Immunologiske metoder

12
Immunologiske metoder
Man kan skelne mellem såkaldte serologiske metoder, der groft set baserer sig
på antigen-antistof reaktioner, og cellulære metoder.
Serologiske metoder
Antistoffernes høje specificitet og affinitet gør dem til værdifulde værktøjer i
en lang række teknikker, som oven i købet kan kombineres, så kun fantasien er
begrænsende for applikationerne. De klassiske teknikker beskrives i det følgende.
Precipitationsreaktionen
Ved optimale koncentrationer af antistof og antigen dannes store immunkomplekser,
som kan nå en størrelse, hvor de fælder ud af en vandig opløsning. Precipitatet
kan ses som gråhvid udfældning fx i agarose gel ved dobbelt immundiffusion,
hvor antistof og antigen diffunderer fra hver sin brønd og lokalisationen
af precipitatet bestemmes af koncentrationsforholdet mellem antistof
og antigen. Ved radial immundiffusion støbes antistof ind i gelen på forhånd, og
diffusionen af antigen fra en udstanset brønd vil føre til en kontinuert fortynding.
Kvadratet på diameteren i den ring, der udgør precipitatet, er proportional
med antigenkoncentrationen. Dannelsen af precipitatet kontrolleres
med standardfortyndinger af tilsvarende antigen. I stedet for passiv diffusion
kan man bringe antigenet til at vandre i et elektrisk felt, hvor vandringen også
vil afhænge af proteinets ladning og molekylvægt. Højden af den raketformede
precipitation er proportional med antigenkoncentrationen. Teknikken
kaldes raket-elektroforese.
Elektroforese
Ved elektroforese separeres proteiner efter mobilitet i en agarose- eller polyacrylamidgel
i et elektrisk felt, idet små proteiner med stor ladning vil have
større mobilitet end store proteiner med lille ladning. Ladningen bestemmes
af proteinets isoelektriske punkt og pH. Positionen af proteinerne kan bestemmes
direkte ved farvning af gelen med fx sølvforbindelser, eller gelens indhold
kan overføres og fikseres ved elektroblotting til en membran (Western blotting),
hvor antigenet fx kan påvises med mærkede antistoffer.

90
Nefelometri
En vandig opløsning af antigen og antistof kan undersøges for dannelse af
immunkomplekser med en laserstråle, hvis diffraktion vil afhænge af mængden
og størrelsen af de dannede komplekser.
Agglutinationsreaktionen
Immunologi
Partikler, bakterier og celler, som bærer et antigen på overfladen, kan bringes
til at agglutinere med antistoffer rettet mod det pågældende antigen. Kravet
er, at cellerne kan bringes til at ligge så tæt, at antistofferne kan danne bro imellem
dem. Ved neutral pH har celleoverfladen en negativ ladning (zeta potentialet),
som modvirker agglutination, men ændring af ionstyrke eller tilsætning
af positivt ladede proteiner kan facilitere reaktionen. IgM er på grund af
den større molekylære struktur mere potent som agglutinator end IgG. Teknikken
er basis for blodtypebestemmelser og antistofscreentesten/forligelighedsreaktionen
forud for blodtransfusion. Mængden af antistof, der er nødvendig
for agglutination, kan bestemmes ved fortynding (titrering), og den
højeste fortynding, der stadig udløser agglutination, kaldes det pågældende
serums titer (fx 1:512). Man benytter ofte et kanin-antistof mod humant
immunglobulin til at udløse agglutination med antistoffer, som ikke i sig selv
kan »nå« fra celle til celle. Teknikken kaldes indirekte antiglobulin (Coombs’
indirekte) teknik (se Fig. 12.1).
Antistof Anti-Ig
Erytrocytter
Figur 12.1. Indirekte Coombs’ teknik.

12. Immunologiske metoder 91
Vævssnit
Mikroskopiglas
med vævssnit
Immunfluorescens
Antistoffer koblet til fluorescerende forbindelser som fluorescein kan anvendes
i fluorescensmikroskopi eller flowcytometri. Antistofferne kan ved mikroskopi
påvise antigen i væv eller på enkelte celler (Fig. 12.2), ligesom teknikkerne
ofte anvendes til påvisning af autoantistoffer og immunkomplekser ved
autoimmune sygdomme. Flowcytometri anvendes til undersøgelse af celler i
enkeltcelle-suspension, der efter mærkning med fluorescerende antistoffer
eller fx fluorescerende DNA-bindende forbindelser passerer en laserstråle
celle for celle. Det fluorescerende lys detekteres af lysdetektorer, hvis signaler
opsamles og gemmes for hver eneste celle på computere. Oplysningerne kan
bruges til analyse af cellulære fordelinger og anvendes fx ved undersøgelse af
HIV-smittede patienters CD4+ T-lymfocytter.
ELISA
Serum
(antistof)
Figur 12.2. Flowcytometer.
Binding
af antistof
Fluorescerende
konjungeret
anti-Ig
Tilsætning af
fluorescerende
konjungeret anti-Ig
Blåt lys
Grønt
fluorescerende
lys
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay er en meget følsom teknik til kvantitering
af antigen. Antigen adsorberes uspecifikt til en plastikoverflade eller bindes
specifikt til antistof, som i stedet er adsorberet til overfladen. Derefter tilsættes
endnu et (detektions-)antistof, som er bundet til et enzym (fx peroksidase eller
alkalisk fosfatase), som kan bringes til at katalysere en kromogen reaktion, dvs.
at et farveløst substrat omdannes til et farvet produkt (Fig. 12.3). Mængden af
antigen kan ud fra en standardkurve bestemmes, når den optiske densitet i
reaktionen måles i et spektrofotometer.

92
Figur 12.3. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA).
RIA
Immunologi
RIA står for RadioImmunoAssay. Grundlæggende ligner RIA og ELISA hinanden,
men i stedet for at anvende enzymkoblede antistoffer benyttes radioaktivt
mærkede detektionsantistoffer. Mængden af bundet radioaktivitet kan
ligeledes ud fra en standardkurve korrelleres til mængden af antigen. Metoden
kan varieres ved i stedet at tilsætte en kendt mængde radioaktivt mærket
antigen, hvorefter mængden af bundet reaktivitet vil aftage med stigende
mængde af det undersøgte antigen på grund af fortrængning.
Plastikrør
med antigen
Patientserum
med antistof
Mærkede
anti-Ig
+ +
Figur 12.4. Radioimmunoassay (RIA).
E
=
Radioaktivitet
måles i tæller

12. Immunologiske metoder 93
Fuldblod
Densitetsmedium
fx G=1,069
Figur 12.5. Differentialcentrifugering.
Cellulære metoder
Centrifugering
Plasma
Buffycoat (MNC)
Densitetsmedium
Rbc, granulocytter
Differential centrifugering, der udnytter mononukleære og polynukleære cellers
forskellige vægtfylde, anvendes ofte til sortering af leukocytter. Der kan
anvendes kontinuerte eller diskontinuerte densitetsgradienter, eller såkaldt
elutriering, hvor cellerne centrifugeres i et flowkammer, så der indstiller sig en
ligevægt mellem flowet og centrifugalkraften (Fig. 12.5).
Proliferationsundersøgelser er specielt velegnet til undersøgelse af T-lymfocytters
reaktivitet og specificitet. Klassisk én-vejs mixed lymphocyte reaction
(eller: MLC, for: Mixed Lymphocyte Culture) udnytter T-cellens reaktion på
fremmed antigen. En stimulator cellepopulation fra et individ bestråles med
gammastråler for at ødelægge cellernes evne til proliferation, hvorefter de
udsættes for et andet individs ikke-bestrålede T-celler, der reagerer på de fremmede
cellers MHC-antigener ved proliferation. Proliferationen monitoreres
typisk ved inkorporation af 3H-thymidin i cellernes nysyntetiserede DNA.
Radioaktiviteten er i korte inkubationer lineært afhængig af den cellulære
proliferation. Metoden kan varieres ved at tilsætte fx mikrobielt antigen til
autologe antigenpræsenterende celler, for derefter at lade disse optræde som
stimulatorceller.
ELISPOT og plaque forming cell assay benyttes typisk til undersøgelse af Blymfocytfunktion.
B-lymfocytterne indlejres i en matrix af fx agar, hvorefter de
stimuleres til antistofproduktion. Det producerede antistof vil derefter kunne
påvises i matricen ved enzymatiske farvereaktioner, immunprecipitationer
eller komplementmedieret lysering af ligeledes indlejrede erytrocytter koblet
med et relevant antigen.
Cellemedieret cytotoksicitet kan anvendes til undersøgelse af NK-celle-aktivitet.
En cellelinje, der er følsom for NK-medieret drab som fx erytroleukæmicellelinjen
K562 (target), indmærkes med 51Cr, hvorefter den co-inkuberes med

94
Specifikt drab (%)
100
50
1:1 5:1 30:1 50:1
Figur 12.6. Cellemedieret cytotoksicitet
E/T-ratio
Immunologi
mononukleære celler eller oprensede NK-celler (effektor) i varierende effektor:target
ratio-kombinationer (E:T), typisk 1:1, 5:1, 30:1 og 50:1 (se Fig. 12.6).
Dræbte targetceller kan kvantiteres ved måling af frisat radioaktivitet efter
korrektion for spontan lækage. Antallet af dræbte celler som funktion af E:T
anvendes som udtryk for NK-celleaktiviteten.
Migrationsundersøgelser anvendes typisk til undersøgelse af granulocytter.
Cellesuspensionen anbringes over en membran (med veldefineret porestørrelse,
fx 5 µm), der coates for at facilitere cellulær adhærence. Under membranen
ligger en opløsning med en kendt eller ukendt kemo-attractant, og efter
en passende inkubationstid undersøges membranens underside for adhærente
celler. Antallet af transmigrerede celler korrigeres for spontan vandring
mod en kontrolopløsning og er derefter et udtryk for cellernes migratoriske
kapacitet mod den pågældende kemo-attractant.