In vitro

2008.7.18 2008 비임상시험 전문인력 교육과정 (GLP 심화과정)유전독성시험 점검사항국립독성과학원 유전독성과염 영 나1

발 표 순 서• 유전독성시험 개요 및 규제• In vitro GLP Studies• 3가지 유전독성시험의 주요 점검사항2

유전독성시험• 시험물질이 DNA나 염색체를 손상시켜 유발되는형태적 변화나 기능적 이상을 확인하는 시험• 물질에 대한 발암성시험을 하기 이전에 신규물질등에 대한 발암성예측을 위해 스크리닝 차원으로수행되는 시험3

Guidelines for the Testing of ChemicalsSection 4:Health Effects471 Bacterial Reverse Mutation Test473 In vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test474 Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test475 Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test476 In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test477 Genetic Toxicology: Sex-Linked Recessive Lethal Test in Drosophila melanogaster478 Genetic Toxicology: Rodent Dominant Lethal Test479 Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells480 Genetic Toxicology: Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay481 Genetic Toxicology: Saacharomyces cerevisiae, Miotic Recombination Assay482 Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair, Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in vitro483 Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test484 Genetic Toxicology: Mouse Spot Test485 Genetic Toxicology: Mouse Heritable Translocation Assay486 Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells in vivoDraft (487) in vitro miconucleus test7

식품의약품안전청 규정• 비임상시험관리기준 (2005.12.21)• 의약품 등의 독성시험기준 (2005.10.21) 중 유전독성시험원칙적으로 모든 시험물질에 대하여 최소한 아래 각호의 유전독성시험을 실시하여야 한다. 상기 규정에도 불구하고 시험물질의 특성 및 시험의 실시목적 등을 고려하여 필요하다고 인정되는 경우에는 OECD 유전독성시험기준에서 정한 그 밖의 유전독성시험으로 대체하거나 추가적으로 실시할 수 있다. 이 경우 본 기준에 언급되지 아니한 시험에 대하여는 OECD 유전독성시험 기준에 준한다가. 박테리아를 이용한 복귀돌연변이 시험나. 포유류 배양세포를 이용한 체외 염색체이상 시험 또는 마우스 림포마 tk 시험다. 설치류 조혈세포를 이용한 체내 소핵시험시험물질의 특성 및 시험의 실시목적 등을 고려하여 필요하다고 인정되는 경우에 대체하거나 추가적으로 실시할 수있는 OECD 유전독성시험은 다음과 같다.1. 포유동물 골수세포 염색체이상시험2. 포유동물 세포를 이용한 체외 유전자 돌연변이시험3. 초파리를 이용한 반성열성치사시험4. 설치류를 이용한 우성치사시험5. 포유동물세포를 이용한 체외 자매염색분체교환시험6. Saccharomyces cerevisiae를 이용한 유전자 돌연변이시험7. Saccharomyces cerevisiae를 이용한 유사분열 재조합시험8. 포유동물세포를 이용한 체외 DNA 손상, 수복, 부정기 DNA 합성시험9. 포유동물 정원세포의 염색체 이상 시험10. 마우스 스포트 시험11. 마우스를 이용한 유전성전좌시험12. 포유동물 간세포를 이용한 체내 부정기 DNA 합성시험8

Genetic Toxicology in PharmaceuticalDevelopment 3 Applications• Discovery- Non-GLP screening assays to assist lead candidate selection• GLP Regulatory Studies for IND- Full ICH/OECD compliant study design with full QA involvement,test article characterization, and dose formulation analysis• Investigative Gene Tox- When issues (i.e. positive responses) arise with a compound,it may be necessary to identify the mechanism of action (MOA) to seeif it is relevant to human exposure- Or it may be necessary to build a weight of evidence (WOE) argumentthat the response is artifactual9

In vitro GLP Studieshttp://www.olis.oecd.org/olis/2004doc.nsf/LinkTo/NT00008FEE/$FILE/JT00174939.PDF10

In vitro GLP Studies1. In vitro 시험의 정의2. 대조물질3. 책임: 시험기관 운영책임자, 시험책임자4. 신뢰성 보증5. 시설: 시험계 시설, 시험물질과 대조물질 취급을 위한 시설6. 기기, 시료, 시약7. 시험계: 새로 입수된 시험계, 시험계 기록8. 시험물질 및 대조물질(음성 및 양성 대조물질 포함)9. 표준작업지침서10.시험 수행 및 시험결과의 보고11.기록 및 시료의 보관 및 보존11

In vitro GLP Studies• 정의: in vitro 시험법은 다세포 개체 전체를 사용하지 않고 미생물이나개체에서 분리한 재료를 사용하거나 시뮬레이션을 시험계로 사용하는것을 말한다.• 안전성 평가에 사용되는 동물의 수를 줄이기 위한 노력이 강화됨에 따라in vivo 시험법의 대체 혹은 보조시험으로 in vitro 시험이 중요한시험방법으로 대두되었다.• OECD GLP 기준의 in vitro 시험에 대한 적용 및 해석관련 추가적인지침을 만드는 작업이 중요하다고 판단되어 스위스 주도하에 실무작업반회원들 및 이들에 의해 추천된 in vitro 시험전문가로 구성된 심화그룹이2004년 2월 12-13일 베른에서 발족되었다.• 심화그룹에서 작성된 지침 문서 초안은 2004년 5월 열린 제 18차 GLP실무작업반 회의에서 검토된 후 수정 및 승인되었다.• 범위: 의약품, 살충제, 화장품, 식품첨가물 및 산업용 화학물질12

대 조 물 질• In vitro 시험지침은 다수의 경우 적절한 양성 대조군, 음성 대조군및/또는 용매 대조군 사용하도록 규정하고 있음.• 양성 대조군, 음성 대조군 및/또는 용매 대조군의 사용은 GLP 에정의된 “대조물질” 의 목적처럼 시험물질에 대한 시험계의반응정도를 평가한다기 보다는 대개 시험계의 적절한 수행여부를콘드롤하기 위한 것이다.13

책임시험기관 운영책임자(Test Facility Management)• 운영책임자의 책임은 자격 있는 직원의 고용 및 적시에 적절한 시험 수행을위한 기기와 시설 요건 등 대부분 전반적인 것이며, in vivo 및 in vitro시험에 동일하게 적용 가능하다.• 시험기관 운영자는 각 시험담당자가 책임감을 가지고 in vitro 시험을수행하여야 함을 주지시켜야 하여야 한다. 이를 위해 시험기관책임자는시험담당자들이 각자의 업무를 분명히 주지하도록 조치하여야 한다.• 또, 무균시험법 및 생물학적 위험물질의 취급에 대한 특수훈련이 필요하며,시험계의 오염을 막기 위한 절차도 필요하다.• GLP시험에 사용되는 시험재료 혹은 시험용 키트가 모두 적절한품질체계에서 생산되고 그 적합성이 확인하기 위하여 해당 물품에 대한공급자의 관행, 업무절차 및 정책을 평가하여 이들 요건이 충족되는지확인하여야 한다.14

시험재료 품질 확인작업S9 certificate• Lot No.• Storage condition• inducer• animal induced(strain, sex, age)• Tissue• 제조일자• 유효기간• 효소성질• 돌연변이 활성15

시험책임자(Study Director)• 시험책임자의 책임은 시험의 종류에 관계없이 GLP 기준에 언급된의무사항이 in vitro 시험에도 적용된다.• 시험책임자는 시험관리에 있어 단일 책임자이며 전반적인 시험 수행 및보고의 의무가 있다.• In vitro 시험에 있어서 시험책임자는 시험계의 타당성 및 특성을문서화하는데 특별한 주의를 기울여야 한다.• 시험계의 타당성 입증은 시험책임자가 사용한 시험방법을 검증하거나시험방법이 구조적으로, 기능적으로 혹은 기전적으로 검증된참고시험방법과 유사함을 기술하여야 한다.• 시험책임자는 in vitro 시험계의 일부 특성(세포주, 연령/계대수, 기원)에대해 기술할 수 있으며, 그 외의 필요한 경우 적절한 대조물질을 사용하여시험하여 시험계가 요구되는 성능을 제공함을 기술하여 시험계의 특성을확인해야 한다.• 시험책임자는 최소한 제조자에 의해 사용된 품질 보증체계의적합성여부를 판정하여야 하며, 시험계의 사용에 따른 적합성을 판단할 수있는 모든 문서(예를 들면 성능수행결과)를 입수할 수 있어야 한다.17

시험담당자• 시험담당자는 해당되는 경우 무균 조건의 요건을 세심하게관찰하고 시험계의 오염을 막기 위해 in vitro 시험 수행시 해당절차를 따라야 한다.• 시험담당자는 교차 오염을 방지하고 시험 적합성을 보장하기 위해적절한 절차를 철저히 준수해야 한다.• 또한 격리 시험계나 생물학적 유해 물질을 사용하는 시험의 요건을잘 이해하고 철저히 준수해야 한다.• 또한 in vitro 시험 중 위험한 화학물질을 사용할 때에는 위험을최소화하기 위해 적절한 예방 조치를 취해야 한다.19

신뢰성 보증• 일반적으로 신뢰성 보증업무는 in vitro와 in vivo 시험에서 유사하다.• In vitro 시험의 경우, 신뢰성 보증을 하기 위해서는 핵심단계들의구성요소를 잘 아는 것이 중요하다.* 점검해야 하는 특별한 사항(예시):• 시험계 성능에 핵심적인 영향을 미치는 세포 혹은 조직 배양 배지의 구성분에 대한모니터링• 세포, 조직 및 기타 지표물질의 기능적 및/또는 형태학적 상태에 대한 평가 및 보증• 잠재적 오염에 대한 모니터링• 청결유지와 오염방지• 세포 및 조직의 적절한 냉동 및 해동의 보증• 세포와 조직배양에 사용된 물질 및 기구들의 무균상태 보증• 개별적 시험 및 시험계 간의 적절한 분리의 유지21

시설* 일반사항• 같은 공간에서 진행되는 in vitro 시험들이 각각 적절히 분리될 수 있도록 방법을강구해야 한다.* 시험계 시설• GLP 기준은 시험계 분리를 위해 충분한 숫자의 방 혹은 구역이 있어야 하며,이러한 구역은 시험계 오염 가능성을 최소화하는데 적합해야 한다.• 각 시험계의 완전성이 중요하며, 잠재적 오염이나 교차오염 혹은 복합된 사항의가능성에 의해 시험이 위태롭게 되어서는 안된다.• 적절한 정도의 구분이 존재한다면, 같은 배양기내에 다른 종류의 시험에 속하는세포 혹은 조직을 배양할 수도 있다.• 시험계의 장기 보존을 위한 전용 방 혹은 특수 기기를 갖춘 구역이 있는지를확인하고, 보존용 용기를 포함, 기기들은 시험계의 장기 안정성을 유지하기 위한적절한 환경을 제공해야 한다.* 시험물질과 대조물질 취급을 위한 시설• In vitro 시험에 있어서 무균환경이 중요한 조건이므로, 시험물질과 대조물질제조에 의한 오염 가능성을 최소화해야 한다.22

기기, 시료, 시약• GLP 준수 환경에서 사용되는 일반적 조건이 in vitro 시험에도 그대로적용되지만, 다른 중요한 특정요소를 확인하여야 한다.• 몇몇 in vitro 시험의 경우 특정기기, 예를 들어 미량천칭, 마이크로피펫,크린벤치 또는 배양기 등의 적정 조건을 유지, 점검하고 보정하는 것이시험의 완전성과 신뢰성을 위해 중요할 수 있다.• 특수 기기에 대해서는 정기적인 점검 또는 경보음 설정과 함께 한계수치를설정해 놓음으로써 핵심적인 요소들이 확인되어야 한다.• 라벨관리 및 유효기간에 대해 GLP 기준에서 규정하는 요건은 in vitro시험에도 동일하게 적용된다.23

시 험 계• In vitro 시험계의 대부분은 주로 생물학적 시스템이다.• 지적재산권이 설정된 시험키트를 포함하는 시험 키트도 역시 시험계로간주한다.• 시험계의 보존 및 시험중 품질과 완전성을 보장하기 위해 적절한 조건들을설정하고, 관리하며, 감시해야 한다. 이에는 세포 계대 번호, 개체 수가2배가 되기까지의 시간 등과 더불어, 시험계의 생물학적 활성과 반응성 설정,관리 및 감시에 대한 문서 기록이 포함된다.• 또한, 환경조건 및 시험계의 품질 및 완전성을 보장하기 위해 필요한조작(예: 항생체 혹은 항진균제 처치, 선택배양)을 기록해야 한다.• 다른 생물학적 시험계와 비교시, 시험계 보존시의 적절한 환경 조건의유지가 데이터의 품질에 더 큰 영향을 미칠 수 있으므로 이들 기록은 데이터품질 및 신뢰성 유지에 매우 중요하다.24

시험계 기록• OECD GLP기준에는 시험계의 공급원, 도착일, 도착조건에 대한 기록을관리하도록 규정하고 있다.• 세포나 조직의 경우 직접 공급원(예: 상업적 공급자) 뿐 아니라 세포나 조직이 원래추출된 기원(예: 초대 배양세포 혹은 공여체 특성을 지닌 조직, 확인된기원으로부터 확립된 세포주등)도 포함되어야 한다.• 유전자 도입 시험계의 경우 도입된 유전자의 형질을 확인하고 적절한 대조군을사용하여 형질 발현 유지를 감시해야 한다.• 보존 및 사용중 시험계에 대한 적절한 라벨링과 함께 해당 라벨 내구성 확보를 위한조치에 특히 주의를 기울여야 한다.• 특히 용기크기, 저장조건이 라벨링시 중요한 요소가 될 수 있으며, 모든 경우시험계를 바르게 식별할 수 있는 조치를 취해야 한다.• 발생 가능한 혼돈을 방지하기 위하여 시험계는 명확하게 명명되어야 하며, 각시험으로 부터 발생한 모든 기록뿐 아니라 시험계 라벨에 대해서도 역시공식적으로 부여된 시험계의 식별표시를 해야 한다.25

표준작업지침서(SOPs)• In vitro 시험 관련 활동 및 공정들이 표준작업지침서에 기술되어 있어야 한다.• 시설: 공기 중 및 표면의 병원체, 세척 및 소독, 시험 시설 혹은 구역 중 감염이나오염시 취해야 하는 행동을 포함하는 환경모니터링을 실시하여야 한다.• 기기: 층류 후드, 배양기등 세포 및 조직배양에 필요한 장비기기에 대한 사용, 관리,성능감시, 세척, 소독, 보존 용기내의 액화질소의 양, 배양기 내 온도, 습도,이산화탄소 농도 교정 및 감사를 실시• 시료, 시약 및 용액: 적합성 평가, 유효기간 연장, 무균상태 평가 및 관리, 흔한병원체 오염원에 대한 스크리닝, 용매 선정 및 사용에 대한 절차, 시험계와 용매간적합성에 대한 확인을 실시• 시험계: 세포 및 조직의 저장, 냉동 및 해동 관련 절차, 흔한 병원체에 대한 시험,오염에 대한 육안평가, 도착 직후 또는 보존 중에 도착 시의 또는 사용 중의 성질과반응성을 확인하기 위한 검증절차, 형태학적 평가, 표현형과 핵형의 안정성 조절,이식 유전자의 안정성 조절, 배양 시작 환경, 배양조건과 계대배양간격, 생물학적유해 물질 및 시험계의 취급, 시험계 폐기에 관한 절차를 검증• 시험수행: 무균 기술, 시험 유효성을 위한 허용 기준, 정량 반복 시험을 위한 기준을정해야 한다.• 신뢰성 보증: 핵심단계의 정의, 점검빈도를 정해야 한다.27

시험 수행 및 시험결과의 보고• In vitro 시험 수행에 관한 GLP 요건들은 그보다 더 보편적인안전성 시험에 적용되는 것들과 동일하다.• 최종시험보고서 뿐 아니라 시험계획서에도 언급해야 할 invitro 시험 특이적인 항목들이 있다. 이러한 항목들은 대부분과학적 의의와 기술적 성질에 관한 것이다.• 모든 in vitro 시험에서 시험계의 시험오차를 제한하고 그성능을 평가하기 위해서는 내부 대조군에 대한 시험을시험물질과 동시에 수행되어야 한다.28

기록 및 시료의 보관 및 보존• GLP 보존에 대한 일반적인 요건들이 in vitro 시험 수행에도적용된다.• 추가적으로 장기간 보존 가능한 시험계(세포주의 특수한서브클론이나 유전자 도입세포)의 경우 시험계의 확인 및/또는재구성을 위해 그 샘플을 보존해 두는 것을 고려해야 한다.• 단기 시험으로 분류되는 in vitro 시험에서 안전성 시험이 대부분을구성하는 경우는 시험물질 샘플의 보존을 고려해야 한다.• 시험계의 반응 범위를 설정하기 위해 사용된 기존의 양성 대조군,음성 대조군, 미처치 대조군 및/또는 용매 대조군 시험결과 기록 역시보존되어야 한다.29

시험결과보고서• 시험책임자의 서명 및 서명날짜• 최종보고서가 수정되었을 경우, 관련 시험책임자에 의한 수행 여부• 시험의뢰자의 시험계획서 승인• 측정, 관찰, 검사 등은 시험계획 및 관련 SOP와 부합하는지 여부• 신뢰성보증부서의 확인 여부• 시험계획서를 이탈하였을 경우, 이에 대한 기록 여부30

Bacterial Reverse Mutation Test• Most widely performed Gene Tox assay• Beautiful in its simplicity• Powerful in the number of exposed targets• Very little change in the basic test system design• Many varied and diverse applications(volatiles, gases, body fluids, environmentalsamples, petroleum samples, cigarette smoke,photomutagenicity)• Metabolism component can vary:(species, strain, sex, inducer, organ)Incubationfor 48hr31

Bacterial Reverse Mutation Test32

In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Testmetaphase-arrestingsubstance, Colcemid35

시험계 : 세포주 관리• 유래, 보존조건, 보존ㆍ계대기록,• mycoplasma 체크, 염색체 모드 수,• 배가시간, 배경 데이터(음성, 양성) 등.• Historical Background data음성대조에서의 염색체이상유발률양성대조에서의 염색체이상유발률Cell Culture Facility‣ CO 2 incubator‣ Clean bench or biological safety cabinet‣ Centrifuge‣ MicroscopeCell Storage FacilityCell Banking Program‣ Quality control‣ Documentation‣ Periodic controls of the instrumentation‣ Training of the laboratory staff36

Culture techniques, procedures and regulations: cell culture laboratory training programme37

Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test• 1 to 3 daily treatments• Animals :sacrificed at 24 and48 hrs after treatment• femursbone marrow to growth mediato make slides.38

Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test39

Historical background dataFrom Parke-Davis Pharmaceutical Research Laboratory, Ann Arbor, MI, USA40

참 고 자 료•Critical aspects in implementing the OECD Monograph 14“The application of the principles of GLP to in vitro studies”41

감 사 합 니 다 !Any Question ?ynyum@kfda.go.kr42