Micro SSP HLA DNA Typing Trays, DANISH VERSION - One Lambda
Micro SSP HLA DNA Typing Trays, DANISH VERSION - One Lambda
Micro SSP HLA DNA Typing Trays, DANISH VERSION - One Lambda
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303-2801 USA | Tlf.: (818) 702-0042 Fax: (818) 702-6904 | WEB:www.onelambda.com<br />
INDLÆGSSEDDEL<br />
MICRO <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong> TYPING TRAYS<br />
(MICRO <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-TYPEBESTEMMELSESBAKKER)<br />
Til in vitro-diagnostisk brug.<br />
VIGTIGT: Se <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> produktreferencetabel (Dokument-id: M<strong>SSP</strong>_REF_TABLE_PI.DOC) til OLIproduktkatalognumre,<br />
specifikke produktkomponenter og krav<br />
TILSIGTET ANVENDELSE<br />
<strong>DNA</strong> typebestemmelse af <strong>HLA</strong> alleler, klasse I eller klasse II.<br />
SAMMENDRAG OG REDEGØRELSE<br />
Historisk har fastlæggelsesmetoden for bestemmelse af <strong>HLA</strong>-antigener været lymfocytotoksicitetstesten. 1 Ved fremkomsten<br />
af PCR-teknologier er <strong>DNA</strong>-baserede vævstypeteknikker imidlertid blevet rutine i laboratoriet. For de fleste <strong>DNA</strong>-baserede<br />
metodologier anvendes PCR-processen kun som et forstærkende trin til at opnå den nødvendige mål-<strong>DNA</strong>. <strong>HLA</strong>typebestemmelsesprocessen<br />
kræver dernæst et efterforstærkende trin for at kunne skelne mellem de forskellige alleler (feks.<br />
RFLP, SSOP, omvendt punktdiagram). I modsætning til andre PCR-baserede metoder, skelner den anvendte <strong>SSP</strong>-metodologi<br />
i <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong>, Inc., <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsestesten mellem de forskellige alleler under PCR-processen. 2 Dette<br />
forkorter efterforstærkningsprocestiden til et enkelt gel-elektroforese detektionstrin. I modsætning til<br />
lymfocytotoksicitetsreaktionsskalaen (1 = negativ til 8 = positiv), er <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> testresultater enten positive eller negative.<br />
Dette afskaffer behovet for den komplicerede fortolkning af resultater. Yderligere kan enkelte nukleotide-ændringer være<br />
diskriminante i PCR-<strong>SSP</strong>, mens krydsreagerende grupper (CREG'er) giver større udfordringer til serologisk<br />
typebestemmelse. 3 Endelig, pga. <strong>DNA</strong>-typereagensernes syntetiske natur (feks. oligonukleotide-primere), er stabiliteten<br />
blevet tydeligt forbedret og lot til lot-varians reduceret.<br />
PRINCIP(PER)<br />
PCR-<strong>SSP</strong>-metodologien er baseret på princippet om, at fuldstændigt matchede oligonukleotide primere anvendes mere<br />
effektivt ved at forstærke en målsekvens, end en mismatchet oligonukleotid primer via rekombinant Taq-polymerase.<br />
Primerpar er designet til kun at have perfekte matcher med en enkelt allele eller gruppe alleler. Under strengt kontrollerede<br />
PCR-forhold, resulterer perfekt matchede par i forstærkelse af målsekvenser (dvs. et positivt resultat), mens mismatchede<br />
primerpar ikke resulterer i forstærkelse (dvs. et negativt resultat). Efter PCR-processen adskilles de forstærkede <strong>DNA</strong>fragmenter<br />
via agarose-gelelektroforese og visualiseres af farvning med ethidiumbromid og eksponering af ultraviolet lys.<br />
Fortolkning af PCR-<strong>SSP</strong>-resultater er baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af et specifikt forstærket <strong>DNA</strong>-fragment.<br />
Eftersom forstærkning under PCR-reaktionen kan påvirkes uhensigtsmæssigt af forskellige faktorer (pipetteringsfejl, ringe<br />
<strong>DNA</strong>-kvalitet, tilstedeværelse af inhibitorer, osv.) er et internt kontrolprimerpar inkluderet i hver PCR-reaktion.<br />
Kontrolprimerparret forstærker et bevaret område af det humane -globin gen, som er til stede i alle humane <strong>DNA</strong>-prøver og<br />
anvendes til at verificere PCR-reaktionens integritet. Ved tilstedeværelsen af et positivt typebestemmelsesbånd (specifik<br />
forstærkelse af en <strong>HLA</strong>-allele) kan produktet af det interne kontrolprimerpar blive svag eller fraværende pga. forskellene i<br />
koncentrationen og smeltetemperaturer mellem de specifikke primerpar og det interne kontrolprimerpar. De forstærkede<br />
<strong>DNA</strong>-fragmenter af de specifikke <strong>HLA</strong> primerpar er mindre end produktet af det interne kontrolprimerpar, men større end det<br />
diffuse, ikke-inkorporerede primerbånd. Således visualiseres en positiv reaktion på en specifik <strong>HLA</strong> allele eller allele-gruppe<br />
på gel'en som et forstærket <strong>DNA</strong>-fragment mellem det interne kontrolproduktbånd og det ikke-inkorporerede primerbånd (se<br />
Forventede værdier/Gel-fortolkning).<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 1 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
REAGENSER<br />
A. Identifikation<br />
<strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker giver sekvensspecifikke oligonukleotide primere til forstærkelse af <strong>HLA</strong>alleler<br />
og det humane -globin-gen via polymerase kædereaktionen (PCR). Præ-optimerede primere er til stede (tørrede)<br />
i forskellige brønde på en 96-brøndglasbakke på 0,2 ml med tynde sider til PCR og er klar til tilføjelsen af <strong>DNA</strong>-prøver,<br />
rekombinant Taq-polymerase og specielt formulerede dNTP-bufferblanding (<strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> D-blanding). Hver<br />
typebestemmelsesbakke omfatter et negativt kontrolreaktionsglas, der detekterer tilstedeværelsen af det interne kontrol-<br />
PCR-produkt genereret af <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakken. Det interne kontrol-PCR-produkt, forstærket af<br />
det humane -globin-gen, er det PCR-produkt, der efter størst sandsynlighed er kontaminerende pga. dets forstærkelse i<br />
hver brønd. Mængden af hver primer justeres til optimal forstærkelse af 100 ng prøve <strong>DNA</strong>, når anvendt sammen med<br />
<strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> D-blanding, den foreskrevne mængde rekombinant Taq-polymerase og PCR-reaktionsprofilen, beskrevet<br />
yderligere i dette dokument (side 2). Se det vedlagte arbejdsark for specifikke alleler, som kan forstærkes via hvert<br />
primersæt under de specificerede PCR-forhold for prøven. For at få mere at vide om lotspecifikke primerlokationer, se<br />
Primerinformationsdokumentet.<br />
B. Advarsel eller forsigtighed<br />
1. Til in vitro-diagnostisk brug.<br />
2. Pipetter anvendt til post-PCR-manipulationer bør ikke anvendes til præ-PCR manipulationer.<br />
3. Advarsel om biologisk fare: Ethidiumbromid, der anvendes til farvning af <strong>DNA</strong> er en mulig carcinogen. Der skal<br />
altid bæres handsker, når farvet gel håndteres.<br />
4. Advarsel om biologisk fare: Alle blodprodukter skal behandles som potentielt infektiøse. Kildematerialet, som dette<br />
produkt stammer fra, blev fundet negativt ved testning i overensstemmelse med de test, der i øjeblikket er påkrævet<br />
af FDA (Food and Drug Administration i USA). Ingen kendte testmetoder kan med sikkerhed fastslå, at produkter<br />
fra humant blod ikke transmitterer infektiøse stoffer.<br />
5. Forsigtig: Bær UV-blokerende øjenbeskyttelse og se ikke direkte ind i UV-lyskilden direkte, når der kigges på eller<br />
fotograferes gel.<br />
6. Se sikkerhedsdatabladet (MSDS) for at få yderligere oplysninger.<br />
C. Brugsanvisning<br />
Se Brugsanvisning.<br />
D. Opbevaringsanvisninger<br />
Opbevar reagenser ved den temperatur, der er angivet på emballagen. Skal anvendes før den påtrykte udløbsdato.<br />
E. Påkrævet rensning eller behandling før anvendelse<br />
Se Brugsanvisning.<br />
F. Indikationer for ustabilitet<br />
1. Primersætbakkerne må ikke anvendes, hvis der er revner i glas eller på tudene, da revner kan resultere i<br />
fordampningstab.<br />
2. Hvis der er udfældet salte af opløsningen i D-blandingsalikvoterne under forsendelse eller opbevaring, opløses disse<br />
igen vha. langvarig vortex ved stuetemperatur (20 til 25 C).<br />
3. D-blandingsalikvoter bør være lyserøde til lyselilla i farve ved optøning ved stuetemperatur (20 til 25C). Ethvert<br />
D-blandingsalikvot uden den specificerede farve bør betragtes som ubrugelig.<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 2 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
INSTRUMENTKRAV<br />
A. Programmering af den termiske cycler<br />
96-brønds GeneAmp® PCR-system 9600, 9700 eller Veriti 96-brønds termisk cykler (Applied Biosystems). Indstil<br />
rampehastigheden til 9600 for 96-brønds GeneAmp® PCR-systemet 9700. Indstil rampehastigheden til 9600<br />
emuleringstilstand for Veriti 96-brønds termisk cykler.<br />
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> PCR-program (OLI-1)<br />
Antal cykler Trin Temp. (C) Tid (sek.)<br />
1 1 96 130<br />
2 63 60<br />
9 1 96 10<br />
2 63 60<br />
20 1 96 10<br />
2 59 50<br />
3 72 30<br />
Slut 1 4 ---<br />
For specifikke oplysninger om den termiske cykler, se fabrikantens brugermanual.<br />
B. 2,5% agarose gelpræparat<br />
(til <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> gel-system, OLI kat. nr. MGS108)<br />
1. Opsætning:<br />
a. Skub låsestiften på bundpladen til åben.<br />
b. Isæt gelboksen i bundpladen, der matcher de farvekodede sider for at sikre korrekt orientering.<br />
c. Lås gelboksen ind i bundpladen ved at skubbe låsestiften til den låste stilling.<br />
d. Anvend nivelleringsboblen og de tre højdejustérbare ben til nivellering af bundpladen.<br />
2. Vend og isæt de 14 gel-kamme helt ind i gelkammeholderen.<br />
3. Til 100 ml 1x tris-borat EDTA-buffer (1x TBE) med 0,5 g/ml ethidiumbromid (i en 500 ml glasflaske), tilføjes 2,5<br />
g agarose af elektroforesekvalitet. Varm indtil der dannes en homogen opløsning.<br />
4. Tilføj 30 ml gelopløsning i gelboksen. Sørg for, at agarosen dækker hele overfladen jævnt ved at hælde gelboksen frem<br />
og tilbage umiddelbart efter, at gelopløsningen er tilføjet. Anbring hurtigt gelkammeholderen på den fyldte gelboks ved<br />
at matche farvekodningen. Lad det stå i 15 minutter.<br />
5. Fjern gelkammene ved at løfte gelkammeholderen, mens der holdes i bundpladen. Tilsæt 10 ml 1xTBE, der<br />
indeholder 0,5 g/ml ethidiumbromim jævnt hen over gel'en, således at det fylder hver brønd.<br />
C. Gel-elektroforese<br />
(Til <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> gel-system, OLI kat. nr. MGS108)<br />
1. Efter færdiggørelse af PCR-reaktionen:<br />
Orientér <strong>DNA</strong>-primersætbakken og gelboksen med den negative kontrolbrønd i øverste venstre hjørne.<br />
Fjern forsigtigt bakkeforseglingen uden at stænke på prøverne.<br />
2. Overfør hver PCR-reaktion (10 l) i sekvens med 2,5% agarose-gel'en. Sørg for at overføre alle prøver i den korrekte<br />
sekvens. (Ingen tilsætning af elektroforesefarve er nødvendig.) Anvendelse af en 8 – 12 kanals Pipetman ® anbefales.<br />
Bemærk: Prøvernes rækkefølge er (for at matche arbejdsarket) fra venstre til højre, oven fra og ned.<br />
3. Dæk gelboksen med gelbokslåget ved at matche de farvekodede sider. Elektroforesér prøverne ved 140 - 150 volts, indtil<br />
den røde sporingsfarve er trængt omkring 0,5 cm ind i gel'en (ca. 3 – 5 minutter, afhængig af den anvendte agarose. Fjern<br />
låget.<br />
4. Skub låsestiften på bundpladen til åben og fjern gelboksen. Overfør gelboksen til en UV-transilluminator. Fotografér den<br />
færdige gel.<br />
5. Orientér fotografiet med den negative kontrolreaktion i øverste venstre hjørne og mærk de tilsvarende positive allelegrupper<br />
på arbejdsarket, der var vedlagt bakken.<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 3 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
PRØVETAGNING OG -FORBEREDELSE<br />
A. <strong>DNA</strong> kan oprenses af humane leukocytter vha. en hvilken som helst foretrukket metode.<br />
B. <strong>DNA</strong>-prøven, der skal anvendes til PCR-<strong>SSP</strong>-analyse bør resuspenderes i sterilt vand eller i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 –<br />
9,0 ved en koncentration på 25 - 200 ng/l i A260/A280-forholdet på 1,65 – 1,80.<br />
C. Prøver bør ikke resuspenderes i opløsninger, der indeholder chelaterende agenter, såsom EDTA, over 0,5 mM i<br />
koncentration.<br />
D. <strong>DNA</strong>-prøver kan anvendes straks efter isolering eller opbevaret ved –20 C i længere tid (over 1 år) med ingen uheldige<br />
påvirkninger af resultater.<br />
E. <strong>DNA</strong>-prøver bør forsendes ved 4 C eller under for at bevare deres integritet under transport.<br />
PROCEDURE<br />
A. Leverede materialer<br />
1. <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>DNA</strong>-primersætbakker<br />
2. Præ-alikvottede D-blandingsglas (korrekt antal til test)<br />
3. Bakkeforseglinger (korrekt antal til test)<br />
B. Påkrævede materialer, der ikke er vedlagte<br />
Rekombinant Taq-polymerase (5 enheder/l)<br />
Pipetteringsanordninger, såsom: Gilson ® P-20, Gilson ® P200 Pipetman ®<br />
Pipettespidser til engangsbrug<br />
Vortexmixer<br />
Mikrocentrifuge<br />
Mikroglasopbevaringsstativ til PCR-bakke og låg (Robbins Scientific, kat. nr. 1044-39-5)<br />
Trykpude til anvendelse sammen med bakke (OLI kat. nr. <strong>SSP</strong>PAD, <strong>SSP</strong>PAD384, <strong>SSP</strong>PADGRY). Anvend kun den<br />
trykpude, der specifikt passer til din termisk cykler. Se <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> trykpudeprotokol (PCR_PAD_INS.DOC.)<br />
Bemærk: Trykpuden kan anvendes til maksimalt 300 PCR-kørsler. Bestil venligst en ny trykpude, hvis overfladen<br />
på puden, der kontakter bakkeforseglingen ikke længere er jævn.<br />
Termisk cykler til PCR med 96-brønde-format og bakke/holder til 0,2 ml tyndvæggede reaktionsglas<br />
Varmeplade eller mikroovn til opvarmning af agaroseopløsninger<br />
Elektroforeseanordning/strømforsyning (150V minimumskapacitet)<br />
UV-transilluminator (Eksempel: Fotodyne FOTO/UV 21)<br />
Fotografisk eller billeddokumentationssystem<br />
1x TBE buffer (89mM tris-borat; 2 mM dinatrium EDTA, pH 8,0) med 0,5 g/ml ethidiumbromid eller 5XTBE<br />
buffer med ethidiumbromid (OLI kat. nr. 5XTBE100)<br />
Agarose af elektroforesekvalitet (feks. FMC Seakem ® LE)<br />
C. Fremgangsmåde trin for trin.<br />
Der henvises til Brugsanvisning nedenfor.<br />
BRUGSANVISNING<br />
A. Tilberedelse af prøve<br />
1. Oprens genomisk <strong>DNA</strong> af leukocytprøve med den foretrukne metode. Endelig <strong>DNA</strong>-koncentration bør være 25 -<br />
200ng/l (100ng/l er optimalt) med A260/A280-forholdet mellem 1,65-1,80.<br />
2. For specifikke oplysninger om prøvetilberedelse og -opbevaring, se Prøvetagning og –forberedelse ovenfor.<br />
3. Udfør PCR på den oprensede <strong>DNA</strong>-prøve vha. en <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakke eller opbevar<br />
<strong>DNA</strong>-prøven ved –20C eller under indtil klar til typebestemmelse.<br />
B. Tilberedelse af reagens/udstyr<br />
1. Programmér en termisk cykler til at køre <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> PCR-programmet. (Se "Instrumentkrav" ovenfor.)<br />
2. Hav klar: rekombinant Taq-polymerase (5 enheder/l) Opbevar ved -20 C.<br />
3. Forbered elektroforesegel (2,5% agarose) vha. <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> gel-systemet (kat. nr. MGS108) eller med mindst 96<br />
prøvebrønde (anbring rækker med brønde mindst 1 cm fra hinanden).<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 4 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
C. Vejledning til pipettering af Taq-polymerase<br />
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong>'s kvalitetskontroltests angiver, at den viste mængde på Taq-polymeraseetiketten er mere end rigelig til<br />
antallet af tests angivet på dette produkt. Hvis yderligere Taq er påkrævet, skal det bestilles direkte fra F. Hoffmann-La<br />
Roche eller deres repræsentant.<br />
For at undgå spild, følges de simple instruktioner angivet nedenfor til pipettering af Taq-polymerase.<br />
Bemærk: Taq-polymerase er meget viskøs og der skal udvises megen forsigtighed ved alikvoteringsprocessen. Hvis de<br />
nedenfor beskrevne trin ikke følges, kan det resultere i reagenstab.<br />
1. Pipettér langsomt vha. en kalibreret Gilson ® Pipetman ® . (En P10 Pipetman ® anbefales til øget nøjagtighed.)<br />
2. Pipettespidsen bør blot akkurat passere Taq's overfladelag.<br />
Advarsel: Pipettespidsen må ikke nedsænkes i Taq.<br />
3. Tør omhyggeligt overskydende Taq fra pipettespidsen på kanten af hætteglasset.<br />
D. Trinvis procedure<br />
1. Fjern fra den angivne opbevaringstemperatur: Mængden (glasset) af <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> D-blanding, der matcher den<br />
valgte <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> primersætbakke, primersætbakken(erne) og det behørige antal <strong>DNA</strong>-prøver. Optø ved<br />
stuetemperatur (20 til 25 C).<br />
Bemærk: Du kan skære bakke og bakkeforsegling op i det antal tests, der er nødvendige for en enkelt arbejdssession.<br />
Sæt straks de ubrugte portioner tilbage i den korrekte opbevaringstemperatur.<br />
2. Vortex <strong>DNA</strong>-prøver til blanding.<br />
3. Anbring primersætbakken i et mikroglasopbevaringsstativ til PCR-bakke (Robbins Scientific, kat. nr. 1044-39-5) og<br />
fjern bakkens etiket.<br />
4. Fjern rekombinant Taq-polymerase fra fryseren og opbevar på is, indtil det skal anvendes.<br />
5. Vha. en Pipetman® (eller tilsvarende) tilsættes 1 l <strong>DNA</strong>-fortynder til reaktionsglasset med den negative kontrol på<br />
primersætbakken.<br />
6. Vha. en Pipetman® (eller tilsvarende) tilføjes rekombinant Taq-polymerase (5 enheder/l) til <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> Dblandingsglasset.<br />
(Se <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> produkttabel vedrørende mængden.)<br />
7. Sæt hætten på glasset og vortex i 5 sekunder. Impulscentrifugér <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> D-blandingsglasset i en<br />
mikrocentrifuge for at bringe al væske ned fra siderne af glasset.<br />
8. Vha. en P20 Pipetman® (eller lignende), pipettér 9 l <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> D-blanding i det negative kontrolreaktionsglas.<br />
9. Vha. en Pipetman® (eller tilsvarende) tilføjes <strong>DNA</strong>-prøven til <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> D-blandingsglasset. (Se <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong><br />
produkttabel vedrørende mængden.)<br />
10. Sæt hætten på glasset og vortex i 5 sekunder. Impulscentrifugér <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> D-blandingsglasset i en<br />
mikrocentrifuge.<br />
11. Vha. en P20 Pipetman® eller en elektronisk Pipetman® alikvoteres 10 l af prøve-reaktionsblandingen fra <strong>Micro</strong><br />
<strong>SSP</strong> D-blandingsglasset i hvert reaktionsglas, med undtagelse af det negative kontrolreaktionsglas fra <strong>Micro</strong><br />
<strong>SSP</strong> primersætbakken.<br />
Vigtigt: Sørg for at give ovenstående prøve primerne (tørret i bunden af hver reaktionsglas) for at undgå<br />
krydskontaminering mellem glas. Rør den indvendige side af glasset med pipettespidsen for at lade prøven glide ned<br />
til bunden af glasset. Tjek, at alle prøver er faldet ned til bunden af hvert glas. Hvis ikke, bankes der let på<br />
arbejdsbordet, således at alle prøver bundfælder sig, før du begynder PCR.<br />
12. Dæk reaktionsglassene med den vedlagte bakkeforsegling. Sørg for, at alle reaktionsglas er helt dækket af<br />
bakkeforseglingen for at sikre fuldstændig tætning og for at forhindre fordampningstab under PCR.<br />
13. Anbring <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> primersætbakken i termisk cykler eller lignende model med en passende glasbakkeadapter.<br />
14. Anbring en trykpude oven på bakken med den teksturerede side op før termisk cyklerlåget lukkes. (Se <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong><br />
trykpudeprotokol for vejledning vedrørende den specifikke pude, der skal anvendes sammen med din termisk<br />
cykler.)<br />
15. Indtast dit <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> PCR-programnummer. Angiv en mulighed for 10 l reaktionsmængde.<br />
16. Start PCR-programmet. Programmet tager ca. 1 time og 16 minutter. Det sidste trin vil holde prøven på 4 C, indtil<br />
kørslen er stoppet.<br />
17. Fjern primersætbakken fra termisk cykler . Fjern forsigtigt bakkeforseglingen uden at stænke på prøverne. Eller<br />
opbevar prøverne i primersætbakken ved -20 C for senere gel-elektroforese.<br />
18. Overfør hver PCR-reaktion (10 l) i sekvens med en 2,5% agarose-gel i <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> gelsystemet (OLI kat. nr.<br />
MGS108). (Anvendelse af en 8- eller 12-kanals Pipetman® eller af 96-brøndsoverførselsanordningen (OLI kat. nr.<br />
TRNDV96) anbefales kraftigt.)<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 5 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
Bemærk: Sørg for at overføre alle prøver i den korrekte sekvens, og vend primersætbakken med den negative<br />
kontrolreaktionsbrønd i øverste venstre hjørne. Prøvernes rækkefølge er (for at matche arbejdsarket)fra venstre til<br />
højre, oven fra og ned. Ingen tilsætning af elektroforesefarve er nødvendig.<br />
19. Elektroforesér prøverne ved 140 - 150 volts indtil den røde sporingsfarve er trængt omkring 0,5 cm ind i gel'en (ca.<br />
3 – 5 minutter, afhængig af den anvendte agarose.<br />
20. Fotografér gel'en på en UV-transilluminator.<br />
21. Fortolk typebestemmelsesresultaterne vha. arbejdsarket, der var vedlagt bakkerne eller vha. <strong>HLA</strong>-softwaret, der fås<br />
fra <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong>, Inc.<br />
Bemærk: Når <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong>'s <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker kun fylder nogle få rækker af elektroforesegel'en, er det muligt at<br />
anbringe adskillige prøver på én gel. Sørg for omhyggeligt at registrere gel'ens positioner.<br />
RESULTATER<br />
Allele-grupper DR 72<br />
serologi<br />
DRB1*01 12 12<br />
DRB1*15 24 24<br />
DRB1*16 2 2<br />
DRB1*0301, 0304 6 6<br />
DRB1*0302, 0303 6 6<br />
DRB1*04 14 14<br />
DRB1*11 23 a<br />
24<br />
DRB1*12 5 5<br />
DRB1*13 17 17<br />
DRB1*14 11 b<br />
<strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong><br />
10<br />
DRB1*07 16 16<br />
DRB1*08 7 7<br />
DRB1*09 5 5<br />
DRB1*10 5 5<br />
DRB5* 26 26<br />
DRB3* 57 c<br />
56<br />
DRB4* 32 d<br />
33<br />
DQB1*05 34 34<br />
DQB1*06 32 32<br />
DQB1*02 24 24<br />
DQB1*0301, 0304 22 22<br />
DQB1*0302, 0304 11 11<br />
DQB1*0303 3 3<br />
DQB1*04 11 11<br />
a, b) Afvigelserne på DRB1*11 og DRB1*14 er baseret på en prøve i<br />
hvilken serologi tildelte en DRB1*14 mens <strong>DNA</strong>-typebestemmelse<br />
tildelte DRB1*1117. DRB1*14 serologiske reagenser er<br />
monoklonale antistoffer, som forventes at detektere epitopen<br />
31 FHNQEEF 37 baseret på mønsteranalyse med DRB1*14 alleler.<br />
Denne aminosyresekvens deles også med DRB1*1117 (baseret på<br />
offentliggjorte aminosyresekvenser).<br />
c) Uoverensstemmelsen på DRB3 er baseret på en prøve, der blev<br />
tildelt en homozygous DRB1*08 både via serologi og <strong>DNA</strong>typebestemmelse,<br />
men blev tildelt endnu en DRB3* via serologi.<br />
DRB1*08 og DRB3* deler aminosyresekvenser, som under<br />
dobbeltdosiseffekterne af DRB1*08 homozygositet kan generere<br />
falskpositive reaktioner. 6<br />
d) Den falsknegative uoverensstemmelse på DRB4 er baseret på en<br />
prøve i hvilken kun <strong>DNA</strong>-typebestemmelse tildelte en DRB4.<br />
Opgaver både via serologi og <strong>DNA</strong>-typebestemmelse viser, at<br />
denne prøve indeholder DR7-DQ9-haplotypen, som man ved<br />
mangler udtryk for DRB4-allelen ved proteinniveauet. 7<br />
Bemærk: Lotspecifikke præstationsdata fås på anmodning.<br />
PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER<br />
A. PCR-<strong>SSP</strong> er en dynamisk proces, der kræver yderst kontrollerede forhold for at sikre diskriminantforstærkelse. Proceduren,<br />
der er vedlagt dette produkt, skal overholdes nøje.<br />
B. Den ekstraherede prøve-<strong>DNA</strong> giver skabelonen for den specifikke forstærkelsesproces og skal således have dens<br />
koncentration og renhed inden for værdiområderne, der er specificeret i denne procedure.<br />
C. Alle instrumenter (feks. PCR-maskine, pipetteringsanordninger) skal kalibreres i henhold til fabrikantens anbefalinger. For<br />
at få lotspecifikke oplysninger, se dokumentet vedrørende Opløsningsbegrænsninger.<br />
D. For at få lotspecifikke oplysninger, se dokumentet vedrørende Opløsningsbegrænsninger.<br />
FORVENTEDE VÆRDIER<br />
A. Data-analyse<br />
1. Et internt kontrolbånd (langsomtvandrende) bør altid være synligt i negative brønde (med undtagelse af negative<br />
kontrolbrønde) som en kontrol for vellykket forstærkelse. Ikke-forstærkelse af enhver brønd kan annullere testresultater.<br />
2. Et hurtigtvandrende, positivt typebestemmelsesbånd vil blive observeret på den elektroforetiske gel, hvis et specifikt<br />
<strong>HLA</strong>-gen blev forstærket under PCR. Dette angiver et positivt restresultat.<br />
3. Det interne kontrolbånd kan være svagt eller mangle i positive brønde.<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 6 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
4. Match mønstret af positive brønde med oplysningerne på <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> arbejdsarket for at opnå <strong>HLA</strong>-typebestemmelsen<br />
af prøve-<strong>DNA</strong>'en.<br />
5. Tilstedeværelsen af det interne kontrolbånd og/eller det positive typebestemmelsesbånd i negative kontrolbrønde<br />
ugyldiggør alle testresultater.<br />
6. Valgfri analyse – <strong>HLA</strong> Fusion software.<br />
B. Gelfortolkning*<br />
Positiv<br />
reaktion<br />
Negativ<br />
reaktion<br />
Ikkeforstærkelse<br />
Brønd<br />
Internt kontrolbånd<br />
Positivt<br />
typebestemmelsesbånd<br />
Primerbånd<br />
*Det interne kontrolbånd og brede uinkorporerede primerbånd tjener som størrelsesmarkører. Ethvert synligt bånd mellem<br />
de to markører i forskellige størrelse bør betragtes som positive typebestemmelsesbånd.<br />
SPECIFIKKE PRÆSTATIONSEGENSKABER<br />
En sammenligning mellem <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> og serologiske <strong>HLA</strong>-typebestemmelsesmetodologier blev udført for at vurdere<br />
nøjagtigheden af <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong>-typebestemmelsessystemet. I denne sammenligning blev 81 tilfældige fuldblodsprøver<br />
indsamlet og analyseret for deres <strong>HLA</strong> klasse II-typebestemmelse vha. <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong>, Inc., <strong>HLA</strong> klasse II<br />
vævstypebestemmelsesbakke DR72F og <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> generisk <strong>HLA</strong> klasse II <strong>DNA</strong> typebestemmelsesbakke. Resultaterne viser<br />
en 96% (78/81) overensstemmelse mellem de to metoder. Tabellen på næste side repræsenterer det samlede antal gange hver<br />
specificitet blev tildelt via de to forskellige metoder. (Fremhævede resultater angiver uoverensstemmelse mellem de to metoder.)<br />
BIBLIOGRAFI<br />
1) Terasaki, P.I., Bernoco, F., Park, M.S., Ozturk, G., and Iwaki, Y. <strong>Micro</strong>droplet testing for <strong>HLA</strong>-A, -B, -C and -D antigens.<br />
American Journal of Clinical Pathology 69:103-120, 1978.<br />
2) Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C., and Markham, A.F.<br />
Analysis of any point mutation in <strong>DNA</strong>. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research 17:<br />
2503-2516, 1989.<br />
3) Slater, R.D. and Parham, P. Mutually exclusive public epitopes of <strong>HLA</strong>-A,B,C Molecules. Human Immunology 26: 85-89,<br />
1989.<br />
4) Bodmer J., Marsh S., Albert E., Bodmer W., Bontrop R., Charron D., Dupont B., Erlich H., Mach B., Mayr W., Parham P.,<br />
Sasazuki T., Schreuder G., Strominger J., Svejgaard A. and Terasaki P. Nomenclature for factors of the <strong>HLA</strong> system, 1995.<br />
Human Immunology 43:149-164, 1995.<br />
5) Terasaki, P.I. Histocompatibility Testing, 1980. UCLA Tissue <strong>Typing</strong> Laboratory, Los Angeles, California.<br />
6) Savage, D.A., Bidwell, J.L., Cullen, C., Bidwell, E.A., and Middleton, D. Identification of <strong>HLA</strong>-DRw52 associated antigens<br />
using <strong>HLA</strong> class II allogenotyping. Tissue Antigens 32: 278-285, 1988.<br />
7) Sutton, V.R., Kienzle, B.K., and Knowles, R.W. An altered splice site is found in the DRB4 gene that is not expressed in<br />
<strong>HLA</strong>-DR7, Dw11 individuals. Immunogenetics 29: 317-322, 1989.<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 7 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
FEJLFINDING<br />
Problem Mulige årsager Løsninger<br />
Ingen bånd eller<br />
svage bånd<br />
<strong>DNA</strong> Ikke anvendt nok<br />
Ikke ren nok (A260/A280 ikke inden for<br />
1,65 – 1,80)<br />
PCR-inhibitor til stede (feks. EDTA over<br />
0,5 mM)<br />
Rekombinant Taqpolymerase<br />
Ikke anvendt nok<br />
Enzym degraderet<br />
Gentag test; angiv mængde<br />
angivet i <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <br />
produkttabel.<br />
Gentag <strong>DNA</strong>-præparationen;<br />
kontrollér at A260/A280 er inden<br />
for 1,65 – 1,80, og gentag<br />
dernæst testen.<br />
Gentag <strong>DNA</strong>-præparationen;<br />
resuspendér <strong>DNA</strong> i opløsning med<br />
EDTA < 0,5 mM, og gentag<br />
dernæst testen.<br />
Gentag test; angiv mængde<br />
angivet i <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <br />
produkttabel.<br />
Gentag test; anvend frisk glas<br />
enzym.<br />
EtBr Ikke anvendt nok Klargør 1 X TBE med EtBr à 0,5<br />
g/ml. Gentag test.<br />
Trykpude Trykpude slidt op Udskift trykpude efter 300 PCRkørsler.<br />
Falske bånd <strong>DNA</strong> For meget anvendt<br />
Ikke ren nok (A260/A280 ikke inden for<br />
1,65 – 1,80)<br />
Kontamineret (andet <strong>DNA</strong> eller PCRprodukt)<br />
Bånd i negativ<br />
kontrol<br />
Rekombinant Taqpolymerase<br />
VAREMÆRKER ANVENDT I DETTE<br />
DOKUMENT/PRODUKT<br />
<strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> Inc.<br />
GeneAmp Perkin-Elmer<br />
Gentag test; angiv mængde<br />
angivet i <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <br />
produkttabel.<br />
Gentag <strong>DNA</strong>-præparationen;<br />
kontrollér at A260/A280 er inden<br />
for 1,65 – 1,80, og gentag<br />
dernæst testen.<br />
Anvend nye alikvotter for alle<br />
buffere/reagenser til <strong>DNA</strong>ekstraktion<br />
og PCR; gentag <strong>DNA</strong>ekstraktion<br />
og test.<br />
For meget anvendt Gentag test; angiv mængde<br />
angivet i <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <br />
produkttabel.<br />
EtBr For meget anvendt Klargør 1 X TBE med EtBr à 0,5<br />
g/ml. Gentag test.<br />
Reagenser Kontamineret (andet <strong>DNA</strong>- eller PCRprodukt)<br />
Fotodyne FOTO/UV 21 FOTODYNE Incorporated<br />
Anvend nye alikvotter for alle<br />
buffere/reagenser til <strong>DNA</strong>ekstraktion<br />
og PCR; gentag <strong>DNA</strong>ekstraktion<br />
og test.<br />
FMC SeaKem FMC Corporation<br />
ARMS <br />
Gilson ® og Pipetman ®<br />
Zeneca Limited<br />
Rainin Instrument Co., Inc.<br />
Veriti Applied Biosystems<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 8 af 9
<strong>One</strong> <strong>Lambda</strong> | Indlægsseddel: <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>HLA</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesbakker<br />
ANVENDTE PATENTER I DETTE DOKUMENT<br />
Bemærkning til køber vedrørende licenseret produkt: Købsprisen af dette produkt inkluderer begrænsede, ikke-overførbare rettigheder under<br />
amerikanske patenter 4,683,202; 4,683,195 og 4,965,188 og deres udenlandske modparter, ejet af Roche Molecular Systems, Inc. og F.<br />
Hoffmann-LaRoche Ltd ("Roche"), som består i kun at anvende denne mængde af produktet til at praktisere polymerase kædereaktions-<br />
("PCR") processen beskrevet i nævnte patenter kun til <strong>HLA</strong>-typebestemmelsesanvendelser af køber udelukkende til organ, knoglemarv eller<br />
vævstransplantation og ekskluderer udtrykkeligt analyse af retslægeligt bevis eller faderskabskontrol. Retten til at anvende dette produkt med<br />
henblik på at udføre og tilbyde kommercielle tjenesteydelser mht. <strong>HLA</strong>-typebestemmelse til organ- eller vævstransplantation vha. PCR,<br />
herunder rapportering af resultaterne af købers aktiviteter mod et gebyr eller andet kommercielt vederlag, gives hermed også. Yderligere<br />
oplysninger vedrørende køb af licenser til at anvende PCR kan fås ved i USA at kontakte Director of Licensing, Roche Molecular Systems,<br />
Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, og uden for USA, PCR Licensing Manager, F. Hoffmann-La Roche Ltd,<br />
Grenzacherstr.124, CH-4070 Basel, Schweiz.<br />
<strong>SSP</strong>-teknologi er licenseret af Zeneca Limited, gennem dets Zeneca Diagnostics-virksomhed, Blacklands Way, Abingdon Business Park,<br />
Abingdon, Oxfordshire, England OX14 IDY og dækket under følgende patenter tilhørende Zeneca Corporation: Europæisk patentnr. 0 332 435<br />
B1, amerikansk patentnr. 5,595,890, ved navn "Method of detecting nucleotide sequences," og canadisk patentnr. 1323592 samt tilsvarende<br />
patenter og patentansøgninger verden over.<br />
<strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> <strong>DNA</strong>-typebestemmelsesreagenser fremstilles og forhandles af <strong>One</strong> <strong>Lambda</strong>, Inc., 21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA<br />
91303, U.S.A. Rekombinant Taq-polymerase fremstilles af F. Hoffmann-LaRoche.<br />
EUROPÆISK AUTORISERET REPRÆSENTANT<br />
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, D-30175 Hannover, Tyskland<br />
REVISIONSHISTORIE<br />
Revision Dato Beskrivelse af revision<br />
16 2009/07<br />
17 2011/12<br />
Side 3, Vedlagte materialer; fjern reference til <strong>Micro</strong> <strong>SSP</strong> referencetabel. Flyt Taq-polymrase til<br />
Påkrævede materialer, der ikke er vedlagt.<br />
Tilføj fodnote sammen med 0197 (0197 gælder kun for produkter i Bilag II, Liste B). Tilføj<br />
yderligere CE-mærke for produkter, der ikke indgår i Bilag II, Liste B.<br />
18 2012/11 Tilføj Fusion-software som en valgmulighed. Ændret øverste overskrift.<br />
*<br />
*0197 Gælder kun for produkter i Bilag II, Liste B.<br />
<strong>SSP</strong>-<strong>DNA</strong>T-PI-DA-00, Rev. 18 Side 9 af 9