til den punkterede linje.

Figur 6. (a) FIA-manifold for detektion af glucose med en amperometrisk
sensor (GE) til bestemmelse af enzymatisk genereret hydrogenperoxid.
(b) Kalibreringskurver for glucose i koncentrationsområdet 0–40 mmol/L
ved tre forskellige flowhastigheder. ( Δ ) 0,50 mL/min; ( ) 0,75 mL/min;
og ( X ) 1,00 mL/min.
Prisen, man betaler, for at få
næsten elimineret interferensen,
er en lidt mindre signalstyrke
for den primære ion.
Præcis det samme koncept med
at manipulere prøveeksponeringstiden
kan udvides til mere
komplicerede sensorer såsom
enzymsensorer. Disse er typisk
opbygget med en membran,
som indeholder et eller flere
enzymer, placeret i umiddelbar
kontakt med den aktive overflade
af en passende detektionsanordning,
som både kan
være af optisk eller elektrokemisk
beskaffenhed. Prøvens
analyt transporteres ved diffusion
ind i membranen, hvor den
nedbrydes enzymatisk under
dannelse af et produkt, som
efterfølgende detekteres. En
betingelse for at opnå en lineær
sammenhæng mellem analytkoncentration
og signal er, at
der hersker pseudo-første ordens
reaktionsbetingelser, dvs.
den koncentration af konverteret
analyt, som når frem til sensorens
overflade må være meget
mindre end Michaelis-
Menten konstanten. Eftersom
denne konstant for de fleste
enzymsystemer er af størrelsesordenen
1 mmol/L, og at
mange prøvematricer (f.eks.
blod og sera) indeholder langt
højere koncentrationer, er det
ved brug af enzymsensorer i
batch-systemer nødvendigt at
anvende et ofte kompliceret
system af yderligere ydremembraner,
som har til formål
at sikre en stærkt nedsat diffusion
af analyt til den underliggende
enzymmembran. Hvis
man derimod benytter et FIAsystem,
kan udstrækningen af
konversion af analyt simpelthen
justeres ved at variere den
tid, som prøven bliver eksponeret
til enzymlaget, dvs. mængden
af omsat analyt kan meget
enkelt reguleres ved at justere
den anvendte flowhastighed.
Denne fremgangsmåde er illustreret
i Figur 6(a), som viser et
system til bestemmelse af glucose
ved hjælp af en amperometrisk
sensor (GE), som indeholder
et lag af enzymet
glucoseoxidase. Alle oxidaser
reagerer med substrater (analyt)
og oxygen under dannelse af
bl.a. hydrogenperoxid. Dette
kan bestemmes amperometrisk
8
(enten ved reduktion til vand
eller oxidation til oxygen – i
begge tilfælde trækkes en
strøm, som er proportional med
mængden af hydrogenperoxid
og dermed af analytten). I Figur
6(b) er vist kalibreringskurver
for 3 forskellige flowhastigheder.
Ved at øge flowhastigheden
fra 0,5 til 1,0 mL/min
ses det, at det lineære måleområde
øges fra 20 til 40 mmol/L
glucose, hvilket således sikrer,
at systemet kan anvendes til
fysiologiske målinger (normalområdet
for glucose i blod er
ca. 7 mmol/L, mens diabetespatienter
typisk har værdier i
området > 12 mmol/L). Prisen
for denne bekvemmelighed er,
at kalibreringskurvens hældningskoefficient
(sensitiviteten)
bliver lidt mindre. Herudover
kan eksponeringstiden udnyttes
til kinetisk diskrimination for
interfererende stoffer, idet man
drager fordel af, at analytten og
interferenserne udviser forskellige
diffusionshastigheder i
sensorens membranlag. I det
aktuelle tilfælde viste det sig, at
man kunne diskriminere for
tilstedeværelsen af paracetamol
(som er et almindeligt stof til
bekæmpelse af hovedpine, og
som derfor kan forefindes i
blodet hos nogle patienter), idet
dets diffusion til sensorens
overflade kunne negligeres ved
den anvendte eksponeringstid.
Som i andre FIA-systemer,
hvor det registrerede signal
udgøres af en top, kan man
udsige, at det registrerede signal
er et mål for den givne koncentration,
mens basislinjesignalet
indikerer sensorens
stabilitet.

Figur 7. Enkeltlinje manifold til bestemmelse af metalioner ved hjælp af
flamme-atomabsorptionsspektrometri (AA), hvor der benyttes en flowhastighed
på 4,9 mL/min og et injiceret prøvevolumen på 150 µL. (a) Kalibreringskørsler
for zinkstandarder i koncentrationsområdet 0,10–2,0
ppm. (b) Skriverudlæsninger for en 1,5 ppm Zn-standard, som registreret
ved (A) injektion via FIA-systemet og (B) ved kontinuert aspiration af
prøveopløsning på konventionel vis. D refererer til dispersionskoefficienten,
som i (B) er lig med 1. (c) Kalibreringskurver for en serie af vandige
Pb-standarder (2–20 ppm) som er præpareret dels uden (0 %) og dels ved
tilstedeværelse af natriumchlorid (3,3 %).
Atomabsorptionsspektrometri
(AAS) er et af flere analytiske
instrumenter, hvis udnyttelse i
høj grad kan drage fordel af –
og i nogle tilfælde kan blive
markant øget – ved kombination
med FIA. Som det ses af
Figur 7, kan man ved at bruge
et system, som helt enkelt består
af en forbindelsesslange
mellem injektionsventilen og
instrumentet (i dette tilfælde et
flamme-atomabsorptionsspektro-meter
(AA)), opnå flere
fordele: Dels kan man i det
tidsrum, over hvilket man konventionelt
ville registrere signalet
(øverste linje i (b)), foretage
flere injektioner, dvs. man kan
øge prøvefrekvensen sammenlignet
med traditionel prøveaspiration,
men hvad der er
9
mere signifikant, man kan herved
ikke blot opnå øget præcision,
men også forbedret nøjagtighed.
Endvidere kan man
drage fordel af, at prøven kun
er eksponeret til instrumentet i
meget kort tid. I den resterende
tid bliver detektoren renset af
bærestrømmen, dvs. vask-tilprøve
forholdet er stort, og
derfor er risikoen for at brænderen
i instrumentet bliver blokeret
af salte i prøveopløsningen
væsentligt nedsat. Dette
kan ses ved at sammenligne
signalerne for en række blystandarder
præpareret i henholdsvis
rent vand og 3,3 %
NaCl-opløsning. For de enkelte
sammenhørende koncentrationsniveauer
er tophøjderne
identiske, dvs. der er ingen
effekt af saltindholdet. I litteraturen
er endvidere beskrevet et
forsøg, hvor man foretog 160
repetitive injektioner af en
1 ppm Cu-standard opløst i
30 % NaCl-opløsning. Her blev
det vist, at stort set ingen forringelse
af signalet kunne registreres
(hvis man omvendt ville
aspirere en så saltholdig opløsning
via konventionel fremgangsmåde,
ville brænderen
”kokse til” efter blot en enkelt
aspiration).
FIA KONVERTERINGS-
TEKNIKKER (MEDIUM
DISPERSION)
Såfremt man ønsker, at der skal
foregå en kemisk reaktion i
FIA-systemet, må man naturligvis
sørge for, at analyt og
reagens kommer i kontakt med
hinanden, dvs. at ved injektion
af prøven må den undergå en
vis dispersion. Denne bør dog

Figur 8. Øverst: Skematisk angivelse af analysesereaktion af thiocyanat
med 5-Br-PADAP ved tilstedeværelse af en oxidant (her dichromat) i surt
miljø, hvilket fører til dannelse af et metastabilt mellemprodukt med
interessante analytiske karakteristika. Nederst: FIA-manifold til bestemmelse
af det metastabile reaktionsprodukt.
ikke være excessiv, da prøven
herved fortyndes meget og detektionsgrænsen
bliver ringere.
Sagt på en anden måde bør der
opereres med medium dispersion.
Den ovenfor omtalte procedure
til bestemmelse af chlorid
er et godt eksempel herpå. Procedurer,
som omfatter kemisk
reaktion, benævnes også FIAkonverteringsteknikker,
idet de
bygger på, at analytten gennem
en intelligent behandling / kemisk
reaktion kan konverteres
Figur 9. Udnyttelse af FIA til kvantificering
af en metastabil analyt i
et system, som tillige involverer
et gradvist stigende baggrundssignalrespons.
På grund af den
præcise og reproducerbare timing
i FIA er det muligt at foretage
udlæsningen ved den tid, som
svarer til den største forskel mellem
analyt- og baggrundssignaler,
markeret ved den stiplede linje.
til en species, som kan detekteres.
I mange tilfælde kan man i
denne sammenhæng drage fordel
af kinetisk diskriminering,
dvs. udnytte det anvendte reagens'
reaktionshastighed med
analytten og med andre i denne
sammenhæng interfererende
species. Et eksempel kan illustrere
dette aspekt, nemlig bestemmelse
af chlorat i en processtrøm,
hvor man benyttede
følgende kemi:
2 ClO3 – + 10 Ti 3+ + 12 H +
→ 10 Ti 4+ + Cl2 + 6 H2O
(hurtig)
Cl2 + LMB → MB + 2 Cl –
(hurtig)
MB + Ti 3+ →
LMB + Ti 4+
10
(langsom)
Analysen gennemføres ved at
injicere en chloratholdig prøve
i en sur bærestrøm af reduktionsmidlet
titanium(III), hvilken
efterfølgende konflueres (blandes)
med en anden strøm indeholdende
leucomethylenblåt
(LMB, dvs. methylenblåt på sin
blege (ufarvede) form), hvor
det dannede chlor oxiderer
LMB til methylenblåt (MB).
MB kan imidlertid reduceres af
Ti(III) til LMB. Mens de to
første af ovennævnte reaktioner
er meget hurtige, er reduktionen
af MB i den tredje reaktion
relativ langsom. Derfor kan
chloratkoncentrationen umiddelbart
bestemmes ved at registrere
intensiteten af farven af
MB genereret i den anden reaktion,
idet regenereringen af
LMB finder sted efter prøvezonen
allerede har passeret
detektoren og er sendt til spild
(hvis man opsamler spildopløsningen
i en flaske vil man da
også se, at den med tiden bliver
mere og mere affarvet).
En anden procedure, som
illustrerer det nævnte koncept,
er bestemmelse af thiocyanat,
en species som der er stor interesse
for inden for klinisk kemi,
fordi den ikke forefindes
naturligt i mennesker i nogen
signifikant udstrækning, med
mindre man er tobaksryger
(eller spiser enorme mængder
kål eller marcipanbrød). Halveringstiden
for thiocyanat i legemet
er ca. 14 dage, og derfor
er det gennem analyse af legemsvæskerne
(spyt, blod,
urin) let at skelne rygere fra
ikke-rygere. En hurtig og simpel
metode til bestemmelse af
thiocyanat består i reaktion
med 2-[(5-brom-2-pyridyl)azo]-5-(diethylamino)phenol
(5-Br-PADAP) i surt miljø ved
samtidig tilstedeværelse af
dichromat som oxidationsmiddel
(Figur 8, øverst), hvorved
der dannes et intenst rød-farvet
produkt. Farven forsvinder
imidlertid hurtigt (inden for ca.

10 s), dvs. det dannede produkt
er ikke stabilt (man kalder det
metastabilt), idet det øjensynligt
spaltes til et eller flere
ufarvede slutprodukter. Da det
farvede mellemprodukt har en
høj molær absorptionskoefficient
(ε), er det analytisk interessant,
idet det betyder, at man
kan bestemme lave koncentrationer
(ifølge Lambert-Beers
lov, A = εlc, hvor A er absorbansen,
ε er den molære absorptionskoefficient,
l er cellelængden
og c er koncentrationen,
vil man for given målt Aværdi
og høj ε-værdi kunne
måle en lav koncentration).
Hvis man således skal basere
sig på det metastabile produkt,
er det essentielt, at man kan
foretage udlæsningen på det
tidspunkt, hvor farveintensiteten
er maksimal, hvorfor et
FIA-system er nødvendigt. Det
anvendte system er vist nederst
i Figur 8. Prøven (som består af
50 µL spyt), injiceres i en bærestrøm
af vand, som efterfølgende
blandes med reagensstrømmen
(5-Br-PADAP), og
slutteligt med den sure opløsning
af dichromat. Baseret på
den nøjagtige timing, er det
muligt at detektere og kvantificere
det metastabile produkt.
Der er imidlertid et yderligere
problem, nemlig at selv når der
ikke er noget thiocyanat til stede,
kan 5-Br-PADAP gradvist
reagere med dichromat under
dannelse af en komponent, som
absorberer ved den bølgelængde,
der anvendes (570 nm),
hvilket således fører til et passivt
baggrundssignal. For at
gøre tingene endnu mere komplicerede,
så stiger baggrunds-
Figur 10. Udlæsningssignaler for thiocyanat som opnået ved at benytte
FIA-manifolden i Figur 8. Til venstre er vist en kalibreringsserie for thiocyanatstandarder
i området 5–100 µmol/L (hver standard injiceret i duplikat).
Til højre er vist signalerne for 10 spytprøver (hver injiceret i duplikat),
hvor de første 5 er fra ikke-rygere, mens de næste 5 er fra rygere. Bemærk
at basislinjen svarer til et meget højt baggrundssignal, men at de
enkelte udlæsninger alligevel alle er meget reproducerbare.
signalet med reaktionstiden.
Med andre ord, så har man i
praksis en situation som den,
der er afbildet i Figur 9, hvor
det transiente signal fra analytten
som en funktion af tiden
først stiger og derefter falder,
mens baggrundssignalet kontinuerligt
stiger. Ved at anvende
FIA er det ved probat design af
det anvendte analytiske system
muligt at justere opholdstiden
for prøven således, at detektionen
kan udføres præcist på det
tidspunkt, hvor differensen
mellem de to signaler er
maksimal (indikeret ved pilen
og den stiplede lodrette linje). I
Figur 10 er vist en række faktiske
signaler, registret under
brug af FIA-systemet i Figur 8.
Til venstre er vist signaler for
11
en række vandige thiocyanatstandarder
i området 5–100
µmol/L, hvor hver standard er
injiceret 2 gange, og til højre er
vist signaler for 5 spytprøver
fra ikke-rygere og fem fra rygere
(begge serier atter injiceret i
duplikat). Det kan ses og rygere
og ikke-rygere falder i to
distinkt adskilte grupper, men
hvad der fra et analytisk synspunkt
er mere signifikant er, at
skønt baggrundssignalet er relativt
højt (A = ca. 0,25) og at
alle signalerne ligger i milliabsorbansområdet
(mAbs), så
er reproducerbarheden af alle
duplikater meget tilfredsstillende.
De ovenfor omtalte konverteringsteknikker
har udelukkende
drejet sig om homogene syste-

Figur 11. Typisk lysudsendelsessignal
ved bio- og kemiluminescens
som funktion af tiden.
Kvantificering kan effektuereres
enten ved at relatere mængden
af analyt til arealet under kurven,
eller ved at bruge FIA og
bestemme intensiteten (dE/dt)
efter en fikseret tidsperiode (Δt).
Såfremt pseudo-første ordens
betingelser er opfyldt, er intensiteten
direkte proportional med
koncentrationen af analyt.
mer (væske-miljø). Det er
imidlertid også muligt at benytte
heterogene konverteringsteknikker,
dvs. hvor man i FIAmanifolden
kan inkorporere
enhedsoperationer baseret på
eksempelvis gasdiffusion, dialyse,
ekstraktion eller brug af
pakkede kolonner for at konvertere
ens analyt til en detekterbar
species. Læseren henvises
til den righoldige litteratur
om disse teknikker, idet vi dog
i det følgende vil se på en af
disse, nemlig anvendelse af
enzymer.
FIA-SYSTEMER MED
ENZYMER
En analytisk kemisk procedure
kan opfattes som en kæde, der
omfatter en række led. Det,
som det gælder om i praksis, er
at gøre et af disse led selektivt,
for i så fald bliver hele kæden
selektiv. Et af de midler, som
er ypperst i denne henseende,
er anvendelsen af enzymer, idet
de enkelte enzymer ofte udviser
stor selektivitet mht. hvilke
substrater, de kan omsætte.
Enzymer er ofte dyre, men i og
med de er katalysatorer og således
ikke bliver forbrugt, selvom
de deltager i de kemiske
reaktioner, kan de teoretisk set
anvendes igen og igen. Det er
imidlertid vanskeligt, for ikke
at sige umuligt, at gøre, når
man arbejder i homogene systemer.
Men ved at immobilisere
enzymerne på passende bærematerialer
og pakke dem i
kolonner, som kan inkorporeres
i FIA-systemer, er det enkelt at
bruge enzymerne repetitivt.
Herved tilgodeser man ikke
blot det økonomiske aspekt,
men man opnår dertil ofte øget
stabilitet samt streng reproducerbarhed
af de processer, der
finder sted, hvilket sikrer en
fikseret analytkonvertering fra
cyklus til cyklus. Ved at en høj
koncentration af enzym kan
immobiliseres på et lille volumen,
opnår man tillige, at den
afledte høje aktivitet medfører
udstrakt og hurtig omsætning
af substrat ved minimal fortynding
af prøven, idet den heraf
følgende lille dispersionskoefficient
resulterer i, at man kan
opnå en lavere detektionsgrænse.
Såvel optiske som elektrokemiske
detektorer kan benyttes
til at monitorere reaktionerne.
Således kan man ved brug
af oxidaser, der som nævnt
ovenfor giver anledning til generering
af hydrogenperoxid,
ved at benytte reaktion med
12
luminol anvende kemiluminescens.
Kemiluminescens (KL) og
bioluminescens (BL) er betegnelse
for energiafgivelse i form
af elektromagnetisk stråling i
det synlige område (lys) ved
exoterme kemiske reaktioner.
Normalt afgives den overskydende
energi i disse som varme,
men i visse tilfælde kan det
ske som luminescens. Sker det
Figur 12.
(a) Manifold til bestemmelse af
glucose ved hjælp af kemiluminescens.
Prøven S injiceres ind i
en bærestrøm af buffer (C) og
ledes dernæst til en enzymreaktor
(ER), som indeholder immobiliseret
glucoseoxidase. Ved
reaktionen dannes hydrogenperoxid,
som efterfølgende blandes
med luminol og hexacyanidoferrat(III),
hvorefter prøvezonen
føres til en diodedetektor, hvor
den udsendte kemiluminescens
registreres. (b) Integreret mikrosystem,
som akkommoderer den
manifold, som er vist i (a), og
hvor C er bærestømmen (bufferopløsning),
R1 er luminol og R2
er hexacyanidoferrat(III). Flowcellen
(FC) huser to fotodioder
(D) i et aflukke påmonteret basispladen
B.

i et biologisk system, kalder
man det BL (et eksempel herpå
er morild i havvand), mens det
ved ”døde” kemiske reaktioner
kaldes KL. I begge tilfælde er
der tale om fascinerende og
attraktive fænomener til udnyttelse
i detektionsøjemed, idet
der potentielt er mulighed for at
måle meget lave koncentrationer
over et stort dynamisk område,
og fordi den krævede
instrumentering er relativt simpel.
Ved sammenligning med
de fleste optiske metoder (som
overvejende er baseret på måling
af absorbans), har luminescensmetoder
den fordel, at lys
kun produceres og måles, når
der er prøve til stede, og der er
derfor generelt ingen problemer
med blindsignaler. Imidlertid er
det således, at luminescensreaktioner
almindeligvis fører
til transiente emissioner, idet
intensiteten af det emitterede
lys er proportionalt med reaktionshastigheden
og ikke direkte
med koncentrationen af de involverede
species (Figur 11).
Man vil derfor observere, at
strålingen oftest udsendes som
et ”flash”, som hurtigt aftager i
intensitet. Derfor har den konventionelle
måde til kvantificering
været at integrere intensiteten
over en fikseret tidsperiode
og relatere denne til mængden
af analyt. Som det ses af
Figur 11 er det imidlertid muligt
at relatere intensiteten af
det udsendte lys (dE/dt) til koncentrationen
af analyt (cA),
såfremt probate betingelser kan
etableres, hvorved alle prøver
behandles, fysisk såvel som
kemisk, på eksakt den samme
vis, dvs. alle målinger bliver
Hydride generation/atomization:
As3+ , Sb3+ −
BH4
, Sn4+ → AsH3 , SbH3 , SnH4 (1)
Acid (HX)
AsH3 , SbH3 , SnH4 ∆
→ As , Sb , Sn + n H2
Side reactions/interferences:
− +
BH4 + 3 HX + H → BX3 + 4 H2 (3)
Me 2+ (Ni, Cu, Co)
repetitivt foretaget på identiske
tider ti efter injektion, og mest
fordelagtigt på den tid, som
svarer til den maksimale emission
(nemlig Δt). Endvidere er
det et krav, at koncentrationen
af det anvendte reagens (B) er
så stor, at den kan anses for
konstant under reaktionen, idet
man herved opnår en pseudoførsteordens
reaktion mht. til
analytkoncentrationen (cA).
Dette er netop muligt ved at
benytte FIA, og derfor har
kombinationen af luminescens
og FIA revolutioneret anvendelsen
af BL og KL som praktisk
anvendelige analytisk kemiske
detektionsprocedurer
(det er blevet sagt, at FIA og
KL/BL udgør det ideelle ægteskab).
Et eksempel på brugen af KL
er givet i Figur 12, hvilket
øverst viser FIA-manifolden og
13
(2)
BH4 −
→ Me 0 (slower) (4)
Acid (HX)
AsH3 , SbH3 , SnH4 Me0
→ As , Sb , Sn + n H2
Figur 13. Reaktioner, som finder sted ved generering af gasformige hydrider
som eksemplificeret for As, Sb og Sn, samt mulige sidereaktioner. De
sidstnævnte kan i vid udstrækning nedsættes og endog elimineres ved at
benytte FIA.
(5)
nederst et af de allerførste producerede
mikrosystemer, som
her er benyttet til bestemmelse
af glucose ved hjælp af immobiliseret
glucoseoxidase. Prøven
injiceres via ventilen i en
bærestrøm af buffer (for at sikre
konstant pH ved den efterfølgende
enzymatiske reaktion)
og bliver dernæst ført til enzymreaktoren,
hvor glucose
bliver omsat under dannelse af
hydrogenperoxid. Dette bliver
efterfølgende blandet med luminol
og base (for at sikre en
høj pH-værdi) samt hexacyanidoferrat(III)
(katalysator), hvilket
fører til generering af kemiluminescens,
som så detekteres
ved hjælp af de to fotodioder i
flowcellen (FC). Som litteraturen
beskriver, er der gennem de
senere årtier publiceret mange
anvendelser af enzymatiske
procedurer under anvendelse af

FIA-systemer, idet enzymerne
har vist sig at udgøre det selektive
led i den analytiske kæde.
Derfor kan man også sige, at
FIA ikke blot udgør en komplementær
facilitet til biosensorer
som sådan, men at systemet
som helhed i mange sammenhænge
kan opfattes som et attraktivt
alternativ til disse.
UDVALGTE ANDRE AT-
TRAKTIVE OG INTERES-
SANTE FIA-TEKNIKKER
I mange analytisk-kemiske
sammenhænge har FIA vist sig
som særdeles attraktiv og her
skal kort omtales nogle yderligere
anvendelser. I Figur 13 er
i reaktionsskema (1) vist, at
visse analytter, såsom As(III),
Sb(III) og Sn(IV), i sur opløsning
og ved tilstedeværelse af
et stærkt reduktionsmiddel
(som f.eks. tetrahydridoborat
(BH4 – ), kan konverteres til de
pågældende grundstoffers hydridforbindelser.
Disse er (analogt
med NH3) gasser, som
derfor meget enkelt kan skilles
fra de øvrige komponenter i
prøveopløsningen ved hjælp af
en gas/væske-separator og efterfølgende
detekteres ved at
løbe gennem en opvarmet
flowcelle i et AAS instrument,
hvorved de atomiseres gennem
opvarmningen (ligning (2)) og
derpå selektivt kan detekteres.
Oprindeligt blev hydridgenerering
introduceret som en batchprocedure,
men dette involverede
adskillige problemer, som
illustreret i Figur 13, nederst:
Konverteringen af analytten må
nødvendigvis finde sted i sur
opløsning, men som det fremgår,
er der muligheder for side-
reaktioner og interferenser (ligning
(3)–(5)). Således kan
tetrahydridoborat selv reagere
med syre under dannelse af
hydrogen, hvorved reagenset
bliver forspildt i forhold til den
primære metalhydridreaktion.
Af samme årsag præparerer
man tetrahydridoboratreagenset
i en svag basisk opløsning, og
mikser først denne med syre,
når prøven samtidig tilsættes.
Et meget alvorligt problem er
tilstedeværelsen af frie metaller
eller metalborider, specielt af
Ni, Cu og Co. Hvis ionspecies
af disse metaller derfor er til
stede i prøveopløsningen kan
de blive reduceret af tetrahydridoborat,
hvilket kan give
mulighed for dannelse af kolloidale
frie metaller eller metalhydrider
(ligning (4)), hvilke
har vist sig at udgøre meget
aktive katalysatorer for nedbrydning
af analythydriderne,
inden de når målecellen. Under
de dynamiske betingelser, som
hersker i FIA, og fordi opholdstiden
af hydridet i systemet
er relativ kort, kan disse
sidereaktioner i vid udstrækning
enten elimineres eller være
kinetisk diskrimineret imod i
forhold til hovedreaktionen.
Hvis sidereaktionerne rent faktisk
skulle ske, vil den præcise
timing i FIA-systemet sikre, at
disse sker i præcis samme udstrækning
for alle prøver, der
introduceres. Som et praktisk
eksempel på udnyttelse af hydridgenerering
kan nævnes
bestemmelse af As i jordprøver
fra forurenede grunde, hvor der
tidligere er foregået træimprægnering.
Dette foregik
ved at benytte opløsninger in-
14
deholdende As, Cu og Cr. Med
sådanne prøver vil det være
umuligt at bestemme As ved
hydridgenerering ved en batchmetode,
idet den genererede
frie mængde Cu-metal vil nedbryde
hydridet, inden det kunne
bestemmes. Ved at benytte et
FIA-system kan interferensen
fra Cu imidlertid totalt elimine-
Figur 14. (a) Simpel stopped-flow
FIA-manifold med optisk detektion.
Når prøven S injiceres,
aktiveres timeren T. Såvel tiden
fra injektion til stop af pumpning
(delay time) som længden på
selve stoptiden styres via en
computer. (b) Kurven A svarer til
en normal FIA-top. B er det signal,
som man ville registrere ved
at stoppe kort efter passage af
toppen, såfremt der ingen reaktion
sker, dvs. ingen ændring i
den registrerede absorbans,
mens den stiplede linje C repræsenter
monitorering af en reaktion,
som stadig foregår, og som
giver anledning til stigende absorbanssignal.
Såfremt reaktionsbetingelserne
enten er af
nulte- eller pseudo-nulte orden,
vil hældningen af C være proportional
med analytkoncentrationen.

es.
Et andet eksempel på en unik
FIA bestemmelse er at anvende
såkaldt stopped-flow, dvs. man
kan, efter at prøve og reagens
er blevet bragt sammen i manifolden,
stoppe flow’et. Dette
kan tjene to formål: enten kan
man stoppe, inden prøven når
detektoren, for at opnå øget
reaktionstid uden at få øget
dispersion (hvilket jo ville ske,
hvis man ville øge tiden gennem
en længere slangelængde),
eller man kan vælge at stoppe
prøven inde i selve detektoren
for her at monitorere den
igangværende kemiske reaktion.
I Figur 14 er vist et simpelt
enstrenget FIA-system,
hvor man vha. en Timer (T)
kan vælge at stoppe den injicerede
prøve. Hvis man ikke
stopper, vil man få registreret
en normal FIA-top (kurve A).
Hvis man vælger at stoppe lige
efter toppen er passeret, kan
der være mulighed for to scenarier:
Hvis den kemiske reaktion
allerede er løbet til ende vil
man få registreret et fladt signal
(kurve B), hvis den stadigt forløber,
vil man få et stigende
signal (kurve C). Sidstnævnte
metode kan således bruges til at
få en idé om en given kemisk
reaktions hastighed. F.eks. er
standardmetoden til bestemmelse
af phosphat som tidligere
nævnt en reaktion med molybdat
under dannelse af et gulfarvetphosphormolybdatkompleks
(se Figur 4). Dette kan
reduceres af f.eks. ascorbinsyre
eller Sn(II) til et intensivt blåtfarvet
kompleks, som derfor
kan benyttes til bestemmelse af
lave koncentrationer af
phosphat. Batch-proceduren
foreskriver, at man skal blande
prøve og reagenser og så vente
ca. en halv time før man spektrofotometrisk
måler intensiteten
af den blå farve. Der er
således tale om en forventelig
langsom reaktion. Dette kan
simpelt eftervises i et FIAsystem,
idet man ved at stoppe
prøven i flowcellen kan se, at
signalet bliver ved med stige.
Omvendt betyder det også, at
ved at benytte sig af den reproducerbare
timing i FIA behøver
man ikke at afvente steadystate
(efter en halv time), men
kan måle efter blot 30 s, hvilket
jo forsimpler og billiggør proceduren
i forhold til den konventionelle
fremgangsmåde.
Stopped-flow-metoden kan
imidlertid også benyttes til
kvantitativ måling af analytten,
hvis man manipulerer sine forsøgsbetingelser
på passende
vis. Hvis vi således forestiller
os, at vi har en reaktion, hvor
analytten A reagerer med reagenset
B under dannelse af et
produkt P, som kan måles
spektrofotometrisk, dvs. den
målte absorbans er proportional
med koncentrationen af P, vil
det tilhørende reaktionshastighedsudtryk
være givet ved:
dP/dt = dA/dt = k cA cB. Hvis vi
sørger for, at reagenset er i stort
overskud, får vi dA/dt = k’cA.
Og hvis koncentrationen af
analytten kan anses for praktisk
taget konstant under målingen,
dvs. cA = k’’, får vi således
dA/dt = k’k’’, hvor k’k’’ således
bliver proportional til cA. Vi
har med andre ord at gøre med
en såkaldt pseudo-nulte ordens
reaktion, hvilket betyder, at
15
hældningskoefficienten på kurven
C, som netop er lig dA/dt,
direkte kan relateres til koncentrationen
cA.
Ovennævnte applikation kan
opfattes som en gradientteknik,
hvor vi udnytter et punkt på
responssignalkurven, som er
forskellig fra toppunktet. Som
det fremgår af Figur 2, vil der
på enhver responskurve være to
væskeelementer, som har samme
dispersionskoefficient (D).
Disse er knyttet til to specifikke
tider ti. Det er således op til os
at udnytte disse sammenknyttede
D- og ti-værdier, hvilket
har givet anledning til udvikling
af en række gradientteknikker,
som udover ovennævnte
stopped-flow-teknik bl.a.
omfatter titrering, automatisk
prøvefortynding og gradientkalibrering.
Der henvises til
litteraturen for specifikke detaljer.
Endelig skal det anføres, at
der inden for det sidste par årtier
er blevet introduceret nogle
varianter og ekstrapolationer af
FIA, nemlig Sequential Injection
Analysis (SIA) og Lab-on-
Valve (LOV). Mens de begge
er baseret på de 3 FIAhovedhjørnesten,
nemlig prøveinjektion,
kontrollerbar dispersion
og reproducerbar timing,
så adskiller de sig fra det oprindelig
FIA-design ved at benytte
en selektionsventil samt i
stor udstrækning at anvende
stempelpumper, idet der generelt
håndteres meget små væskevolumener.
Der henvises til
litteraturen, herunder til nogle
af nedennævnte artikler i
Dansk Kemi.

Om forfatteren
Elo Harald Hansen, dr.techn., er
professor emeritus, Kemisk Institut,
DTU.
Referencer
Monografier
1. J. Ruzicka, E. H. Hansen: Flow Injection
Analysis, 2nd Edition, John Wiley and
Sons, Inc., New York, USA, 1988. (ISBN
0-471-81355-9).
2. S. Kolev, I. McKelvie (red.): Flow Injection
Analysis and Related Techniques,
Elsevier B.V., 2008 (ISBN 978-0-444-
53094-3).
3. M. Trojanowicz (red.): Advances in Flow
Analysis, Wiley-VCH Verlag GmbH &
Co. KGaA, 2008 (ISBN 9783527318308)
Reviewartikler i internationale tidsskrifter:
4. J. F. Tyson: “Flow Injection Analysis
Techniques for Atomic-Absorption Spectrometry.
A Review” Analyst, 110 (1985)
419–429.
5. J. Ruzicka and E. H. Hansen: “The First
Decade of Flow Injection Analysis: From
Serial Assay to Diagnostic Tool” Anal.
Chim. Acta 179 (1986) 1–58.
6. E. H. Hansen and J. Wang: “Mini Review:
The Three Generations of Flow Injection
Analysis” Anal. Lett. 37(3) (2004) 345–
359.
7. Paraskevas D. Tzanavaras, Demetrius G.
Themelis: “Review of recent applications
of flow injection spectrophotometry to
pharmaceutical analysis” Analytica Chimica
Acta 558(1) (2007) 1–9.
8. E. H. Hansen, M. Miró: “Interfacing
microfluidic handling with spectroscopic
detection for real-life applications via the
lab-on-valve platform: A review” Appl.
Spectrosc. Rev. 43(4) (2008) 335–357.
CD-ROM
9. Jaromir Ruzicka: Flow Injection Analysis:
CD-ROM Tutorial, 4th Edition, 2010.
CD-ROM som omtaler udviklingen af
FIA, historiske aspekter og teknologiske
landvindinger. Free of charge from
www.flowinjection.com
Det eneste, der er publiceret om FIA på dansk,
er artikler i Dansk Kemi, nemlig følgende:
10. E. H. Hansen: ”Flow Injection Analysis”
Dansk Kemi 67 (1986) 100.
11. E. H. Hansen: ”Flow Injection Analysis og
luminescens. En optimal kombination til
udnyttelse af bio- og kemiluminescens til
analytisk-kemiske formål” Dansk Kemi
75(11) (1994) 12–16.
12. E. H. Hansen: ”Flow Injection analyse
baseret på bestemmelse af metastabile specier”
Dansk Kemi 76(9) (1995) 11–13.
13. E. H. Hansen: ”Flow injection
atomabsorptionsspektrometri (FI-AAS) –
en effektiv og attraktiv analytisk kemisk
kombination.” Dansk Kemi 77(9) (1996)
18–23.
14. E. H. Hansen: ”Flow Injection Analysis
fylder 25 år” Dansk Kemi 80(4) (1999)
14–16.
15. E. H. Hansen, S. Nielsen: ”Kombination af
flow injection og elektrotermisk
atomabsorptionsspektrometri” Dansk Kemi,
80(4) (1999) 17–21.
16. E. H. Hansen, J. Wang: ”Bestemmelse af
sporstofkoncentrationer af metaller i komplekse
matricer” Dansk Kemi 83(9) (2002)
49–55.
17. E. H. Hansen, R. Chomchoei, X.-B. Long:
”Tre generationer af Flow Injection Analysis”
Dansk Kemi 85(10) (2004) 58–63.
18. E. H. Hansen, M. Miró, R. Chomchoei:
”Bestemmelse af sporstofmetaller med en
ny dynamisk fraktioneringsmetode” Dansk
Kemi, 86(10) (2005) 18–22.
16